PRÓBA ZASTOSOWANIA REGRESJI LINIOWEJ DO OKREŚLENIA
ZWIĄZKU POMIĘDZY BARWĄ A WŁAŚCIWOŚCIAMI
ANTYOKSYDACYJNYMI MIODÓW
Liczne opracowania dotyczące działania przeciwutleniającego miodów pszczelich wskazują, że miody ciemne charakteryzują się znacznie wyższą aktywnością antyoksydacyjną niż miody jasne. Celem niniejszej pracy było określenie związku pomiędzy barwą a aktywnością antyoksydacyjną miodów metodą regresji liniowej. Wykazano, że istnieje silna korelacja pomiędzy parametrami barwy a dzia-łaniem przeciwutleniającym miodów pszczelich, ale mimo wysokiego stopnia skorelowania nie udało się ustalić wystarczająco dokładnego liniowego związku pomiędzy tymi zmiennymi.
Słowa kluczowe: parametry barwy, aktywność antyoksydacyjna, regresja liniowa
WSTĘP
Miód jest produktem, którego lecznicze i prozdrowotne działanie było znane i wykorzystywane od wieków. Wśród składników prozdrowotnych obecnych w miodzie istotną rolę odgrywają substancje wykazujące działanie przeciwutlenia-jące, takie jak: enzymy (katalaza, oksydaza), witaminy (karotenoidy, wit. C, wit. E), kwasy organiczne, aminokwasy i proteiny, a także liczne polifenole [1, 2, 6, 12]. Na aktywność antyoksydacyjną miodów w największym stopniu wpływa zawar-tość zawiązków fenolowych: flawonoidów i fenolokwasów, która jest uzależniona od pochodzenia botanicznego miodów [1, 8]. Na aktywność antyoksydacyjną wpływ mają także procesy technologiczne, takie jak ogrzewanie czy przechowy-wanie [13, 14]. Wykazano również, że barwa miodów może wpływać na ich dzia-łanie przeciwutleniające. Według licznych opracowań miody ciemne wykazują stosunkowo wysoką aktywność antyoksydacyjną w porównaniu z miodami jasnymi [3, 4, 5, 9, 10, 15]. Inne badania [16] wskazują, że to wartość parametru b* może mieć związek z przeciwutleniającym i przeciwrodnikowym działaniem miodów pszczelich.
Celem badań podjętych w niniejszej pracy było określenie związku pomiędzy barwą a działaniem przeciwutleniającym miodów.
Metodą statystyczną pozwalającą na badanie związku pomiędzy wielkościami danych i przewidywanie na tej podstawie nieznanych wartości jednych wielkości (objaśnianych, zależnych, tu: aktywność antyoksydacyjna) na podstawie znanych
wartości innych (objaśniających, niezależnych, tu: parametry barwy) jest analiza regresji. Równanie regresji liniowej w przypadku jednej zmiennej niezależnej ma postać: y = a + bx, gdzie: y – zmienna zależna, x – zmienna niezależna, b – współczynnik regresji, a – wyraz wolny.
Związek między zmiennymi jest istotny, gdy wartość współczynnika regresji jest różna od zera.
Jeżeli jest kilka zmiennych niezależnych, równanie przyjmuje postać: y = a + b1x1+ b2x2 +…+ bnxn,
gdzie:
xn – kolejne zmienne niezależne,
bn – kolejne współczynniki regresji.
W analizie regresji ważnymi statystykami są współczynnik determinacji (R2) i błąd standardowy szacunku (SEE). Współczynnik determinacji jest podstawową miarą dopasowania prostej regresji do danych empirycznych i informuje, jaka część zmienności zmiennej zależnej została wyjaśniona przez zmienne niezależne. Błąd standardowy szacunku określa, o ile przeciętne wartości empiryczne różnią się od wartości teoretycznych, reprezentowanych przez prostą regresji [11].
