ANNA STÓJ, ZDZISŁAW TARGOŃSKI, AGNIESZKA MALIK METODY W YKRYW ANIA ZAFAŁSZOWAŃ SOKÓW Z OWOCÓW JAGODOWYCH

(1)

ŻYWNOŚĆ 1(26), 2001

ANNA STÓJ, ZDZISŁAW TARGOŃSKI, AGNIESZKA MALIK

M E TO D Y W Y K R Y W A N IA ZA FA ŁSZO W A Ń SO K Ó W Z O W O CÓ W JA G O D O W Y C H

S t r e s z c z e n i e

W artykule przedstawiono metody określania autentyczności soków z owoców jagodowych. Soki owocowe mają charakterystyczny skład chemiczny pozwalający na ich identyfikację. Do oznaczania składu chemicznego soków stosuje się metody chromatograficzne, enzymatyczne, SIRA-MS, SNIF-NMR.

Podstawowym sposobem wykrywania zafałszowań soków jest porównywanie ich składu chemicznego z ustalonymi wartościami standardowymi.

Wstęp

Zafałszowania żywności mają swoją wielowiekową tradycję. Klasycznym tego przykładem jest dodawanie wody do wina. Z problematyką fałszowania żywności można się spotkać przy ocenie takich środków spożywczych, jak: napoje bezalkoholo

we, wina, napoje wysokoalkoholowe, ocet, środki aromatyzujące, mięso, wyroby wę

dliniarskie, oleje i inne.

Zafałszowania soków owocowych stanowią poważny problem ekonomiczny. Do

chody z tego rodzaju działalności mogą sięgać milionów dolarów. Natomiast konsu

ment ponosi straty, gdyż oczekuje produktu pełnowartościowego, autentycznego, o określonych cechach żywieniowych.

Sposoby zafałszowania soków owocowych rozwijały się stopniowo, od prostego rozcieńczania wodą i wprowadzania tańszych dodatków takich, jak: cukier, kwasy organiczne, barwniki, innego typu soki owocowe, do bardziej wyrafinowanych metod wykorzystujących tzw. koktajle chemiczne, zaprojektowane tak, aby odpowiednio zamaskować proces fałszowania [13, 14, 18],

Postęp techniczny sprzyja postępowi w sposobach fałszowania, co z kolei wyma

ga stosowania coraz bardziej wysublimowanych technik analitycznych [15].

Mgr inż. A. Stój, prof, dr hab. Z. Targoński, mgr inż. A. Malik, Akademia Rolnicza w Lublinie, ul. Aka

demicka 13, 20-950 Lublin.

(2)

W krajach wysokouprzemysłowionych funkcjonują organizacje zajmujące się ba

daniem autentyczności soków owocowych. W oparciu o nowoczesne techniki analizy instrumentalnej i statystycznej ustalają one zawartości standardowe poszczególnych składników soków ow ocow ych, uwzględniając fakt, że skład soków owocowych pod

lega wpływom wielu czynników takich, jak: odmiana owoców, stopień ich dojrzałości, rodzaj uprawy, Stan pogody oraz przebieg procesu technologicznego. Association of the Industry of Juices and Nectars opracowała kodeks postępowania - Code of Practice przy ocenie soków owocowych [2],

Podstawowym sposobem wykrywania zafałszowań soków owocowych jest po

równywanie ich składu chemicznego z ustalonymi wartościami standardowymi [15].

