Med. Weter. 2012, 68 (5) 299
Opis przypadku Case report
Od 1971 r. na terenie Puszczy Bia³owieskiej prowa-dzone s¹ odstrza³y ¿ubrów Bison bonasus (Linnaeus, 1758) celem regulacji liczebnoci stada, obejmuj¹ce zarówno samce, jak i samice (8). Przyczyny elimi-nacji samców to: choroby, ze szczególnym uwzglêd-nieniem nekrotycznego zapalenia napletka samców (NZN), z³a kondycja, wady eksterieru, urazy ró¿nego pochodzenia, agresja w stosunku do cz³owieka, sta-roæ (8, 9, 15). Wszystkie odstrzelone ¿ubry podda-wane s¹ badaniu sekcyjnemu. Na podstawie badañ patomorfologicznych makroskopowych i mikroskopo-wych rozpoznano w uk³adzie p³ciowym mêskim tych zwierz¹t NZN o ró¿nym stopniu nasilenia (8, 9, 15), wnêtrostwo dotycz¹ce lewego lub prawego j¹dra (1, 4, 6, 7, 18) i torbiele naj¹drzy (12, 13, 17). Natomiast dotychczas nie stwierdzano zmian o charakterze no-wotworowym, zapalnym czy rozrostowym w obrêbie
j¹der i naj¹drzy. Poni¿ej opisano zmiany patomorfo-logiczne stwierdzone w preparatach mikroskopowych naj¹drza 13-letniego samca ¿ubra.
Celem badañ by³o okrelenie charakteru zmian pa-tomorfologicznych stwierdzonych w naj¹drzu 13-let-niego samca ¿ubra nowotworowego, zapalnego czy rozrostowego.
Materia³ i metody
18 grudnia 2002 r. w okolicy wsi Smolnice eliminowano samca ¿ubra o numerze ewidencyjnym 1043 (pochodz¹ce-go z wolno ¿yj¹cej populacji) ze wzglêdu na wyrz¹dzanie szkód i przejawian¹ agresjê. Wiek ¿ubra (ok. 13 lat) zosta³ okrelony przez J. Dackiewicza z Bia³owieskiego Parku Narodowego na podstawie wygl¹du zêbów oraz wielkoci i kszta³tu rogów (10, 19). Masa cia³a badanego zwierzêcia wynosi³a 646 kg, masa j¹dra lewego 283 g, masa j¹dra
Przypadek przewlek³ego wytwórczego zapalenia
naj¹drza ¿ubra
EL¯BIETA CZYKIER, WOJCIECH BIELECKI*, ZBIGNIEW NAMIOT**, JANUSZ DZIÊCIO£**
Zak³ad Histologii i Embriologii UM, ul. Waszyngtona 13, 15-269 Bia³ystok
*Katedra Patologii i Diagnostyki Weterynaryjnej Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej SGGW, ul. Nowoursynowska 159c, 02-776 Warszawa
**Zak³ad Anatomii Prawid³owej Cz³owieka UM, ul. Mickiewicza 2a, 15-230 Bia³ystok Czykier E., Bielecki W., Namiot Z., Dziêcio³ J.
