ELW IRA W O R O B IE J
ZMIANY WIELKOŚCI MAS CZĄSTECZKOWYCH BIAŁEK PREPARATÓW Z NASION ROŚLIN STRĄCZKOWYCH
POD WPŁYWEM RODNIKÓW HYDROKSYLOWYCH
S t r e s z c z e n i e
W pracy określano zmiany zachodzące w białkach preparatów nasion bobu, grochu i fasoli poddanych działaniu rodników hydroksylow ych. Rozdziały przeprowadzone m etodą SE-HPLC w ykazały, że białka badanych gatunków nasion roślin strączkow ych zachow ują się odmiennie pod w pływ em tych rodników.
W białkach preparatów bobu i grochu Ό Η spowodowały przyrost frakcji w ysokocząsteczkowej (330-400 kDa), wynikający z rozkładu i polim eryzacji podjednostek niskocząsteczkowych. N atom iast główna frakcja białek fasoli (7S) ulegała częściowej fragmentacji pod w pływ em *OH.
Wstęp
W olne rodniki (np.'O H , 0 2*~) oraz inne aktyw ne form y tlenu ( ’0 2, H20 2) w yw o
łując szereg niekorzystnych zm ian w żyw ności, przyczyniają się do pogorszenia jej jakości żyw ieniow ej i sensorycznej.
W przem yśle spożyw czym procesom utleniania zapobiega się pow szechnie przez stosow anie przeciw utleniaczy. D u żą w agę przyw iązuje się ostatnio do przeciw utlenia- jących w łaściw ości białek [7, 8, 12]. B adania przeprow adzone na białkach nasion ro
ślin strączkow ych w ykazały ich w ysoką aktyw ność antyrodnikow ą [1, 3, 4, 9],
N ależy jed n ak rów nież zw rócić uw agę na fakt, że białka biorąc udział w zm iata
niu w olnych rodników sam e u legają zm ianom - następuje fragm entacja i tw orzenie polim erów [6, 7], zostaje też obniżona ich straw ność [10]. Produkty pow stałe pod w pływ em rodników nie są w ykorzystyw ane przy syntezie białka [1 1],
M gr inż. E. Worobiej, Zakład O ceny Jakości Żywności, Wydział Technologii Żywności, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego, u l Rakowiecka 26/30, 02-528 Warszawa.
56 Elw ira Worobiej
C elem pracy było określenie zm ian zachodzących w białkach preparatów otrzy
m anych z nasion bobu, grochu i fasoli pod w pływ em działania rodników hydroksylo
wych.
Materiał i metody badań
M ateriał dośw iadczalny stanow iły obłuszczone i zm ielone nasiona bobu odm iany Bartom , grochu odm iany Poa, fasoli białej odm ian Piękny Ja ś Tyczny i Prosną oraz fasoli kolorow ej: brązow ej odm iany N ida, czarnej odm iany Green M un g i czerwonej odm iany R ed K idney.
B adania prow adzono na preparatach białkow ych otrzym anych w procesie izolacji w punkcie izoelektrycznym z alkalicznych ekstraktów m ąki. O czyszczoną globulinę 7S z nasion fasoli uzyskano we Francji w Laboratorium Technologii i B iochem ii B iałek (INRA, N antes).
Preparaty białkow e [5 m g białka/m l] inkubow ano w 37°C przez 24 godz., w m ie
szaninie generującej w olne rodniki hydroksylow e, zaw ierającej H202/C u2+ w buforze fosforanow ym o pH 7,2. P róbką odniesienia były preparaty nie poddane działaniu rod
ników hydroksylow ych.
Do określenia zm ian w ielkości mas cząsteczkow ych białek preparatów pod w pływ em rodników hydroksylow ych stosowano m etodą SE-HPLC. R ozdziały białek w ykonyw ano na kolum nie TSK G 2000SW LKB (0,75 x 60 cm), a ich detekcją prow a
dzono przy 280 nm (detektor U V SPD -6A Shim adzu). Do elucji używ ano bufor fosfo
ranow y (0,1 M; pH 7,0) i N aCl (0,5M ) o przepływ ie 0,5 m l/m in. N a kolum ną nanoszo
no 20 μΐ przesączonej (filtr Supelco) próbki. Do kalibracji kolum ny w ykorzystano w zorce m as cząsteczkow ych (firm y Pierce): cytochrom (12.5 kD a), chym otrypsynogen (25 kDa), album iną ja ja (45 kDa), album iną w ołow ą (67 kDa), katalazą (158 kDa), ferrytyną (240 kD a) i Blue D ekstran (2000 kDa).
