DONIESIENIE ZJAZDOWE
FORUM ZAKAŻEŃ 2016;7(5):385–388 © Evereth Publishing, 2016
KATARZYNA GALANT1 | STEFANIA GIEDRYS-KALEMBA2 | ALEKSANDRA JOHANIUK2 | PAULINA ROSZKOWSKA3 |
JOANNA JURSA-KULESZA4
CZĘSTOŚĆ WYSTĘPOWANIA GENÓW ZWIĄZANYCH ZE ZDOLNOŚCIĄ
DO TWORZENIA BIOFILMU WŚRÓD METYCYLINOWRAŻLIWYCH
I METYCYLINOOPORNYCH SZCZEPÓW
STAPHYLOCOCCUS AUREUS
IZOLOWANYCH Z ZAPALEŃ KOŚCI
OCCURENCE OF FACTORS ASSOCIATED WITH ABILITY TO BIOFILM FORMATION AMONG METHICILLIN-
-SENSITIVE AND METHICILLIN-RESISTANT
STAPHYLOCOCCUS AUREUS STRAINS ISOLATED FROM PATIENTS
WITH BONE INFECTIONS
STRESZCZENIE: Celem badań była analiza częstości występowania genów kodujących biał-ka związane z adhezją i tworzeniem biofilmu wśród 250 szczepów Staphylococcus aureus po-chodzących od chorych na przewlekłe zapalenie kości i szpiku. Identyfikacji genów kodujących białka wiążące: sialoproteinę (bbp), elastynę (ebpS), lamininę (eno), fibronektynę A i B
(fnbA-/B), clumping factor (clfA(fnbA-/B), fibrynogen (fib), białko plazminowrażliwe (pls), kolagen (cna) oraz
białka macierzy zewnątrzkomórkowej (emp) dokonano przy użyciu metody Single i Multipleks PCR. Wśród szczepów MRSA istotnie statystycznie częściej stwierdzono geny kodujące fibro-nektynę B, lamininę oraz sialoproteinę, a wśród szczepów MSSA – geny kodujące czynnik zlep-ny B, elastynę i fibrynogen. Tylko szczepy MSSA wykazały obecność genu kodującego fibronek-tynę A. Żaden szczep nie posiadał genu kodującego białko Pls. Zaobserwowano 67 kombinacji genów, 60 wśród szczepów MSSA, 22 wśród MRSA. Na podstawie przeprowadzonych badań stwierdzono, że analizowane szczepy MSSA i MRSA wykazują ogromne zróżnicowanie w za-kresie występowania genów kodujących czynniki wirulencji związane ze zdolnością do adhezji i tworzenia biofilmu, co nie pozwoliło na wyróżnienie profilu genetycznego charakterystycz-nego dla szczepów S. aureus izolowanych z przewlekłych zapaleń kości.
SŁOWA KLUCZOWE: biofilm, Staphylococcus aureus, zapalenia kości
ABSTRACT: The aim of the study was to analyze the occurrence genes encoding proteins re-sponsible for adhesion and biofilm formation among 250 S. aureus strains isolated from pa-tients with chronic bone infections. For identification of genes encoding bone sialoprotein
(bbp), elastin (ebpS), laminin (eno), fibronectin binding protein A and B (fnbA/B), clumping
fac-tor A and B (clf A/B), fibrinogen (fib), plasmin-sensitive protein (pls) collagen binding protein
(cna) and extracellular matrix protein (emp) Single and Multiplex PCR were performed.
Signi-ficantly more frequent were detected genes encoding fibronectin B, laminin and bone sialo-protein among MRSA and genes encoding clumping factor B, elastin and fibrinogen among MSSA. The genes encoding fibronectin A were presented only in MSSA strains. Genes for pro-tein Pls were not found in studied strains. 67 gene combinations were observed, 60 among MSSA and 22 among MRSA strains. In conclusion, analyzed S. strains, both MSSA and MRSA, have showed a large diversity in the occurrence of genes responsible for adhesin and biofilm formation. The characteristic genetic profile for S. aureus strains isolated from chronic bone in-fections was not found.