Case of chronic progressive epididymitis in a European bison Summary
The aim of the study was to determine whether the character of a histopathological change observed in the epididymis of a 13-year-old European bison male was neoplastic, inflammatory or proliferous. Samples from both testes and epididymes were collected. The material was fixed in Bouins fluid; 6 mm paraffin sections were stained with hematoxylin and eosin (H+E), as well as by Brachets method. Full blood samples were collected from the femoral artery (post mortem). Immunocytochemical reactions were performed by the EnVisionTM FLEX+ technique. Specific monoclonal mouse and polyclonal rabbit antibodies were used against:
vimentin (No IS630); human cytokeratin (No IS053); human CD 34 (No IS632); human desmin (No IS606); human smooth muscle myosin heavy chain (No IS066); myogenin (No IS067); human muscle actin (No M0635) in a 1:50 dilution; human MyoD1 (No M3512) in a 1:50 dilution; human myeloid/histiocyte (No M0747) in a 1:100 dilution; human receptor Cd 68 (No IS609); S-100 (No IS504). Micromorphometric measurements were carried out to assess the extent of connective tissue hyperplasia in the epididymis. The histopathological change in the epididymis of the 13-year-old bull was progressive and caused by chronic inflammation, which was confirmed by the micromorphometric analysis and the evidence of plasma cells and connective tissue hyperplasia. Immunohistochemical staining carried out to find vimentine receptors showed mesenchymatic cells forming disseminated foci in the epididymis. The appearance of the cells that made up the microgranulomas indicated their epithelioid nature. These transformed macrophages were devoid of the typical receptors Cd68 and Mac 387. However, the presence of spermatozoa in the foci suggested their phagocytic properties.
Damage to the canaliculi of the epididymis and their phagocytosis could have been caused by an unknown proinflammatory factor. It is also likely that the destruction was induced by epithelioid cell proteins, which resulted in a dislocation of sperm to the epididymal stroma.
Med. Weter. 2012, 68 (5) 300
prawego 263,1 g. W badaniu sekcyjnym stwierdzono: rop-ne zapalenie p³uc i p³atów przeponowych, zmiany pomo-tylicze oraz motylicê. Nie obserwowano u tego osobnika NZN ani torbieli naj¹drzy (8, 9, 12, 13, 15, 17). Krew po-brano z têtnicy udowej (post mortem). Z obu j¹der i naj¹d-rzy pobrano wycinki. Materia³ utrwalano w p³ynie Bouina, prowadzono technik¹ parafinow¹, barwiono H+E oraz me-tod¹ Bracheta. Wykonano odczyny immunohistochemicz-ne metod¹ EnVisionTM FLEX+ z u¿yciem nastêpuj¹cych
przeciwcia³ monoklonalnych mysich: przeciwko ludzkim cytokeratynom, klon AE1/AE3 (No IS053); przeciwko kiemu CD 34, klon QBEnd 10, (No IS632); przeciwko ludz-kiej desminie, klon D33 (No IS606); przeciwko vimenty-nie, klon V9 (No IS630); przeciwko ludzkiej miozynie z ko-mórek miêniowych g³adkich, klon SMMS-1 (No IS066); przeciwko miogeninie, klon F5D (No IS067); przeciwko ludzkiej miêniowej aktynie, klon HHF35 (No M0635) w rozcieñczeniu 1 : 50; przeciwko ludzkiej MyoD1, klon 5.8A (No M3512) w rozcieñczeniu 1 : 50; przeciwko ludz-kim histiocytom, klon Mac 387 (No M0747) w rozcieñcze-niu 1 : 100; przeciwko ludzkiemu receptorowi Cd 68, klon KP1 (No IS609) oraz przeciwcia³a poliklonalnego króli-czego przeciwko S-100 (No IS504). Wszystkie wymienio-ne przeciwcia³a zakupiono w firmie DAKO. Procedurê wykonano w automacie Dako (Autostainer/Autostainer Plus).
Skrawki umieszczone na sylanizowanych szkie³kach odparafinowano, uwodniono. Nastêpnie wykonano ciepl-ne odmaskowanie epitopu antygenu przez 20 min. w tem-peraturze 97°C w wysokim pH, po czym zablokowano aktywnoæ endogennej peroksydazy odczynnikiem EnVi-sionTM FLEX Peroxidase bloking Reagent (SM821).
Skraw-ki z przeciwcia³em pierwotnym inkubowano 20 min., po czym p³ukano w roztworze TRIS. Nastêpnie zastosowa-no odczynnik detekcyjny Dako EnVisionTM FLEX/HRP
(DM802) zawieraj¹cy przeciwcia³o wtórne i peroksydazê, przeprowadzono p³ukanie w roztworze TRIS. Wykonano reakcjê z DAB. Podbarwiono j¹dra komórkowe hemato-ksylin¹, nastêpnie odwodniono skrawki i zamkniêto.
