L U C Y N A G RĘBEC K A
Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego PAN Warszawa
M IG R A C JA K O M Ó R E K T K A N K O W Y C H C Z Y N N IK I O G R A N IC Z A JĄ C E I PO B U D ZA JĄ C E
Pierwsze opisy ruchu ameboidalnego, pochodzące jeszcze z ubiegłego wieku, oparte były na obserwacjach dużych, swobodnie żyjących ameb, takich jak
Chaos chaos, Amoeba proteus. Obecnie większość danych dotyczących tego
ruchu, a przede wszystkim jego podstaw molekularnych pochodzi z badań prowadzonych nad ruchliwymi kom órkam i tkankowymi. F akt ten staje się zrozumiały, gdy uświadomimy sobie, że są to między innymi:
1) istotne w morfogenezie i rozwoju embrionalnym kom órki zarodka, 2) odpowiedzialne za swoiste i nieswoiste reakcje odpornościowe organizmu takie kom órki jak: limfocyty, granulocyty czy m akrofagi,
3) biorące udział w gojeniu ran fibroblasty i kom órki epitelialne, 4) inwazyjne i m etastatyczne kom órki nowotworowe,
a także wiele innych kom órek wędrujących w obrębie organizm u stale, bądź tylko w pewnych okresach swego cyklu życiowego, jak erytrocyty lub kom órki nerwowe. Czy jednak ruch swobodnie żyjących ameb i migrujących w organiz mie kom órek tkankow ych jest tym samym? Przy założeniu, że jest to sposób przemieszczania się drogą kolejnych deformacji ciała, odpowiedź będzie brzm ia ła — tak. O ba bowiem rodzaje kom órek migrują wytwarzając nibynóżki — przejściowe struktury lokom otoryczne różnych kształtów, od wydłużonych filopodiów poczynając, a na szeroko rozlanych lam melipodiach kończąc. Uściślając definicję ruchu ameboidalnego możemy też powiedzieć, że kom órka poruszająca się w ten sposób musi spełniać trzy warunki: 1 — przylegać do podłoża, 2 — być spolaryzowana i 3 — wytwarzać siłę m otoryczną. Do zapewnienia efektywnej lokomocji konieczne są także odpowiednie ilościowe stosunki pomiędzy tymi param etram i. Od nich zależy czy kom órka porusza się szybko i w określonym kierunku, czy też chaotycznie ślizga się po podłożu — lub przeciwnie, zbyt silnie z nim związana nie może poruszyć się z miejsca.
Okazało się, że obie grupy ruchliwych kom órek — tkankow e i swobodnie żyjące spełniają trzy wymienione warunki. Stwierdzono jednak także, że mogą je realizować przy pom ocy różnych mechanizmów m olekularnych. N a przykład, polaryzacja jest w kom órce podtrzym ywana bądź przez układ m ikrotubuli, w przypadku kom órek tkankow ych, bądź z pom ocą jądra, co praw dopodobnie występuje u swobodnie żyjących Amoeba proteus. Musimy sobie jednak zdać
sprawę z tego, że podobnego rzędu różnice m ogą wystąpić również w obrębie tej samej grupy komórek.
W ędrów ka kom órek w organizmie jest zjawiskiem złożonym. K ontrolują ją zarów no czynniki urucham iające i zatrzym ujące kom órkę, jak i czynniki sterujące odpowiedzialne za wyznaczanie kierunku migracji. Ruchliwość kom ó rek tkankow ych m ogą ograniczać połączenia m iędzykomórkowe. Połączenia te zespalają kom órki, stanow ią więc przeszkodę w ich swobodnej, indywidualnej migracji.
PO ŁĄ C ZEN IA M IĘ D Z Y K O M Ó R K O W E
Najmniej skomplikowane połączenia m iędzykomórkowe polegają na tym, że łączą się ze sobą pojedyncze cząsteczki białek z powierzchni dwóch przylegają cych kom órek. Cząsteczki takie noszą nazwę białek adhezji międzykomórkowej (Cell Adhesion Molecules, CAMs). G dy cząsteczki wiążące sąsiednie kom órki są takie same, wiązanie nosi nazwę homofilowego. Ten typ połączeń pojawia się bardzo wcześnie, np. w zarodku mysim już po pierwszym podziale, w stadium dwóch blastomerów ( F l e m i n g i J o h n s o n 1988). W ystępuje tam uw om oru- lina, powszechnie identyfikow ana z E-kadheryną. G rupa kadheryn należy do tych białek adhezji m iędzykomórkowej, których działanie związane jest z obec nością C a2+ w środkowisku (T i n g s t r o m i in. 1990).
E-kadheryna zbudow ana jest z długiego łańcucha polipeptydowego przebija jącego błonę kom órki. Fragm ent zewnętrzny tego łańcucha składa się z 6 pętli; po usunięciu ze środowiska jonów wapniowych ulegają one zwinięciu, stając się wrażliwe na błonowe enzymy proteolityczne (rys. 1). W tedy utw orzone przez dwie cząsteczki E-kadheryny wiązanie homofilowe między sąsiadującymi kom ó rkam i (rys. 2) ulega rozerwaniu (T a k e i c h i 1990).
