Wstęp i cel pracy
G³ównym celem kryminalistycznych badañ gene-tycznych jest dostarczenie danych umo¿liwiaj¹cych identyfikacjê osoby, która pozostawi³a œlad biologiczny na miejscu pope³nienia przestêpstwa. Ze wzglêdu na to, ¿e na podstawie wniosków z opinii bieg³ego sk³a-dy orzekaj¹ce s¹dów karnych podejmuj¹ decyzje pro-cesowe, konieczne jest stosowanie takich metod anali-tycznych, które cechuj¹ siê pewnoœci¹ i powtarzalno-œci¹ uzyskanych wyników oraz spe³niaj¹ warunek po-wszechnej akceptacji œrodowiska naukowego. Natural-n¹ drog¹ rozwoju kryminalistycznych badañ genetycz-nych jest dostosowanie do swoich potrzeb technologii badawczych, które wykorzystywane s¹ podczas innych badañ molekularnych. Drugim czynnikiem, który wp³y-wa na koniecznoœæ stosowp³y-wania nowoczesnych technik badawczych, jest zmiana taktyki pope³niania prze-stêpstw. Sprawcy przyk³adaj¹ coraz wiêksz¹ wagê do zabezpieczenia siê przed pozostawieniem œladów, na podstawie których mo¿na by³oby ich zidentyfiko-waæ. Bior¹c pod uwagê tylko te najwa¿niejsze czynni-ki, postêp genetycznej metody identyfikacyjnej jest œci-œle skorelowany z rozwojem, jaki dokonuje siê w in-nych ga³êziach nauk przyrodniczych. Pozwala to na analizê œladów biologicznych, które dotychczas nie mog³y zostaæ wykorzystane do kryminalistycznej iden-tyfikacji indywidualnej.
Jeszcze do niedawna eksperci wykonuj¹cy badania na potrzeby wymiaru sprawiedliwoœci nie byli w stanie uzyskaæ wiarygodnych rezultatów, izoluj¹c DNA z ma-³ej liczby komórek, pomimo istnienia takiej mo¿liwoœci. Nawet jeœli w toku oglêdzin miejsca pope³nienia prze-stêpstwa zabezpieczono œlad powsta³y w wyniku krót-kotrwa³ego kontaktu sprawcy z ofiar¹ czy przedmio-tem, to taki materia³ by³ czêsto bez wartoœci dla tocz¹-cego siê postêpowania. W zwi¹zku z tym wysi³ki gene-tyków zmierzaj¹ w stronê modyfikacji istniej¹cych pro-cedur badawczych albo zastosowania innych technolo-gii, ni¿ standardowo wykorzystywanych w kryminali-stycznych badaniach genetycznych.
Z tych w³aœnie powodów, bazuj¹c na doœwiadczeniu i wiedzy cytogenetyków molekularnych i onkologów,
wprowadzono do praktyki kryminalistycznej dwie meto-dy analityczne: fluorescencyjn¹ hybrymeto-dyzacjê in situ (FISH) oraz mikrolaserowe pozyskiwanie komórek (LCM) [9]. Mo¿liwe sta³o siê oznaczenie profilu DNA z materia³u, który do tej pory stwarza³ du¿e trudnoœci podczas procesu identyfikacji indywidualnej. Po³¹cze-nie tych dwóch metod badawczych, od wielu lat wyko-rzystywanych w cytogenetyce molekularnej oraz w on-kologii, jest szczególnie u¿yteczne podczas wykony-wania ekspertyz genetycznych, w których istnieje ko-niecznoœæ oznaczenia typów komórek i ich odseparo-wania od siebie. Najczêœciej taka sytuacja powstaje w toku badania materia³u dowodowego zabezpieczo-nego po pope³nieniu przestêpstwa zgwa³cenia. Zarów-no, gdy analizowany jest wymaz z pochwy ofiary, wy-maz z powierzchni penisa pobrany od podejrzanego, czy z prezerwatywy zabezpieczonej w toku oglêdzin miejsca zdarzenia, zastosowanie standardowych pro-cedur postêpowania czêsto nie przynosi pozytywnych rezultatów. W takich sytuacjach konieczne staje siê zi-dentyfikowanie komórek ¿eñskich i odseparowanie ich od komórek mêskich. Zastosowanie obu metod anali-tycznych umo¿liwia oddzielenie materia³u genetyczne-go ofiary przestêpstwa oraz sprawcy czynu zabronio-nego.