Przeprowadzono badanie mikromorfometryczne w celu oceny stopnia rozrostu tkanki ³¹cznej zrêbu naj¹drza. Mie-rzono szerokoæ pomiêdzy przewodzikami wyprowadzaj¹-cymi. W tym celu wyznaczano odcinki, których koñce opar-te by³y na b³onie podstawnej s¹siaduj¹cych ze sob¹ prze-wodzików. Przeprowadzano kolejnych 100 pomiarów, po czym je zsumowano, obliczano redni¹ szerokoæ pomiê-dzy przewodzikami i odchylenie standardowe oraz war-toci minimalne i maksymalne. Dla porównania pomiarów w badanym przypadku wykonano te¿ pomiary w dwóch preparatach naj¹drzy, w których badaniem przegl¹dowym nie stwierdzono cech zapalenia. Pomiary przeprowadzono pod powiêkszeniem 50 ×, u¿ywaj¹c zestawu do mikrosko-powej analizy obrazu Eclipse 90i (Nikon, Japan) wyposa-¿onego w komputerowy program Lucia 5.16.
Metod¹ immunoenzymatyczn¹ ELISA oznaczono stê¿e-nie 17â-estradiolu (E2) (No RE 52041) oraz stê¿estê¿e-nie wol-nego testosteronu (FT) (No RE 52171) firmy Immuno-bio-logical Laboratories (Hamburg, Niemcy).
Dane dotycz¹ce masy cia³a ¿ubra uzyskano z Bia³owie-skiego Parku Narodowego.
Wyniki i omówienie
W badaniu makroskopowym nie obserwowano od-chyleñ od stanu prawid³owego w budowie j¹der i na-j¹drzy badanego 13-letniego ¿ubra. Badaniem mikro-skopowym stwierdzono prawid³owy obraz histologicz-ny j¹dra, na przekroju poprzeczhistologicz-nym widoczne by³y kanaliki krête j¹der pokryte nab³onkiem plemnikotwór-czym. Miêdzy kanalikami krêtymi j¹der widoczna by³a tkanka ³¹czna i komórki Leydiga (ryc. 1). Podczas badañ mikroskopowych preparatów z naj¹drza barwio-nych H+E stwierdzono obecnoæ komórek nietypo-wych dla budowy j¹dra i naj¹drza (ryc. 2, 3). Komórki mia³y kszta³t owalny, epitelioidny. J¹dro komórkowe po³o¿one by³o ekscentrycznie, bez wyranego j¹der-ka. Cytoplazma jasna, lekko kwasoch³onna o charak-terze piankowatym, drobnoziarnistym. Komórki nie tworzy³y jednolitej, ograniczonej struktury, wchodzi-³y jednak w otoczenie w postaci gniazd, pasm i jê-zyków, sprawiaj¹c wra¿enie niszczenia podcieliska.
Ryc. 1. J¹dro 13-letniego ¿ubra. Na przekroju poprzecznym widoczne s¹ kanaliki krête j¹der pokryte nab³onkiem plem-nikotwórczym. Miêdzy kanalikami wystêpuje tkanka ³¹czna i komórki Leydiga. Barw. H i E. Pow. 200 ×
Ryc. 2. Naj¹drze 13-letniego ¿ubra. Wnikanie nacieku pomiê-dzy kanaliki naj¹drza. Barw. H i E. Pow. 200 ×
Med. Weter. 2012, 68 (5) 301
Uk³ad komórek w zmianie by³ luny, bez cech przyle-gania i bez tworzenia struktur organoidnych (ryc. 2, 3). Cechy te wskazuj¹ na nienab³onkowy charakter ko-mórek. W badanych komórkach nie znaleziono podzia-³ów mitotycznych, co mog³oby wskazywaæ na nisk¹ aktywnoæ mitotyczn¹ lub jej brak. W okolicy grup wymienionych komórek widoczne by³y sporadyczne nacieki limfocytarne oraz w³óknienie podcieliska z rozplemem naczyñ. Miejscami komórki te wymie-szane by³y z plemnikami (ryc. 3).
