Medycyna Weterynaryjna - Summary Medycyna Wet. 64 (8), 1012-1015, 2008

Medycyna Wet. 2008, 64 (8) 1012

Praca oryginalna Original paper

Staphylococcus aureus jest wa¿nym czynnikiem etiologicznym zapalenia gruczo³u mlekowego u krów mlecznych (19). Jego znaczenie systematycznie wzra-sta, czego wyrazem jest trzykrotny wzrost zaka¿eñ tym drobnoustrojem w ostatnim dziesiêcioleciu w Polsce (21). Chorobotwórczoœæ S. aureus wynika ze zdolnoœci bakterii do adhezji do komórek nab³onka gruczo³u mlekowego (11), wytwarzania enzymów i toksyn oraz zdolnoœci przetrwania w gruczole mlekowym. Przyle-ganie bakterii do komórek nab³onkowych, które u³atwia obecnoœæ gronkowcowych bia³ek powierzchniowych i egzopolisacharydów, prowadzi do kolonizacji tkanek gruczo³u mlekowego i jest uznawane za pierwszy etap zaka¿enia (1, 4). Wytwarzanie przez drobnoustroje en-zymów, takich jak: koagulaza, fibrynolizyna, hialuroni-daza, lipaza oraz toksyn, g³ównie hemolizyn i leukocy-dyn, zwiêksza inwazyjnoœæ S. aureus i u³atwia penetra-cjê do tkanki gruczo³owej (7). Tworzenie otorbionych ropni, zdolnoœæ prze¿ywania w makrofagach (12) oraz tworzenie biofilmu powoduje, ¿e drobnoustroje s¹ mniej

podatne na fagocytozê i dzia³anie antybakteryjne leków (9, 28). Skutkuje to równie¿ trudnymi w leczeniu i zwal-czaniu zapaleniami gruczo³u mlekowego. W zapobie-ganiu wystêpowania nowych zaka¿eñ nale¿y uwzglêd-niæ programy zwalczania mastitis w stadzie, jak rów-nie¿ dok³adne poznanie czynnika etiologicznego.

Ze wzglêdu na du¿¹ zmiennoœæ fenotypow¹ drobno-ustrojów coraz czêœciej stosowane jest ró¿nicowanie szczepów na poziomie molekularnym. Jedn¹ z metod szybkiego ró¿nicowania, nawet bardzo blisko spokrew-nionych szczepów, jest analiza polegaj¹ca na amplifi-kacji fragmentów DNA otaczaj¹cych rzadkie miejsca restrykcyjne (ADSRRS – Amplification of DNA Frag-ments Surrounding Rare Restriction Sites) (13, 14, 22). Celem badañ by³o okreœlenie wystêpowania wybra-nych w³aœciwoœci chorobotwórczych i analiza genomów szczepów S. aureus wyizolowanych z mleka krów z za-paleniem gruczo³u mlekowego. Szczególn¹ uwagê zwró-cono na zale¿noœæ miêdzy przynale¿noœci¹ szczepów do danego genotypu a ich cechami chorobotwórczoœci,

Wybrane cechy chorobotwórczoœci oraz zró¿nicowanie

genomowe szczepów Staphylococcus aureus

wyizolowanych z mleka krów z zapaleniem gruczo³u

mlekowego w regionie pó³nocno-wschodniej Polski

MA£GORZATA DZIEKIEWICZ-MRUGASIEWICZ, MAGDALENA RZEWUSKA*, ILONA STEFAÑSKA*, ANTONI JAKUBCZAK**

Zak³ad Diagnostyki Laboratoryjnej i Klinicznej Katedry Nauk Klinicznych Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej SGGW, ul. Nowoursynowska 159c, 02-787 Warszawa

*Zak³ad Bakteriologii i Biologii Molekularnej Katedry Nauk Przedklinicznych Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej SGGW, ul. Ciszewskiego 8, 02-786 Warszawa

**Katedra Mikrobiologii AP, ul. Prusa 12, 08-110 Siedlce

Dziekiewicz-Mrugasiewicz M., Rzewuska M., Stefañska I., Jakubczak A.