G³ównym celem ³¹cznego zastosowania tych tech-nik badawczych na potrzeby wymiaru sprawiedliwoœci jest dowodzenie przestêpstw z rozdzia³u XXV kodeksu karnego, jednak spektrum ich wykorzystania jest znacznie szersze. Po³¹czone metody FISH i LCM do-skonale nadaj¹ siê do identyfikacji i oddzielenia diplo-idalnych komórek mêskich od ¿eñskich w zaschniê-tych, mieszanych plamach krwi. Dziêki wykorzystaniu tych technologii badawczych, po nielegalnym zabiegu aborcji, okreœlono profil DNA biologicznego ojca [2]. Tak¿e w celu oddzielenia komórek ró¿nych gatunków taksonomicznych mo¿na stosowaæ metody poprzedza-j¹ce badania genetyczne. Ma to znaczenie podczas dowodzenia przestêpstw zwi¹zanych z nielegalnym obrotem chronionymi gatunkami roœlin i zwierz¹t oraz ich przetworzonymi fragmentami.
Stosowanie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ oraz mikrolaserowego pozyskiwania komórek sta³o siê
Wojciech Achrem, Małgorzata Parafiniuk-Pacholska
Fluorescencyjna hybrydyzacja
in situ (FISH) i metoda laserowego
pozyskiwania mikroskrawków (LCM)
konieczne tak¿e ze wzglêdu na tworzenie i rozwijanie bazy danych DNA, w których g³ówn¹ rolê odgrywaj¹ profile osób oparte na niekoduj¹cych fragmentach DNA, typu STR, o wysokim polimorfizmie, zlokalizowa-nych na chromosomach autosomalzlokalizowa-nych. Mimo i¿ mo¿-liwe jest uzyskanie informacji (w postaci uk³adu alleli) tylko o mê¿czyŸnie (polimorfizm fragmentów ulokowa-nych na chromosomie Y) czy o kobiecie (polimorfizm fragmentów znajduj¹cych siê na chromosomie X), to jednak moc dyskryminuj¹ca takiego wyniku jest sto-sunkowo niewielka. Wspólne zastosowanie obu opisy-wanych metod pozwoli na okreœlenie profili autosomal-nego DNA, które mo¿na bêdzie porównaæ z rekordami zgromadzonymi w genetycznej bazie danych.
Celem artyku³u jest ukazanie zastosowania dwóch metod badawczych: fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ oraz laserowego pozyskiwania mikroskrawków w nowoczesnych badaniach kryminalistycznych.
Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH)
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych in situ, czyli w miejscu ich naturalnego wystêpowania, polega na ³¹-czeniu znakowanego polinukleotydu – sondy moleku-larnej – z komplementarnymi sekwencjami kwasów nu-kleinowych w komórce. Pocz¹tkowo znacznikami son-dy molekularnej by³y izotopy, jednak stosunkowo szyb-ko radioaktywna hybrydyzacja kwasów nukleinowych zosta³a wyparta przez metodê immunofluorescencyjn¹. Zalet¹ FISH jest jej wykonywanie bezpoœrednio na szkie³ku mikroskopowym. Metoda umo¿liwia wykry-cie poszukiwanej sekwencji DNA lub RNA oraz, co jest szczególnie istotne z kryminalistycznego punktu widze-nia, lokalizuje dan¹ sekwencjê w komórkach czy nawet na chromosomach. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ charakteryzuje siê wysok¹ czu³oœci¹, szybkoœci¹ uzyskania wyników oraz mo¿liwoœci¹ zastosowania, podczas jednego badania, wielu fluorochromów o ró¿-nym zabarwieniu [1, 10, 11, 12].
Pierwszym etapem jest denaturacja kwasu dezo-ksyrybonukleinowego chromosomowego oraz DNA sondy molekularnej na powierzchni podstawowego szkie³ka mikroskopowego. Po zapewnieniu odpowied-nich warunków termicznych nastêpuje proces ³¹czenia siê sondy molekularnej z komplementarn¹ sekwencj¹ DNA badanych komórek. Nastêpnie s³abo hybrydyzo-wane sondy DNA zostaj¹ wyp³ukane z preparatu. Miej-sca hybrydyzacji wykrywa siê metodami immunoche-micznymi lub poprzez bezpoœredni¹ obserwacjê prepa-ratu pod mikroskopem wyposa¿onym w lampê fluore-scencyjn¹ (ryc. 1) [11].
Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ pozwala miê-dzy innymi na: lokalizacjê konkretnych genów lub ich fragmentów w obrêbie poszczególnych chromosomów, identyfikacjê addycji chromosomowych, wykrywanie obcego materia³u genetycznego w komórkach, identy-fikacjê chromosomów markerowych, lokalizacjê mikro-delecji oraz identyfikacjê chromosomowych pêkniêæ i translokacji, identyfikacjê chromosomów p³ci oraz ich regionów, ocenê ekspresji okreœlonych genów w ko-mórkach, badania z zakresu ewolucjonizmu porów-nawczego, analizê aberracji chromosomowych w ba-daniach z zakresu genetyki toksykologicznej [11].
W kryminalistycznych badaniach genetycznych szczególnie przydatnymi w³aœciwoœciami tej metody badawczej s¹: identyfikacja sekwencji markerowych charakterystycznych dla danego gatunku oraz identyfi-kacja chromosomów p³ci. Mo¿liwoœæ zastosowania ró¿nobarwnych znaczników fluorescencyjnych sond komplementarnych do sekwencji fragmentów DNA zlo-kalizowanych na chromosomie X i Y pozwala, podczas analizy mikroskopowej, na rozró¿nienie komórek ¿eñ-skich od mê¿eñ-skich [9].
Metoda mo¿e byæ z powodzeniem stosowana w ge-netycznych laboratoriach kryminalistycznych. Nie ma
Ryc. 1. Schemat metody fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ [autorzy za M. Achrem wg 11]
Fig. 1. Scheme of fluorescence in situ hybridization (FISH) method [by 11]
FISH
FLUORESCENCYJNA HYBRYDYZACJA IN SITU
Preparat cytologiczny
Denaturacja
Hybrydyzacja
P³ukanie hybrydyzacyjne
Wykrywanie zhybrydyzowanych sond
Barwienie z wykorzystaniem fluorochromów
Analiza preparatów w mikroskopie fluorescencyjnym
koniecznoœci tworzenia nowej pracowni, lecz istniej¹c¹ nale¿y wyposa¿yæ w dodatkowy sprzêt. Warunkiem niezbêdnym do przeprowadzenia udanej hybrydyzacji jest zapewnienie optymalnych warunków termicznych denaturacji oraz póŸniejszego ³¹czenia siê sond mole-kularnych z komplementarnymi sekwencjami DNA. Mo¿na to zrealizowaæ, wyposa¿aj¹c termocykler – standardowo stosowany w badaniach genetycznych – w przystawkê do hybrydyzacji in situ. Dziêki temu jed-no urz¹dzenie bêdzie wykorzystywane do ³añcuchowej reakcji polimerazy i do procesu ³¹czenia siê oligonukle-otydów z komplementarn¹ sekwencj¹ DNA. Termocy-kler z blokiem umo¿liwiaj¹cym wykonanie hybrydyzacji przedstawia rycina 2.
Kolejnym elementem wyposa¿enia laboratorium jest mikroskop optyczny z lamp¹ fluorescencyjn¹, sprzê¿o-ny z systemem komputerowym za pomoc¹ toru wizyj-nego. Obrazy mikroskopowe s¹ zapisywane na noœni-ku magnetycznym komputera. Stanowisko do analizy obrazów mikroskopowych przedstawiono na rycinie 3.
Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ jest procesem niewymagaj¹cym du¿ej liczby specjalistycznych urz¹-dzeñ. Zastosowanie wielu fluorochromów jednocze-œnie podnosi jej wartoœæ jako metody do zastosowania
w badaniach kryminalistycznych. Co wa¿ne, po proce-sie ³¹czenia siê sond molekularnych z komplementar-nymi sekwencjami istnieje mo¿liwoœæ amplifikacji ozna-kowanego fragmentu DNA [11].
Metoda ma pewne ograniczenia. Podczas procesu hybrydyzacji mo¿e dojœæ do renaturacji helisy DNA, a powsta³e hybrydy bardzo czêsto s¹ niestabilne [1, 11].
Laserowe pozyskiwanie
mikroskrawków (LCM)
Istotnym problemem w nowoczesnych badaniach onkologicznych jest heterogeniczna natura struktur tkankowych. Uniemo¿liwia to dokonanie analizy cech
morfologicznych czy fizjologicznych pojedynczych, zmutowanych komórek. Doœwiadczenia kliniczne po-kazuj¹, i¿ rezultaty badañ struktur komórkowych nie-wyselekcjonowanych z tkanki bardzo czêsto by³y co najmniej nieprecyzyjne. St¹d te¿, aby wp³yw œrodowi-ska nie zaburza³ toku leczenia, pojawi³a siê koniecz-noœæ selekcjonowania fragmentów tkanek lub po-szczególnych komórek, w celu poddania ich dok³adnej analizie w warunkach pozaustrojowych. Rozwój tech-nik mikroskopowych umo¿liwia precyzyjn¹ selekcjê
Ryc. 2. Termocykler z przystawk¹ do hybrydyzacji in situ Fig. 2. Thermocycler equipped in with situ hybridization heater Ÿród³o (ryc. 2–3): autorzy
Ryc. 3. Stanowisko do analizy obrazu spod mikroskopu fluorescencyjnego Fig. 3. Fluorescence microscope equipped with LCD camera
materia³u, w zwi¹zku z tym zdecydowano siê na po³¹-czenie ich z fizycznym oddzielaniem komórek od in-nych struktur za pomoc¹ energii lasera [3, 7].