Analiza antocyjanów w sokach owocowych

Analiza antocyjanów służy do oceny autentyczności soków z owoców jagodo

wych, gdyż poszczególne soki różnią się ilością i rodzajem antocyjanów. Według Skrede i wsp. [16], w soku truskawkowym, w największej ilości występuje pelargoni- dyno-3-glukozyd. Sok z czarnej porzeczki zawiera głównie delfinidyno-3-rutynozyd i cyjanidyno-3-rutynozyd oraz mniejsze ilości delfinidyno-3-glukozydu i cyjanidyno-3- glukozydu. Natomiast charakterystycznym antocyjanem soku malinowego jest cyjanidyno-3-soforozyd [1],

Znanych jest wiele metod pozwalających oznaczyć antocyjany takich, jak: chro

matografia bibułowa, chromatografia cienkowarstwowa i wysokosprawna chromato

grafia cieczowa. Nie ma wątpliwości, że technika HPLC jest najbardziej odpowiednia do oznaczania antocyjanów, spotyka się jednak wiele wariantów wykorzystania tej metody [8], Przykład warunków rozdziału antocyjanów podają Koswig i Hofsommer [10]:

• kolumna: Hypersil ODS, 250 x 4,6 mm, 5 jam,

• temperatura: 40°C,

• wielkość przepływu: 1,0 ml / min,

• detekcja: detektor UV, 518 nm,

• eluenty: A - woda/ kwas mrówkowy (90:10); (v:v),

B — woda/ kwas mrówkowy/acetonitryl (40:10:50); (v:v:v),

• gradient:

Czas [min] %A %B

0 88 12

26 70 30

35 ⁰ ^{1 0 0}

38 ⁰ 1 0 0

43 ^{8 8} ¹²

45 8 8 1 2

(3)

28 Anna Stój, Zdzisław Targoński, Agnieszka Malik

a)

b)

c)

Retention time 500

0 .3 0 .5 0 .8 1 .0 1.3 1.5 1.B 2 .0 2 .3 2.5 Retention time

500 , 450 400 .350 300 250

200

150 100 50

O

0.0

Rys. 1. Chromatogramy antocyjanów soków [10].

Fig. 1. Chromatograms o f anthocyanins in juices [10].

a. z maliny a. from raspberry b. z czerwonej porzeczki b. from redcurrant c. z czarnej porzeczki c. from blackcurrant

(4)

Rys. 2. Chromatogramy antocyjanów soków [9].

Fig. 2. Chromatograms o f anthocyanins in juices [9].

a. truskawkowego a. strawberry

b. truskawkowego z dodatkiem soku z czarnego bzu b. strawberry with addition o f elderberry juice

c. truskawkowego z dodatkiem soku z buraka czerwonego c. strawberry with addition o f red beet juice

(5)

Każdy sok owocowy ma charakterystyczny profil chromatograficzny antocyja- nów, tak zwany fingerprint, który pozwala na jego identyfikację (rys. 1). Poprzez po

równanie wykresu nieznanej próbki z charakterystycznym wykresem autentycznego soku można stwierdzić czy analizowana próbka jest autentyczna czy zafałszowana (rys. ²). O skuteczności proponowanej metody świadczy zestawienie analiz autentycz

nych i zafałszowanych soków owocowych, podane w tab. 1. Istnieje możliwość popeł

niania błędów i nie rozpoznania soku zafałszowanego. Jednak należy podkreślić, że wszystkie próbki, które zostały określone jako autentyczne rzeczywiście nimi były [7, 8 ,9 ,1 0 ,1 7 ],

T a b e l a 1

Zestawienie skuteczności analizy próbek autentycznych i zafałszowanych [8].

Evaluation o f usability o f HPLC method for juices adulteration analyses [8],

Liczba pró Ocena / Evaluation

bek Number of

samples

Próbki soków

Samples o f juices prawidłowa correct

zła wrong

wątpliwa suspicious

niemożliwa impossible

5 z czerwonych winogron

/red grape/ 3 - 1 1

q z czarnej porzeczki 6 1 1 1

/black currant/

z wiśni -

/cherry/

10 autentyczne /authentic/ 7 - 1 2

9 zafałszowane /adulterated/ 7 2 - -

Analizując antocyjany należy zwrócić uwagę na fakt, że są one związkami mało stabilnymi i ich zawartość zmienia się w czasie procesu technologicznego i przecho

wywania. Największe zmniejszenia zawartości antocyjanów (o 50%) obserwowano podczas obróbki termicznej, ale miało to niewielki wpływ na obraz chromatograficzny.