Select pathogenic characteristics as well as the genotypic diversity of Staphylococcus aureus strains isolated from milk of cows with mastitis in the north-east region of Poland

Summary

The aim of this study was the characterization of Staphylococcus aureus strains isolated from milk of cows with mastitis in the north-east region of Poland. Genotyping of 45 isolates by ADSRRS-fingerprinting showed nine different patterns of bands. Genotype D was predominant and 29 S. aureus strains (65.5%) were classi-fied to this genotype. These strains of genotype D had strong pathogenicity, because in the first year of the study only 14.29% isolates belonged to D and in the next year 73.64% isolates. The strains of the predominant genotype showed stronger pathogenic properties then the strains of other genotypes. The majority of them showed a significant adhesion to the epithelial cells of the mammary gland, and the strong ability to produce slime and to form biofilm.

Medycyna Wet. 2008, 64 (8) 1013

takimi jak zdolnoœæ do adhezji oraz tworzenie œluzu i biofilmu.

Materia³ i metody

Materia³ do badañ stanowi³o 45 szczepów S. aureus wy-izolowanych z mleka krów z zapaleniem gruczo³u mlekowe-go w latach 2002-2003. Próbki mleka pochodzi³y z mlekowe- gospo-darstw województwa podlaskiego, z powiatów: ³om¿yñskie-go, kolneñskie³om¿yñskie-go, zambrowskie³om¿yñskie-go, grajewskie³om¿yñskie-go, monieckie-go i Wysokie Mazowieckie. Izolacjê i identyfikacjê szczepów wykonano wed³ug metodyki opisanej przez Malinowskiego i K³ossowsk¹ (20).

Cechy chorobotwórczoœci. Zdolnoœæ szczepów S. aureus do adhezji do komórek nab³onka gruczo³u mlekowego okreœ-lono wed³ug metody opracowanej przez Frosta (11). Zdol-noœæ do wytwarzania œluzu badano na pod³o¿u z czerwieni¹ Congo (CRA – Congo Red Agar) zgodnie z zaleceniami Freemana i wsp. (10). Natomiast zdolnoœæ do tworzenia bio-filmu badano metod¹ p³ytkow¹ wed³ug Vasudevana i wsp. (28). Do wykrywania penicylinazy wykorzystano â-laktama-zowe patyczki identyfikacyjne – BR66A (Oxoid Ltd), test wykonano zgodnie z procedur¹ zalecan¹ przez producenta. Wytwarzanie lipazy badano na pod³o¿u Baird-Parkera (BBL) z dodatkiem 5% ¿ó³tka jaja kurzego. Wyniki odczytywano po 48 godz. inkubacji w 37°C.

Analiza genotypowa metod¹ ADSRRS-fingerprinting. Genomowy DNA izolowano z komórek 24-godzinnych ho-dowli poszczególnych szczepów S. aureus uzyskanych na pod³o¿u agarowym. U¿ywano zestawu Genomic DNA Prep Plus (A&A Biotechnology, Polska), zgodnie z procedur¹ za-lecan¹ przez producenta.

Trawienie enzymatyczne genomowego DNA przeprowadza-no przy u¿yciu 2 enzymów restrykcyjnych: XbaI (10 U/µl) i BglII (10 U/µl) (Sigma-Aldrich, Niemcy). Reakcja trawie-nia przebiega³a przez 2-3 godziny w temperaturze 37°C. Na-stêpnie DNA wytr¹cano z mieszaniny reakcyjnej stosuj¹c pre-cypitacjê etanolem.

Strawiony DNA poddano reakcji ligacji z dwoma adapto-rami: krótkim adaptorem dla enzymu XbaI sk³adaj¹cym siê z dwóch oligonukleotydów: 5’-CTAGGTCGACGTT-3’; 3’-CAGCTGCAACCACCTACTTCC-5’ i adaptorem d³ugim dla enzymu BglII: 5’-GATCCGTCGACAACGGCGTTCCT-TCGTCTACCATCC-3’; 3’-GCAGCTGTTGCCGCAAG-GAAGCAGATGGTAGG-5’ (DNA-Gdañsk, Polska).