Metoda laserowego pozyskiwania mikroskrawków pozwala na izolacjê tych struktur biologicznych bezpo-œrednio z preparatu mikroskopowego. Aktualnie stoso-wane s¹ dwie techniki: z wykorzystaniem lasera pod-czerwonego oraz lasera ultrafioletowego. Pierwszym etapem metody jest wizualizacja preparatu pod mikro-skopem. Nastêpnie okreœlane s¹ wspó³rzêdne po³o¿e-nia komórek, które maj¹ byæ usuniête ze szkie³ka mi-kroskopowego. Po zatwierdzeniu przez operatora wprowadzonych danych laser rozpoczyna oddzielanie oznaczonej struktury od œrodowiska i nastêpuje jej transfer. Metoda charakteryzuje siê bardzo du¿¹ precy-zj¹. Za pomoc¹ energii lasera mo¿liwe jest wycinanie i przenoszenie fragmentów tkankowych oraz pojedyn-czych komórek. Wysoka selektywnoœæ pozwalaj¹ca na separacjê pojedynczych komórek jest cech¹ szcze-gólnie predysponuj¹c¹ metodê do badañ kryminali-stycznych [7].
Systemy wyposażone w laser podczerwony
Po bezpoœredniej wizualizacji komórek i oznaczeniu ich po³o¿enia na szkie³ku mikroskopowym uruchamia-ny jest laser pulsuj¹cy, którego zadaniem jest zmiana w³aœciwoœci fizycznych filmu polimerowego przymoco-wanego do przezroczystego stolika zamontoprzymoco-wanego w osi optycznej mikroskopu. Pod wp³ywem energii b³o-na polimerowa przykleja siê do wybranej komórki. Si³y adhezji s¹ na tyle du¿e, ¿e komórka jest odrywana od struktury tkankowej. Nastêpnie jest ona przenoszo-na do probówki i zalewaprzenoszo-na buforem ekstrakcyjnym. Umo¿liwia to oddzielenie filmu polimerowego od wyciê-tych komórek. W wyniku procesu otrzymuje siê jedno-rodny materia³ biologiczny, który jest zakwalifikowany do dalszych badañ genetycznych [7].
Systemy wyposażone w laser UV
Energia promieniowania ultrafioletowego s³u¿y do wycinania oznaczonych fragmentów tkanek lub ko-mórek znajduj¹cych siê na szkie³kach zaopatrzonych w membrany polietylenowe (PEN lub PET). Po wyciêciu komórek energia tego samego lasera powoduje, ¿e s¹ one katapultowane do probówki z buforem adhezyjnym. Zalet¹ tej techniki jest to, i¿ podczas wycinania i przeno-szenia materia³u biologicznego nie dochodzi do kontak-tu komórek z membran¹. Dziêki temu ryzyko kontami-nacji innym materia³em biologicznym jest znikome. Po-dobnie jak w poprzedniej metodzie otrzymuje siê ko-mórki, które mo¿na poddaæ procedurom stosowanym w genetycznych badaniach kryminalistycznych [6, 7, 9].
Stosowanie metody laserowego pozyskiwania mi-kroskrawków pozwala na precyzyjn¹ selekcjê materia-³u biologicznego, wczeœniej zdiagnozowanego metod¹ fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ. Oddzielenie od siebie komórek ró¿nej p³ci zapobiega wystêpowaniu mieszaniny DNA (o dominuj¹cym komponencie) czy zjawisku amplifikacji preferencyjnej. Wyposa¿enie la-boratorium kryminalistycznego w tego typu urz¹dzenie jest jednak kosztowne. Wymaga to bowiem stworzenia oddzielnej pracowni oraz zatrudnienia osoby, która specjalizowa³aby siê w obs³udze tych urz¹dzeñ.