MATERIAŁ I METODY
Przedmiot badań stanowiły 82 miody odmianowe, świeże, nieogrzewane, niestandaryzowane, pochodzące ze zbiorów w latach 2009–2010, pozyskane bez-pośrednio od pszczelarzy. Wśród analizowanych były: 4 miody akacjowe, 3 nawło-ciowe, 7 faceliowych, 4 lipowe, 3 wrzosowe, 4 nektarowo-spadziowe, 8 spadzio-wych, 10 gryczanych, 17 wielokwiatowych i 22 rzepakowe.
Parametry barwy L*, a*,b* analizowanych próbek miodów oznaczono w sys-temie międzynarodowym CIE za pomocą kolorymetru Konica-Minolta CR 400 dla standardowego obserwatora 2° i iluminatu D 65. Pomiaru barwy dokonywano w szalce pomiarowej ze szkła optycznego o średnicy 34 mm, grubość warstwy miodu to 10 mm.
Potencjał antyoksydacyjny badanych próbek oznaczono jako całkowitą zawar-tość polifenoli (TP), za pomocą metody z zastosowaniem odczynnika Folina--Ciocalteu. Aktywność antyutleniającą (AA) określano też jako zdolność zmiatania wolnych rodników: rodnika DPPH• oraz kationorodnika ABTS+. Wyniki oznaczeń AA podano jako % inhibicji wolnych rodników:
gdzie:
AA – absorbancja badanej próbki,
AB – absorbancja próby kontrolnej.
Do określenia stopnia wzajemnych powiązań pomiędzy poszczególnymi pa-rametrami obliczono współczynniki korelacji r Pearsona oraz wyznaczono funkcję liniową regresji. Wszystkie obliczenia wykonano przy użyciu programu Statistica 10.0 (Statsoft Inc.). Hipotezy statystyczne weryfikowano na poziomie istotności α = 0,05.
WYNIKI
W tabeli 1 przedstawiono wyniki oznaczania parametrów barwy miodów. Spośród analizowanych odmian najjaśniejszą barwą charakteryzowały się miody akacjowe (średnie L* = 40,4), podczas gdy miody gryczane były najciemniejsze (średnie L* = 21,3). Najwyższą średnią wartość parametru a* (czerwoność barwy) wykazywały miody wrzosowe (a* = 4,83) i gryczane (a* = 5,02), a najmniejszą (wartości ujemne – elementy zielonkawe) miody akacjowe (a* = –0,85). Najwyż-sze średnie wartości parametru b* zaobserwowano w miodach akacjowych (21,21), co oznacza, że miody te były najbardziej żółte. Miody gryczane charakteryzowały się natomiast najniższą wartością parametru b* (4,89).
Tabela 1. Parametry barwy poszczególnych odmian miodów [badania własne] Table 1. Colour parameters of particular types of honey
Odmiana (n) Parametr NKw (17) SI (8) NA (4) NN (3) NR (22) NF (7) NL (4) NW (3) NS (4) NG (10) L* Średnia ±SD Minimum Maksimum 32,2b 4,99 22,2 40,8 23,2a,c 2,89 20,9 29,7 40,4d 2,56 37,3 43,6 28,6b,c 1,11 27,7 29,8 32,6b 4,66 25,5 43,1 29,4b,c 5,27 26,8 37,9 32,2b 3,45 28,6 36,9 23,8a,c 1,44 22,9 25,5 27,4a,b,c 5,56 19,9 33,3 21,3a 0,98 20,5 22,6 a* Średnia ±SD Minimum Maksimum 0,53c 1,28 -1,9 2,24 2,60a,b 2,23 0,44 7,17 -0,85c 0,78 -1,5 0,29 0,98b,c 0,94 0,20 2,02 0,52c 1,09 -1,2 3,35 2,12b 1,68 1,16 4,91 0,52b,c 0,75 -0,2 1,77 4,83a 1,70 2,93 6,19 4,12a 4,06 1,15 9,88 5,02a 2,68 3,84 9,00 b* Średnia ±SD Minimum Maksimum 14,7b 4,66 4,81 22,3 6,11c 3,92 3,04 14,2 21,21a 3,68 16,1 24,9 11,3b 0,57 10,9 11,9 13,2b 4,21 7,67 22,3 13,8b 9,62 11,7 31,7 14,8a,b 2,87 12,3 19,7 6,92c 2,95 5,15 10,3 14,9b 5,42 9,45 21,8 4,43c 1,84 3,06 6,90
