Ewelina Dymarska

(1)

WPŁYW METANOLU NA PROCES BIOSYNTEZY KWASU CYTRYNOWEGO Z SACHAROZY

PRZEZ ASPERGILLUS NIGER

Ewelina Dymarska

^1,2

, Jerzy Jan Pietkiewicz

²

1 Uniwersytet Ekonomiczny we Wrocławiu

2 Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Witelona w Legnicy

Streszczenie. Na przebieg hodowli Aspergillus niger i szybkość biosyntezy kwasu cytryno- wego metodą wgłębną wpływa wiele czynników, m.in. rodzaj źródła węgla i jego stężenie, rodzaj i stężenie jonów metali występujących w podłożach hodowlanych oraz morfologia grzybni. Wpływ czynników stymulujących proces biosyntezy kwasu cytrynowego był dotąd szeroko badany. Alkohole o małej masie cząsteczkowej, jak metanol, etanol oraz n-propanol, mogą stymulować proces produkcji kwasu cytrynowego. Celem pracy było określenie wpływu alkoholu metylowego na biosyntezę kwasu cytrynowego w wgłębnych hodowlach okresowych Aspergillus niger PD-66 w podłożu syntetycznym z sacharozą. Przeprowadzono dwie serie badań, w których do podłoża hodowlanego dodawano alkohol metylowy w ilo- ściach 2, 3, 4, i 5% obj. W pierwszej serii badań alkohol metylowy dodawano do sterylnego podłoża przed rozpoczęciem hodowli, natomiast w drugiej serii – w 45. godzinie hodowli.

Analiza wyników badań wykazała, że alkohol metylowy wpływa negatywnie na efektywność biosyntezy kwasu cytrynowego w całym zakresie stosowanych stężeń niezależnie od momen- tu wprowadzenia go do podłoża fermentacyjnego. Obniżenie efektywności procesu wynikało przede wszystkim z toksycznego oddziaływania metanolu na wzrost grzybni.

Słowa kluczowe: Aspergillus niger, kwas cytrynowy, metanol, hodowla okresowa, bio- synteza

WSTĘP

Kwas cytrynowy jest powszechnie stosowany w przemyśle spożywczym, chemicz- nym i farmaceutycznym. Jego globalna produkcja w 2010 roku wyniosła ponad 1,8 mln ton. Występuje on w tkankach roślinnych i zwierzęcych. Dla organizmów żywych jest

Adres do korespondencji – Corresponding author: Ewelina Dymarska, Uniwersytet Ekonomicz- ny we Wrocławiu, Instytut Chemii i Technologii Żywności, Zakład Mikrobiologii i Biosyntezy, ul. Komandorska 118-120, bud. H, 53-345 Wrocław, e-mail: ewelina.dymarska@ue.pl

nr 584, 2016, 23–31

(2)

niezbędny w szeregu reakcji cyklu Krebsa, w którym następuje oksydacja węglowo- danów do ditlenku węgla i wody z uwolnieniem energii [Fiume i in. 2012]. Kwas cytrynowy obecny jest głównie w owocach cytrusowych: cytrynach (4–8%), grejpfrutach (1,2–2,1%), pomarańczach (0,6–1,0%), mandarynkach (0,4–1,2%), a także w ananasach, truskawkach, malinach i porzeczkach [Dziezak 2003]. Przemysłowo kwas cytrynowy jest otrzymywany z udziałem grzybów Aspergillus niger w hodowlach wgłębnych oraz w hodowlach w podłożach stałych. Szczepy Aspergillus niger charakteryzują się dużą wydajnością produkcji oraz homofermentatywnością biosyntezy kwasu cytrynowego [Pietkiewicz 2002, Papagianni 2007, Dhillon i in. 2013].