KEY WORDS: biofilm, bone infections, Staphylococcus aureus
1 Zakład Medycyny Laboratoryjnej Katedry Mikrobiologii, Immunologii i Medycyny Laboratoryjnej Pomorskiego Uniwersytetu Medycznego w Szczecinie 2 ALAB Laboratoria Sp. z o.o.
3 Zakład Diagnostyki Immunologicznej Katedry Mikrobiologii, Immunologii i Medycyny Laboratoryjnej Pomorskiego Uniwersytetu Medycznego w Szczecinie 4 Zakład Mikrobiologii Lekarskiej Katedry Mikrobiologii, Immunologii i Medycyny Laboratoryjnej Pomorskiego Uniwersytetu Medycznego w Szczecinie
} KATARZYNA GALANT
Zakład Medycyny Laboratoryjnej, Katedra Mikrobiologii, Immunologii i Medycyny Laboratoryjnej, Pomorski Uniwersytet Medyczny, al. Powstańców Wlkp. 72, 70-111 Szczecin, Tel.: (91) 466 16 69,
e-mail: kasieg231@wp.pl Wpłynęło: 17.10.2016 Zaakceptowano: 21.10.2016 DOI: dx.doi.org/10.15374/FZ2016065
Artykuá jest dostĊpny na zasadzie dozwolonego uĪytku osobistego. Dalsze rozpowszechnianie (w tym umieszczanie w sieci) jest zabronione i stanowi powaĪne naruszenie przepisów prawa autorskiego
386 © Evereth Publishing, 2016
FORUM ZAKAŻEŃ 2016;7(5)
WSTĘP
Staphylococcus aureus należy do częstych czynników
etiologicznych różnych zakażeń szpitalnych i pozaszpital-nych. Wywołuje ropne zakażenia skóry i tkanek podskór-nych, zakażenia narządowe, bakteriemie i sepsy, choroby wywołane toksynami gronkowcowymi, a także zatrucia po-karmowe. Jest to najczęstszy patogen powodujący zapalenie kości i szpiku. Szczepy S. aureus wykazują duże zróżnicowa-nie w zakresie produkcji czynników zjadliwości, co decydu-je o wystąpieniu określonych objawów lub co decydu-jednostki choro-bowej. Pomimo licznych badań dotyczących występowania czynników wirulencji u gronkowców, patomechanizm zaka-żeń gronkowcowych, w tym zapalenia kości, wciąż nie jest w pełni wyjaśniony.
Udział S. aureus w patogenezie zapalenia kości wyni-ka m.in. ze zdolności patogenu do produkcji różnych czyn-ników adhezyjnych oraz z budowy komórki bakteryjnej. Zdolność adhezji szczepów S. aureus do tkanek gospodarza, a następnie tworzenia biofilmu, powoduje grupa białek po-wierzchniowych określanych jako MSCRAMMs (ang. mi-crobial surface components recognizing adhesive matrix molecules), wiążących się z białkami macierzy zewnątrzko-mórkowej – ECM (ang. extracellular matrix). Jedną ze skła-dowych ECM jest fibronektyna, posiadająca odrębne do-meny wiążące się zarówno z ligandami, którymi są recep-tory powierzchniowe na komórkach gronkowca, jak i inny-mi składowyi inny-mi ECM (np. kolagen, fibrynogen, heparyna).
S. aureus posiada dwa białka wiążące fibronektynę
określa-ne jako: FnBPA i FnBPb (ang. fibrookreśla-nectin-binding protein). Są one niezbędne w procesie inwazji bakterii w obrębie oste-oblastów i stanowią jeden z czynników wirulencji gronkow-ców wywołujących zapalenia kości [1].