Wykorzystanie metody fluorescencyjnej
hybrydyzacji in situ (FISH) i laserowego
pozyskiwania mikroskrawków (LCM)
w badaniach kryminalistycznych
Po³¹czenie zalet obu metod, które standardowo s¹ wykorzystywane od wielu lat w cytogenetyce moleku-larnej i onkologii, pozwala na przekroczenie kolejnej granicy w genetycznych badaniach kryminalistycznych. Dziêki fluorescencyjnej analizie mikroskopowej oraz precyzyjnemu pobieraniu komórek z preparatu mikro-skopowego mo¿liwe jest uzyskanie profilu DNA, na podstawie którego mo¿liwa jest identyfikacja krymi-nalistyczna osoby. Pominiêcie tego etapu przed bada-niami genetycznymi niektórych œladów czy dowodów rzeczowych skutkuje najczêœciej tym, i¿ bieg³y we wnioskach swojej opinii nie mo¿e jednoznacznie siê wypowiedzieæ o dawcy DNA na podstawie wyników badañ z zabezpieczonej próbki substancji.
Zastosowanie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ oraz metody laserowego pozyskiwania mikroskrawków jest szczególnie przydatne podczas wykonywania ba-dañ genetycznych zleconych przez organy procesowe w postêpowaniach dotycz¹cych przestêpstw na tle seksualnym. Jeœli materia³em dowodowym jest wymaz pobrany od ofiary i gdy po badaniu mikroskopowym rozmazu na szkie³ku nie stwierdzono obecnoœci plem-ników, to standardowe sposoby postêpowania s¹ bez-celowe. W takim przypadku zastosowanie procedury li-zy preferencyjnej nie spowoduje oddzielenia siê frakcji mêskiej od ¿eñskiej, poniewa¿ w materiale do badañ znajduj¹ siê tylko komórki o podobnym ciê¿arze. Ana-liza danych statystycznych pokazuje, i¿ azoospermia wystêpuje coraz czêœciej w populacji. Oznacza to, i¿ tak¿e wiêksza liczba gwa³cicieli cierpi na tê dolegli-woœæ. Jednak brak plemników w materiale biologicz-nym pobrabiologicz-nym od kobiety, ofiary gwa³tu, nie oznacza, i¿ nie ma tam materia³u biologicznego pochodz¹cego od mê¿czyzny. Leukocyty sprawcy oraz komórki na-b³onkowe z jego przewodu ejakulacyjnego s¹ obecne w wymazie zabezpieczonym do dalszych badañ, pod warunkiem ¿e sprawca nie u¿ywa³ prezerwatywy
podczas dokonania czynu zabronionego. W takiej sytu-acji bieg³y ma do czynienia z mieszanin¹ DNA, w któ-rej dominowaæ bêdzie komponent pochodz¹cy od ko-biety, przy znikomo ma³ej iloœci mêskiego kwasu de-zoksyrybonukleinowego. Przy takiej dysproporcji, czê-sto siêgaj¹cej czê-stosunku 70:1 i wiêcej, szanse na uzy-skanie wyniku badañ genetycznych, który bêdzie mo¿-na poddaæ amo¿-nalizie statystycznej, s¹ ma³e. Zazwyczaj uzyskuje siê wyraŸny profil kobiety oraz nieliczne alle-le pochodz¹ce od mê¿czyzny. Konieczne jest wiêc do-konanie separacji komórek mêskich od ¿eñskich jesz-cze przed badaniami genetycznymi. Na rynku dostêp-ne s¹ sondy ze znacznikami fluorescencyjnymi kom-plementarnymi do specyficznej sekwencji satelity alfa centromeru chromosomu X oraz satelity III DNA w re-gionie Yq12 chromosomu Y (na przyk³ad zestaw CEP X Spectrum Orange i Y Spectrum Green firmy Ab-bott Molecular). Komórki ¿eñskie, zawieraj¹ce dwa chromosomy X, bêd¹ oznaczone kolorem pomarañ-czowym, natomiast w przypadku komórek mêskich do chromosomu X przy³¹czy siê sonda z pomarañczo-wym znacznikiem, a do chromosomu Y oligonukleotyd oznaczony kolorem zielonym. Obraz z mikroskopu flu-orescencyjnego przedstawiono na rycinie 4. Metoda FISH pozwala zatem na identyfikacjê komórek mêskich i ¿eñskich. Po okreœleniu wspó³rzêdnych po³o¿enia ko-mórek mêskich na szkie³ku mo¿liwe staje siê ich pobra-nie z preparatu za pomoc¹ metody laserowej mikrode-sekcji. Po ich wyodrêbnieniu z mieszaniny wysoce prawdopodobne jest uzyskanie profilu DNA, na podsta-wie którego mo¿na dokonaæ identyfikacji kryminali-stycznej [6, 7, 8].