Omówienie wyników
M asy cząsteczkow e frakcji białkow ych obliczano stosując rów nanie A ndrew s’a [2], K alibracja kolum ny w ykazała, że nie m ożna w yznaczyć m as cząsteczkow ych dw óch pików o najkrótszych czasach retencji. W oparciu o dane literaturow e [5]
pierw szą frakcją zidentyfikow ano jako globuliną 11S o m. cz. 330-400 kDa. N atom iast drugi pik zidentyfikow ano jak o globuliną 7S (150-180 kDa) na podstaw ie rozdziałów oczyszczonego preparatu tej frakcji.
A nalizując udziały procentow e frakcji białek zam ieszczone w tab. 1. oraz chro- m atogram y preparatów bobu i grochu (rys. 1A, IB ) stw ierdzono, że oddziaływ anie rodników hydroksylow ych spow odow ało rozkład i polim eryzacją frakcji niskoczą-
steczkow ych o m. cz. 13-16 kD a oraz znaczny w zrost udziału frakcji o m .cz. 330—
400 kDa.
T a b e l a 1
Udział procentowy frakcji białek preparatów bobu, grochu i fasoli oraz 7S globuliny po inkubacji (37oC/24 godz.) bez rodników i z rodnikami hydroksylowymi.
Fraction contents [%] o f faba bean, pea and beans proteins preparations and 7S globulin after incubation (37°C/24 h) with and w ithout hydroxyl radicals.
Masa cząste
czkowa M olecular
mass [kDa]
Bób Faba bean
Groch Pea
Fasola / Bean 7S globulina
7S globulin
Nida Jaś Tyczny
bez *OH z ’OH bez ’OH z 'O H bez *OH z ’OH bez ’OH z ’OH bez ’OH z ’OH
330-400 53,5 94 53,5 78,5 8 8,5 8 11 10 16
150-180 - - - - 41 36 22,5 23 90 81
52 - - - - - - 4,5 6,5 - -
33,5 - - - - 6,5 4 5 5,5 - -
21,5 - - -
16,5 2 2,5 -
44,5
- -
16 38,5* -
43,5 -
31,5 50,5 -
13,2 - 5 - - 3
12,5 - - - - 15 - - - - -
11,3 4 - 3 - 9,5 2,5 - - - -
10,4 4 6 - - 6 13 3 9,5 - -
9,5 - - - - 7 - 2,5 - - -
8,3 - - - - 5 2 4 - - -
* - piki nie rozdzielone / non-separated peaks.
R ozdziały białek czterech spośród pięciu badanych odm ian fasoli były bardzo p o dobne, dlatego przykładow o przedstaw iono chrom atogram białek fasoli brązowej od
m iany N ida (rys. 2A). W białkach preparatów fasoli dom inow ała frakcja 7S, która stanow iła ok. 41% w szystkich białek. Pow ierzchnia tej frakcji pod w pływ em ’OH nie zm ieniła się znacząco. Stw ierdzono, że jej udział obniżył się o ok. 12%. W yraźniejsze zm iany zaobserw ow ano we frakcjach niskocząsteczkow ych, w m iejscu pięciu frakcji o m asach od 8 do 12,5 kD a zaobserw ow ano frakcję o m. cz. 13-16 kD a stanow iącą ok.
32%. N astępow ał rów nież przyrost ilościow y frakcji o m. cz. ok. 10 kDa.
N a rys. 2B przedstaw iono chrom atogram rozdziału białek fasoli odm. Ja ś Tyczny, którego przebieg w yraźnie różnił się w porów naniu z pozostałym i odm ianam i. W b iał
kach tej fasoli dom inow ała frakcja o m. cz. ok. 16 kDa, która pod w pływ em ’OH u le
gała fragm entacji i polim eryzacji do podjednostek o nieco wyższej m asie cząsteczko
wej.
58 Elwira Worobiej
Rys. 1. Chrom atogram y rozdziału białek preparatów bobu (A) i grochu (B) inkubowanych (37°C/24 godz.) bez rodników i z rodnikami hydroksylowymi.
Fig. 1. Chrom atogram s o f protein preparations from faba bean (A) and pea (B) incubated (37°C/24 h) w ith and w ithout hydroxyl radicals.
ZMIANY WIELKOŚCI MAS CZĄSTECZKOWYCH BIAŁEK PREPARATÓW Z NASION ROŚLIN.., 59
Rys. 2. Chrom atogram y rozdziału białek preparatów fasoli odmian Nida (A) i Jaś Tyczny (B) oraz fakcji 7S (C) inkubow anych (37°C/24 godz.) bez rodników i z rodnikami hydroksylowymi.
Fig. 2. Chrom atogram s o f protein preparations from beans var. Nida (A) and Jaś Tyczny (B) and o f 7S fraction (C) incubated (37°C/24 h) with and without hydroxyl radicals.