Typowy chromatogram otrzymano po wszystkich etapach procesu technologicznego.

Natomiast dłuższe przechowywanie powodowało znaczne obniżenie wysokości pików.

Piki stopniowo obniżały się, a następnie zanikały, co świadczyło o polimeryzacji anto

cyjanów [⁸].

Analiza zawartości kwasów organicznych w ocenie zafalszowań soków owocowych Podstawowymi kwasami organicznymi występującymi w sokach owocowych są kwasy: cytrynowy, jabłkowy i izocytrynowy. Durst i Wrolstad [5] określili średnie ich zawartości w sokach malinowych z różnych odmian malin. Wynosiły one odpowiednio 1,7 g/100 ml, 66,1 mg/100 ml i 44,0 mg/100 ml. Zawartość wymienionych kwasów

(6)

organicznych oraz stosunek kwasu cytrynowego do kwasu izocytrynowego są różne dla różnych soków owocowych, stąd ich przydatność w ocenie zafałszowań tych so

ków.

Obecnie do oznaczania składu kwasów organicznych wykorzystuje się wysoko- sprawną chromatografią cieczową i metody enzymatyczne. Zaletą HPLC jest możli

wość równoczesnego oznaczania i identyfikacji różnych kwasów organicznych, co pozwala na uzyskanie informacji zarówno o autentyczności produktu, jak i o jego zmianach mikrobiologicznych. W metodach HPLC jako detektory wykorzystuje się najczęściej detektor refraktometryczny lub detektor UV. Zastosowanie tych detektorów wymaga procedur oczyszczających w celu eliminacji interferujących cukrów i związ

ków fenolowych, co negatywnie wpływa na szybkość i prostotę oznaczeń. Ten pro

blem może być wyeliminowany poprzez użycie detektora konduktometrycznego w połączeniu z chemicznym supresorem chromatografii jonowej. Na rys. 3. i rys. 4.

przedstawiono chromatogramy autentycznych soków wiśniowych oraz soków wiśnio

wych z dodatkiem 10% soku z buraka czerwonego i 10% soku z czarnej jagody. Warto podkreślić, że ta metoda pozwala na równoczesną identyfikację i oznaczanie jonów nieorganicznych, w szczególności jonów chlorkowych i azotanowych [6],

Do oznaczania kwasów organicznych częściej wykorzystuje się metody enzyma

tyczne, charakteryzujące się wysoką specyficznością i dokładnością [1 2],

Rys. 3. Chromatogramy autentycznego soku wiśniowego (-) i soku wiśniowego z 10% dodatkiem soku z buraka czerwonego (—). Wzrost stężenia kwasu cytrynowego, chlorków i azotanów spowo

dowany jest dodatkiem soku z czerwonego buraka [6].

Fig.3. Chromatograms o f authentic cherry juice (-) and cherry juice with 10% o f red beet juice (—) . Citric acid, chlorides and nitrates increase due to the addition o f red beet juice [6].

(7)

Rys. 4. Chromatogramy autentycznego soku wiśniowego (-) i soku wiśniowego z 10% dodatkiem soku z czarnej jagody (—). Obserwowany jest wzrost stężenia kwasu izocytrynowego pochodzącego z czarnej jagody [6],

Fig. 4. Chromatograms o f authentic cherry juice (—) and cherry juice with 10% o f blackberry juice (—).

Isocitric acid increases due to the addition o f blackberry juice [6].

Wykrywanie dodatku cukru do soków owocowych

Soki znajdujące się w handlu często są otrzymywane przez rozcieńczenie kon

centratów soków owocowych do naturalnych stężeń. W pewnych przypadkach produ

cenci dodają więcej wody niż to wynika z przyjętych norm.