Podobny schemat postêpowania obowi¹zuje w przypadku, gdy zabezpieczono wymaz z penisa osoby podejrzanej o pope³nienie przestêpstwa zgwa³-cenia. Oprócz pochodz¹cego od mê¿czyzny materia³u, którego iloœæ jest dominuj¹ca, w pobranym materiale obecne s¹ komórki nab³onkowe pochodz¹ce od ofiary gwa³tu. W takim przypadku uwaga bieg³ego jest skon-centrowana na oznaczeniu komórek ¿eñskich i skich, a nastêpnie na wyodrêbnieniu komponentu mê-skiego z mieszaniny i jego póŸniejszej analizie gene-tycznej [4, 5].
Po³¹czenie obu opisanych powy¿ej metod z bada-niami genetycznymi daje dobre rezultaty, gdy w toku oglêdzin miejsca pope³nienia przestêpstwa zgwa³cenia ujawniono i zabezpieczono do dalszych badañ prezer-watywê. Pobieraj¹c, w warunkach laboratoryjnych, wy-mazy substancji biologicznej naniesionej na obie po-wierzchnie prezerwatywy, mo¿na sprawdziæ, na której z nich znajduj¹ siê komórki mêskie, a gdzie dominuj¹ komórki ¿eñskie. Oznaczenie p³ci metodami cytogene-tyki molekularnej i wyodrêbnienie komórek z preparatu oraz zastosowanie odpowiednich metod analizy
gene-tycznej pozwol¹ na powi¹zanie zabezpieczonego œla-du z ofiar¹ przestêpstwa oraz ze sprawc¹ [8].
Nie tylko dowodzenie przestêpstw z rozdzia³u XXV kodeksu karnego (przeciwko wolnoœci seksualnej i obyczajnoœci) mo¿e byæ wspomagane po³¹czeniem metod FISH i LCM. Spektrum zastosowania w bada-niach kryminalistycznych tych technologii jest znacznie szersze. Wszêdzie tam, gdzie istnieje koniecznoœæ
od-dzielenia od siebie materia³u biologicznego w formie komórek, mo¿na te procedury analityczne z powodze-niem wykorzystaæ. W literaturze opisane s¹ przypadki, w których zastosowanie przez bieg³ych fluorescencyj-nej hybrydyzacji in situ i laserowego pozyskiwania mi-kroskrawków oraz badañ genetycznych pozwoli³o na ustalenie biologicznego ojca p³odu po nielegalnie wykonanej aborcji. Fluorescencyjna hybrydyzacja in si-tu pozwoli³a na rozró¿nienie fragmentów tkankowych pochodz¹cych od matki i p³odu, a metoda laserowej mikrodesekcji na precyzyjne wyselekcjonowanie mate-ria³u do badañ genetycznych [2, 14].
Zalety zastosowania fluorescencyjnej
hybrydyzacji in situ (FISH) i laserowego
pozyskiwania mikroskrawków (LCM)
w badaniach kryminalistycznych
Proces wdra¿ania do praktyki kryminalistycznej me-tod badawczych, które s¹ wykorzystywane w innych dziedzinach nauki, jest czasoch³onny i wymaga
ponie-Ryc. 4. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) interfazowych komó-rek ludzkich. Zielony sygna³ wskazuje sondê specyficzn¹ dla ludzkiego chromosomu Y (satellite III DNA), a czerwony to sonda specyficzna dla ludzkiego chromosomu X (alpha satellite DNA) [13]
Fig. 4. Fluorescence in situ hybridization (FISH) of a interphase human cells. The green colour indicates a probe specific for human chromosome Y (satellite III DNA) and red is a probe specific for human chromoso-me X (alpha satellite DNA) [13]
sienia du¿ych kosztów. Jednak ich zastosowanie po-zwoli na uzyskanie wiarygodnych wyników, których do niedawna nie mo¿na by³o interpretowaæ. Dla krymi-nalistyki wprowadzenie nowej metodyki badawczej to du¿a korzyœæ. Poszerza siê spektrum stosowanych technologii, co ma wp³yw na wykrywanie sprawców przestêpstw. Dziêki nowatorskim rozwi¹zaniom badaw-czym rola prewencyjna kryminalistyki stale siê zwiêksza. Równie wa¿nym aspektem jest wzmacnianie wœród spo³eczeñstwa poczucia posiadania przez orga-ny wymiaru sprawiedliwoœci narzêdzi, które spowoduj¹ nieuchronnoœæ kary za pope³nione przestêpstwo. Roz-wój metod badawczych umo¿liwia udowodnienie po-pe³nienia czynu zabronionego przez oskar¿onego, a to wp³ywa na rozstrzygniêcie procesowe sk³adu orzekaj¹-cego.