Efektywność procesu biosyntezy kwasu cytrynowego zależy od wielu czynników, m.in. właściwości zastosowanego szczepu oraz doboru optymalnych parametrów bioprocesu. W celu uzyskania dużej wydajności procesu biosyntezy kwasu cytrynowego wprowadzane są do podłoży stymulatory bioprocesu. Do potencjalnych stymulatorów fermentacji cytrynowej należą alkohole o małej masie cząsteczkowej, jak alkohole metylowy, etylowy i n-propylowy [Haq i in. 2003]. Alkohol metylowy w przeciwień- stwie do etanolu nie jest asymilowany przez Aspergillus niger i nie ulega konwersji do acetylo-CoA, będącego prekursorem cyklu Krebsa. Alkohol metylowy dodany do podłoży hodowlanych hamuje wzrost grzybni i zarodnikowanie, zmniejsza zużycie substratu, zwiększa przepuszczalność błony komórkowej, a także wpływa na aktyw- ność syntazy cytrynianiowej oraz akonitazy [Leśniak 1974, Pazouki i in. 2000, Bar- rington i in. 2008].

Celem pracy było określenie wpływu metanolu na proces biosyntezy kwasu cytry- nowego z sacharozy przez szczep Aspergillus niger PD-66 we wgłębnych hodowlach okresowych prowadzonych w kolbach na wstrząsarce.

MATERIAŁ I METODY

W badaniach stosowano szczep Aspergillus niger PD-66 pochodzący z Kolekcji Czy- stych Kultur Katedry Biotechnologii Żywności Uniwersytetu Ekonomicznego we Wro- cławiu.

Podłoże hodowlane używane w badaniu zawierało w swoim składzie [g·dm^–3]: sacha- rozę – 150,0; NH₄NO₃ – 2,0; KH₂PO₄ – 0,2; MgSO₄ 7H₂O – 0,2 i wodę wodociągową [Pietkiewicz 2002]. Kwasowość czynną regulowano przez dodatek wodnego roztworu HCl o stężeniu 0,5 mol·dm^–3 i ustalono na poziomie 3,0. Podłoże sterylizowano w temperaturze 121°C przez 30 min. Do schłodzonego podłoża dodawano około 10 cm³ przygo- towanego inokulum, tak aby stężenie konidiów wynosiło 10⁵·cm^–3. Hodowle prowadzono przez 15 dni w temperaturze 30°C, w kolbach stożkowych o pojemności 500 cm³ wypeł- nionych 150 cm³ podłoża, umieszczonych we wstrząsarko-inkubatorze GFL 3033 przy prędkości wstrząsania 200 obr·min^–1.

Stężenie suchej substancji biomasy grzybni oznaczono metodą wagową. Stężenie kwasu cytrynowego oznaczano metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC).

Stosowano chromatograf Perkin Elmer wyposażony w detektor UV-VIS CE przy długo- ści fali 210 nm. W analizach zastosowano kolumnę Knauer Eurokat H65 utrzymywaną w temperaturze 60°C w termostacie Corabid Type KB 5506. Prędkość przepływu fazy

(3)

mobilnej ustalono na poziomie 0,6 cm³·min^–1 z zastosowaniem wody do HPLC jako fazy wymywającej.

Do oceny przebiegu hodowli obliczono następujące parametry kinetyczne: średnią szybkość objętościową wzrostu biomasy (R_X), średnią szybkość objętościową biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego (R_P), średnią szybkość właściwą biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego (Q_P), wydajność biosyntezy biomasy w stosunku do wpro- wadzonego substratu (Y_X/S), wydajność biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego (Y_P/S), współczynnik efektywności biosyntezy (K_ef) [Pietkiewicz 2002]. Do wykonania obliczeń i prezentacji danych zastosowano pakiet Excel Microsoft Office 2011.

Analizę statystyczną wyników wykonano z wykorzystaniem środowiska GNU R wer- sja 3.1.0. Za poziom istotności statystycznej przyjęto p <0,01. Do stwierdzenia czy mię- dzy badanymi grupami występują istotnie statystyczne różnice wykorzystano test niepa- rametryczny Kruskala–Wallisa. W celu sprawdzenia między którymi grupami występują różnice statystyczne wykonano analizę post hoc z wykorzystaniem testu Tukeya.

WYNIKI I DYSKUSJA

Podstawowe parametry kinetyczne obrazujące przebieg hodowli Aspergillus niger PD-66 w podłożu bez dodatku alkoholu metylowego przedstawiono na rysunku i w tabeli 1.