Rys. 1. Połączenie dwóch cząsteczek E-kadheryny. C i N — zakończenia cząsteczki, M — błona kom órkowa, C a2+ — jony w apnia w środowisku. Z akropkow ano wnętrze kom órki
W następnej kolejności pojawiają się połączenia złożone, składające się z większej liczby cząsteczek. Należą do nich m.in. połączenia szczelinowe (gap junction); są to miejsca w których pomiędzy sąsiadującymi kom órkam i zachodzi wymiana m etabolitów i jonów. Połączenia szczelinowe zbudowane są z kanałów (koneksonów), z których każdy utw orzony jest z sześciu integralnych białek błonowych — koneksyn. Koneksyny m ają bezpośredni wpływ na
funkc-Rys. 2. Schemat połączeń homofilowych: N-, E- i P-kadheryny
jonow anie połączeń szczelinowych. Zew nątrzkom órkow e i błonowe domeny białek z rodziny koneksyn są homologiczne. Różnice strukturalne między nimi obserwuje się w regionach cytoplazmatycznych. Średnica koneksonu wynosi 1,5 nm; przez te połączenia m ogą więc przechodzić cząsteczki do 1500 daltonów — cukry, aminokwasy, nukleotydy i witaminy, ale już nie takie makrocząsteczki jak białka, cukry złożone czy kwasy nukleinowe. Zależnie od stanu kom órki, kanały m ogą być otwarte, lub przez spiralny obrót koneksyn m ogą ulec zamknięciu (rys. 3).
Rys. 3. Schemat połączenia szczelinowego. A — konekson otw arty, B — konekson zamknięty
W kolejnych stadiach rozwoju zarodka pojawiają się następne złożone połączenia m iędzykomórkowe, jak połączenia zamykające (tight junction) i desmosomy. Nie zostaną one tu jednak dokładnie omówione, ponieważ nie wiążą się bezpośrednio z tem atyką tego artykułu.
Przypuszczenie, że połączenia m iędzykomórkowe ograniczają migrację zwią zanych nimi kom órek wydaje się całkowicie uzasadnione. M ożna to jednak
udowodnić pokazując, że rozerwanie tych połączeń zapoczątkow uje m igra cję.
C Z Y N N IK I U M O Ż L IW IA JĄ C E M IG R A C JĘ K O M Ó R E K
Z A N IK PO ŁĄ C ZEŃ M IĘ D Z Y K O M Ó R K O W Y C H
Zanik białek adhezji międzykomórkowej (CAM s)
Zjawisko zaniku połączeń międzykomórkowych, w związku z migracją kom órek, było badane m.in. przez J.P. T h i e r r y ’ e g o (1984), który zajmował się wędrówkam i kom órek w zarodkach. O kazało się, że L-CAM i N-CAM (białka adhezji międzykomórkowej, występujące w kom órkach grzebienia nerwowego zarodków kurzych) zanikały, gdy kom órki te rozpoczynały m igra cję. Kiedy kom órki zatrzymywały się i skupiały, stwierdzono w nich ponowne pojawienie się białek odpowiedzialnych za adhezję międzykomórkową.
W rozwijającym się zarodku myszy indukcja przejścia ruchliwych kom órek mezenchymalnych w zwarty układ epitelialny towarzyszyła powstawaniu kanali ków nefridialnych. Około 12 godzin po indukcji kom órki zaczynały przylegać do siebie, a na ich powierzchni pojawiała się uw om orulina (V e s t w e b e r i in. 1985).
Dowody istnienia zależności pomiędzy ruchliwością a indywidualizacją kom órek zawiera również praca Behrens i in. (1989) pokazująca, że prawidłowe kom órki nabłonkow e m ogą stać się inwazyjne po utracie adhezji m iędzykom ór kowej zależnej od uwomoruliny. A utorzy posługiwali się w doświadczeniach kom órkam i M D C K (M adin-D arby Canine Kidney — kom órki pochodzące z psiej nerki) rosnącymi w hodowli jednow arstw ow o i wykazującymi wszystkie cechy epitelium in vivo.
Te ściśle do siebie przylegające kom órki, pod wpływem przeciwciał skierowa nych przeciwko uwomorulinie, ulegały rozproszeniu i przybierały kształt migrujących fibroblastów. Zaczynały one również wykazywać własności in wazyjne, przenikając do trójwymiarowych żeli kolagenowych oraz w głąb tkanki serca zarodka kurzego. Podobnie zachowywały się kom órki M D C K transfor m owane wirusem M aloneya lub Harveya. W obu typach kom órek następowała utrata uwom oruliny, wywołana bądź tylko przeciwciałem, bądź tylko transfor m acją wirusową. Czynnikiem decydującym o inwazyjności kom órek wydaje się więc w tym przypadku zanik białka adhezji międzykomórkowej.