Aktualnie wyniki badañ genetycznych s¹ gromadzo-ne w formie elektronicznych baz danych. Ich konstrukcja pozwala miêdzy innymi na porównywanie profili DNA osób z uk³adami alleli uzyskanymi po badaniu zabezpie-czonych œladów kryminalistycznych. Najwiêksze zna-czenie maj¹ bazy danych, w których zgromadzone s¹ in-formacje o loci autosomalnych typu STR. Wynika to z ich du¿ej wartoœci diagnostycznej oraz przydatnoœci do ana-lizy statystycznej. St¹d te¿ istnieje tendencja, aby wpro-wadzaæ metody badawcze ukierunkowane na analizê tych niekoduj¹cych fragmentów DNA. Polimorfizm chro-mosomów X i Y oraz analiza mitochondrialnego DNA maj¹ aktualnie znaczenie wspomagaj¹ce. Zastosowanie metod fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ oraz lasero-wego pozyskiwania mikroskawków pozwala na oznako-wanie i selekcjê komórek z opisanego powy¿ej materia-³u biologicznego, a poprzez zastosowanie metod analizy genetycznej mo¿liwe jest oznaczenie profilu DNA, który mo¿na bêdzie wprowadziæ do baz danych i porównaæ go z jej zasobami.
Dziêki wprowadzeniu do praktyki kryminalistycznej obu tych metod mo¿liwe sta³o siê otrzymanie wyników badañ z materia³u, który do tej pory nie móg³ byæ anali-zowany. W sytuacjach mieszanin DNA, w przypadku których jeden z komponentów znacznie przewa¿a nad drugim, np. stosunek mieszaniny 70:1, brak selek-cji komórek mêskich od ¿eñskich spowodowa³by, i¿ ma-³o realne byma-³oby oznaczenie pe³nego profilu komponen-tów mieszaniny DNA. Oddzielenie komórek mêskich od ¿eñskich ten problem ca³kowicie eliminuje [3, 9].
Przedstawiony przegl¹d niektórych korzyœci p³y-n¹cych bezpoœrednio z ³¹cznego zastosowania obu metod pokazuje, i¿ poniesione koszty zwi¹zane z wy-posa¿eniem i szkoleniem pracowników s¹ szybko kompensowane, w chwili gdy na podstawie badañ sk³ady orzekaj¹ce s¹dów karnych otrzymaj¹ wiary-godne narzêdzie, które umo¿liwia podjêcie decyzji procesowej.
Podsumowanie
Cech¹ charakterystyczn¹ kryminalistycznych badañ genetycznych jest wykorzystywanie technologii badaw-czych, które s¹ z powodzeniem stosowane w innych dziedzinach biologii molekularnej. Wprowadzenie do praktyki kryminalistycznej metody fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ oraz laserowego pozyskiwania mi-kroskrawków, standardowo od wielu lat wykorzystywa-nych w cytogenetyce molekularnej i w onkologii, po-zwoli³o na oznaczenie profili DNA z materia³u biologicz-nego, który do tej pory nie móg³ byæ analizowany. Za-prezentowany kierunek rozwoju badañ kryminalistycz-nych jest zwi¹zany z regu³ami uznania dakryminalistycz-nych metod badawczych za spe³niaj¹ce wymogi przydatnoœci pod-czas dowodzenia pope³nienia przestêpstw.
Przydatnoœæ opisanych powy¿ej dwóch metod ana-litycznych jest szczególnie du¿a do wykrywania spraw-ców przestêpstw przeciwko wolnoœci seksualnej i oby-czajnoœci. Dziêki zastosowaniu FISH i LCM uzyskuje siê materia³ biologiczny, który daje du¿e prawdopodo-bieñstwo otrzymania wiarygodnego i potwierdzonego statystycznie wyniku badañ genetycznych.
BIBLIOGRAFIA
1. Brown T.: Genomy, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2001.
2. Budimlija Z., Lechpammer M., Popiolek D., Fogt F., Prinz M., Bieber F.: Forensic applications of Laser Capture Microdissection: use in DNA-based parentage testing and platform validation, Croat. Medicine Journal 2005, 46 (4), 549. 3. Burgemeister R.: New Aspects of Laser Microdissec-tion in research and routine, Journal of Histochemistry & Cy-tochemistry 2005, vol. 53 (3), 409.
4. Cina S., Collins K., Pettenati M., Fitts M.: Isolation and Identification of Female DNA on Postcoital Penile Swabs, American Journal of Forensic Medicine & Pathology 2000, 21 (2): 97.