W celu maskowania rozcieńczenia wodą, do soku dodają cukry pochodzenia przemysłowego i kwasy organiczne. W większości soków owocowych zawartość natu

ralnych cukrów jest ograniczona do glukozy, fruktozy i sacharozy. W celu odróżnienia cukru naturalnego od cukru dodanego stosuje się spektrometrię masową (SIRA-MS - Stable Isotope Ratio Analysis by Mass Spectrometry), pozwalającą określić stosunki izotopów: ¹³C/¹²C, ,⁸0 / 160 i ²H/'H. Udział izotopów porównuje się ze standardami, którym jest w przypadku tlenu i wodoru woda morska (SMOW - Standard Medium Ocean Water), a w przypadku węgla — belemnit (PDB — Pee Dee Belemnite). Metody izotopowe określają dokładnie odchylenie od przyjętych standardów:

5 O (Rpróbka " RsMOW^ Rs m o w) 1 0 0 0 [ 1 3 ] R s m o w = 0 ,0 0 3 9 9 4 8

S D (Rpróbka ~ R s M O W / R s m o w ) 1 0 0 0 [1 3 ] Rsmow = 0 ,0 0 0 3 1 6

(8)

S 13C - (Rpróbka - RpDb/ RpDb) 1 0 0 0 [ 1 3 ]

R p d b = 0,0 1 1 2 3 7

R próbka - stosunek izotopów w próbce,

Rsmow.Rpdb- stosunek izotopów w standardach.

W roślinach udział poszczególnych izotopów jest charakterystyczny dla danego gatunku, a odchylenia mogą być spowodowane różnymi czynnikami jak:

• różnice w metabolizmie,

• pochodzenie,

• niektóre procesy fizyczne np. parowanie.

Owoce jagodowe, z których otrzymuje się soki, należą do szlaku metabolicznego C3. W takich sokach można wykryć dodatek cukrów pochodzących z roślin szlaku C4

(trzcina cukrowa, kukurydza), gdyż stosunek izotopów węgla w roślinach szlaku C3

jest mniejszy o około 29 promili niż w roślinach szlaku C4. Nie można natomiast tą metodą wykiyć zafałszowania soków z owoców jagodowych, polegającego na dodatku cukru buraczanego, gdyż burak cukrowy należy również do roślin C3. W tym przypad

ku, jak również do wykrywania soków otrzymanych przez rozcieńczenie koncentra

tów, stosuje się metodę pomiaru stosunku izotopów tlenu ¹⁸0 / 160 i wodoru ²H/'H.

Wówczas należy skorzystać z faktu, że woda w owocach zawiera więcej izotopu tlenu isO i deuteru w porównaniu z wodami gruntowymi [4, 13].

Dodatek cukru buraczanego do soków z owoców jagodowych można wykryć sto

sując metodę SNIF-NMR (Site-Specific Natural Isotope Fractionation Nuclear Magne

tic Resonance), czyli metodę wyznaczania względnego obsadzenia frakcji izotopów przy wykorzystaniu jądrowego rezonansu magnetycznego. Opiera się ona na fakcie, że zawartość deuteru w specyficznych miejscach cząsteczki cukru jest większa w cukrach naturalnie występujących, aniżeli w cukrze buraczanym.

Soki owocowe poddaje się fermentacji, a otrzymany alkohol destyluje się ilo

ściowo i analizuje za pomocą spektrometru NMR. Rejestrowane są ilości deuteru związanego z węglem w grupach metylowych etanolu. Ilości te są mniejsze w przy

padku dodania cukru buraczanego [^{1 1}].

Metody izotopowe są dość zawiłe i niełatwe w rutynowej analizie, chociaż w pewnych przypadkach niezbędne. Dlatego nadal ważnymi pozostają inne metody kon

troli autentyczności cukrów w sokach owocowych, które są łatwiejsze w użyciu i tań

sze. Wśród metod chromatograficznych jedną z najlepszych jest analiza cukrów wyko

rzystująca pulsacyjny detektor amperometiyczny i ulepszone kolumny aniono- wymienne. Pozwala ona na detekcje oligosacharydów występujących w sokach owo

cowych i buraku cukrowym, nawet w stężeniu 40 ppm [3],

Zawartość cukrów można też oznaczyć metodami enzymatycznymi. Wskaźni

kiem zafałszowań jest stosunek glukozy do fruktozy, który wg Kodeksu Postępowania

(9)

AIJN [2] powinien wynosić dla autentycznego soku truskawkowego 0,75-1, soku ma

linowego 0,6-0,95, z czarnej porzeczki 0,6-0,9.