Analiza przebiegu hodowli Aspergillus niger PD-66 w podłożu bez dodatku metanolu wykazała stopniowy wzrost stężenia kwasu cytrynowego, którego maksymalny poziom został osiągnięty w 14. dobie hodowli (126,0 g·dm^–3). Końcowe stężenie biomasy w pod- łożu wyniosło 11,5 g·dm^–3. Średnia całkowita wydajność kwasu cytrynowego w stosunku do wprowadzonej sacharozy wynosiła 84,0% (m/m), średnia szybkość właściwa (Q_P) i ob- jętościowa (R_P) biosyntezy kwasu cytrynowego wyniosły odpowiednio 0,0029 g·g^–1·h^–1 i 0,362 g·dm^–3·h^–1, a współczynnik efektywności biosyntezy K_ef = 30,4.

0,000 0,050 0,100 0,150 0,200 0,250 0,300 0,350 0,400

0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00 140,00

Rp [g·dm-3·h-1]

P [g·dm-3]; Y p/s [%]

Czas [h]

P Yp/s Rp

Rys. Przebieg zmian stężenia kwasu cytrynowego (P), wydajności (Y_P/S) oraz szybkości biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego (R_P) w czasie wgłębnej hodowli okresowej Aspergillus niger PD-66 w podłożu bez dodatku metanolu

Fig. Time course of changes of citric acid concentration (P), yield (Y_P/S) and volumetric rate (R_P) of citric acid biosynthesis in submerged batch culture of Aspergillus niger PD-66 without addition of methanol

(4)

Tabela 1. Podstawowe parametry kinetyczne charakteryzujące biosyntezę kwasu cytrynowego we wgłębnych hodowlach okresowych przez Aspergillus niger PD-66 w podłożu bez dodat- ku alkoholu metylowego

Table 1. Kinetic parameters of citric acid biosynthesis in submerged batch culture of Aspergillus niger PD-66 without addition of methanol

Symbol Jednostka Parametr Wartości

t h czas trwania hodowli 348

S₀ g·dm^–3 początkowe stężenie cukru w podłożu 150,0

XK g·dm^–3 końcowe stężenie biomasy w podłożu 11,5

RX g·dm^–3·h^–1 średnia szybkość objętościowa wzrostu biomasy 0,036 PK g·dm^–3 końcowe stężenie jednowodnego kwasu cytrynowego w podłożu 126,0 RP g·dm^–3·h^–1 średnia szybkość objętościowa biosyntezy jednowodnego kwasu cytryno-

wego 0,362

QP g·g^–1·h^–1 średnia szybkość właściwa biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego 0,029

YX/S % (m/m) wydajność biosyntezy biomasy 8,4

YP/S % (m/m) wydajność biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego 84,0

K_ef – współczynnik efektywności biosyntezy 30,4

W hodowlach prowadzonych bez dodatku metanolu grzybnia Aspergillus niger rosła głównie w postaci kuleczek o średnicy 1–2 mm oraz kłaczków o długości 1–2 mm.

W pierwszym etapie badano wpływ alkoholu metylowego, na proces biosyntezy kwasu cytrynowego, dodawanego w ilości 2, 3, 4 i 5% obj. do sterylnego podłoża przed roz- poczęciem hodowli grzybów. Otrzymane wyniki przedstawiono w tabeli 2.