Strawiony DNA po precypitacji rozpuszczano w 20 µl mie-szaniny ligacyjnej, która sk³ada³a siê z: 2 µl buforu do ligacji (10 ×), 1 µl (20 pmol) ka¿dego z adaptorów, 0,5 µl T4 ligazy DNA (Epicentre, USA), 2 µl 50% roztworu PEG 4000 i 13,5 µl wody. Reakcja ligacji przebiega³a w 16°C przez 2 godz. Na-stêpnie dodano 80 µl buforu TE i produkty reakcji ligacji pre-cypitowano alkoholem etylowym.

Cz¹steczki DNA zligowanego z adaptorami stanowi³y matrycowy materia³ do reakcji PCR. Mieszanina reakcyjna zawiera³a: 2 µl matrycowego DNA, 5 µl buforu do polimera-zy Pwo (10 ×), 5 µl mieszaniny dNTPs (po 2 mM ka¿dego), 1 µl (1 U) polimerazy Pwo (DNA-Gdañsk II, Polska), po 50 pM ka¿dego ze starterów: XbaI – krótki starter (5’-CCTT-CATCCACCAACGTCGAC-3’) i BglII – d³ugi starter (5’-GGATGGTAGACGAAGGAACGC-3’) oraz wodê do ob-jêtoœci 50 µl. Reakcja PCR by³a przeprowadzana w termocy-klerze GENEAMP PCR System 2400 (Perkin-Elmer, USA). Zastosowany zosta³ nastêpuj¹cy profil temperaturowy: wstêp-na dewstêp-naturacja w temperaturze 94°C przez 5 min.,

wype³nia-nie koñców fragmentów DNA w temperaturze 72°C przez 5 min., denaturacja w temperaturze 94°C przez 5 min., a na-stêpnie 22 cykle: 94°C przez 30 s, 62°C przez 30 s, 72°C przez 90 s. Koñcowy etap wyd³u¿ania przeprowadzono w tem-peraturze 72° przez 5 min. Produkty PCR rozdzielano elek-troforetycznie w 6% ¿elu poliakrylamidowym w buforze TBE, a nastêpnie wybarwiano bromkiem etydyny (0,5 µg/ml) przez 10-15 min. Wynik rozdzia³u oceniano w œwietle UV i doku-mentowano wykonuj¹c fotografie.

Do analizy statystycznej zastosowano pakiet statystyczny SPSS 12.0. Do analizy wytwarzania œluzu, biofilmu, lipazy i â-laktamazy zastosowano nieparametryczne testy zgodnoœ-ci Chi-kwadrat Pearsona, natomiast do oznaczenia zdolnoœzgodnoœ-ci do adhezji do komórek nab³onkowych gruczo³u mlekowego wykorzystano jednoczynnikow¹ analizê wariancji (UNI-ANOVA).

Wyniki i omówienie

W wyniku badania 45 szczepów S. aureus metod¹ ADSRRS-fingerprinting otrzymano ró¿ne profile am-plifikacyjne, na które sk³ada³o siê od 9 do 13 fragmen-tów DNA o wielkoœci 200-1600 par zasad. Dane te przedstawiono na ryc. 1. Na podstawie analizy uzyska-nych rezultatów wyró¿niono 9 grup genotypowych szczepów, które oznaczono literami od A do I. Najwiê-cej szczepów S. aureus zaliczono do genotypu D (29 izolatów). Do pozosta³ych genotypów zakwalifikowa-no: 5 szczepów – genotyp A, 4 szczepy – genotyp E, 2 szczepy – genotyp C oraz po jednym szczepie do ge-notypów B, F, G, H, I.