Do białek powierzchniowych kowalencyjnie zakotwiczo-nych w peptydoglikanie należą m.in. clfA i clf B (ang. clum-ping factor). Wykazują one ekspresję in vitro tylko w fazie wzrostu logarytmicznego bakterii, a ich głównym zadaniem jest unieruchamianie i zapoczątkowanie zlepiania przez
bakterie rozpuszczalnego fibrynogenu. Posiadają także spe-cyficzne receptory dla fibrynogenu i fibronektyny, jak rów-nież dla sialoprotein i kolagenu.
Białka adhezyjne wiążące kolagen – cna (ang. colla-gen binding protein) mogą być także związane z zapale-niem kości. Jednak nie wszystkie szczepy S. aureus powo-dujące zapalenia kości posiadają zdolność wiązania kolage-nu, co wskazuje, iż obecność tych genów nie jest niezbędna do wystąpienia tego rodzaju zakażenia.
Innymi składowymi matrycy MSCRAMMs są białka wiążące elastynę – ebpS (ang. elastin binding protein), la-minę – eno (ang. laminin binding protein), fibrynogen – fib (ang. fibrinogen binding protein) oraz sialoproteinę – bbp (ang. sialoprotein binding protein). Ekspresja genów ko-dujących te białka jest szczególnie intensywna w początko-wych etapach tworzenia biofilmu. Do białek adhezyjnych należą także białka określane jako plazminowrażliwe – pls (ang. plasmin-sensitive), których geny kodujące znajdują się w regionie mec DNA i występują zwykle wśród szczepów metycylinoopornych oraz tzw. białka emp (ang extracellu-lar matrix protein-binding protein) wpływające na adhezję bakterii do fibrynogenu i fibryny [2–4].
Celem badań było porównanie częstości występowania genów kodujących adhezyny wśród metycylinowrażliwych (MSSA) i metycylinoopornych (MRSA) szczepów izolowa-nych z zapaleń kości.
MATERIAŁ I METODY
Do badań wykorzystano 250 szczepów S. aureus, w tym 218 MSSA i 32 MRSA, które zostały wyizolowane od chorych na przewlekłe zapalenie kości i szpiku w latach 2000–2010. Geny kodujące adhezyny wykrywano metodą Single i Mul-tipleks PCR. Zidentyfikowano następujące geny: bbp – biał-ko wiążące sialoproteinę, ebpS – białko wiążące elastynę, eno – białko wiążące lamininę, fnb A/B – białko wiążące fibro-nektynę, clf A/B – białko wiążące clumping factor A i B, fib
Gen Liczba (%) szczepów n=250
Liczba (%) szczepów MRSA n=32
Liczba (%) szczepów MSSA n=218 bbp 31 (12,4) 9 (28,1) * 22 (10,1) clfA 191 (76,4) 22 (68,8) 169 (77,5) clfB 144 (57,6) 13 (40,6) 131 (60,1)* cna 41 (16,4) 6 (18,8) 35 (16,1) ebpS 66 (26,4) 2 (6,3) 64 (29,4)* eno 130 (52,0) 22 (68,8)* 108 (49,5) emp 106 (42,4) 18 (56,3) 88 (40,4) fib 72 (28,8) 3 (9,4) 69 (31,7)* fnbA 21 (8,4) 0 21 (9,6) fnbB 75 (30,0) 15 (46,9 ) * 60 (27,5) pls 0 0 0
Tabela 1. Występowanie genów kodujących adhezyny wśród szczepów MRSA i MSSA izolo-wanych od pacjentów z zapaleniem kości.
* – różnice istotne statystycznie; p≤0,05.