Badania M areela i in. (1990) potwierdzają przypuszczenie o udziale białek adhezyjnych w inwazyjności. W roku 1990, na zjeździe w Antwerpii po święconym ruchom kom órkow ym , M areel przedstawił hipotezę, która mówi, że inwazyjność kom órki wynika z równowagi pomiędzy ekspresją dwóch rodzajów genów: genów i + — kodujących białka odpowiedzialne za ujawnienie się
inwazyjnego fenotypu I +, oraz genów i“ odpowiedzialnych za nieinwazyjny fenotyp I”, przy czym pojawienie się fenotypu I" jest zjawiskiem oddzielnym, a nie prostym brakiem ekspresji genów i+ w kom órce. W edług M areela produktam i genów i+ i i” m ogą być między innymi białka wpływające na ruchliwość kom órek. Przy tym założeniu E-kadheryna, powodująca ograniczenie ruchliwo ści byłaby produktem genu z grupy i", a białka stymulujące ruchliwość, jak m otogenne cytokiny, byłyby kodow ane przez geny i+. M areel powoływał się na szereg doświadczeń potwierdzających słuszność jego hipotezy, przynajmniej w tej jej części, która dotyczy m anipulacji białkam i ograniczającymi ruchliwość kom órki — jak E-kadheryna. I tak stwierdzono, że przeciwciała przeciw E-kadherynie dodane do hodowli indukują pojawienie się inwazyjnego fenotypu w nieinwazyjnych uprzednio kom órkach M D C K . Co więcej, wprowadzenie do kom órek nie m ających E-kadheryny sekwencji D N A kodującej to białko prowadziło do pojawienia się go na błonie powierzchniowej kom órek i powstanie populacji nieinwazyjnej. Doświadczenia odw rotne, wprowadzenie do kom órek, w których E-kadheryna występuje, odwróconej sekwencji D N A kodującej to białko, wygaszało ekspresję E-kadheryny, a kom órki zaczynały migrować.
Doświadczenia te pokazują, że istnieje in vitro możliwość m anipulow ania inwazyjnością fenotypu przez genetyczne m anipulacje ekspresją E-kadheryny w kom órce ( V l e m i n c k x 1991). Okazało się, że podobne wyniki m ożna otrzym ać in vivo. Hom ogenne pod względem występowania E-kadheryny populacje kom órek w prow adzano iniekcyjnie do myszy pozbawionej grasicy. Tworzył się guz, dający przerzuty do węzłów chłonnych i płuc. Pojawieniu się inwazyjności towarzyszyło pojawienie się kom órek bez E-kadheryny, mimo, że wszystkie wszczepione uprzednio kom órki miały tę glikoproteinę. Co więcej, pobrane z organizm u heterogenne populacje kom órek m etastatycznych, po kilku pasażach w hodowli stawały się znowu hom ogenne i każda kom órka zawierała E-kadherynę. Praw dopodobnie więc inwazyjność może być wynikiem przejściowego tylko zaniku ekspresji genu kodującego w kom órce E-kadherynę.
Przytoczone wyniki znalazły potwierdzenie w badaniach klinicznych pacjen tów ze złośliwym now otw orem jelita grubego, u których stwierdzono w prze rzutach obecność kom órek pozbawionych E-kadheryny.
ZA N IK POŁĄCZEŃ SZC ZELIN O W Y C H
Jedną z podstawowych różnic pomiędzy kom órkam i prawidłowymi a now o tworowymi jest to, że te ostatnie same kontrolują wiele swoich czynności życiowych. Zmniejsza się więc ich potrzeba kon tak tu z innymi kom órkam i, które między innymi przekazują informacje regulujące różne procesy kom órkowe. M ożna więc uważać, że połączenia szczelinowe, pełniące właśnie takie funkcje „transportow e” , są w kom órkach nowotworowych zbędne. O kazało się jednak, że w niektórych now otw orach łagodnych pochodzenia epitelialnego połączenia te wciąż występują. D opiero uzłośliwienie now otw oru wiąże się z ich utratą.
N i c o 1 s o n (1988) badał występowanie połączeń szczelinowych w serii sklono wanych kom órek adenocarcinom a o różnych zdolnościach tworzenia prze rzutów do płuc i węzłów limfatycznych. Stosował w takich przypadkach powszechnie używaną m etodę „dye-transfer” , w której rozchodzący się pom ię dzy kom órkam i barw nik (lucifer yellow) wskazywał na obecność w nich połączeń szczelinowych N i c o 1 s o n stwierdził, że połączenia szczelinowe występowały w niem etastazujących kom órkach adenocarcinom a, ale brak ich było wśród kom órek o dużym stopniu uzłośliwienia.
Podobne wyniki znajdujemy w pracy V a n h a m m e i in. (1989). Autorzy transform ow ali kom órki nabłonkow e onkogenem H -ras 1, powodując cał kowitą utratę, lub przynajmniej znaczne zmniejszenie liczby połączeń szczelino wych. Otrzym any wynik wiązano ze zmianam i w fosforylacji białek budujących te połączenia.