Analiza pochodzenia szczepów S. aureus nale¿¹cych do poszczególnych genotypów wykaza³a, ¿e szczepy grupy D dominowa³y w powiatach: zambrowskim, gra-jewskim, Wysokie Mazowieckie, kolneñskim i ³om¿yñ-skim. Jedynie w powiecie monieckim wystêpowa³y szczepy zaliczone do genotypu E. Najbardziej zró¿ni-cowane genotypowo szczepy wyizolowano w powiecie ³om¿yñskim. Wœród nich wyodrêbniono 8 genotypów, tj. A, B, C, D, E, F, G, H. Do dominuj¹cej grupy zali-F D A E A D D D D D D D A D C B A A M

Ryc. 1. Profile ADSRRS-fingerprinting uzyskane dla wybra-nych szczepów S. aureus (M – marker, cyfry oznaczaj¹ bada-ne szczepy; litery oznaczaj¹ przynale¿noœæ do genotypu)

Medycyna Wet. 2008, 64 (8) 1014

czono 13 szczepów S. aureus (50%). Do pozosta³ych zaliczono, odpowiednio: 5 szczepów (genotyp A), 2 szczepy (genotyp C i E) i po 1 szczepie do genotypów B, F, G, H. W powiecie kolneñskim 85,71% przebada-nych szczepów zaliczono do genotypu D. Stwierdzono, ¿e odsetek izolacji szczepów dominuj¹cego genotypu systematycznie wzrasta³. W pierwszym roku badania szczepy genotypu D stanowi³y 14,29%, w drugim roku badania a¿ 73,64% wszystkich izolatów S. aureus.

Porównanie w³aœciwoœci fenotypowych szczepów genotypu D oraz szczepów nale¿¹cych do innych typów (tab. 1) wykaza³o, ¿e szczepy nale¿¹ce do geno-typu D maj¹ wiêcej cech determinuj¹cych chorobotwór-czoœæ gronkowców ni¿ szczepy nale¿¹ce do pozosta-³ych genotypów. Wœród szczepów dominuj¹cego geno-typu 16 (55,2%) mia³o zdolnoœæ do wytwarzania œluzu, a 20 z nich (69%) tworzy³o biofilm. Wœród szczepów zaliczonych do pozosta³ych 8 genotypów œluz wytwa-rza³o 18,8%, a biofilm 56,2% szczepów. Zdecydowanie silniejsz¹ adhezjê do komórek nab³onka gruczo³u mle-kowego wykazywa³y równie¿ szczepy dominuj¹cego ge-notypu, wœród których œrednia liczba komórek bakte-ryjnych przylegaj¹cych do pojedynczej komórki nab³on-kowej wynosi³a ponad 10. Podobnie, wiêkszy odsetek szczepów genotypu D wykazywa³ zdolnoœci do wytwa-rzania lipazy (58,6%) i â-laktamazy (41,4%).

Do ró¿nicowania szczepów S. aureus izolowanych z mleka krów z powodzeniem stosowano ró¿ne metody biologii molekularnej, takie jak: analiza profili plazmi-dowych (16), analiza restrykcyjna plazmidowego (5) lub chromosomalnego DNA (REA) (23), rybotypowanie (5), analiza polimorfizmu genów, g³ównie genu spa i genu coa (16, 25) oraz ró¿ne odmiany PCR (15, 18, 23, 26). Metod¹, która doskonale sprawdzi³a siê w ró¿nicowa-niu gronkowców, jest PFGE (16, 29), uznawana ze wzglêdu na du¿¹ si³ê dyskryminacyjn¹ za „z³oty stan-dard”. Jednak z uwagi na du¿e koszty i czêste trudnoœci techniczne metoda ta nie jest wykorzystywana w ruty-nowej diagnostyce klinicznej. Zastosowana w badaniach w³asnych metoda ADSRRS-fingerprinting cechuje siê wysokim potencja³em ró¿nicuj¹cym, a wybiórcza am-plifikacja, bêd¹ca wynikiem zjawiska supresji reakcji PCR prowadzi do powstawania niewielkiej liczby pro-duktów, co pozwala na ³atw¹ interpretacjê wyników (13). Dotychczas metodê ADSRRS-fingerprinting z powodze-niem stosowano do ró¿nicowania wyizolowanych od ludzi szczepów: Escherichia coli, Klebsiella oxytoca i K. pneumoniae (22), Serratia marcescens i

