Izolacja genomowego DNA z plam krwawych metodą absorpcji-elucji

(1)

Wstęp i cel

Izolacja kwasu dezoksyrybonukleinowego ze œla-dów biologicznych zabezpieczonych na miejscu zda-rzenia jest jednym z wa¿niejszych etapów badañ w ge-netycznych badaniach kryminalistycznych. Otrzymanie pe³nego profilu genetycznego sprawcy uzale¿nione jest miêdzy innymi od uzyskania odpowiedniego stê¿e-nia DNA w roztworze wolnym od inhibitorów reakcji ³añ-cuchowej polimeryzacji (PCR). Wybór odpowiedniej metody ekstrakcji DNA stanowi klucz do uzyskania pra-wid³owych wyników badañ. Dostêpnych jest wiele ko-mercyjnych zestawów dedykowanych do wyodrêbnia-nia ludzkiego DNA z ró¿nego rodzaju materia³u, z jakim mo¿na siê spotkaæ w badaniach medyczno-s¹dowych. W numerze 264/2009 „Problemów Kryminalistyki” przedstawione zosta³y wyniki doœwiadczeñ maj¹cych

na celu porównanie efektywnoœci ró¿nych metod izola-cji genomowego DNA ze œladów biologicznych [1]. W artykule omówiono skutecznoœæ czterech nowych ze-stawów przeznaczonych do izolacji DNA ze œladów bio-logicznych. Dwa z nich opiera³y siê na technologii se-paracji magnetycznej, dwa pozosta³e by³y to zestawy kolumienkowe wykorzystuj¹ce technologiê separacji kwasu dezoksyrybonukleinowego na membranie siliko-nowej. W przypadku metod kolumienkowych jednym z etapów ekstrakcji jest oddzielenie lizatu od pod³o¿a, na

którym znajdowa³ siê zabezpieczony œlad biologiczny, a nastêpnie jego transfer na membranê silikonow¹ wi¹-¿¹c¹ DNA. Od sposobu przeprowadzenia tego etapu zale¿y w du¿ej mierze wydajnoœæ ca³ego procesu izo-lacji. Odzyskanie jak najwiêkszej objêtoœci lizatu ma bowiem bezpoœredni wp³yw na stê¿enie DNA w uzy-skanym ekstrakcie. W praktyce laboratoryjnej lizat naj-czêœciej odci¹ga siê z probówki i przenosi na kolumnê silikonow¹ za pomoc¹ pipety (ryc. 1–3). Mo¿e to jed-nak powodowaæ pozostawanie cennego materia³u ge-netycznego na pod³o¿u. Dzieje siê tak szczególnie w przypadku pod³o¿y ch³onnych, np. tkanin, papieru.

Istnieje jednak alternatywna metoda, w której lizat wraz z pod³o¿em umieszcza siê w specjalnym filtrze, a nastêpnie odwirowuje. Pod³o¿e zostaje zatrzymane na siateczce o odpowiedniej strukturze, natomiast ca³y roztwór przechodzi do dolnej czêœci probówki. Tak

od-dzielony lizat przenosi siê w ca³oœci na kolumnê siliko-now¹. Schemat procedury oczyszczania lizatu z u¿y-ciem filtra przedstawia rycina 4.

Na stê¿enie DNA w uzyskanym ekstrakcie wp³ywa równie¿ iloœæ RNA obecnego w lizacie. Z³o¿e krzemion-kowe wchodz¹ce w sk³ad kolumn stosowanych w izo-lacji metod¹ absorpcji-elucji przy³¹cza zarówno kwas rybonukleinowy, jak równie¿ kwas dezoksyrybonukle-inowy. Dodanie do buforu lizuj¹cego odpowiedniego odczynnika, tzw. noœnika RNA, zwiêksza efektywnoœæ

Magdalena Dębska Jacek Drabik

Izolacja genomowego DNA

z plam krwawych

metodą absorpcji-elucji

Ryc. 1. Schemat izolacji DNA metod¹ separacji na membranie silikonowej z przenoszeniem lizatu na kolumnê za pomoc¹ pipety Fig. 1. Scheme of DNA isolation using separation on silica membrane with transferring lysate onto the column by pipette Ÿród³o (ryc. 1–9b): autorzy

Liza Przeniesienie

(2)

wi¹zania DNA do membrany silikonowej na kolumnie [2]. W przypadku izolacji DNA ze œladów kryminali-stycznych, a tak¿e próbek zawieraj¹cych ma³e iloœci DNA zestawem QIAamp®DNA Micro zaleca siê stoso-wanie noœnika RNA. Substancja ta, wed³ug producen-ta zesproducen-tawu, sproducen-tabilizuje DNA w próbkach o bardzo ni-skim stê¿eniu kwasów nukleinowych (ryc. 5–7).