Interpretacja ta znalazła potwierdzenie w pracy M u s i l i in. (1990) badających kom órki sarcom a S I80, które nie m ają połączeń szczelinowych, chociaż znajduje się w nich koneksyna — związek z grupy białek budujących te połączenia. Dopiero wprowadzenie do kom órki sekwencji D N A kodującej białko adhezji międzykomórkowej (L-CAM ) spowodowało pojawienie się połączeń szczelinowych. Obecność L-CAM umożliwiła fosforylację koneksyny 43, k tóra przechodząc w formę 43 P2 utworzyła połączenie. A utorzy przypusz czają więc, że nie m utacja w genie koneksyny, lecz brak adhezji m iędzykom ór kowej jest odpowiedzialny za fenotyp kom órek S 180. W ynika to również z ich poprzednich doświadczeń ( M u s i l i in. 1990) prowadzonych nad praw id łowymi kom órkam i soczewki oka zarodka kurzego. T kanka ta m a niezwykle dużo połączeń szczelinowych oraz białka adhezji międzykomórkowej. Okazało się, że kom órki soczewki syntetyzują koneksynę 43, która posttranslacyjnie ulega fosforylacji i dopiero wtedy uczestniczy w tworzeniu połączeń szczelino wych.
Bardzo podobne wyniki uzyskali J o n g e n i in. (1991), badając połączenia szczelinowe w kom órkach epidermalnych. Stwierdzili oni, że zależność wy stępowania połączeń szczelinowych w tych kom órkach od poziom u jonów Ca2 + w środowisku wynika z bezpośredniego wpływu białka adhezji m iędzykom ór kowej — E-kadheryny. Praw dopodobnie i tutaj jest to związane z posttranslacyj- ną fosforylacją koneksyny 43.
W yniki tych ostatnich prac wydają się szczególnie ciekawe. Pokazują one co może wyniknąć z krótkotrw ałego nawet wygaśnięcia ekspresji genu kodującego tylko jedną cząsteczkę w komórce. K om órka tracąca białko adhezji między komórkowej traci połączenia szczelinowe. W rezultacie zyskuje ona zdolności inwazyjne a równocześnie wyzwala się spod kontroli innych kom órek. Tego typu zmiany stanowić m ogą poważne zagrożenie dla organizmu.
C Z Y N N IK I STY M U L U JĄ C E M IG R A C JĘ C Z Y N N IK R O ZPR A SZA JĄ C Y „SC A TTE R F A C T O R ” (SF)
P R O D U K O W A N Y PR Z E Z FIBROBLASTY
Efekt działania tego czynnika na kom órki jest podobny do efektu działania czynników powodujących zanik białek adhezji międzykomórkowej. Czynnik rozpraszający został odkryty i opisany przez S t o k e r a i in. (1985). Zauważyli oni, że środowisko modyfikowane przez hodow ane w nim fibroblasty, dodane do hodowli kom órek nabłonkow ych powodow ało ich rozproszenie. W tes towanych koloniach obserwowano wzmożenie aktywności ruchowej powierz chni przylegających do siebie kom órek i stopniowe ich odsuwanie się, aż do całkowitego rozejścia. Dalsze badania prow adzone w tym kierunku pozwoliły na ustalenie, że działający czynnik jest białkiem, które produkują i wydzielają niektóre fibroblasty, a wrażliwe na nie są kom órki nabłonkow e ( S t o k e r 1987) i endotelialne ( R o s e n 1990). Jest to więc czynnik działający parakrynnie.
W roku 1989 czynnik rozpraszający został oczyszczony, a jego masa określona na 62 kD ( G h e r a r d i i in. 1989). D okonano porów nania wpływu na kom órki nabłonkow e (M D C K ) tego czynnika oraz przeciwciała przeciw uwomorulinie. Do odseparowania kom órek wystarczył czynnik rozpraszający o stężeniu 2-3 pmoli podczas gdy stężenie przeciwciała konieczne do uzyskania tego samego efektu było 10 000 razy większe. Ta duża biologiczna aktywność czynnika rozpraszającego wskazuje na obecność w epitelialnych kom órkach receptorów powierzchniowych o bardzo wysokim powinowactwie do tego czynnika. O kazało się również, że heparyna (w stężeniu 5 mg/ml) blokowała aktywność czynnika rozpraszającego, co pozwala przypuszczać, że może on być m odulow any in vivo przez niektóre składniki pozakom órkowej macierzy (ECM ). Odkrycie to nabiera znaczenia w świetle faktu, że wszystkie migrujące kom órki organizm u przechodzą przez pozakom órkow ą macierz.
W roku 1989 S t o k e r podjął próby zbadania wpływu czynnika roz praszającego na ruchliwość kom órek epitelialnych i fibroblastów. Chodziło o stwierdzenie, czy czynnik ten tylko rozprasza kom órki, czy też stymuluje lokomocję pojedynczych kom órek, a także sprawdzenie, czy nie wywiera on rzeczywiście żadnego wpływu na wydzielające go fibroblasty.
Testowane kom órki (fibroblasty, keratynocyty, kom órki M D C K ) umiesz czano w kom orach Boydena. K om órki przechodziły przez otwory o średnicy 8 jim. Liczono kom órki przechodzące w w arunkach kontrolnych (środowisko hodowli po obu stronach otworu) i doświadczalnych, po podaniu badanego czynnika z jednej tylko strony.