Entero-coccus faecium (13, 14) oraz S. aureus (3). Ostatnio me-todê ADSRRS-fingerpinting zastosowano równie¿ do oceny zmiennoœci genomowej szczepów Corynebacte-rium pseudotuberculosis wyizolowanych od kóz (27).

Wykorzystuj¹c tê metodê stwierdzono wystêpowanie w badanym regionie szczepów S. aureus ró¿ni¹cych siê genomami, a tak¿e dominacjê szczepów zaliczonych do genotypu D, rozprzestrzeniaj¹cych siê wœród zwierz¹t w wielu powiatach województwa podlaskiego. Wielu autorów podkreœla fakt, ¿e chocia¿ w badanych regio-nach izolowane s¹ ró¿ne genotypowo szczepy S. aureus (5, 29), to nowe zaka¿enia gruczo³u mlekowego na ogó³ wywo³uj¹ szczepy dominuj¹cego genotypu, co wyka-zano równie¿ w badaniach w³asnych. Lipman i wsp. (18) przy wykorzystaniu techniki PCR-fingerprinting wyka-zali, ¿e w badanym stadzie za nowe zaka¿enia u krów odpowiedzialne by³y szczepy nale¿¹ce do jednego ge-notypu. Równie¿ badania Lama i wsp. (15) wykaza³y, ¿e mastitis w 7 badanych stadach, wywo³ywa³ jeden dominuj¹cy szczep S. aureus. Raimundo i wsp. (25) izo-lowali szczepy S. aureus o tym samym genotypie z pró-bek mleka pochodz¹cych od krów z odleg³ych ferm w Australii, miêdzy którymi nie by³o ¿adnego kontaktu. W innych badaniach Zadoks i wsp. (29) wykazali, ¿e za ostre przypadki mastitis, które wyst¹pi³y równoczeœnie u kilku krów w stadzie, odpowiada³y szczepy S. aureus nale¿¹ce do dominuj¹cego w tym regionie genotypu. Obserwacje te œwiadcz¹, ¿e zaka¿enia wywo³ane przez gronkowca z³ocistego s¹ zaraŸliwe, a dominuj¹ce szczepy szybko rozprzestrzeniaj¹ siê w stadzie. Potwierdzaj¹ to równie¿ analizy wykonane na prze³omie 2002 i 2003 r., w których okreœlano wystêpowanie szczepów S. aureus u krów w badanym regionie. W ich wyniku stwierdzo-no ponad trzykrotny wzrost odsetka izolacji S. aureus (8). Sachanowicz i wsp. (26), poddali genotypowaniu metod¹ PCR-fingerprinting 10 szczepów S. aureus izolo-wanych z mleka krów w regionie ³om¿yñskim w 2000 r. W wyniku otrzymali 6 odmiennych wzorów produktów amplifikacji. ¯adnego genotypu nie mo¿na by³o uznaæ za dominuj¹cy. Mo¿e to sugerowaæ, ¿e w przeci¹gu 2 lat pojawi³y siê w regionie szczepy gronkowcowe bardziej zjadliwe i inwazyjne, które szybko rozprzestrzeniaj¹ siê wœród krów. Wed³ug danych piœmiennictwa (29), szcze-py dominuj¹cych genotypów maj¹ wiêcej cech deter-minuj¹cych chorobotwórczoœæ ni¿ pozosta³e. Potwier-dzaj¹ ten fakt równie¿ badania w³asne. Porównanie za-le¿noœci pomiêdzy przynaza-le¿noœci¹ do danego genoty-pu a wystêpowaniem okreœlonych cech