Przeprowadzona analiza statystyczna wyników wykazała istotny wpływ dodatku alkoholu metylowego na proces biosyntezy kwasu cytrynowego w podłożach z sacharo- zą. Alkohol metylowy dodany do podłoża hodowlanego przed rozpoczęciem hodowli negatywnie wpływał na efektywność procesu biosyntezy kwasu cytrynowego w całym zakresie stosowanych stężeń. Najwyższe stężenie jednowodnego kwasu cytrynowego (98,0 g·dm^–3) w podłożach z dodanym alkoholem metylowym osiągnięto, stosując daw- kę 2% obj., a wydajność procesu biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego w stosunku do wprowadzonej sacharozy (Y_P/S) wynosiła 65,3%. Stężenie kwasu cytrynowego w podłożu zmniejszało się wraz ze wzrostem stężenia alkoholu metylowego, osiągając 48,7 g·dm^–3przy 5% dawce metanolu. Alkohol metylowy hamował wzrost grzybni. Za- wartość biomasy w podłożu malała wraz ze wzrostem stężenia metanolu, osiągając przy dawce 5% wartość 7,64 g·dm^–3, a przy dodatku metanolu w ilości 2–4% następowała niewielka redukcja zawartości biomasy. W podłożach zawierających alkohol metylowy dodany w ilości od 2 do 4% pleśń Aspergillus niger rosła w postaci rozproszonych strzę- pek i drobnych kuleczek tworzących puszystą grzybnię. Przy 5% dodatku alkoholu metylowego powstawały kuliste agregaty grzybni o średnicy około 4 mm.

W drugim etapie badań określano wpływ alkoholu metylowego dodawanego w ilości 2, 3, 4 i 5% obj. w 45. godzinie hodowli. Wyniki badań wpływu dawki alkoholu metylowego wprowadzonej do podłoża hodowlanego w 45. godzinie hodowli na biosyntezę kwasu cytrynowego przez Aspergillus niger PD-66 przedstawiono w tabeli 3.

(5)

Tabela 3. Parametry kinetyczne charakteryzujące biosyntezę kwasu cytrynowego we wgłębnych hodowlach okresowych Aspergillus niger PD-66 przy różnych stężeniach alkoholu mety- lowego dodanego w 45. godzinie hodowli

Table 3. Kinetic parameters of citric acid biosynthesis in submerged batch cultures of Aspergillus niger PD-66 with different concentration of methanol added at 45 hours of the cultivation

Symbol Jednostka Parametr Dawka metanolu [%]

0 2 3 4 5

t h czas trwania hodowli 348 348 348 348 348

S₀ g·dm^–3 początkowe stężenie cukru w podłożu 150,0 150,0 150,0 150,0 150,0 X_K g·dm^–3 końcowe stężenie biomasy w podłożu 8,72 9,60 8,72 6,60 5,48 R_X g·dm^–3·h^–1 średnia szybkość objętościowa wzrostu bio-

masy 0,025 0,028 0,025 0,019 0,016

P_K g·dm^–3 końcowe stężenie jednowodnego kwasu

cytrynowego w podłożu 115,2 70,0 23,8 14,4 8,4

R_P g·dm^–3·h^–1 średnia szybkość objętościowa biosyntezy

jednowodnego kwasu cytrynowego 0,331 0,201 0,068 0,041 0,024 Q_P g·(g^–1·h^–1) średnia szybkość właściwa biosyntezy jedno-

wodnego kwasu cytrynowego 0,038 0,021 0,008 0,006 0,004 Y_X/S % (m/m) wydajność biosyntezy biomasy 8,7 9,6 5,8 4,4 3,7 Y_P/S % (m/m) wydajność biosyntezy jednowodnego kwasu

cytrynowego 76,8 46,7 15,9 9,6 5,6

K_ef – współczynnik efektywności biosyntezy 25,4 9,4 1,1 0,4 0,1 Tabela 2. Parametry kinetyczne charakteryzujące biosyntezę kwasu cytrynowego we wgłębnych

hodowlach okresowych Aspergillus niger PD-66 przy różnych stężeniach metanolu do- danego na początku hodowli

Table 2. Kinetic parameters of citric acid biosynthesis in submerged batch cultures of Aspergil- lus niger PD-66 with different concentration of methanol added at the beginning of the cultivation

Symbol Jednostka Parametr Dawka metanolu [%]