Barwienie preparatów mikroskopowych wykona-nych z naj¹drza ¿ubra metod¹ Bracheta wykaza³o obec-noæ komórek plazmatycznych. Plazmocyty tworzy³y skupiska od 5 do 30 komórek. Zgrupowania plazmo-cytów rozrzucone by³y w preparacie nieregularnie (ryc. 4). Pomiary mikromorfometryczne wykaza³y 2-3-krotny rozrost tkanki ³¹cznej zrêbu naj¹drza u tego ¿ubra w porównaniu z osobnikami, u których nie ob-serwowano zapalenia (tab. 1). Po wykonaniu badañ
immunohistochemicznych otrzymano nastêpuj¹ce wy-niki: vimentyna (+) w komórkach nacieku oraz w ko-mórkach miêniowych g³adkich naczyñ i przewodu na-j¹drza (ryc. 5); cytokeratyny (PanCK) () w komór-kach nacieku, (+) w nab³onku kanalików naj¹drza; desmina () w komórkach nacieku, (+) w komórkach miêniowych g³adkich naczyñ krwiononych i prze-wodu naj¹drza; aktyna () w komórkach nacieku, (+) w komórkach miêniowych g³adkich naczyñ krwio-nonych i przewodu naj¹drza, MyoD1 () w komór-kach nacieku, (+) w r¹bku komórek nab³onka przewo-du naj¹drza; SMM () w komórkach nacieku, (+) w komórkach miêniowych g³adkich naczyñ krwio-nonych i przewodu naj¹drza; myogenina brak odczy-nu w preparacie; CD 34 brak odczyodczy-nu w preparacie; S-100 (+/) w komórkach nacieku, (+) w nab³onku prze-wodu naj¹drza; Mac 387 brak odczynu w preparacie; CD 68 brak odczynu w preparacie; Ki 67 brak odczy-nu w preparacie. Stê¿enie E2 w surowicy wynosi³o 175 pg/ml, stê¿enie FT w surowicy wynosi³o 85 pg/ml.
Ryc. 3. Naj¹drze 13-letniego ¿ubra. Plemniki pomiêdzy ko-mórkami nacieku. Barw. H i E. Pow. 400 ×
Ryc. 4. Naj¹drze 13-letniego ¿ubra. Plazmocyty tworz¹ sku-piska od 5 do 30 komórek. Zgrupowania plazmocytów niere-gularnie rozrzucone w preparacie. Metoda Bracheta. Pow. 400 ×
Ryc. 5. Naj¹drze 13-letniego ¿ubra. Dodatni odczyn na vi-mentynê w komórkach nacieku oraz w komórkach miênio-wych g³adkich przewodu naj¹drza. W komórkach nacieku produkt reakcji o charakterze ziarnistym nierównomiernie wype³nia cytoplazmê komórki, przy czym natê¿enie reakcji jest ró¿ne, w jednych komórkach odczyn jest silny, w innych redni. W komórkach miêniowych g³adkich przewodu na-j¹drza odczyn jest s³aby, zlokalizowany w cytoplazmie. Pow. 200 ×
Tab. 1. rednie wartoci oceny morfometrycznej stopnia rozrostu tkanki ³¹cznej naj¹drza doros³ych samców ¿ubrów (x ± SD)
Objanienia: Nr 1043 13-letni samiec ¿ubra z diagnozowan¹ zmian¹ w naj¹drzu; B1 i F2 dwa doros³e samce ¿ubra z prawid-³ow¹ budow¹ naj¹drzy
a r b u ¿ r N Rozrosttkanki³¹cznej(µm) D S ± x min. max. 3 4 0 1 y n a d a B 163,14±73,11 49,44 438,6 1 B y n l o rt n o K 70,86±27,1 19,39 115,6 2 F y n l o rt n o K 49,72±32,1 19,12 177,4
Med. Weter. 2012, 68 (5) 302
Masa cia³a i masa j¹der badanego ¿ubra nie ró¿ni³a siê od masy innych osobników bêd¹cych w tym sa-mym wieku (powy¿ej 12. roku) (3, 7). Natomiast stê¿enie wolnego testosteronu w surowicy tego zwie-rzêcia osi¹gnê³o wysok¹ wartoæ w porównaniu do innych starych ¿ubrów (2). Byæ mo¿e przejawiana przez ¿ubra agresja by³a nastêpstwem wysokich stê-¿eñ FT, bêd¹cego czynn¹ frakcj¹ testosteronu. Nato-miast stê¿enie 17â-estradiolu w surowicy nie odbie-ga³o od wartoci stê¿eñ tego hormonu u innych sta-rych zwierz¹t tego gatunku (dane nie publikowane).