Oznaczenia literowe (a, b, c, d) oznaczają grupy jednorodne, wyodrębnione na podstawie analizy post hoc (test Tukeya). NKw – miód nektarowy wielokwiatowy, SI – miód spadziowy ze spadzi iglastej, NA – miód nektarowy akacjowy, NN – miód nektarowy nawłociowy, NR – miód nektarowy rzepakowy, NF – miód nektarowy faceliowy, NL – miód nektarowy lipowy, NW – miód nektarowy wrzosowy, NS – miód nektarowo-spadziowy, NG – miód nektarowy gryczany
Wykazano, że poszczególne odmiany miodów różnią się istotnie parametrami barwy, co potwierdziła analiza statystyczna (analiza wariancji Kruskala-Wallisa).
Obliczone wartości statystyki H wyniosły odpowiednio 93,7921 dla L* (p = 0,000), 74,9317 dla a* (p = 0,000) i 81,1489 dla b* (p = 0,000). Testy post hoc pozwoliły na wyodrębnienie grup jednorodnych. W grupie miodów najciemniejszych, charak-teryzujących się jednocześnie największą czerwonością barwy (grupa „a” ze względu na parametry L* i a*) znalazły się miody gryczane, wrzosowe, spadziowe i nektarowo-spadziowe, natomiast do najjaśniejszych, a zarazem zawierających najwięcej żółtych elementów (grupa „a” ze względu na parametr b*) zaliczono miody akacjowe i lipowe.
W tabeli 2 zaprezentowano wyniki pomiaru aktywności antyoksydacyjnej miodów. Najwyższą aktywnością antyoksydacyjną wyrażoną jako zdolność zamia-tania rodników DPPH charakteryzowały się miody wrzosowe, natomiast najwyż-szą zdolność zmiatania kationorodników ABTS i najwyżnajwyż-szą ogólną liczbę polife-noli miały miody gryczane. Z kolei miody akacjowe charakteryzowały się najniższą zdolnością zmiatania zarówno rodników DPPH, jak i kationorodników ABTS, a rzepakowe miały najniższą ogólną liczbę polifenoli.
Tabela 2. Aktywność antyoksydacyjna polskich miodów odmianowych [badania własne] Table 2. Antioxidant activity of Polish types of honey
Odmiana (n) Parametr NKw (17) SI (8) NA (3) NN (3) NR (22) NF (7) NL (4) NW (3) NS (4) NG (10) AADPPH• [%] Średnia ±SD Minimum Maksimum 63,5b 16,2 33,0 80,3 74,5a 8,72 59,1 84,9 47,2c 8,75 36,5 57,8 48,1c 13,1 34,6 60,9 50,9c 15,2 27,0 82,2 74,6b 15,7 56,3 88,6 66,8c 16,1 48,7 80,3 83,4a,b 4,11 78,7 85,8 57,0a,b 26,6 15,2 90,5 70,6a,b 18,0 38,1 85,8 AAABTS+ [%] Średnia ±SD Minimum Maksimum 31,8d 17,4 13,6 60,4 49,1a,c 4,77 45,3 54,4 6,00d 6,00 2,29 12,9 40,9b,c 33,3 21,2 79,4 18,4d 4,35 9,83 24,6 28,7d 7,45 20,4 35,6 24,4c,d 8,42 18,2 30,3 53,4a,b 1,23 49,3 56,4 26,7b,c 18,1 4,35 56,2 69,7a,b 27,0 24,0 91,5 TP [mgGAE/100 g] Średnia ±SD Minimum Maksimum 62,5b,c 23,6 30,0 110 87,4b 21,4 4,4 114 53,1c 5,46 48,4 61,0 80,7b,c 78,7 32,6 171 47,5b,c 16,5 25,1 85,8 51,3b 7,17 42,8 60,4 49,0b,c 6,60 43,7 57,7 155a 75,0 71,9 217 54,8b,c 27,0 16,5 85,8 177a 79,4 37,2 320