Ryc. 2a–c. Przenoszenie lizatu na kolumnê za pomoc¹ pipety (NucleoSpin®Tissue XS)

Fig. 2a–c. Transferring lysate onto the column by pipette (NucleoSpin®Tissue XS)

Ryc. 3a–b. Przenoszenie lizatu na kolumnê za pomoc¹ pipety (QIAamp® DNA Micro)

Fig. 3a–b. Transferring lysate onto the column by pipette (QIAamp® DNA Micro)

(3)

Celem przeprowadzonych badañ by³o sprawdzenie, w jaki sposób zastosowanie etapu oddzielania pod³o¿a od lizatu za pomoc¹ filtrów wp³ywa na efektywnoœæ izo-lacji DNA w zastosowanej metodzie. Testowano rów-nie¿ wp³yw obecnoœci noœnika RNA w buforze lizuj¹-cym na wydajnoœæ procesu ekstrakcji. Otrzymane wy-niki zosta³y porównane pod k¹tem wydajnoœci metody (porównanie uzyskanych stê¿eñ DNA) oraz jakoœci uzyskanego DNA (porównanie uzyskanych profili ge-netycznych). Zwrócono równie¿ uwagê na ryzyko

wy-st¹pienia kontaminacji na etapie oddzielania lizatu na filtrach.

Materia³ i metody

Materia³em do badañ by³y jak uprzednio [1] próbki krwi pobrane od oœmiu osób i umieszczone w probów-kach z heparyn¹ jako œrodkiem antykoagulacyjnym. Krew nanoszono na pod³o¿e ch³onne (ja³owe p³ótno) oraz na pod³o¿e ch³onne zawieraj¹ce inhibitor PCR

Ryc. 4. Schemat izolacji DNA metod¹ separacji na membranie silikonowej z u¿yciem filtra do oddzielenia lizatu od pod³o¿a Fig. 4. Scheme of DNA isolation using separation based on silica membrane with lysate separation by means of filter unit

Ryc. 5b. Pod³o¿e w filtrze NucleoSpin po odwirowaniu (NucleoSpin®Tissue XS)

Fig. 5b. Solid sample material on NucleoSpin filter unit after centrifugation (NucleoSpin®Tissue XS)

Ryc. 5a. Lizat wraz z pod³o¿em na filtrze NucleoSpin (NucleoSpin®Tissue XS)

Fig. 5a. Lysate with solid sample material on NucleoSpin filter unit (NucleoSpin®Tissue XS)

(4)

(materia³ jeansowy) o wymiarach oko³o 5 x 5 mm, a na-stêpnie przechowywano przez okres 4 miesiêcy w wy-ja³owionych, suchych, otwartych probówkach w tempe-raturze pokojowej. Wszystkie próbki poddano ekstrak-cji DNA metod¹ absorpekstrak-cji-eluekstrak-cji z wykorzystaniem dwóch ró¿nych zestawów odczynników:

1. Izolacjê DNA z u¿yciem zestawu Nucleo-Spin®Tissue XS (ryc. 8a–b) wykonano w dwóch wariantach:

a) zastosowanie etapu oddzielania lizatu na filtrach NucleoSpin®,

b) przenoszenie lizatu na kolumnê silikonow¹ za po-moc¹ pipety bez u¿ycia filtrów.

Dla ka¿dego wariantu wykonano osiem powtórzeñ dla nastêpuj¹cych przypadków:

• 1 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno. • 2,5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno. • 5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno.

• Degradacja – 1 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ót-no, degradowanej 30 min w temp. 150oC.

• Inhibicja – 1 μl krwi naniesionej na materia³ jean-sowy zawieraj¹cy barwnik indygo.

• Kontrola negatywna – ja³owe p³ótno bez naniesio-nej krwi.

Izolowane DNA zawieszano zgodnie z zaleceniami producenta w objêtoœci 20 μl.

2. Izolacjê DNA z u¿yciem zestawu QIAamp® DNA Micro wykonano w trzech wariantach:

a) zastosowanie etapu oddzielania lizatu na filtrach QIAshredder (ryc. 9a–b); bufor lizuj¹cy z dodat-kiem noœnika RNA,

b) przenoszenie lizatu na kolumnê silikonow¹ za po-moc¹ pipety bez u¿ycia filtrów; bufor lizuj¹cy bez dodatku noœnika RNA,

c) przenoszenie lizatu na kolumnê silikonow¹ za po-moc¹ pipety bez u¿ycia filtrów; bufor lizuj¹cy z dodatkiem noœnika RNA.

Dla ka¿dego wariantu ekstrakcjê wykonano dla na-stêpuj¹cych przypadków:

• 1 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno (8 powtó-rzeñ).