Artykuá jest dostĊpny na zasadzie dozwolonego uĪytku osobistego. Dalsze rozpowszechnianie (w tym umieszczanie w sieci) jest zabronione i stanowi powaĪne naruszenie przepisów prawa autorskiego
387 © Evereth Publishing, 2016 FORUM ZAKAŻEŃ 2016;7(5) Genotypy Liczba (%) szczepów n=250 Liczba (%) szczepów MRSA n=32 Liczba (%) szczepów MSSA n=218
fnbB clfA/clfB eno fib ebpS emp
4 (1,6) – 4 (1,8) fnbB clfA eno bbp ebpS emp 4 (1,6) 2 (6,2) 2 (0,8) fnbA clfA/B eno fib ebpS 2 (0,8) – 2 (0,8) clfA/B eno bbp ebpS emp 7 (2,8) 1 (3,1) 6 (2,8) clfA/B eno ebpS cna emp 1 (0,4) – 1 (0,4) fnbB clfA/B bbp eno emp 3 (1,2) 1 (3,1) 2 (0,8) clfA/B bbp eno emp 1 (0,4) 1 (3,1) – fnbB clfA/B bbp eno 1 (0,4) 1 (3,1) – clfA/B bbp fib emp 1 (0,4) – 1 (0,4) fnbB clfA/B cna emp 1 (0,4) – 1 (0,4) clfA/B eno cna emp 2 (0,8) 1 (3,1) 1 (0,4) fnbB clfA/B eno emp 1 (0,4) – 1 (0,4) clfA/B eno emp ebpS 2 (0,8) – 2 (0,8) clfA/B ebpS can emp 2 (0,8) – 2 (0,8) clfA/B ebpS eno cna 2 (0,8) – 2 (0,8) clfA/B fib cna emp 3 (1,2) 1 (3,1) 2 (0,8) fnbB clfA eno fib emp 2 (0,8) – 2 (0,8) clfA/B fib eno ebpS 10 (4,0) – 10 (4,6) fnbA clfA/B eno fib 2 (0,8) – 2 (0,8) clfA/B eno fib emp 5 (2,0) 1 (3,1) 4 (1,8) fnbB bbp eno emp 1 (0,4) – 1 (0,4) clfA/B bbp emp 1 (0,4) – 1 (0,4) clfA/B bbp fib 1 (0,4) – 1 (0,4) fnbB clfA bbp eno 1 (0,4) 1 (3,1) – fnb B clfA/B eno 4(1,6) – 4 (1,8) fnbB clfA eno fib 1 (0,4) – 1 (0,4) clfA eno ebpS emp 1 (0,4) – 1 (0,4) fnbB clfA/B eno 2 (0,8) 2 (6,2) 2 (0,8) fnbB clfA eno emp 4 (1,6) 1 (3,1) 3 (1,4) clfA/B eno emp 4 (1,6) – 4 (1,8) fnbB clfA/B emp 6 (2,4) 2 (6,2) 5 (2,3) fnbB clfA/B cna 1 (0,4) 2 (6,2) 1 (0,4) fnbB clfA/B 4 (1,6) – 4 (1,8) clfA/B cna 1 (0,4) – 1 (0,4) Genotypy Liczba (%) szczepów n=250 Liczba (%) szczepów MRSA n=32 Liczba (%) szczepów MSSA n=218 fnbB clfA emp 2 (0,8) – 2 (0,8) clfA/B emp 5 (2,0) – 5 (2,3) fnbB clfA eno 6 (2,4) 1 (3,1) 5 (2,3) clfA/B eno 6 (2,4) – 6 (2,8) clf A eno emp 3 (1,2) 3 (9,4) – fnbB eno emp 2 (0,8) 1 (3,1) 1 (0,4) clfA/B ebpS 2 (0,8) – 2 (0,8)
clfA eno ebpS 2 (0,8) – 2 (0,8)
fnbA eno ebpS 1 (0,4) – 1 (0,4)
eno cna ebpS 1 (0,4) – 1 (0,4)
clfA/B fib 6 (2,4) – 6 (2,8)
clfA fib emp 2 (0,8) – 2 (0,8)
clfA bbp emp 1 (0,4) 1 (3,1) – clfA/B bbp 1 (0,4) – 1 (0,4) bbp eno emp 1 (0,4) 1 (3,1) – eno fib 3 (1,2) – 3 (1,4) fib emp 1 (0,4) 1 (0,4) clfA eno 2 (0,8) 1 (3,1) 1 (0,4) eno cna 2 (0,8) 2 (6,2) 1 (0,4) fnbB eno 6 (2,4) – 6 (2,8) clfA/B 13 (5,2) – 13 (5,9) fnb clfA 5 (2,0) – 5 (2,3) fnbB cna 1 (0,4) 1 (3,1) – clfA 42(16,8) 1 (3,1) 41 (18,9) clfB 20 (8,0) – 20 (9,2) cna 2 (0,8) – 2 (0,8) bbp 1 (0,4) – 1 (0,4) ebpS 7 (2,8) – 7 (3,2) eno 18 (7,2) – 18 (8,3) emp 14 (5,6) 1(3,1) 13 (6,) fib 9 (3,6) – 9 (4,1) fnbA 1 (0,4) – 1 (0,4) fnBb 10 (4,0) – 10 (4,6) Liczba (%) szcze-pów n=250
Liczba (%) szczepów MRSA n=32 Liczba (%) szczepów MSSA n=218
Liczba genotypów (średnio na liczbę szczepów) 67 (3,7) 22 (1,4) 60 (3,6)
Tabela 2. Występowanie kombinacji genów kodujących adhezyny wśród szczepów MRSA i MSSA izolowanych z zapaleń kości.