Czynnik rozpraszający (pochodzący z fibroblastów M R C 5) powodował, w zależności od użytego stężenia, 5-15-krotny wzrost liczby przechodzących kom órek. Przedostawały się również fragm enty bezjądrowe. W zmożona m igra cja kom órek nabłonkow ych w kierunku czynnika rozpraszającego udowodniła, że jest on nie tylko czynnikiem separującym kom órki, ale także stymuluje ich lokomocję ( S t o k e r i G h e r a r d i 1991).
Fibroblasty wykazywały znikom ą wrażliwość na czynnik rozpraszający. M aksym alne zwiększenie ich aktywności lokomotorycznej wynosiło 1,4 wartości migracji spontanicznej, podczas gdy P D G F (czynnik wzrostowy wydzielany przez płytki krwi) zwiększał liczbę migrujących fibroblastów aż siedm iokrotnie w porów naniu z kontrolą.
Fibroblasty produkujące czynnik rozpraszający są bardzo ruchliwe. D opusz cza się więc możliwość, że reagują one na produkow any przez siebie „scatter factor” . Słaba odpowiedź fibroblastów na ten czynnik wprow adzony do środowiska tłumaczy się tym, że część powierzchniowych receptorów kom órek jest perm anentnie związana produkow anym przez nie czynnikiem rozpraszają cym.
W przypadku tych fibroblastów, które — chociaż ruchliwe — nie wydzielają czynnika rozpraszającego, S t o k e r (1989) postuluje występowanie pętli auto- krynnej. Syntetyzowany przez kom órkę „scatter factor” stymulowałby kom órkę nie opuszczając jej.
C Z Y N N IK R O ZPR A SZA JĄ C Y P R O D U K O W A N Y P R Z E Z N 1E R Ó ŻN IC U JĄ C E SIĘ K ER A TY N O C Y TY (K O M Ó R K I N D K )
Nieróżnicujące się keratynocyty, choć pochodzenia epitelialnego, zarów no kształtem ja k zachowaniem przypom inają ruchliwe, swobodnie migrujące fibroblasty ( A d a m s i W a t t 1988). Stanowią więc niezwykle ciekawy model do badań nad czynnikiem rozpraszającym — zwykłe produkow anym przez fibroblasty, a działającym na epitelium. A d a m s i in. (1991) wykorzystali środowisko modyfikowane przez te keratynocyty do testow ania kolonii kom ó rek nabłonkow ych M D C K . Okazało się, że pod jego wpływem kom órki tych kolonii ulegały rozproszeniu, chociaż środowisko modyfikowane przez praw id łowe keratynocyty nie wywoływało takiego efektu. W badaniach biochemicz nych wykazano, że nieróżnicujące się keratynocyty produkow ały białko, którego biologiczna aktywność oraz charakterystyka im m unologiczna były takie same jak czynnika rozpraszającego produkow anego przez fibroblasty.
Badano również wpływ na nieróżnicujące się keratynocyty i nabłonkow e kom órki M D C K polyanionowego detergentu — suraminy. Cząsteczki tego związku blokują wiązania czynników wzrostowych do błony komórkowej ( H o s a n g 1985; C o f f e y 1987). Suram ina podana do środowiska, w którym rosły kom órki M D C K nie wywoływała efektu. Ujawniał się on dopiero przy jednoczesnej obecności suram iny i czynnika rozpraszającego. O kazało się, że suram ina blokowała działanie tego czynnika, podobnie jak w przypadku czynników wzrostowych.
N astępnie poddano działaniu tego detergentu nieróżnicujące się keratynocy ty. Inkubow anie w obecności suram iny powodow ało skupianie się tych kom ó rek. Przepłukane i pozostawione w norm alnym środowisku hodowli, nieróż nicujące się keratynocyty powracały do swego właściwego stanu, tzn.
roz-proszone swobodnie migrowały. W ynika, z tego, że produkow any przez nieróżnicujące się keratynocyty czynnik rozpraszający jest czynnikiem auto- krynnym dla tych kom órek i parakrynnym dla typowych nabłonkowych kom órek M D C K . Rozprasza on oraz pobudza do migracji produkujące go kom órki.
W związku z tymi wynikami interesujące wydawało się poddanie działaniu suram iny fibroblastów produkujących czynnik rozpraszający. W przeciwieńst wie do ruchliwych, ale pochodzenia epitelialnego nieróżnicujących się keratyno cytów, fibroblasty ( S t o k e r , dane nie publikowane) nie wykazywały wrażliwo ści na suraminę.
Suram ina powoduje w kom órkach ndk również pewne zmiany w cyto- szkielecie aktynowym — pojawiają się dodatkow e, krótkie włókna naprężenio we w pobliżu kontaktów międzykomórkowych. Badano również rozmieszczenie białek wzajemnej adhezji międzykomórkowej w nieróżnicujących się keratyno- cytach znajdujących się pod wpływem suraminy. M im o że suram ina wywoływała skupianie się tych kom órek, nie pow odow ała u nich podniesienia bardzo niskiego poziom u E- i P-kadheryny. Obserwuje się natom iast wyraźny wpływ tego detergentu na integryny. W nietkniętych kom órkach ndk, integryna a2/?Jest skoncentrow ana w regionie falowań błony, zaś a3ß 1 na powierzchni licznych w tych kom órkach mikrowilli. Suram ina powoduje częściowe przemieszczenie tych integryn do regionów kontaktów międzykomórkowych. Takie rozmiesz czenie integryn zawierających podjednostkę ßx jest typowe dla normalnych keratynocytów.