Oznaczanie składu aminokwasowego soków jako kryterium oceny ich autentyczności

Połączenie soku z obcym, często tańszym rodzajem soku owocowego może być rozpoznane poprzez analizę spektrum wolnych aminokwasów. Stosunkowo łatwo jest wykryć dodatek obcych aminokwasów do takiej mieszaniny. Nadmierne rozcieńczenie soków powoduje obniżenie stężenia aminokwasów, co pozwala wykryć ten rodzaj zafałszowania.

Spośród 21 wolnych aminokwasów wyróżniono ⁸, które stanowią podstawę do rozróżniania soków owocowych; są to: prolina, kwas asparaginowy, seryna, asparagi- na, kwas glutaminowy, alanina, kwas y-aminobutyrowy i arginina. Reprezentują one około 90 do 95% wolnych aminokwasów w większości soków owocowych i odpowia

dają za charakterystyczne spektrum aminokwasów.

Analizę składu aminokwasowego wykonuje się z wykorzystaniem automatyczne

go analizatora aminokwasów metodą chromatografii cieczowej. Wybrane pojedyncze aminokwasy można oznaczyć także prostszymi metodami chemicznymi lub enzyma

tycznymi. Opierając się na analizie proliny można wykryć zafałszowania tanim kon

centratem winogronowym soków z czarnej porzeczki, czerwonej porzeczki, truskawki, maliny, jeżyny, czarnej borówki. Wzrastające zawartości proliny we względnie defi

cytowych sokach z czarnej i czerwonej porzeczki oraz maliny wskazują na manipulacje tymi sokami. Inna jest sytuacja w przypadku soku wiśniowego, w którym prolina wy

stępuje w sposób naturalny w stężeniu podobnym jak w soku winogronowym. Jednak

że wykorzystanie całego spektrum aminokwasowego pozwala na weryfikację soku wiśniowego - przez dodanie soku winogronowego do soku wiśniowego zawartość asparaginy znacznie spada, podczas gdy zawartość argininy znacznie wzrasta.

Charakterystyczną wartością pozwalającą udowodnić rozcieńczenie soku jest liczba formolowa. Odzwierciedla ona zawartość wolnych aminokwasów w soku i jest pośrednią miarą sumy wolnych aminokwasów [13]. Oznaczanie liczby formolowej polega na doprowadzeniu soku do pH 8,0, dodaniu roztworu formaldehydu i ponow

nym doprowadzeniu roztworu do pH 8,0 za pomocą 0,1N NaOH. Liczba formolowa jest więc ilością ml 0,1N NaOH potrzebnego na doprowadzenie 100 ml soku do pH 8,0. Wartość współczynnika jest zmienna dla różnych soków owocowych. W przypad

ku soku z czarnej porzeczki wynosi 7-30 ml NaOH/lOOml, soku z maliny 10-50, a z truskawki 5-26 [2].

(10)

Podsumowanie

Analizując so ki z owoców jagodowych pod względem zafałszowań, należy ozna

czyć zawartość wielu składników chemicznych i porównać je z wartościami standar

dowymi. Osąd o autentyczności nie może ograniczać się do pojedynczego parametru.

Należy również pamiętać, że skład soków owocowych podlega wpływom wielu czyn

ników i nie można wykluczyć wyjątkowych odchyleń powstałych w ekstremalnych warunkach lub podczas procesu technologicznego. W tym przypadku sok nie musi być zafałszowany. Dlatego powinny być wykonane dalsze analizy, aby potwierdzić czy odchylenia są specyficzne dla surowca lub związane z procesem produkcyjnym, czy niedeklarowanymi dodatkami.