• 5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno (6 powtó-rzeñ).

• Inhibicja – 1 μl krwi naniesionej na materia³ jean-sowy zawieraj¹cy barwnik indygo (8 powtórzeñ). • Kontrola negatywna – ja³owe p³ótno bez

naniesio-nej krwi (8 powtórzeñ).

Izolowane DNA zawieszano zgodnie z zaleceniami producenta w objêtoœci 20 μl.

Ekstrakcjê DNA przeprowadzono zgodnie z zalece-niami producentów, stosuj¹c protoko³y dla œladów kry-minalistycznych w postaci zaschniêtych plam krwa-wych [2, 3]. Wszystkie badania przeprowadzono

Ryc. 6. Pod³o¿e na filtrze QIAshredder po zwirowaniu (QIAamp® DNA Micro)

Fig. 6. Solid sample material on QIAshredder filter unit after centrifugation (QIAamp® DNA Micro)

Ryc. 7. Noœnik RNA (QIAamp® DNA Micro) Fig. 7. Carrier RNA (QIAamp® DNA Micro)

(5)

w obecnoœci kontroli pozytywnej (DNA o znanym geno-typie) oraz kontroli negatywnej (próba odczynnikowa), otrzymuj¹c prawid³owe dla nich wyniki.

Oznaczenie stê¿enia DNA w uzyskanych izolatach wykonano metod¹ „Real Time PCR” za pomoc¹ apa-ratu ABI PRISM 7500 Sequence Detection System i oprogramowania 7500 System Detection Software v. 1.2.3 z zastosowaniem zestawu odczynników Quanti-filer™ Human DNA Quantification Kit. Otrzymane eks-trakty DNA amplifikowano z u¿yciem zestawu odczyn-ników AmpFlSTR® SGM Plus™ i aparatu GeneAmp PCR System 9700. Produkty reakcji PCR poddawano elektroforezie w sekwenatorze ABI PRISM®3130 XL. Do analizy wyników u¿ywano oprogramowania Gene-Mapper® ID v.3.2.1 firmy Applied Biosystems.

Wyniki uzyskane z oznaczenia iloœciowego stê¿eñ DNA po izolacji zestawem NucleoSpin® Tissue XS opracowano przy u¿yciu testu t-studenta, natomiast zestawem QIAamp® DNA Micro przy u¿yciu analizy wariancji testem Tukeya. Do obliczeñ statystycznych zastosowano wersjê demo oprogramowania Graph-Pad Prism v. 5 (zgodnie z obowi¹zuj¹c¹ licencj¹ pro-ducenta).

Wyniki

Testowane w doœwiadczeniu warianty oddzielania li-zatu od pod³o¿a, a tak¿e wp³yw obecnoœci noœnika RNA w buforze lizuj¹cym na efektywnoœæ izolacji anali-zowano w nastêpuj¹cych aspektach:

• Wydajnoœæ metody (uzyskane stê¿enia DNA). • Jakoœæ uzyskanego DNA (obraz profili

genetycz-nych).

• Ryzyko wyst¹pienia kontaminacji (obecnoœæ profili mieszanych).

Analiza ilościowa uzyskanego DNA

Izolacja DNA z użyciem zestawu NucleoSpin® Tissue XS

Zale¿noœæ stê¿enia DNA w otrzymanych izolatach od wariantu oddzielania lizatu od pod³o¿a dla metody NucleoSpin®Tissue XS przedstawiaj¹ tabele 1–5.

Ryc. 8a. Zestaw filtrów NucleoSpin oraz kolumienek silikonowych (NucleoSpin®Tissue XS)

Fig. 8a. NucleoSpin filter units and silica membrane columns (NucleoSpin®Tissue XS)

Ryc. 8b. Kolumna z membran¹ silikonow¹ (NucleoSpin®Tissue XS) Fig. 8b. Silica membrane column (NucleoSpin®Tissue XS)

Ryc. 9a. Zestaw filtrów QIAshredder oraz kolumienek silikonowych (QIAamp® DNA Micro)

Fig. 9a. QIAshredder filter units and silica membrane columns (QIAamp® DNA Micro)

Ryc. 9b. Kolumna z membran¹ silikonow¹ (QIAamp® DNA Micro) Fig. 9b. Silica membrane column (QIAamp® DNA Micro)

(6)