Zmiany histopatologiczne stwierdzone w naj¹drzu trzynastoletniego ¿ubra mia³y charakter wytwórczy, rozwija³y siê w procesie przewlek³ego zapalenia. wiadcz¹ o tym widoczne w preparatach komórki plaz-matyczne, których obecnoæ potwierdzono barwieniem metod¹ Bracheta. Rozrost tkanki ³¹cznej zrêbu naj¹d-rza równie¿ przemawia³ za przewlek³ym zapaleniem wytwórczym. Identyfikacja ognisk nietypowych dla struktur naj¹drza ¿ubra oparta na metodach barwienia histologiczego nastrêcza trudnoci. Immunohistoche-miczna ocena opisanych skupisk komórek w naj¹drzu nie da³a wi¹¿¹cych rozstrzygniêæ odnonie do ich cha-rakteru. Dodatni wynik barwienia w kierunku wykry-cia receptorów wimentyny pozwoli³ jedynie na przy-puszczenie, ¿e komórki te maj¹ pochodzenie mezen-chymatyczne, jednak¿e wygl¹d struktur w postaci zespo³u komórek o wygl¹dzie epitelioidnym wyra-nie wskazuje na mikroziarniniaki utworzone przez komórki nab³onkowate. Te przekszta³cone makrofagi nie zachowuj¹ markerów charakterystycznych dla osiad³ych makrofagów, takich jak CD 68 czy Mac 387 (14, 16). O w³aciwociach ¿ernych badanych komó-rek mo¿e wiadczyæ obecnoæ plemników w obszarze badanych ognisk. Prawdopodobne jest, ¿e pod wp³y-wem nieznanego czynnika zapaleniotwórczego dosz³o do uszkodzenia kanalików naj¹drza i ich fagocytozy. Mo¿liwe jest równie¿ niszczenie kanalików naj¹drza przez bia³ka komórek nab³onkowatych, na skutek czego nast¹pi³o przemieszczenie plemników do zrêbu naj¹drza (11). Nieznany jest czynnik, który spowodo-wa³by tego typu zmiany. Potencjalnym patogenem, który u prze¿uwaczy wywo³uje zmiany w j¹drze i na-j¹drzu, jest Brucella abortus. Dotychczasowe badania maj¹ce na celu wykrycie zaka¿enia t¹ bakteri¹ wyklu-czaj¹ jednak jej udzia³ w patogenezie chorób u ¿ubrów w Polsce (5), a zatem pochodzenie zmian, które stwier-dzono w naj¹drzu pozostanie nieznane, lecz pewny jest ich charakter wytwórczy.
Pimiennictwo
1.Czykier E.: The case of left crypthorchid testis in the European bison histo-logical and morphometric description. Med. Weter. 2011, 67, 774-777. 2.Czykier E., Krasiñska M.: Stê¿enia wolnego testosteronu w surowicy
sam-ców ¿ubra (Bison bonasus) w zale¿noci od wieku, masy cia³a i masy j¹der badanie wstêpne. Parki Nar. Rez. Przyr. 2006, 25, 119-131.