60 Elwira Worobiej B iałka fasoli składają się z kilku podjednostek. A by stw ierdzić jak im zm ianom pod w pływ em *OH ulegała głów na frakcja, badania przeprow adzono rów nież na oczyszczonej do 90% globulinie 7S otrzym anej z nasion fasoli (rys. 2C). Efektem działania rodników było pow iększenie się obecnej rów nież w preparacie frak
cji w ysokocząsteczkow ej ( 3 3 0 ^ 0 0 kDa) i pow stanie podjednostek niskocząsteczko- w ych (1 3 -1 6 kD a), w ynikające ze zm niejszenia udziału głównej frakcji o ok. 10%.
Dane otrzym ane z rozdziałów 7S globuliny potw ierdzają w yniki otrzym ane dla czte
rech odm ian fasoli.
B iałka badanych gatunków nasion roślin strączkow ych zachow yw ały się odm ien
nie pod w pływ em działania rodników hydroksylow ych, co w ynika z różnic w składzie ich podstaw ow ych frakcji.
Wnioski
1. W białkach bobu i grochu, pod w pływ em rodników hydroksylow ych, następuje znaczący w zrost udziału frakcji w ysokocząsteczkow ej, św iadczący o polim eryzacji białek.
2. M niejsze zm iany pod w pływ em rodników zachodziły w białkach fasoli i dotyczyły głów nie podjednostek niskocząsteczkow ych, natom iast udział frakcji globulin 7S zm ieniał się nieznacznie.
LITERATURA
[1] A laiz M ., Zam ora R., H idalgo, F.J. A ddition o f oxidized lipid/amino acid reaction products delays the peroxidation initiated in a soybean oil. J. Agric. Food Chem., 43, 1995, 2698.
[2] Andrews P., Estim ation o f m olecular weights o f proteins by Sephadex gel-filtration, Biochem. J., 94, 1964,222.
[3] Chen Η -M ., M uram oto K., Y am auchi F.: Structural analysis o f antioxydative peptides from soybean beta-conglycinin. J. Agric. Food Chem., 43, 1995, 574.
[4] Chen Η -M., M uramoto K., Y am auchi F., Fujimoto K., N okihara K.: A ntioxidative properties o f histidine-containing peptides designed from peptide fragments found in the digests o f a soybean protein. J. Agric. Food Chem. 46,1998, 49.
[5] D erbyshire E., W right D. J., B oulter D.: Legum in and V icilin, Storage Proteins o f Legume Seeds.
Phytochem istry, 15, 1976, 3.
[6] G ardner H. W.: Lipid Hydroperoxide Reactivity w ith Proteins and Amino Acids: A Review. J.
Agric. Food Chem., 27, 1979, 220.
[7] H unt J.V., Sim pson J.A., D ean R.T.: Hydroperoxide-mediated Fragm entation o f Proteins. Biochem.
J., 250, 1988, 87.
[8] K anazaw a K., A shida H., N atake M.: Autoxidizing process interaction o f linoleic acid w ith casein.
J. Food Sci., 52, 1987,475.
[9] Okada, Y., Okada, M. Scavenging effect o f w ater soluble proteins in broad beans o f free radicals and active oxigen species. J. Agric. Food Chem., 46, 1998, 401.
[10] Sanchez-V ioque R., Vioque J., Clemente A., Pedroche J., B autista J., M ilian F.: Interaction o f chickpea (Cicer arietinum L.) legum in w ith oxidized linoleic acid. J. Agric. Food Chem. 47, 1999, 813.
[11] Simat T.J., Steinhard H.: O xidation o f free tryptophan and tryptophan residues in peptides. J. Agric.
Food Chem., 46, 1998, 490.
[12] Y amamoto Y., Kato E., Ando A.: Increased antioxidative activity o f ovalbum in by heat treating in an emulsion o f linoleic acid. Biosci. Biotech. Biochem., 60, 1996, 1430.
C H A N G E S IN M O L E C U L A R M A SS O F L E G U M E P R O T E IN P R E P A R A T IO N S CA U SED BY H Y D R O X Y L R A D IC A LS
S u m m a r y
Changes induced in protein preparations from pea, bean and faba bean by hydroxyl radicals were de
termined in this study. Size exclusion chrom atography showed that the proteins o f legumes investigated are subjected to different changes. In pea and faba been proteins the radicals caused the increm ent o f high m olecular w eight fraction (330-400 kDa) o f resulted from fragmentation and polym erisation o f low m o
lecular w eight subunits and, on the contrary, the main fraction o f bean proteins (7S) undergoes partial fragmentation. ^