Wy¿sze œrednie stê¿enie DNA izolowanego z mate-ria³u stanowi¹cego 1 μl krwi naniesionej na p³ótno uzy-skano przy przenoszeniu lizatu na kolumnê Nucleo-Spin® za pomoc¹ pipety. W przypadku zastosowania tego sposobu istnieje du¿a rozbie¿noœæ pomiêdzy wy-nikami cz¹stkowymi, co potwierdza otrzymana wysoka wartoœæ odchylenia standardowego. Przy zastosowa-niu filtrów do oddzielania lizatu od pod³o¿a w próbce nr 3 zanotowano wy¿sze stê¿enie DNA, znacznie odbie-gaj¹ce od innych wyników (1,98 ng/μl). Pomimo wyeli-minowania tej wartoœci z obliczeñ statystycznych za pomoc¹ testu Grubbsa, nie stwierdzono statystycznie istotnej ró¿nicy pomiêdzy otrzymanymi œrednimi stê¿e-niami DNA po izolacji z zastosowaniem filtrów i przy przenoszeniu lizatu na kolumnê za pomoc¹ pipety.

Przy izolacji DNA z materia³u stanowi¹cego 2,5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno, podobnie jak w przy-padku 1 μl krwi, wy¿sze œrednie stê¿enie DNA w eks-traktach uzyskano przy zastosowaniu wariantu z prze-noszeniem lizatu na kolumnê za pomoc¹ pipety. Stosu-j¹c filtry do oddzielania lizatu od pod³o¿a, otrzymano du¿¹ rozbie¿noœæ wyników cz¹stkowych. Odchylenie standardowe przewy¿szy³o wartoœæ œredni¹ obliczon¹ na podstawie wyników z pomiarów. W tym przypadku równie¿ nie stwierdzono statystycznie istotnej ró¿nicy

Tabela 1 Stê¿enie DNA [ng/μl] uzyskane w zale¿noœci od zastosowanego wariantu oddzielania lizatu od pod³o¿a

przy izolacji DNA metod¹ NucleoSpin®Tissue XS z materia³u stanowi¹cego 1 μl krwi

naniesionej na ja³owe p³ótno

Concentration of DNA [ng/μl] obtained from 1 μl of blood taken from linen using NucleoSpin®Tissue XS method, depending on

the lysate separation variant

S.D. – odchylenie standardowe

[…] – wartoœæ podana w nawiasie zosta³a wyeliminowana z obliczeñ sta-tystycznych za pomoc¹ testu Grubbsa

Ÿród³o (tabele 1–9): opracowanie w³asne

przy izolacji DNA metod¹ NucleoSpin®Tissue XS z materia³u stanowi¹cego 2,5 μl krwi

Concentration of DNA [ng/μl] obtained from 2,5 μl of blood taken from linen using NucleoSpin®Tissue XS method, depending on

przy izolacji DNA metod¹ NucleoSpin®Tissue XS z materia³u stanowi¹cego 5 μl krwi

Concentration of DNA [ng/μl] obtained from 5 μl of blood taken from linen using NucleoSpin®Tissue XS method, depending on

Œrednie stê¿enia DNA [ng/μl] oznaczone parami liter ró¿ni¹ siê staty-stycznie: ab przy p ≤ 0,05 [p – poziom istotnoœci]

(7)

pomiêdzy œrednimi stê¿eniami DNA uzyskanymi po izolacji przy zastosowaniu obu wariantów oddzielania lizatu od pod³o¿a.

W przypadku ekstrakcji DNA z materia³u stanowi¹-cego 5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno stwierdzo-no statystycznie istotnie wy¿sze œrednie stê¿enie DNA w izolatach uzyskanych po przeniesieniu lizatu na ko-lumny silikonowe za pomoc¹ pipety (p ≤ 0,05). W przy-padku próbki nr 3 zmierzona wartoœæ stê¿enia DNA znacznie przewy¿sza³a inne wyniki otrzymane tym sposobem (10,87 ng/μl). Wynik ten wyeliminowano z obliczeñ statystycznych za pomoc¹ testu Grubbsa. Po-dobna sytuacja mia³a miejsce w przypadku próbki nr 2 w opcji z zastosowaniem filtra.

W przypadku izolacji DNA z 1 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno i degradowanej w eksperymentalnie do-branych warunkach termicznych, zastosowanie filtrów do oddzielania lizatu od pod³o¿a skutkowa³o obni¿eniem œredniego stê¿enia DNA w uzyskiwanych izolatach w stosunku do ekstraktów otrzymanych po zastosowaniu wariantu przenoszenia lizatu za pomoc¹ pipety. Wynik ten zosta³ potwierdzony statystycznie (p ≤ 0,05).

Przy izolacji DNA z materia³u stanowi¹cego 1 μl krwi naniesionej na pod³o¿e zawieraj¹ce inhibitor reakcji ³añcuchowej polimeryzacji, wy¿sze œrednie stê¿enie DNA w ekstraktach uzyskano, stosuj¹c filtry do

oddzie-lania lizatu od pod³o¿a. Jednak pomimo wyeliminowa-nia z obliczeñ wartoœci odbiegaj¹cej od pozosta³ych wyników (próbka nr 3 w opcji z zastosowaniem filtra), nie stwierdzono statystycznie istotnej ró¿nicy pomiêdzy otrzymanymi wynikami.