Oznaczenia literowe (a, b, c, d) oznaczają grupy jednorodne, określone na podstawie analizy post hoc. AAABTS+ – aktywność antyoksydacyjna mierzona względem kationorodnika ABTS+,AADPPH• – aktywność antyoksydacyjna mierzona względem rodnika DPPH•, TAEC – aktywność antyoksydacyjna wyrażana jako stężenie równoważników troloksu, TP – zawartość związków fenolowych ogółem
Analiza statystyczna wykazała, że pochodzenie botaniczne badanych próbek wpływa na ich aktywność antyoksydacyjną, mierzoną jako zdolność zmiatania wolnych rodników DPPH• (K-W, H(9,82) = 64,09048, p = 0,00), zdolność zmiata-nia wolnych rodników ABTS+ (ANOVA, F(9,82) = 14,587, p = 0,00), jak również na ogólną zawartość polifenoli TP (K-W, H(9,82) = 76,78994, p = 0,00). Na podsta-wie przeprowadzonych testów post hoc wyodrębniono grupy jednorodne (tab. 2). Warto zauważyć, że w grupach charakteryzujących się najwyższą aktywnością antyoksydacyjną (grupa „a”) zawsze występują miody gryczane, wrzosowe i
spa-dziowe, czyli miody ciemne, natomiast w grupach miodów o najniższej aktywności antyoksydacyjnej (grupy „c” i „d”) znalazły się miody jasne – akacjowe, nawło-ciowe i lipowe.
Powyższe wyniki wskazują, że istnieje zależność pomiędzy parametrami bar-wy miodów a ich zdolnością przeciwutleniającą. Aby obiektywnie potwierdzić tę tezę, zastosowano analizę korelacji. Analiza ta wykazała istotne statystycznie za-leżności, zarówno dodatnie, jak i ujemne. Na szczególną uwagę zasługują wartości współczynników korelacji pomiędzy L* a zdolnością zmiatania wolnych rodników DPPH• i ABTS+ oraz ogólną zawartością polifenoli, które wyniosły: r = -0,57 dla
L*/AADPPH•, r = -0,72 dla L*/AAABTS+ i r = -0,60 dla L*/TP. Wartości te
potwierdza-ją obserwację, że miody ciemne mapotwierdza-ją wyższą aktywność przeciwrodnikową niż miody jasne, jak również że zawartość polifenoli, mierzona metodą F-C w miodach ciemnych jest istotnie wyższa niż w miodach jasnych. Zaobserwowano również istotny statystycznie, choć słaby, związek pomiędzy czerwonością barwy (warto-ścią parametru a*) a aktywnością antyoksydacyjną mierzoną zarówno jako zdol-ność zmiatania rodnika DPPH•, jak i ABTS+. Odnotowano bardzo słaby związek pomiędzy wartością parametru b* a aktywnością przeciwrodnikową oraz ogólną zawartością polifenoli (tab. 3).