0 2 3 4 5

t h czas trwania hodowli 348 348 348 348 348

S₀ g·dm^–3 początkowe stężenie cukru w podłożu 150,0 150,0 150,0 150,0 150,0 X_K g·dm^–3 końcowe stężenie biomasy w podłożu 12,48 11,88 11,08 11,06 7,64 R_X g·dm^–3·h^–1 średnia szybkość objętościowa wzrostu biomasy 0,036 0,034 0,032 0,034 0,022 P_K g·dm^–3 końcowe stężenie jednowodnego kwasu cytry-

nowego w podłożu 126,0 98,0 72,8 69,0 48,7

R_P g·dm^–3·h^–1 średnia szybkość objętościowa biosyntezy

jednowodnego kwasu cytrynowego 0,362 0,282 0,209 0,198 0,140 Q_P g·(g^–1·h^–1) średnia szybkość właściwa biosyntezy jedno-

wodnego kwasu cytrynowego 0,029 0,024 0,019 0,017 0,018 Y_X/S % (m/m) wydajność biosyntezy biomasy 8,4 7,9 7,4 7,8 5,1 Y_P/S % (m/m) wydajność biosyntezy jednowodnego kwasu

cytrynowego 84,0 65,3 48,5 46,0 32,4

K_ef – współczynnik efektywności biosyntezy 30,4 18,4 10,2 9,1 4,5

(6)

Analiza statystyczna wyników wykazała istotny wpływ dodatku alkoholu metylowego na proces biosyntezy kwasu cytrynowego w podłożach z sacharozą, jednak alkohol metylowy dodany do podłoża w 45. godzinie hodowli wyraźnie negatywnie oddziały- wał na przebieg bioprocesu. Największą wydajność biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego w stosunku do sacharozy (Y_P/S) (46,7%) osiągnięto, stosując małą dawkę alkoholu metylowego (2%). Dodatek metanolu w ilości od 3 do 5% znacząco zmniejszał efektywność procesu. Stężenie jednowodnego kwasu cytrynowego w podłożu malało wraz ze wzrostem stężenia alkoholu metylowego i wyniosło 70 g·dm^–3 przy 2% dodatku metanolu, natomiast przy największej 5% dawce tylko 8,4 g·dm^–3. Alkohol metylowy dodany w 45. godzinie hodowli w ilości 2% sprzyjał przyrostowi biomasy, natomiast dodany do podłoża w ilości od 4 do 5% wyraźnie hamował wzrost grzybni. Dodatek 5%

alkoholu spowodował zmniejszenie zawartości grzybni o około 60% w stosunku do jej zawartości w próbie kontrolnej. Dodatek alkoholu metylowego wpływał na kształtowanie morfologii grzybni Aspergillus niger PD-66. Przy dawce 2% sprzyjał tworzeniu grzybni w postaci kuleczek o średnicy około 1 mm, a przy dodatku w ilościach od 3 do 5% grzybnia przybierała postać luźnej zawiesiny.

Uzyskane w ramach tych badań wyniki, dotyczące wpływu stężenia i różnego mo- mentu wprowadzenia metanolu do podłoża hodowlanego na proces biosyntezy kwasu cytrynowego, wykazały, że w podłożach syntetycznych zawierających sacharozę jako źródło węgla alkohol metylowy wywiera toksyczny wpływ na syntezę biomasy grzybni;

hamuje on wzrost grzybni, a w konsekwencji powoduje obniżenie efektywności biopro- cesu. Szczep Aspergillus niger PD-66 produkował kwas cytrynowy z największą szybko- ścią w podłożach nie zawierających alkoholu metylowego. Dawka alkoholu metylowego w ilości od 2 do 4% toksycznie oddziaływała na wzrost biomasy, redukując jej ilość w nieznacznym stopniu. Podobnych wniosków dostarcza praca Roukas i Kotzekidou [1997], w której dodatek od 1 do 4% alkoholu metylowego nie ograniczał w znacznym stopniu wzrostu grzybni. Przy dawce 5% alkohol metylowy znacząco ograniczał wzrost biomasy. Również El-Holi i inni [2004], badając wpływ dodatku metanolu w podłożach zawierających sacharozę i serwatkę, zauważyli, że dawki metanolu powyżej 5% powo- dują znaczne ograniczenie wzrostu biomasy. Wyniki uzyskane w badaniach prezentowa- nych w tej pracy wykazały, że alkohol metylowy dodany do podłoży z sacharozą negatywnie oddziałuje na efektywność bioprocesu, powodując redukcję biosyntezy kwasu cytrynowego wraz ze wzrostem jego stężenia. Wyraźnie większą redukcję ilości uzyska- nego kwasu cytrynowego odnotowano, gdy alkohol metylowy dodawano w 45. godzinie hodowli. Dawka 5% alkoholu metylowego dodana w 45. godzinie hodowli spowodowała 14-krotne zmniejszenie ilości kwasu cytrynowego w stosunku do próby kontrolnej. Ta sama ilość alkoholu dodana przed rozpoczęciem hodowli powodowała około dwukrotny spadek ilości kwasu cytrynowego.