Izolacja DNA z użyciem zestawu QIAamp®DNA Micro

W tabelach 6–8 przedstawiono stê¿enia DNA w izo-latach uzyskanych metod¹ QIAamp®DNA Micro z za-stosowaniem ró¿nych wariantów oddzielania lizatu od pod³o¿a oraz w zale¿noœci od obecnoœci noœnika RNA w buforze lizuj¹cym.

Przy izolacji DNA z materia³u stanowi¹cego 1 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno stwierdzono ni¿sze stê¿e-nie DNA w wariancie oddzielania lizatu od pod³o¿a z zastosowaniem filtrów QIAshredder. W opcji przeno-szenia lizatu na kolumnê za pomoc¹ pipety obecnoœæ noœnika RNA lub jego brak w buforze lizuj¹cym nie od-grywa wiêkszej roli. W obydwu przypadkach uzyskano podobne wartoœci œrednich stê¿eñ DNA w izolatach. Wyniki nie by³y istotne statystycznie.

Izolacja DNA z materia³u stanowi¹cego 5 μl krwi na-niesionej na ja³owe p³ótno wykaza³a wy¿sze œrednie stê¿enie DNA w izolatach otrzymanych przy

przeno-Tabela 4 Stê¿enie DNA [ng/μl] uzyskane w zale¿noœci od zastosowanego wariantu oddzielania lizatu od pod³o¿a

przy izolacji DNA metod¹ NucleoSpin®Tissue XS z materia³u zdegradowanego stanowi¹cego 1 μl krwi

Concentration of DNA [ng/μl] obtained from 1μl of degraded blood taken from linen using NucleoSpin®Tissue XS

method, depending on the lysate separation variant

przy izolacji DNA metod¹ NucleoSpin®Tissue XS z materia³u stanowi¹cego 1 _{μμl krwi naniesionej na jeans} z barwnikiem indygo (pod³o¿e z inhibitorem reakcji PCR) Concentration of DNA [ng/μl] obtained from 1 μl of blood taken

from jeans (PCR inhibitor) using NucleoSpin®Tissue XS method, depending on the lysate separation variant

Œrednie stê¿enia DNA [ng/μl] oznaczone parami liter ró¿ni¹ siê miêdzy sob¹ statystycznie: ab przy p ≤ 0,05 [p – poziom istotnoœci]

(8)

Tabela 6 Stê¿enie DNA [ng/μl] uzyskane w zale¿noœci od zastosowanego wariantu oddzielania lizatu od pod³o¿a przy izolacji DNA

metod¹ QIAamp®DNA Micro z dodatkiem noœnika RNA oraz bez dodatku noœnika RNA do buforu lizuj¹cego z materia³u stanowi¹cego 1 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno

Concentration of DNA [ng/μl] obtained from 1 μl of blood taken from linen using QIAamp®DNA Micro method with or without carrier RNA present in lysis buffer, depending on the lysate separation variant

[…] – wartoœæ podana w nawiasie zosta³a wyeliminowana z obliczeñ statystycznych za pomoc¹ testu Grubbsa

metod¹ QIAamp®DNA Micro z dodatkiem noœnika RNA oraz bez dodatku noœnika RNA do buforu lizuj¹cego z materia³u stanowi¹cego 5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno

Concentration of DNA [ng/μl] obtained from 5 μl of blood taken from linen using QIAamp®DNA Micro method with or without carrier RNA present in lysis buffer, depending on the lysate separation variant

Œrednie stê¿enia DNA [ng/μl] oznaczone parami liter ró¿ni¹ siê miêdzy sob¹ statystycznie: AB przy p ≤0,01 [p – poziom istotnoœci]

(9)

szeniu lizatu na kolumny silikonowe za pomoc¹ pipety. Wynik ten by³ statystycznie istotny (p ≤ 0,01). Po eks-trakcji z dodatkiem i bez dodatku noœnika RNA do bu-foru lizuj¹cego w obydwóch przypadkach uzyskano po-dobne œrednie stê¿enia DNA. W opcji z zastosowaniem filtrów QIAshredder izolacjê wykonano w oœmiu powtó-rzeniach, natomiast przy przenoszeniu lizatu na kolum-nê za pomoc¹ pipety – w szeœciu. Z obliczeñ staty-stycznych wyeliminowano za pomoc¹ testu Grubbsa wartoœci uzyskane dla próbek nr 2, które znacz¹co od-biega³y od innych uzyskanych wyników w wariantach przenoszenia lizatu na kolumny silikonowe za pomoc¹ pipety.