chorobotwór-p y t o n e G n z u l Œ * BioNfSlim LiNpaSza bl-akNtaSmaza Adh*e*jza + – + – + – + – œrednia b³¹d D 29 ₅₅1_,6_{2% 44}1_,83_{% 69}2_,00_{% 31,}9_{0% 58}1_,62_{% 41}1_,47_{% 41}1_,2_{4% 58}1_,7_6% 10,46 ±0,50 e n n I 16 _18,3_{8% 81}1_,33_{% 56,}9_{2% 43,}7_{8% 50,}8_{0% 50}8_{,0% 18,}3_{8% 81}1_,33_% 17,63 ±0,67

Objaœnienia: (–) – wynik ujemny, brak badanej w³aœciwoœci; (+) – wynik dodatni, wystêpowanie badanej w³aœciwoœci; * – p £ 0,05; ** – p £ 0,01; NS – nieistotne statystycznie

Medycyna Wet. 2008, 64 (8) 1015

czoœci wykaza³o, ¿e zjadliwoœæ szczepów nale¿¹cych do genotypu D by³a wiêksza ni¿ szczepów nale¿¹cych do pozosta³ych genotypów. Szczepy genotypu D zdecy-dowanie silniej przylega³y do komórek nab³onka gru-czo³u mlekowego ni¿ szczepy innych grup oraz wiêk-szoœæ z nich (55,2%) wytwarza³a œluz i tworzy³a bio-film (69%). Adhezja do komórek nab³onka gruczo³u mlekowego jest uznawana za pierwszy etap zaka¿enia, natomiast wytwarzanie egzopolisacharydów zwiêksza zdolnoœæ do przylegania do komórek gospodarza (1, 4). W badaniach Baselgi i wsp. (4) wykazano, ¿e szczepy S. aureus wytwarzaj¹ce œluz czêœciej wywo³ywa³y za-ka¿enie wewn¹trzwymieniowe u owiec ni¿ szczepy nie wytwarzaj¹ce œluzu. Szczepy te by³y mniej wra¿liwe na mechanizmy obronne gospodarza (17), poniewa¿ otocz-ka œluzowa maskuje antygeny wystêpuj¹ce w œcianie ko-mórkowej bakterii (6). W³aœciwoœci te stwierdzono u szczepów z grupy D, co mo¿e t³umaczyæ jego szybkie rozprzestrzenianie siê w badanym regionie. Dodatko-wo szczepy dominuj¹cego genotypu w wiêkszym od-setku tworzy³y biofilm i wytwarza³y â-laktamazê, co sugeruje, ¿e komórki bakteryjne by³y chronione przed dzia³aniem mechanizmów obronnych gospodarza oraz wyjaœnia ich mniejsz¹ wra¿liwoœæ na dzia³anie antybio-tyków (2). Dowodem mo¿e byæ fakt, ¿e szczepy tego samego genotypu by³y izolowane na pocz¹tku choroby i po kilkutygodniowym leczeniu (24). Fox i wsp. (9) stwierdzili, ¿e szczepy S. aureus wyizolowane z mleka krów mia³y wiêksz¹ zdolnoœæ do tworzenia biofilmu ni¿ szczepy wyizolowane ze skóry r¹k dojarzy i przewo-dów sprzêtu udojowego. Potwierdza to, ¿e zdolnoœæ do tworzenia biofilmu jest wa¿nym czynnikiem chorobo-twórczoœci gronkowców wywo³uj¹cych mastitis, utrud-niaj¹cym zwalczanie zaka¿eñ w stadzie. W³aœciwoœæ ta umo¿liwia przetrwanie drobnoustrojów w gruczole mle-kowym i przyczynia siê do powstawania zapaleñ prze-wlek³ych.