C Z Y N N IK STY M U LU JĄ C Y M IG R A C JĘ — M IG R A T IO N STIM U L A T IN G FA C T O R (M SF)
Badania przeprowadzone przez S c h o r r i współpracowników (1988a i b) na fibroblastach pochodzących z płodów ludzkich oraz z osobników dorosłych (zdrowych i z nowotworem piersi) wykazały, że istnieje podobieństwo w sposo bie migracji fibroblastów pochodzenia płodowego i pobieranych od chorych pacjentów. H odow ane w bardzo gęstych kulturach penetrują one żele kolageno we dużo szybciej i łatwiej niż fibroblasty pochodzące ze zdrowych, dorosłych osobników. Ze środowiska, w którym hodow ano te ruchliwe fibroblasty, wyizolowano białko o masie rzędu 50-60 kD, które okazało się czynnikiem odpowiedzialnym za zwiększenie aktywności omawianych kom órek. Nazwano je czynnikiem stymulującym migrację (M SF). Czynnik ten, odwrotnie niż czynnik rozpraszający (SF), działa przede wszystkim autokrynnie. Stwierdzono jednak, że środowisko modyfikowane przez produkujące ten czynnik fibroblasty może stymulować, w pewnych ściśle określonych w arunkach, również fibroblas ty pochodzące z osobników zdrowych i dorosłych. Dzieje się tak wtedy, gdy te ostatnie tworzą bardzo gęste kultury.
A U T O K R Y N N Y C Z Y N N IK R U C H LIW O ŚC I — A U T O C R IN E M O TILITY FA C T O R (A M F)
W iadom o, że kom órki nowotworowe wymykające się spod kontroli organiz m u same kontrolują większość własnych czynności życiowych. Nieograniczony rozrost tych kom órek wynika między innymi z autokrynnego oddziaływania czynników wzrostu (growth factors). Czynniki wzrostowe należą do cytokin m itogennych, cytokiny m ogą jednak wpływać stymulująco również na inne procesy zachodzące w komórce.
Stwierdzono, że inwazje i przerzuty nowotworów nie są prostą konsekwencją rozrostu kolonii zmienionych kom órek, ale zjawiskiem odrębnym i złożonym z wielu etapów. N a preparatach tkanki zaatakowanej przez now otw ór widać często pojedyncze kom órki lub ich niewielkie grupy wybiegające poza główną masę kolonii. Uważa się, że populacje kom órek nowotworowych są heterogenne. Pewne kom órki odznaczają się ruchliwością i migrują, podczas gdy inne ograniczają się tylko do wzmożonej proliferacji, pozostając na miejscu.
Biochemiczne mechanizmy regulujące inwazyjność kom órek now otw oro wych są przedmiotem wielu badań. Stwierdzono, że jednym z czynników stymulujących migrację takich kom órek może być białko o masie około 55 kD, odkryte w roku 1985, a opisane w roku 1986 przez znanego badacza kom órek nowotworowych — Lance L iott’ę i jego współpracowników. Wyszli oni z założenia, że podobnie jak istnieją autokrynne czynniki wzrostowe, przy pom ocy których kom órka now otw orow a sama pobudza się do podziału, mogą istnieć również autokrynne czynniki pobudzające ją do lokomocji. A utorzy ci zbadali wysoko m etastatyczny klon (A 2058) kom órek czerniaka (melanoma) jednego z najbardziej złośliwych nowotworów ludzkich. Badane kom órki umieszczali w środowisku o ściśle określonym składzie chemicznym i po 18 godzinnej inkubacji sprawdzali działanie tego środowiska na kom órki A2058. Stwierdzili, że w kierunku modyfikowanego środowiska migrowało 5-10 razy więcej kom órek niż w kierunku środowiska kontrolnego. Następnym krokiem była izolacja i charakterystyka białka wydzielanego do hodowli przez kom órki czerniaka, a będącego autokrynnym stym ulatorem ruchliwości tych kom órek. Dalsze badania m ożna więc było prowadzić przy użyciu określonych stężeń A M F. M aksym alną efektywność osiągnięto przy stężeniu A M F 10 nmoli. W ykazano, że czynnik ten działa zarów no chemotaktycznie jak i chemokinetycz- nie, ale tylko na kom órki m elanoma. G ranulocyty obojętnochłonne, które są kom órkam i ruchliwymi nie reagowały zupełnie na A M F, chociaż inhibitory ich lokomocji takie jak toksyna kokluszu ham owały chemotaksję kom órek m elano ma.