Tabela 3. Wartości współczynników korelacji Pearsona [badania własne] Table 3. Values of Pearson's correlation coefficient
L* a* b* AADPPH• AAABTS+ TP
L* 1 – – -0,57a -0,72a -0,60a
a* – 1 – 0,23a 0,33a 0,17
b* – – 1 -0,15 -0,19 -0,16
AADPPH• -0,57a 0,23a -0,15 1 0,68a 0,50a
AAABTS+ -0,72a 0,33a -0,19 0,68a 1 0,91a
TP -0,60a 0,17 -0,16 0,50a 0,91a 1
a – statystyczna istotność przy p < 0,05
Biorąc pod uwagę powyższe wyniki, podjęto próbę określenia związku po-między jasnością barwy a aktywnością antyoksydacyjną, mierzoną wobec rodni-ków DPPH•, ABTS+ oraz wyrażoną jako ogólna zawartość polifenoli. Celem anali-zy była budowa modelu, za pomocą którego można by prognozować wartość zmiennej zależnej (AADPPH•, AAABTS+, TP) na podstawie wartości zmiennej niezależ-nej, w tym przypadku jasności barwy (L*). Obliczone równania regresji przyjęły postać:
TP = 255,54 – 5,733 · L*, przy czym R = -0,59, R2 = 0,35739, SEE = 0,10; (1)
AADPPH• = 110,86 – 1,6732 · L*, przy czym R = -0,5738, R2 = 0,329, SEE = 0,11; (2)
AAABTS+ =105,27 – 2,0132 · L*, przy czym R = -0,52, R2 = 0,27, SEE = 0,12. (3)
We wszystkich trzech przypadkach uzyskano współczynniki regresji różne od zera, co oznacza istotny związek pomiędzy analizowanymi parametrami. Jednakże niskie wartości skorygowanego współczynnika determinacji (R2) wskazują na słabe
dopasowanie modelu do danych. Na podstawie wartości R2 można stwierdzić, że jasność miodów jedynie w około 30% odpowiada za ich właściwości przeciw-utleniające, natomiast za pozostałe 70% odpowiadają inne, nieuwzględnione w tym modelu czynniki. Uzyskane równania regresji nie mogą służyć więc do przewidy-wania wartości TP, AADPPH• i AAABTS+ na podstawie jasności barwy.
W związku z tym, że również pozostałe parametry barwy (a*, b*) mają istotny wpływ na aktywność antyoksydacyjną, przeprowadzono analizę regresji prostoli-niowej z kilkoma zmiennymi niezależnymi. Uzyskano następujące równania:
TP = 129,97 + 7,69 · a* – 4,55 · b*, przy czym R = 0,63, R2 = 0,39; (4)
AADPPH• = 102,34 – 1,79 · L* + 2,08 · a* + 0,75 · b*, przy czym R = 0,64, R2 = 0,41; (5)
AAABTS+= 36,83 + 6,01 · a*, przy czym R = 0,55, R2 = 0,31. (6)
Przedstawione powyżej modele zawierają jedynie te zmienne niezależne, któ-re w wyniku analizy okazały się być istotne statystycznie (przy p < 0,05). Uzyska-ne umiarkowaUzyska-ne wartości współczynników determinacji (około 0,4) oznaczają, że również te modele wyjaśniają mniej niż połowę zaobserwowanego związku po-między wszystkimi parametrami barwy a aktywnością antyoksydacyjną. Wynika stąd, że wartości parametrów barwy nie mogą służyć do przewidywania wartości TP, AADPPH• i AAABTS+.
PODSUMOWANIE I WNIOSKI
1. Przeprowadzona analiza wykazała istnienie silnej zależności pomiędzy parame-trami barwy a działaniem przeciwutleniającym miodów pszczelich.
2. Pomimo wysokiego stopnia skorelowania, wartości parametrów barwy i aktyw-ności antyoksydacyjnej nie udało się określić wystarczająco dokładnego liniowego związku pomiędzy tymi zmiennymi. Ze względu na niski stopień dopasowania uzyskane równania regresji liniowej nie mogą służyć do przewidywania wartości TP, AADPPH• i AAABTS+ na podstawie wartości parametrów barwy.