Do podobnych wniosków doszedł Rugsaseel i inni [1996], którzy w celu określenia roli metanolu w stymulowaniu procesu biosyntezy kwasu cytrynowego, przeprowadzili badania z udziałem mutantów szczepu Aspergillus niger, charakteryzujących się zaburze- niami syntezy białek. Autorzy wykazali, że dodatek metanolu do podłoży syntetycznych powodował ograniczenie produkcji kwasu cytrynowego oraz wzrostu grzybni wraz ze zwiększaniem stężenia metanolu w podłożu. Mutanty charakteryzowały się większą wy-

(7)

dajnością procesu bez obecności metanolu. Z kolei szczep rodzicielski więcej kwasu cytrynowego wytwarzał hodowany w podłożach z dodatkiem 2% metanolu. Stąd wniosek, że wydajność procesu biosyntezy kwasu cytrynowego w środowisku z metanolem zależy od cech osobniczych stosowanych drobnoustrojów.

Mechanizm oddziaływania metanolu na biosyntezę kwasu cytrynowego zarówno w podłożach syntetycznych, jak i naturalnych nie został do końca wyjaśniony. Prze- prowadzone doświadczenia wykazały, że alkohol metylowy w podłożach z sacharozą, szczególnie zastosowany w dużych dawkach, znacznie obniża efektywność bioprocesu.

Prawdopodobnie wynika to z faktu, że alkohol metylowy zaburza procesy metaboliczne oraz wzrost biomasy, co skutkuje obniżeniem produkcji kwasu cytrynowego. Powoduje on również zaburzenia w syntezie białek komórkowych we wczesnych etapach hodowli [Rugsaseel i in. 1996, Nadeem i in. 2010]. Alkohol metylowy wpływa na przepuszczal- ność błon komórkowych, czego przyczyną mogą być zmiany w składzie fosfolipidów i trójgliceroli [Podgórski 2002]. Według Jernejec i innych [1990] fosfolipidy odgrywają istotną rolę w regulacji przepuszczalności błon dla kwasu cytrynowego. Alkohol metylowy może zaburzać kształtowanie się struktury grzybni poprzez efekt chelatowania jonów metali takich jak jony miedzi (II), które odgrywają istotną rolę w regulowaniu zawartości kwasów tłuszczowych glikolipidów i fosfolipidów [Benuzzi i Segovia 1996].

Przedstawione w pracy wyniki potwierdzają, że alkohol metylowy wpływa na zmniejszenie akumulowanego kwasu cytrynowego, oddziałując toksycznie na wzrost grzybni.

Twierdzeniu temu przeczą badania udowadniające pozytywny wpływ metanolu na bio- syntezę kwasu cytrynowego w podłożach syntetycznych. W badaniach Maddox i innych [1986] metanol w podłożach syntetycznych, zawierających galaktozę jako źródło węgla, wywoływał efekt toksyczny poprzez ograniczenie wzrostu grzybni i zmniejszenie zuży- cia substratu, ale równocześnie zwiększał wydajność procesu produkcji kwasu cytrynowego. Ponadto alkohol metylowy hamował aktywność dehydrogenazy 2-oksyglutarowej, co pociągało za sobą zwiększenie akumulacji kwasu cytrynowego. Również Yaykaşlı i inni [2005] dowodzą, że alkohol metylowy w procesie biosyntezy przy użyciu unie- ruchomionych konidiów Aspergillus niger w podłożach z sacharozą przyczynia się do zwiększenia produkcji kwasu cytrynowego.