Z materia³u stanowi¹cego 1 μl krwi naniesionej na pod³o¿e zawieraj¹ce inhibitor PCR przy zastosowaniu do oddzielenia lizatu od pod³o¿a filtrów QIAshredder nie uda³o siê wyizolowaæ DNA w ogóle. Tylko w jed-nym przypadku uzyskano stê¿enie DNA w badajed-nym izolacie (0,01 ng/μl), jednak wynik ten, jako odbiega-j¹cy od pozosta³ych, wyeliminowano z obliczeñ staty-stycznych za pomoc¹ testu Grubbsa. Œrednie ze stê-¿eñ DNA w izolatach otrzymanych po izolacji z prze-noszeniem lizatu na kolumny za pomoc¹ pipety by³y jednakowe (0,01 ng/μl) dla procedur z zastosowaniem i bez zastosowania noœnika RNA w buforze lizuj¹cym. W ¿adnym z badanych przypadków nie stwierdzono statystycznie istotnej ró¿nicy pomiêdzy otrzymanymi wynikami.

Analiza jakościowa uzyskanego DNA

Charakterystykê jakoœci profili genetycznych uzy-skanych z badanych próbek przedstawiono w tabeli 9. Izoluj¹c DNA zestawem NucleoSpin® Tissue XS z materia³u stanowi¹cego 1, 2,5 i 5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno oraz w próbie kontrolnej, uzyskano pe³ne profile genetyczne we wszystkich badanych przypad-kach bez wzglêdu na sposób oddzielania lizatu od pod-³o¿a. Przy zastosowaniu filtrów NucleoSpin® do izola-cji DNA z materia³u zdegradowanego uzyskano szeœæ profili czêœciowych, w których wypadniêciu uleg³y tylko allele w loci o wysokiej masie cz¹steczkowej: D2S1338 i D18S51, w dwóch przypadkach dodatkowo D16S539 i D21S11 i w jednym przypadku locus FGA. Dla pod³o-¿a z inhibitorem otrzymano jeden pe³ny profil genetycz-ny, jeden czêœciowy (wypad³y allele z uk³adów D21S11, D18S51 oraz FGA), a w przypadku pozosta-³ych szeœciu próbek wynik genotypowania by³ nega-tywny. W wariancie z przenoszeniem lizatu na kolumny ze z³o¿em krzemionkowym za pomoc¹ pipety dla ma-teria³u poddawanego degradacji termicznej uzyskano pe³ne profile genetyczne w siedmiu badanych przypad-kach oraz jeden profil czêœciowy, gdzie wypadniêciu uleg³y wysokocz¹steczkowe loci D21S11, D18S51 oraz FGA. Izolacja DNA z materia³u stanowi¹cego 1 μl krwi naniesionej na pod³o¿e z inhibitorem PCR skutko-wa³a otrzymaniem trzech pe³nych profili genetycznych

metod¹ QIAamp®DNA Micro z dodatkiem noœnika RNA oraz bez dodatku noœnika RNA do buforu lizuj¹cego z materia³u stanowi¹cego 1 μμl krwi naniesionej na jeans z barwnikiem indygo (pod³o¿e z inhibitorem reakcji PCR) Concentration of DNA [ng/μl] obtained from 1 μl of blood taken from jeans (PCR inhibitor) using QIAamp®DNA Micro method

with or without carrier RNA present in lysis buffer, depending on the lysate separation variant

(10)

oraz dwóch profili czêœciowych, w których wypadniêciu uleg³y nastêpuj¹ce uk³ady: D2S1338, D18S51 oraz FGA w jednej próbce, a tak¿e D3S1358, D16S539, D2S1338, D21S11, D18S51, TH01 oraz FGA w drugiej próbce. W pozosta³ych trzech przypadkach nie uda³o siê uzyskaæ profili genetycznych.

Przy ekstrakcji DNA zestawem QIAamp® DNA Mi-cro, oddzielaj¹c lizat od pod³o¿a za pomoc¹ pipety i bez dodatku noœnika RNA do buforu lizuj¹cego, uzy-skano pe³ne profile genetyczne we wszystkich powtó-rzeniach dla 1 i 5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno. Podobny wynik otrzymano dla wariantu z dodaniem no-œnika RNA do buforu lizuj¹cego – szeœæ pe³nych profili genetycznych (na szeœæ badanych) dla 5 μl krwi nanie-sionej na ja³owe p³ótno i siedem profili genetycznych dla 1 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno. Tu jednak dla jednej próbki wynik genotypowania by³ negatywny. Przy zastosowaniu filtrów QIAshredder do izolacji DNA z 1 i 5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno uzyskano czêœciowe profile genetyczne, w których wypad³y uk³a-dy: D18S51 w jednej próbce oraz D3S1358, vWA, D16S539, D2S1338, D21S11, D18S51, D19S433, TH01 i FGA w kolejnych. Wraz ze wzrostem iloœci ma-teria³u wyjœciowego uzyskiwano wiêcej pe³nych profili genetycznych – cztery dla 1 μl, piêæ dla 2,5 μl oraz szeœæ dla 5 μl. Dla prób stanowi¹cych 1 μl krwi nanie-sionej na jeans w ogóle nie uzyskano wyników