LITERATURA
1. Aljadi A.M., Kamaruddin M.Y., Evaluation of the phenolic contents and antioxidants capacity of two Malaysian floral honeys, Food Chem., 2004, 85, s. 513–518.
2. Al-Mamary M., Al-Meeri A., Al-Habori M., Antioxidant activities and total phenolics of different types of honey, Nutr. Res., 2002, 22, s. 1041–1047.
3. Bertoncelj J., Doberšek U., Jamnik M., Golob T., Evaluation of the phenolic content, antioxidant activity and colour of Slovenian honey, Food Chem., 2007, 105, s. 822–828.
4. Blasa M., Candiracci M., Accorosi A., Piacentini M.P. et al., Raw Millefiori honey is packed full of antioxidants, Food Chem., 2006, 97, s. 217–222.
5. Brudzynski K., Miotto D., The relationship between the Maillard reaction-like products and bioactivity of Canadian honeys, Food Chem., 2011, 124, s. 869–874.
6. Gheldof N., Engeseth N.J., Antioxidant capacity of honeys from various floral sources based on the determination of oxygen radical absorbance capacity and inhibition of in vitro lipoprotein oxidation in human serum samples, J. Agric. Food Chem., 2002, 50, s. 3050–3055.
7. Gheldof N., Wang X.H., Engeseth N.J., Identification and quantification of antioxidant components of honeys from various floral sources, J. Agric. Food Chem., 2002, 50(21), s. 5870–5877. 8. Küçük M., Kolayli S., Karaoğlu S., Ulusoy E. et al., Biological activities and chemical composition of
three honeys of different types from Anatolia, Food Chem., 2007, 100, s. 526–534.
9. Lachman J., Orsák M., Hejtmánkowá A., Kovářová E., Evaluation of antioxidant activity and total phenolics of selected Czech honeys, LWT, 2010, 43, s. 52–58.
10. Meda A., Lamien C.E., Romito M., Millogo J., Nacoulma O.G., Determination of the total phenolic, flavonoid and proline contents in Burkina Fasa honeys as well as their radical scavenging activity, Food Chem., 2005, 91, s. 571–577.
11. Meissner W., Metody statystyczne w biologii, Wyd. UG, Gdańsk 2010.
12. Weston R.J., The contribution of catalase and other natural products to the antibacterial activity of honey: a review, Food Chem., 2000, 71, s. 235–239.
13. Wilczyńska A., Zmiany barwy, aktywności antyoksydacyjnej oraz zawartości HMF w miodach pszczelich zachodzące pod wpływem ogrzewania, Prace i Materiały Wydz. Zarządzania UG, 2010, 2/2, s. 291–298.
14. Wilczyńska A., Zmiany barwy oraz aktywności antyoksydacyjnej miodów podczas przechowywa-nia, Bromatologia i Chemia Toksykologiczna, 2011, XLIV, 3, s. 945–950.
15. Wilczyńska A., Przybyłowski P., Colour, phenolics content and antioxidant activity of Polish honeys, Zeszyty Naukowe UE w Poznaniu, 2010, 158, s. 7–14.
16. Zalibera M., Staško A., Šlebodowa A., Jančovičowá V. et al., Antioxidant and radical-scavenging activities of Slovak honeys – an electron paramagnetic resonance study, Food Chem., 2008, 110, s. 512–521.
AN ATTEMPT TO USE LINEAR REGRESSION TO DETERMINE THE RELATIONSHIP BETWEEN COLOR
AND ANTIOXIDANT PROPERTIES OF HONEY Summary
Numerous studies on the antioxidant activity of honey indicate that dark honey has a much higher antioxidant activity than pale honey. The aim of this study was to determine the relationship between color and antioxidant activity of honey by linear regression. It has been shown that there is a strong correlation between the parameters of color and antioxidant properties of honey, but despite the high degree of correlation the linear relationship between these variables could not be determined with sufficient accuracy.