A utorzy stwierdzili również, że kom órki czerniaka wykazują wyraźniejszą reakcję chemokinetyczną niż chem otaktyczną na A M F. W ydaje się, że może to mieć znaczenie w procesie inwazyjnym in vivo. W ytworzone lokalnie wysokie stężenie A M F powoduje praw dopodobnie bezładną migrację kom órek. W tra k cie tego zachodzi selekcja kom órek najbardziej agresywnych — tych które okazały się najbardziej wrażliwe na autokrynny czynnik ruchliwości. K om órki te
wyruszają następnie, forsując błonę podstaw ną, przez pozakom órkow ą macierz oraz naczynia krwionośne i limfatyczne ku innym regionom organizmu, gdzie utw orzą nowe kolonie.
L i o 11 a i współpracownicy stwierdzili, że A M F produkow any jest także przez inne kom órki carcinom a. G u i r g u i s i inni (1987) uzupełnili te badania szczegółową analizą m orfologii ruchu kom órek nowotworowych stym ulowa nych A M F. Podając A M F w stężeniu 1 nM wywoływali bezładne form owanie nibynóżek, co poprzedzało przemieszczanie się kom órek. N ibynóżki wysuwane były również przez fragm enty bezjądrowe kom órek. Podanie przeciwciał przeciw A M F ham ow ało zarów no tworzenie pseudopodiów , jak i lokomocję tes towanych kom órek. D odatkow o, w indukow anych za pom ocą A M F pseudo- podiach autorzy obserwowali wyraźną sieć włókienek aktynowych. Stwierdzili też na powierzchni wysuwanych nibynóżek 20-krotne zwiększenie receptorów lamininowych i innych integryn. Zwiększenie liczby tych receptorów wskazuje na przystosowanie badanych kom órek nowotworowych do przemieszczania się przez błonę podstaw ną i pozakom órkow ą macierz. Obecność m ikrofilam entów aktynowych w pseudopodiach lokom otorycznych wskazuje natom iast na toż samość m olekularnych podstaw ruchu kom órek nowotworowych i innych, w tym również swobodnie żyjących kom órek ameboidalnych.
TISSU E C ELL M IG R A T IO N — SOM E FA CTO RS L IM IT IN G A N D S T IM U L A T IN G M O T IL IT Y
S u m m a r y
A moeboid movement, the directed locom otion associated with the cell shape changes, occurs as well in free-living am oebae as in motile tissue cells. There are several factors limitting or stim ulating this type o f movement.
Am ong factors restricting motility o f the tissue cells the intercellular connections are o f the prim ary im portance. A lterations o f cell-cell and cell-substratum interactions take place during embryogenesis and tumorigenesis. T hat is particularly evident in tumorigenesis o f the epithelial tissue, where the m alignant cells loose their adhesion to the original neighbours. A m ong the m olecular mechanisms underlying such alterations, changes in cell-cell interactions mediated by the cadherin family o f molecules have received increasing interest in the last few years. A recent study on E-cadherin expression in several carcinom as and H -ras-transform ed M D C K cells indicates, that acquisition o f the invasiveness by these cells is often associated with the loss o f E-cadherin expression. Similar interrelations were shown for the gap junctions.
Stoker with co-workers discovered in 1985 a specific factor produced by some fibroblasts. This paracrine Scatter F actor (SF) is capable o f inducing the disruption and scattering o f epithelial colonies and increasing the m otility o f individual epithelial or endothelial cells. A n autocrine M otility Stimulating Factor (M SF) was described by Scorr et al. in 1988. It is produced by foetal fibroblasts and fibroblasts from patients with the breast cancer, and can also stim ulate the m igration o f norm al fibroblasts from high-density cultures. L iotta et al (1983, 1986) have shown th at several highly metastatic cell lines produce and respond chemotactically to an A utocrine M otility F actor (AM F). This chemotactic factor has also been isolated by other w orkers from mouse and rat hepatom a lines, a rat m am m ary adenocarcinom a m etastatic clone and hum an leukemia cells.
L IT E R A T U R A
A d a m s J. C., W a t t F. M. — An unusual strain o f human keratinocytes which do not stratify or
undergo terminal differentiation in culture. J. Cell. Biol. 107: 1927-1938, 1988.
A d a m s J. C., F u r l o n g R. A. , W a t t F. M. — Production o f scatter fa cto r by ndk, a strain o f
epithelial cells, and inhibition o f scatter factor activity by suramin. J. Cell Sei. 98: 385-394, 1991.
B e h r e n s J., M a r e e l M. M. , V a n R o y F. M. , B i r c h m e i e r W. — Dissecting tumor cell
invasion: epithelial cells acquire invasive properties after the loss o f uvomorulin-mediated cell-cell adhesion. J. Cell Biol. 108: 2435-2447, 1989.
C o f f e y R. J. Jr., L e o f L. B., S h i p l e y G. D. , M o s e s H. L. — Suramin inhibition o f growth
factor receptor binding and mitogenicity in A K R -2B cells. J. Cell. Physiol. 132: 143-148, 1987.
F l e m i n g T. P., J o h n s o n M. H. — From egg to epithelium. A nn. Rev. Cell Biol. 4:459-485,1988 G h e r a r d i E., G r a y . , S t o k e r M. , P e r r y m a n M. , F u r l o n g R. — Purification o f scatter
factor, a fibroblast-derived basic protein that modulates epithelial interactions and movement.