genoty-powania. Przenosz¹c lizat na kolumny za pomoc¹ pi-pety, otrzymano jeden pe³ny i cztery czêœciowe profile genetyczne w wariancie bez dodatku noœnika RNA do buforu lizuj¹cego. We wszystkich przypadkach wypad-niêciu uleg³y allele z loci D21S11, D18S51 oraz FGA, a dodatkowo TH01 w trzech próbkach, D3S1358 i D19S433 – w dwóch i vWA, D16S539 oraz D2S1338 – w jednej. Po dodaniu noœnika RNA do buforu lizuj¹-cego otrzymano trzy pe³ne i dwa czêœciowe profile ge-netyczne z wygaszeniem sygna³u w uk³adach D16S539, D2S1338, D18S51 i FGA. Podobnie jak uprzednio, dla trzech próbek nie uzyskano wyników ge-notypowania. W próbie kontrolnej dla izolacji z zastoso-waniem filtrów QIAshredder uzyskano piêæ pe³nych profili genetycznych oraz trzy czêœciowe, w których wy-padniêciu uleg³y allele w uk³adach D16S539, D2S1338, D18S51 i FGA.

W ¿adnym z analizowanych przypadków nie stwier-dzono wyst¹pienia profilu mieszanego, co œwiadczy o braku kontaminacji próbek.

Podsumowanie

Wiêksz¹ efektywnoœæ izolacji genomowego DNA z materia³u stanowi¹cego 5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno przy u¿yciu zestawu NucleoSpin® Tissue XS obserwowano w przypadku oddzielania lizatu od

pod-Tabela 9 Analiza uzyskanych profili genetycznych w zale¿noœci od zastosowanego wariantu izolacji

* zbadano 6 próbek

Analysis of the genetic profiles depending on the extraction’s method variant * six samples were examinated

Zastosowane w tabeli oznaczenia: FP – pe³ny profil (full profile) PP – czêœciowy profil (partial profile) NEG. – brak profilu

(11)

³o¿a i jego przenoszenia na kolumny silikonowe za po-moc¹ pipety. Analogiczne rezultaty uzyskano w przy-padku materia³u zdegradowanego. Podobnie wy¿sze œrednie stê¿enia DNA przy zastosowaniu tego sposobu uzyskano w przypadku izolacji z materia³u 1 oraz 2,5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno, jednak¿e wyniki te nie zosta³y potwierdzone statystycznie. Uzyskanie mniejszego stê¿enia DNA przy zastosowaniu filtrów NucleoSpin mog³o wynikaæ z faktu zatrzymywania siê czêœci kwasów nukleinowych na membranie filtra. Od-dzielanie lizatu od pod³o¿a za pomoc¹ filtrów Nucleo-Spin powoduje obni¿enie stê¿enia DNA w otrzymywa-nych izolatach. Jedynie w przypadku analizy wyników uzyskanych po izolacji DNA z materia³u stanowi¹cego 1 μl krwi naniesionej na pod³o¿e z inhibitorem PCR uzyskano wy¿sze œrednie stê¿enie DNA przy zastoso-waniu filtrów NucleoSpin, ale wynik ten nie by³ staty-stycznie istotny.

Sposób oddzielania lizatu z próbek stanowi¹cych 1, 2,5 i 5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno oraz w przy-padku próby kontrolnej nie mia³ wp³ywu na jakoœæ ge-notypowania. Dla próbek poddanych degradacji oraz próbek na pod³o¿u z inhibitorem PCR przy oddzielaniu lizatu od pod³o¿a za pomoc¹ pipety odsetek pe³nych profili genetycznych by³ wiêkszy ni¿ przy zastosowaniu filtrów.