Podsumowuj¹c nale¿y stwierdziæ, ¿e metoda ADS-RRS-fingerprinting jest w du¿ym stopniu przydatna do ró¿nicowania szczepów S. aureus izolowanych od krów oraz w dochodzeniu epidemiologicznym. Zaobserwo-wana zale¿noœæ pomiêdzy przynale¿noœci¹ do okreœlo-nych grup genomowych a w³aœciwoœciami chorobotwór-czymi powinna byæ brana pod uwagê w opracowywa-niu skutecznych programów zwalczania tych zaka¿eñ gruczo³u mlekowego u krów.

Piœmiennictwo

1.Aguilar B., Amorena B., Iturralde M.: Effect of slime on adherence of Staphylo-coccus aureus isolated from bovine and ovine mastitis. Vet. Microbiol. 2001, 78, 183-190.

2.Amorena B., Garcia E., Monzün M., Leiva J., Oteiza C., Pérez M., Alabart J. L., Hernández-Yago J.: Antibiotic susceptibility assay for Staphylococcus aureus in biofilms developed in vitro. J. Antimicrobial Chem. 1999, 44, 43-55. 3.Barañska-Rybak W.: Amplification of DNA fragments surrounding rare

restric-tion sites (ADSRRS-fingerprinting) for typing Staphylococcus aureus isolated from patients with recurrent furunculosis. ECCMID Meeting, Prague, Czech Republic, Poster 2004.

4.Baselga R., Albizu I., De La Cruz M., Cacho E., Barberan M., Amorena B.: Phase variation of slime production in Staphylococcus aureus: implications in colonization and virulence. Infect. Immun. 1993, 61, 4857-4862.

5.Buzzola F. R., Quelle L., Gomez M. I., Catalano M., Steele-Moore L., Berg D., Gentilini E., Denamiel G., Sordelli D. O.: Genotyping analysis of

Staphylococ-cus aureus from milk of dairy cows with mastitis in Argentina. Epidemiol. Infect. 2001, 126, 445-452.

6.Caputy C., Costerton J. W.: Immunological examination of glycocalyces of Staphylococcus aureus strains Willey and Smith. Current Microbiol. 1984, 11, 297-302.

7.Cifrian E., Guidry A. J., Bramley A. J., Norcross N. L., Bastida-Corcuera F. D., Marquardt W. W.: Effect of staphylococcal â toxin on the cytotoxicity, prolifera-tion and adherence of Staphylococcus aureus to bovine mammary epithelial cells. Vet. Microbiol. 1996, 48, 187-198.

8.Dziekiewicz-Mrugasiewicz M.: Wystêpowanie i charakterystyka szczepów Sta-phylococcus aureus izolowanych z mleka krów w regionie pó³nocno-wschod-niej Polski. Praca dokt. SGGW, Warszawa 2007.

9.Fox L. K., Zadoks R. N., Gaskins C. T.: Biofilm production by Staphylococcus aureus associated with intramammary infection. Vet. Microbiol. 2005, 107, 295-299.

10.Freeman D. J., Falkiner F. R., Keane C. T.: New method for detecting slime production by coagulase negative staphylococci. J Clin. Pathol. 1989, 42, 872-874.

11.Frost A. J.: Selective adhesion of microorganisms to the ductular epithelium of bovine mammary gland. Infect. Immun. 1975, 12, 1154-1156.

12.Hébert A., Sayasith K., Sénéchal S., Dubreuil P., Lagacé J.: Demonstration of intracellular Staphylococcus aureus in bovine mastitis alveolar cells and macro-phages isolated from naturally infected cow milk. FEMS Microbiol. Letters 2000, 193, 57-62.

13.Krawczyk B., Lewandowski K., Bronk M., Samet A., Myjak P., Kur J.: Evalu-ation of novel method based on amplificEvalu-ation of DNA fragments surrounding rare restriction sites (ADSRRS-fingerprinting) for typing strains of vancomycin – resistant Enterococcus faecium. J. Microbiol. Methods. 2003, 52, 341-351. 14.Krawczyk B., Naumiuk £., Lewandowski K., Baraniak A., Gniadowski M.,

Samet A., Kur J.: Evaluation and comparison of random amplification of poly-morphic DNA, pulsed-field gel electrophoresis and ADSRRS-fingerprinting for typing Serratia marcescens outbreaks. FEMS 2003, 38, 241-248.