Większość dostępnych danych literaturowych donosi o pozytywnym wpływie niż- szych stężeń alkoholu metylowego na wydajność procesu produkcji kwasu cytrynowego przez Aspergillus niger w podłożach naturalnych, charakteryzujących się małą czysto- ścią, np. w podłożach melasowych [Moyer 1953b, Roukas i Kotzekidou 1997, Podgór- ski 2002, Haq i in. 2003, Ashraf i in. 2004, Nadeem i in. 2010, Kareem 2010, Shetty 2015]. Stymulujący wpływ alkoholu metylowego dodanego do podłoży naturalnych wynika z ograniczenia negatywnego oddziaływania na proces biosyntezy zawartych w podłożu jonów metali, takich jak: mangan, żelazo i cynk, na które szczepy Aspergil- lus niger wykazują dużą wrażliwość. Alkohol metylowy natomiast zwiększa toleran- cję Aspergillus niger na zawartość jonów żelaza, manganu oraz cynku występujących w podłożach [Moyer 1953a]. Alkohol metylowy powoduje zmiany w normalnej ścieżce metabolizmu węglowodanów, zwiększając zdolności glikolityczne, a w konsekwencji akumulację kwasu cytrynowego. W podłożach naturalnych stymuluje produkcję kwasu cytrynowego, wpływając na wzrost grzybni oraz zmianę składu lipidów ściany komór- kowej [Shetty 2015].

(8)

WNIOSKI

Wyniki przeprowadzonych badań pozwalają stwierdzić, że alkohol metylowy w pod- łożach syntetycznych, zawierających sacharozę jako źródło węgla, okazał się czynnikiem negatywnie wpływającym na wydajność i szybkość biosyntezy kwasu cytrynowego we wgłębnych hodowlach okresowych Aspergillus niger PD-66. Obniżenie ilości produko- wanego kwasu cytrynowego było wynikiem toksycznego oddziaływania alkoholu metylowego na przyrost oraz morfologię biomasy grzybni.

LITERATURA

Ashraf H., Rehman A., Haq I., 2004. Effect of alcohols on the production of citric acid by Aspergil- lus niger using solid state fermentation. J. Food Technol. 2, 1, 1–3.

Barrington S., Kim J.W., 2008. Response surface optimization of medium components for citric acid production by Aspergillus niger NRRL 567 grown in peat moss. Bioresource Tech- nol. 99, 2, 368–377.

Benuzzi D.A., Segovia R.F., 1996. Effect of the copper concentration on citric acid productivity by an Aspergillus niger strain. Appl. Biochem. Biotech. 3, 61, 393–397.

Dhillon G.S., Brar S.K., Kaur S., Verma M., 2013. Bioproduction and extraction optimization of citric acid from Aspergillus niger by rotating drum type solid-state bioreactor. Ind. Crop Prod. 41, 78–84.

Dziezak J.D., 2003. Acids. Properties and determination. Encyclopedia of Food Sciences and Nu- trition. Institute of Food Research, Norwich, UK, Elsevier.

El-Holi M.A., Al-Delaimy S., 2004. Citric acid production from whey with sugars and additives by Aspergillus niger. Afr. J. Biotechnol. 2, 10, 356–359.

Fiume M., Heldreth B., 2012. Final report. On the safety assessment of citric acid, inorganic citrate salts, and alkyl citrate esters as used in cosmetics. Pobrane z: http://www.cir-safety.org/

sites/default/files/citric032012FR.pdf.

Haq I.U., Ali S., Qadeer M., Iqbal J., 2003. Stimulatory effect of alcohols (methanol and ethanol) on citric acid productivity by a 2-deoxy D-glucose resistant culture of Aspergillus niger GCB-47. Bioresource Technol. 86, 3, 227–233.

Jernejec K., Cimerman A., Vendramin M., Perdih A., 1990. Lipids of a citric-acid-producing Asper- gillus niger strain grown in copper- and in manganese-supplemented media. Appl. Mi- crobiol. Biot. 32, 6, 699–703.

Kareem S.O., Akpan I., Alebiowu O.O., 2010. Production of citric acid by Aspergillus niger using pineapple waste. Malays J. Microbiol. 6, 2, 161–166.