– białko wiążące fibrynogen, pls – białko plasminowrażliwe,
cna – białko wiążące kolagen, emp – wiążące białka
macie-rzy zewnątrzkomórkowej.
Do oceny różnic istotnych statystycznie zastosowano, w zależności od liczby przypadków, test niezależności χ2 lub
test niezależności χ2 z poprawką Yatesa. Weryfikację
hipo-tez statystycznych przeprowadzono na poziomie istotności
p≤0,05.
WYNIKI
Wszystkie badane szczepy S. aureus, zarówno MSSA, jak i MRSA, wykazywały obecność przynajmniej jednego genu kodującego białka adhezyjne związane ze zdolnością tworze-nia biofilmu. W obu grupach szczepów najczęściej występu-jącym był gen kodujący czynnik zlepny A (MSSA – 77,5%, MRSA – 68,8%), kolejnymi: wśród szczepów MSSA geny Artykuá jest dostĊpny na zasadzie dozwolonego uĪytku osobistego. Dalsze rozpowszechnianie
(w tym umieszczanie w sieci) jest zabronione i stanowi powaĪne naruszenie przepisów prawa autorskiego oraz grozi sankcjami prawnymi.
388 © Evereth Publishing, 2016
FORUM ZAKAŻEŃ 2016;7(5)
kodujące czynnik zlepny B (60,1%) i białko wiążące lamini-nę (49,5%), natomiast wśród szczepów MRSA geny kodują-ce białko wiążąkodują-ce lamininę (68,8%) i białka macierzy zewną-trzkomórkowej (56,3%).
Wśród szczepów MRSA istotnie statystycznie częściej stwierdzono obecność genów kodujących lamininę (MRSA – 68,8% vs. MSSA – 49,5%), fibronektynę B (MRSA – 46,9%
vs. MSSA – 27,5%) oraz sialoproteinę (MRSA – 28,1% vs.
MSSA – 10,1%). Wśród szczepów MSSA istotne różnice sta-tystyczne odnotowano dla genów kodujących czynnik
zlep-ny B (MRSA – 40,6% vs. MSSA – 60,1%), elastynę (MRSA
– 6,3% vs. MSSA – 29,4%) oraz fibrynogen (MRSA – 9,4%
vs. MSSA – 31,7%). Gen kodujący fibronektynę
A posiada-ły tylko szczepy MSSA. Żaden szczep nie wykazał obecno-ści genu kodującego białko plazminowrażliwe. Szczegółowe wyniki przedstawiono w Tabeli 1 i Tabeli 2.
Geny kodujące białka adhezyjne występowały w różnych kombinacjach, obejmujących 1–7 genów. Łącznie zaobser-wowano 67 genotypów, 60 wśród szczepów MSSA (średnio jeden na 3,6 szczepów), 22 wśród szczepów MRSA (średnio jeden na 1,4 szczepów). Wśród szczepów MSSA najczęściej stwierdzono genotyp clf (18,9% szczepów), wśród szczepów MRSA genotyp clfA eno emp (9,4%).