15.Lam T. J., Lipman L. J., Schukken Y. H., Gaastra W., Brand A.: Epidemiological characteristics of bovine clinical mastitis caused by Staphylococcus aureus and Eschericha coli studied by DNA fingerprinting. Am. J. Vet. Res. 1996, 57, 39-42. 16.Lange C., Cardoso M., Senczek D., Schwarz S.: Molecular subtyping of Staphy-lococcus aureus from cases bovine mastitis in Brazil. Vet. Microbiol. 1999, 67, 127-141.

17.Lee J. C., Betley M. J., Hopkins C. A., Pérez N. E., Pier G. B.: Virulence studies, in mice, of transposoninduced mutans of Staphylococcus aureus differing in capsular size. J. Infect. Dis. 1987, 156, 935-939.

18.Lipman L., Nijs de A., Lam T., Rost J., Dijk von L., Schukken Y., Gaastra W.: Genotyping by PCR, of Staphylococcus aureus strains, isolated from mammary gland of cows. Vet. Microbiol. 1996, 48, 51-55.

19.Malinowski E.: Przyczyny, leczenie i zapobieganie mastitis u krów. PIWet Pu³awy 1997.

20.Malinowski E., K³osowska A.: Diagnostyka zaka¿eñ i zapaleñ wymienia. PIWet Pu³awy 2002.

21.Malinowski E., Lassa H., K³ossowska A., Smulski S., Markiewicz H., Kaczma-rowski M.: Etiological agents of dairy cows mastitis in western part of Poland. Pol. J. Vet. Sci. 2006, 9, 191-194.

22.Masny A., P³ucienniczak A.: Fingerprinting of bacterial genomes by amplifica-tion of DNA fragments surrounding rare restricamplifica-tion sites. BioTechniques. 2001, 13, 930-936.

23.Matthews K. R., Jayarao B. M., Oliver S. P.: Plasmid pattern analysis of Staphy-lococcus aureus isolated from bovine mammary secretions. J. Dairy Sci. 1993, 75, 3318-3323.

24.Myllys V., Ridell J., Björkroth J., Biese I., Pyörälä S.: Persistence in bovine mastitis of Staphylococcus aureus clones as assessed by random amplified polymorphic DNA analysis, ribotyping and biotyping. Vet. Microbiol. 1997, 57, 245-251.

25.Raimundo O., Deighton M., Capstick J., Gerraty N.: Molecular typing of Staphylococcus aureus of bovine origin by polymorphisms of the coagulase gene. Vet. Microbiol. 1999, 66, 275-284.

26.Sachanowicz J., Jakubczak A., Kleczkowski M.: Ró¿nicowanie szczepów Staphylococcus aureus metod¹ PCR-fingerprinting. Medycyna Wet. 2003, 59, 710-712.

27.Stefañska I., Rzewuska M., Nowicki M., Kaba J., Binek M.: W³aœciwoœci fizjolo-giczne i zmiennoœæ genomowa szczepów Corynebecterium pseudotuberculosis wyizolowanych od kóz. Medycyna Wet. 2007, 63 Suplement, 1474-1477. 28.Vasudevan P., Nair M., Annamalai T., Venkitanarayanan K. S.: Phenotypic and

genotypic characterization of bovine mastitis isolates of Staphylococcus aureus for biofilm formation. Vet. Microbiol. 2003, 92, 179-185.

29.Zadoks R.: Comparison of Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis and human skin, milking equipment and bovine milk by phage typing, pulsed – field gel elektrophoresis and binary typing. J. Clin. Microbiol. 2002, 40 (11), 3894-3902.

Adres autora: dr Ma³gorzata Dziekiewicz-Mrugasiewicz, ul. Nowoursy-nowska 159c, 02-787 Warszawa; e-mail: mdziekiewicz@o2.pl