Leśniak W., 1974. Przydatność niektórych substancji jako stymulatorów w procesie fermentacji wgłębnej kwasu cytrynowego. Prace Naukowe Wyższej Szkoły Ekonomicznej We Wro- cławiu 52, 74, 49–61.

Maddox I.S., Hossain M., Brooks J.D., 1986. The effect of methanol on citric acid production from galactose by Aspergillus niger. Appl. Microbiol. Biot. 23, 3, 205–205.

Moyer A.J., 1953a. Effect of alcohols on the mycological production of citric acid in surface and submerged culture. I. Nature of the alcohol effect. Appl. Microbiol. 1, 1, 1–6.

Moyer A.J., 1953b. Effect of alcohols on the mycological production of citric acid in surface and submerged culture. II. Fermentation of crude carbohydrates. Appl. Microbiol. 1, 1, 7–13.

Nadeem A., Syed Q., Baig S., Irfan M., Nadeem M., 2010. Enhanced production of citric acid by Aspergillus niger m-101 using lower alcohols. Turk. J. Biochem. 35, 1, 7–13.

(9)

Papagianni M., 2007. Advances in citric acid fermentation by Aspergillus niger: Biochemical aspects, membrane transport and modeling. Biotechnol. Adv. 25, 244–263.

Pazouki M., Felse P.A., Sinha J., Panda T., 2000. Comparative studies on citric acid production by Aspergillus niger and Candida lipolytica using molasses and glucose. Bioprocess Eng.

22, 4, 353–361.

Pietkiewicz J.J., 2002. Biosynteza kwasu cytrynowego przez Aspergillus niger w warunkach jed- no- i wielostopniowych hodowli ciągłych. Prace Naukowe Akademii Ekonomicznej we Wrocławiu. Monografie i Opracowania 927/100.

Podgórski W., 2002. Kształtowanie aktywności oddechowej i kwasotwórczej Aspergillus niger podczas produkcji kwasu cytrynowego w podłożach z melasą trzcinową. Prace Naukowe Akademii Ekonomicznej We Wrocławiu. Monografie i Opracowania 914/144.

Roukas T., Kotzekidou P., 1997. Pretreatment of date syrup to increase citric acid production. En- zyme Microb. Tech. 21, 4, 273–276.

Rugsaseel S., Kirimura K., Usami S., 1996. Citric acid accumulation by cycloheximide sensitive mutant strains of Aspergillus niger. Appl. Microbiol. Biot. 45, 1–2, 28–35.

Shetty V.G., 2015. Production and optimization of citric acid by Aspergillus niger using molasses and corncob. Int. J. Pharm. Sci. 7, 5, 152–157.

Yaykaşlı K.O., Demirel G., Yaţar A., 2005. Influence of alcohols on citric acid production by Asper- gillus niger A-9 entrapped in polyacrylamide gels. J. Food Eng. 70, 4, 518–522.

EFFECT OF METHANOL ON CITRIC ACID BIOSYNTHESIS FROM SUCROSE BY ASPERGILLUS NIGER

Summary. Several factors influence the course of the Aspergillus niger culture and the rate of citric acid biosynthesis in submerged culture. Amongst them are the kind of carbon source and its concentration, type and concentration of metal ions present in the culture media and the mycelium morphology. The stimulating effect of the factors on the citric acid biosynthesis has been studied extensively. Low molecular weight alcohols, such as methanol, ethanol and n-propanol can stimulate the biosynthesis of citric acid. The aim of the study was to evaluate the effect of methyl alcohol on citric acid biosynthesis in submerged batch culture by Aspergillus niger PD-66 in synthetic medium with sucrose. Two series of tests were conducted in which the methyl alcohol was added to the culture medium in amounts of 2, 3, 4, 5% (v/v). In the first series of tests methyl alcohol was added to the sterile medium before the start of the culture, while in other – after period of 45 hours of culture run. Analysis of the results showed that the methyl alcohol gives negative effect on the efficiency of biosynthesis of citric acid over the range of concentrations used. This was observed regardless of the time when alcohol was added to the fermentation medium. The efficiency reduction of the process was primarily due to the toxic effects of the methanol on the formation of mycelium.

Key words: Aspergillus niger, citric acid, methanol, batch culture, biosynthesis