LITERATURA

[1] Boyles M.J., Wrolstad R.E.: Anthocyanin composition o f red raspberry juice: influences o f cultivar, processing and environmental factors, J. Food Sci., 58 (5), 1993, 1135.

[2] Code o f practice for evaluation o f fruit and vegetable juices. A.I.J.N., Brussels, 1996, 6, 5.

[3] Corradini C., Cristalli A., Corradini D.: Determination o f carbohydrates in fruit-based beverages by high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAEC- PAD), Fruit Processing, 8, 1995, 261.

[4] Czapski J., Tyma P.: Metody wykrywania zafałszowań przetworów owocowych, Przem. Ferm. i Owoc.-Warz., 10, 1996, 22.

[5] Durst R.W., Wrolstad R.E.: Sugar, nonvolatile acid, I3C /12C ratio and mineral analysis for determi

nation o f the authenticity and quality o f red raspberry juice composition, J. Assoc. Off. Anal.

C hem .,78(5), 1995, 1195.

[6] Gherardi S., Saccani G., Trifir A., Calza M.: Use o f ion chromatography for organic acid determi

nation in fruit juices, Fruit Processing, 7, 1995, 206.

[7] Goiffon J.P., Brun M., Bourrier M.J.: High performance liquid chromatography o f red fruit antho

cyanin, J. Chromatogr., 537, 1991, 101.

[8] Hofsommer H.J.: Determination o f anthocyanins and carotinoids in fruit juices, Fruit Processing, 4, 1995, 90.

[9] Hofsommer H.J.: Progress in the authenticity-assurance for fruit juices. Raport on SCF-Symposium, Parma, Italy, 1994.

[10] Koswig S., Hofsommer H.J.: HPLC-Methode zur Untersuchung von Anthocyanen in Buntsaften und anderen gefarbten Lebensmitteln, Fliissiges Obst., 62 (4), 1995, 125.

[11] Martin G.G., Wood R., Martin G.J.: Detection o f added beet sugar in concentrated and single strength fruit juices by deuterium nuclear magnetic resonance (SNIF-NMR): collaborative study, J.

Assoc. Off. Anal. Chem., 79 (4), 1996, 917.

[12] Methods o f enzymatic bioanalysis and food analysis. Boehringer Mannheim GmbH, Biochemica, Mannheim.

[13] Nagy S. Attaway J.A., Rhodes M.E.: Adulteration o f fruit juice beverages. Marcel Dekker Inc., New York, 1988, 3,21, 109, 125.

[14] Nagy S.: Economic adulteration o f fruit beverages. Fruit Processing, 4, 1997, 125.

(11)

36 Anna Stój, Zdzisław Targoński, Agnieszka Malik [15] Obiedziński M.: Urzędowa kontrola żywności w Unii Europejskiej, Przem. Spoż., 12, 1998, 37.

[16] Skrede G., Wrolstad R.E., Lea P., Enersen G.: Color stability o f strawberry and blackcurrant syrups, J. Food Sci., 57 (1), 1992,172.

[17] Versari A., Barbanti D., Biesenbruch S., Famell P.J.: Analysis o f anthocyanins in red fruits by use o f HPLC/spectral array detection, Ital. J. Food Sci., 9 (2), 1997,141.

[18] Wrolstad R.E.: Ethical issues concerning food adulteration, Food Technol., 5, 1991, 108.

DETECTION OF ADULTERATIONS IN JUICES FROM BERRY FRUITS

S u mma r y

Methods o f analysis o f authenticity juices from berry fruits were presented in the paper. Characteristic compounds present in fruit juices enable their identification. To assay chemical composition o f fruit juices chromatographic, enzymatic, SIRA-MS, SNIF-NMR methods are employed. Comparison o f chemical composition with determined standards is a basic way o f detection adulterations o f juices. | | j