Proe. N atl. Acad. Sei. USA 86: 5844-5848, 1989.
G u i r g u i s R., M a r g u l i e s I., T a r a b o l e t t i G. , S c h i f f m a n n E., L i o t t a L. — Cyto
kine-induced pseudopodial protrusion is coupled to tumour cell migration. N ature 329: 261-263,
1987.
H o s a n g M. — Suram in binds to platelet-derived grow th factor and inhibits its biological activity. J. Cell. Biochem. 29: 265-273, 1985.
J o n g e n W. M . F. , F i t z g e r a l d D. J., A s a m o t o M. , P i c c o 1 i C., S 1 a g a T. J., G r o s D. , T a k e i c h i M. , Y a m a s a k i H. — Regulation o f connexin 43 — mediated gap junctional
intercellular communication by Ca2+ in mouse epidermal cells is controlled by E-cadherin. J. Cell
Biol. 114: 545-555, 1991.
L i o t t a L. A., M a n d l e r R., M u r a n o G. , K a t z D. A. , G o r d o n R. K. , C h i a n g P. K., S c h i f f m a n n E. — Tum or cell autocrine motility factor. Proc. N atl. Acad. Sei. USA 83: 3302-3306, 1986.
M a r e e l M. — Cell-cell adhesion molecules in tumor invasion. Eur. J. Cell Biol. 53 (Suppl. 31): 46, 1990.
M u s i l L. S . , B e y e r E. C . , G o o d e n o u g h D . A. — Expression o f the gap junction protein
connexin 43 in embryonic chick lens: molecular cloning, ultrastructural localization, and post-translational phosphorylation. J. M em br. Biol. 116: 163-175, 1990.
M u s i l L. S . , C u n n i n g h a m B. A . , E d e l m a n G . M . , G o o d e n o u g h D . A. — Differential phosphorylation o f the gap junction protein connexin 43 in junctional com
munication-competent and -deficient cell lines. J. Cell Biol. I l l : 2077-2088, 1990.
N i c o l s o n G . L . , D u l s k i K . M . , T r o s k o J . E. — Loss o f intercellular junctional
communication correlates with metastatic potential in m ammary adenocarcinoma cells. Proc. N atl.
Acad. Sei. USA 85: 473-476, 1988.
R o s e n E. M . , M e r o m s k y L . , S e t t e r E . , V i n t e r D . W . , G o l d b e r g I . D. — Quantitation o f cytokine-stimulated migration o f endothelium and epithelium by a new assay
using microcarrier beads. Exp. Cell Res. 186: 22-31, 1990.
S c h o r S. L . , S c h o r A . M . , G r e y A . M . , R u s h t o n G. — Foetal and cancer patient
fibroblasts produce an autocrine migration-stimulating fa cto r not made by normal adult cells. J.
Cell Sei 90: 391-399, 1988.
S c h o r S . L . , S c h o r A . M . , R u s h t o n G. — Fibroblasts fro m cancer patients display
a m ixture o f both fo e ta l and adult-like phenotypic characteristics. J. Cell Sei. 90: 401-407, 1988.
S t o k e r M. — Effects o f scatter fa cto r on m otility o f epithelial cells and fibroblasts. J. Cell Physiol. 139: 565-569, 1989.
S t o k e r M . , P e r r y m a n M. — An epithelial scatter fa cto r released by embryo fibroblasts. J. Cell Sei. 77: 209-233, 1985.
S t o k e r M . , G h e r a r d i E . , P e r r y m a n M . , G r a y J. — Scatter factor is a fibro
S t o k e r M . , G h e r a r d i E. — Regulation o f cell movement: the motogenic cytokines. Biochim. Biophys. A cta 1072: 81-102, 1991.
T a k e i c h i M. — Cadherins: a molecular fa m ily important in selective cell-cell adhesion. A nn. Rev. Biochem. 59: 237-252, 1990.
T h i e r r y J . P. — Mechanism ofcell migration in the vertebrate embryo. Cell. Differ. 15: 1-15, 1984. T i n g s t r o m A . , B l i k s t a d I . , A u r i v i l l i u s M . , O b r i n k B. — C -C A M (C ell-C A M
105) is an adhesive cell surface glycoprotein with homophilic binding properties. J. Cell Sei. 96:
17-25, 1990.
V a n h a m m e L . , R o l i n S . , S p i r e r C. — Inhibition o f gap-junctional intercellular com
munication between epithelial cells transformed by the activated H -ras-I oncogene. Exp. Cell Res.
180: 297-301, 1989.
V e s t w e b e r D . , K e m l e r R . , E k b l o m P. — Cell-adhesion molecule uvomorulin during
kidney development. Dev. Biol. 112: 213-221, 1985.
V l e m i n c k K . , V a k a e t L . J r . , M a r e e l M . M . , F i e r s W . , V a n R o y F. — Genetic
manipulation o f E-cadherin expression by epithelial tumor cells reveals an invasion suppresor role.