3.Czykier E., Sawicki B., Krasiñska M.: Postnatal development of the European bison spermatogenesis. Acta Theriol. 1999, 44, 77-90.
4.Gill J.: Zarys fizjologii ¿ubra. Wyd. Severus. Warszawa 1999, 42-60.
5.Kita J., Anusz K.: Serologic survey for bovine pathogens in free-ranging Europen bisons from Poland. J. Wildl. Dis. 1991, 27, 16-20.
6.Koziorowski M., Seremak B., Gi¿ejewski Z., Gilu P., Kozio³ K., Kowal E., Jagustyn B., Sulik M., Szeleszczuk O., Olech W., Söderguist L., Glogowski J.: Season controlled reproduction of undomesticated animals. Reprod. Biol. 2006, 6, 137-149.
8.Krasiñska M., Krasiñski Z. A.: European bison. The Nature Monograph. Mammal Research Institute, Polish Academy of Sciences, Bia³owie¿a 2007, 1-317.
7.Krasiñska M., Gi¿ejewski Z., Czykier E., Krasiñski Z. A., Matuszewska M.: Changes of weight and size of European bison testes during postnatal deve-lopment. Acta Theriol. 2009, 54, 111-126.
9.Krasiñska M., Krasiñski Z. A.: Przebieg i dyspersja choroby nekrotycznego zapalenia napletka samców ¿ubra na terenie polskiej czêci Puszczy Bia³o-wieskiej. Parki nar. Rez. Przyr. 2010, 29, 107-128.
10.Krasiñski Z. A., Caboñ-Raczyñska K., Krasiñska M.: Immobilizing and marking of the European bison. Acta Theriol. 1982, 27, 181-190. 11.Madej J. A.: Zapalenie przekroczenie kompetencji obronnych. Med. Weter.
2010, 66, 156-161.
12.Matuszewska M., Sysa P.: Epididymal cysts in European bison. J. Wildl. Dis. 2002, 38, 637-640.
13.Matuszewska M., Sysa P.: Epididymal defects in European bison. Folia Morphol. 2001, 60, Suppl. 145.
14.Pedica F., Pecori S., Vergine M., Brunelli M., Montagna L., Parolini C., Daniele I., Capelli P., Menestrina F., Chilosi M.: Cathepsin-k as a diagno-stic marker in the identification of micro-granulomas in Crohns disease. Pathologica. 2009, 101, 109-111.
15.Piusiñski W., Bielecki W., Malicka E., Kita J., Dzi¹ba K., Osiñska B., Anusz K., Kowalski B., Lenartowicz-Kubrat Z.: Pathomorphology and pathogenesis of diseased genital organs (prepuce and penis) of bison in the Bia³owie¿a Forest. Med. Weter. 1997, 53, 596-600.
16.Reghelin D., Poletti V., Tomassett S., Dubini A., Cavazza A., Rossi., Lesta-ni M., Pedron S., Daniele I., Montagna L., Murer B., Chilos M.: Cathepsin-K is a sensitive immunohistochemical marker for detection of micro-granulo-mas in hypersensitivity pneumonitis. Sarcoidosis Vasc. Dif. 2010, 27, 57-63. 17.Sysa P., Matuszewska M.: Cytogenetic, ultrastructure of seminiferous tubu-les and epididymal cysts in European bison Bison bonasus (L.), [w:] Kita J., Anusz K.: Health threats for the European bison partilularly in free-roaming populations in Poland. The SGGW Publishers, Warszawa 2006, 244-249. 18.wie¿yñski K.: The male reproduction organs of the European bison. Acta
Theriol. 1968, 13, 511-551.
19.Wêgrzyn M., Serwatka S.: Teeth eruption in the European bison. Acta Theriol. 1984, 29, 111-121.
Adres autora: dr med. El¿bieta Czykier, ul. Waszyngtona 13, 15-269 Bia³ystok; e-mail: czykier@umwb.edu.pl