5. Di Martino D., Giuffre G., Staiti N., Simone A., Le Donne M., Saravo L.: Single sperm cell isolation by laser mi-crodissection. Congrès Mediterranean Academy of Forensic Sciences, Workshop No 1, Reggio Calabria, ITALIE 2004, vol. 146, SUP (226 p.) (6 ref.), 151.
6. Elliott K., Hill D., Lambert C., Burroughes T., Gill P.: Use of laser microdissection greatly improves the recovery of DNA from sperm on microscope slides, 2003, 137 (1): 28.
7. Espina V., Wulfkuhle J., Calvert V., VanMeter A., Zhou W., Coukos G., Geho D., Petricoin E., Liotta L.: La-ser-capture microdissection, Nature Protocols 2006, 1, 586.
8. Maj S., Cina S., Collins K., Fitts M., Pettenati M.: Iso-lation and Identification of Male and Female DNA on a Post-coital Condom, Archives of Pathology and Laboratory Medici-ne 2000, vol. 124, No. 7, pp. 1083.
9. Murray C., McAlister C., Elliott K.: Identification and isolation of male cells using fluorescent in situ hybridization and laser microdissection, for use in the investigation of sexu-al assault, Forensic Science Internationsexu-al: Genetics 2007, 1, 247.
10. Primrose S.: Zasady analizy genomu, Wydawnictwa Naukowo-Techniczne, Warszawa 1999.
11. Skuza L., S³omiñska-Walkowiak R., Filip E., Achrem M., Kalinka A.: Wybrane metody biologii i cytogene-tyki molekularnej, Wydawnictwo Uniwersytetu Szczeciñskie-go, Szczecin 2008.
12. S³omski R. [red.]: Przyk³ady analiz DNA, Wydawnic-two Akademii Rolniczej w Poznaniu, Poznañ 2004.
13. Wojtkiewicz P.: Advanced LMD Forensic Applica-tions. North Louisiana Crime Lab, prezentacja z konferencji Technology Transfer Workshop, National Institute of Justice 2007.
14. Vecchiotti C., Spaltro G., Bloise D,. Brunetli E., Sciacchitano S.: Demonstration of a Gastric Bioptic Speci-men Mix-up by Laser Capture Microdissection (LCM) and DNA Fingerprinting, American Journal of Forensic Medicine & Pathology 2004, 25 (2): 113.
Streszczenie
Celem artyku³u jest przedstawienie dwóch metod badaw-czych: fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ oraz laserowego po-zyskiwania mikroskrawków, które s¹ standardowo wykorzysty-wane w cytogenetyce molekularnej i w onkologii. Ich ³¹czne za-stosowanie w genetycznych badaniach kryminalistycznych
po-zwoli na uzyskanie rezultatów – profili autosomalnego DNA w uk³adach polimorficznych typu STR. Przedstawiono zasadê dzia³ania tych metod, ich zalety oraz wady z punktu widzenia identyfikacji kryminalistycznej. Przedstawiono tak¿e obszary dzia³añ przestêpczych, przy dowodzeniu których mo¿liwe jest wykorzystanie opisanych technologii.
S³owa kluczowe: kryminalistyczne badania genetyczne, uk³ady typu STR, przestêpstwa przeciwko wolnoœci seksualnej, mieszaniny DNA, laserowe pozyskiwanie mikroskrawków (LCM), fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH), bazy da-nych DNA.
Summary
The main aim of this article is to describe two biological technologies: fluorescence in situ hybridization (FISH) and laser capture microdissection (LCM). These methods are used in molecular cytogenetic and oncology. Their application to forensic science enables identification of male and female cells and isolation of spermatozoa from microscope slides containing sperms and vaginal cells. Fluorescence in situ hybridization (FISH) and laser capture microdissection (LCM) are both useful tools to prove sexual assaults. The authors describe forensic usefulness and emphasise advantages and disadvantages of these technologies.
Keywords:forensic science, short tandem repeat (STR) pro-files, sexual assault, DNA mixtures, laser capture microdissec-tion (LCM), fluorescence in situ hybridizamicrodissec-tion (FISH), DNA database.
Czytelniku,
Czytelniku,
informujemy, ¿e jest do nabycia monografia
autorstwa Tomasza Bednarka
pt. „Dowód osmologiczny.
Aspekty kryminalistyczne i procesowe”.
Ksi¹¿kê mo¿na zamawiaæ w Biurze Logistyki Policji KGP ul. Domaniewska 36/38, 02-672 Warszawa
tel. (022) 601-29-45, faks (022) 601-15-71