W metodzie QIAamp®DNA Micro równie¿ wy¿sze stê¿enia DNA w izolatach uzyskiwano dla wariantu od-dzielania lizatu od pod³o¿a za pomoc¹ pipety. Analo-gicznie, jak w poprzedniej metodzie, ró¿nice by³y istot-ne statystycznie dla 5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno. Z zastosowaniem filtrów QIAshredder wydaj-noœæ procesu ekstrakcji znacz¹co spada³a. To samo dotyczy³o materia³u stanowi¹cego 1 μl krwi naniesionej na pod³o¿e z inhibitorem PCR. Mia³o to swoje odzwier-ciedlenie w jakoœci uzyskiwanych profili genetycznych. W opcji z zastosowaniem filtrów QIAshredder do od-dzielenia lizatu od pod³o¿a jakoœæ genotypowania w rozpatrywanych przypadkach by³a znacznie ni¿sza ni¿ przy oddzielaniu lizatu od pod³o¿a za pomoc¹ pipety.

Nie zaobserwowano znacz¹cego wp³ywu obecnoœci noœnika RNA w buforze lizuj¹cym ani na iloœæ, ani na jakoœæ otrzymanych wyników.

BIBLIOGRAFIA

1. Dêbska M., Drabik J.: Porównanie efektywnoœci ró¿-nych metod izolacji genomowego DNA ze œladów biologicz-nych, „Problemy Kryminalistyki” 2009, 264, 11–25.

2. Qiagen QIAamp® _{DNA Micro Handbook, Germany}

2003, 1–47.

3. Macherey–Nagel User Manual, NucleoSpin®_{Tissue XS}

– Genomic DNA from Tissue, Germany 2007, 1–29.

Streszczenie

Celem przeprowadzonych badañ by³o sprawdzenie, w jaki sposób zastosowanie etapu oddzielania pod³o¿a od lizatu za po-moc¹ filtrów wp³ywa na efektywnoœæ izolacji DNA przy zasto-sowaniu metody absorpcji-elucji zestawami NucleoSpin®Tissue XS oraz QIAamp® DNA Micro. Testowano równie¿ wp³yw obecnoœci noœnika RNA w buforze lizuj¹cym na wydajnoœæ pro-cesu ekstrakcji. Materia³ do badañ stanowi³a wysuszona krew na ja³owym pod³o¿u oraz na pod³o¿u zawieraj¹cym inhibitor PCR, a tak¿e materia³ zdegradowany. Wiêksz¹ efektywnoœæ izo-lacji genomowego DNA otrzymano w przypadku pominiêcia etapu oczyszczania pod³o¿a na filtrach zarówno w metodzie NucleoSpin®Tissue XS jak te¿ QIAamp®DNA Micro. Ró¿ni-ce statystycznie istotne stwierdzono w przypadku izolacji DNA z 5 μl krwi na ja³owym pod³o¿u. Zastosowanie filtrów w meto-dzie NucleoSpin®Tissue XS w przypadku izolacji z 1, 2,5 oraz 5 μl krwi na ja³owym p³ótnie oraz w próbie kontrolnej nie mia-³o wp³ywu na jakoœæ genotypowania. Natomiast dla próbek zde-gradowanych oraz zawieraj¹cych inhibitor PCR zanotowano wiêksz¹ iloœæ pe³nych profili przy oddzielaniu lizatu od pod³o¿a za pomoc¹ pipety. W przypadku metody QIAamp®DNA Micro zastosowanie filtrów wp³ywa³o na uzyskanie mniejszej iloœci pe³nych profili genetycznych w rozpatrywanych przypadkach. Nie zaobserwowano znacz¹cego wp³ywu obecnoœci noœnika RNA ani na uzyskiwane stê¿enia DNA, ani na jakoœæ otrzymy-wanych profili genetycznych.

S³owa kluczowe:izolacja DNA, noœnik RNA, œlady biolo-giczne, kryminalistyczne badania DNA, metoda absorpcji--elucji.

Summary

The purpose of the research was to compare two methods of separation of the lysate from the solid sample material by the use of filter units and by pipette using different protocols for silica membrane based kits: NucleoSpin®Tissue XS and QIAamp® DNA Micro. The influence of carrier RNA addition to the lysis buffer on efficiency of DNA extraction was also tested. The ma-terial for the research consisted of dried blood spots on sterile li-nen as well as on jeans containing PCR inhibitor and also de-graded DNA. As far as quantity aspect is concerned better re-sults in both methods were obtained with no use of filter units. Statistical significance was observed in case of DNA extraction from 5 μl of blood on sterile linen. On the other hand the use of filter units had no influence on quality of DNA profiles in case of DNA extraction from 1, 2,5 and 5 μl of blood on sterile linen or from control samples. Better genotyping quality was obta-ined for degraded DNA and samples on jeans when the lysate was separated by pipette. The use of filter units in QIAamp® DNA Micro kit caused a decrease in genotyping quality. There was no significant influence on concentration of DNA or on ge-notyping quality when carrier RNA was added to the lysis buf-fer.

Keywords:DNA extraction, carrier RNA, forensic biology, absorption-elution method.