OMÓWIENIE
Adhezyny, czyli białka ułatwiające adhezję komórek bak-teryjnych do tkanek gospodarza oraz wiązanie z białka-mi macierzy zewnątrzkomórkowej, odgrywają istotną rolę w chorobotwórczości szczepów S. aureus. Są one prawdo-podobnie najistotniejszymi czynnikami odpowiadający-mi za powstawanie bakteryjnego biofilmu. Jednakże rze-czywisty udział tych białek w patogenezie zakażenia gron-kowcowego przebiegającego w układzie kostno-stawowym wciąż pozostaje nieznany. Badania własne wykazały ogrom-ne zróżnicowanie w zakresie produkcji genów kodujących
adhezyny wśród szczepów S. aureus, zarówno MRSA, jak
i MSSA, izolowanych z przewlekłych zapaleń kości i szpiku. W obu grupach szczepów obserwowano występowanie wie-lu różnych kombinacji genów, co nie pozwoliło na wyróż-nienie profilu genetycznego charakterystycznego dla szcze-pów S. aureus izolowanych z zapaleń kości, a tym samym
na wskazanie dominujących adhezyjnych czynników wiru-lencji związanych patomechanizmem gronkowcowego za-palenia kości. Istnieje zatem potrzeba prowadzenia dalszych badań w tym zakresie.
WNIOSKI
Szczepy S. aureus, zarówno MSSA, jak i MRSA, izolowa-ne z przewlekłych zapaleń kości i szpiku wykazują ogrom-ne zróżnicowanie w zakresie produkcji adhezyjnych czynni-ków wirulencji biorących udział w tworzeniu biofilmu.
Najczęściej stwierdzano geny kodujące czynnik zlepny A i B oraz białka wiążące lamininę i białka macierzy zewną-trzkomórkowej. Geny kodujące białko wiążące fibronektynę A występowały tylko wśród szczepów MSSA, żaden szczep nie wykazał obecności genu kodującego białko plazminow-rażliwe.
Występowanie genów kodujących białka adhezyjne w wielu różnych kombinacjach nie pozwoliło na wyróżnie-nie profilu genetycznego charakterystycznego dla szczepów
S. aureus izolowanych z przewlekłych zapaleń kości i szpiku.
Nie wykazano wyraźnej korelacji pomiędzy opornością na metycylinę a występowaniem wybranych czynników wi-rulencji związanych ze zdolnością szczepu do adhezji i two-rzenia biofilmu.
KONFLIKT INTERESÓW: nie zgłoszono.
PIŚMIENNICTWO
1. Arciola CR, Campoccia D, Gamberini S, Baldassarri L, Montanaro L. Prevalen-ce of cna, fnbA and fnbB adhesion genes among Staphylococcus aureus isola-tes from orthopedic infections associated to different types of implant. FEMS Microbiol Lett 2005;246(1):81– 86.
2. Kurlenda J, Grinholc M, Wegrzyn G. Presence of cna, emp and pls genes and pathogenicity of methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains. World J Microbiol Biotechnol 2008;24(4):591– 594.
3. Walsh E.J, O’Brien LM, Liang X, Hook M, Foster TJ. Clumping factor B, a fibri-nogen-binding MSCRAMM (microbial surface components recognizing ad-hesive matrix molecules) adhesin of Staphylococcus aureus, also binds to the tail region of type I cytokeratin 10. J Biol Chem 2004;379(49):50691– 50699. 4. Kalinka J, Hachmeister M, Geraci J et al. Staphylococcus aureus isolates from
chronic osteomyelitis are characterized by high host cell invasion and in-tracellular adaptation, but still induce inflammation. Int J Med Microbiol 2014;304(8):1038– 1049.
Artykuá jest dostĊpny na zasadzie dozwolonego uĪytku osobistego. Dalsze rozpowszechnianie (w tym umieszczanie w sieci) jest zabronione i stanowi powaĪne naruszenie przepisów prawa autorskiego
