11 Aleksandra Buchaj Monika Garbacz

.N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018

streszczenie

O batoklaks jest antagonistą białek należących do rodziny Bcl-2, zawierających cz- tery domeny homologiczne. Wiąże się on do domeny BH3 białek należących do rodziny Bcl-2, uniemożliwiając wiązanie białek anty- apoptotycznych z białkami proapoptotycznymi (Bax i Bak), skutkując aktywację szlaku apop- totycznego w komórce. Białka z rodziny Bcl-2 (Bcl-2, Bcl-xL i Mcl-1) ulegają nadekspresji w przypadku wielu nowotworów. Komórki nowotworowe nabyły sposoby unikania pro- gramowanej śmierci komórki. Badania kliniczne II fazy prowadzone w innych jednostkach nau- kowych potwierdziły możliwość zastosowania obatoklaksu w leczeniu białaczki, chłoniaka oraz włóknienia szpiku. Celem przeprowad- zonych badań in silico było zobrazowanie in- terakcji obatoklaksu z wybranymi białkami proapoptotycznymi. Wykonano je przy pomocy narzędzi bioinformatycznych udostępnionych na zasadach bezpłatnej licencji (icn3D, NGL Protein Viewer, BLAST). Potwierdzono spe- cyficzne wiązanie się obatoklaksu do domeny BH3 białek Bcl-xL, Bcl-xS oraz Mcl-1.

abstract

O batoclax is an antagonist of Bcl-2 family members containing four homology do- mains. It binds to BH3 domain in members of the Bcl-2 protein family, preventing the bind- ing of these anti-apoptotic proteins to the pro- apoptotic proteins (Bax and Bak) and so pro- moting the activation of the apoptotic pathway in Bcl-2-overexpressing cells. The Bcl-2 fam- ily of proteins (Bcl-2, Bcl-xL and Mcl-1) are overexpressed in a wide variety of cancers.

Cancer cells acquire instruments to circum- vent programmed cell Heath. Several Phase II clinical trials were completed that investigated use of Obatoclax in the treatment of leukemia, lymphoma and myelofibrosis. In silico research was performed using bioinformatic software (icn3D, NGL Protein Viewer, BLAST). Spe- cific binding of obatoklaks to the BH3 doment of the Bcl-xL, Bcl-xS and Mcl-1 proteins was confirmed.

Aleksandra Buchaj Monika Garbacz

Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie Wydział Biologii i Biotechnologii UMCS

Studenckie Koło Naukowe Biotechnologów „Mikron”

ul. Akademicka 19, 20-033 Lublin e-mail: aleksandra.buchaj@gmail.com

Badania interakcji obatoklaksu z białkami z rodziny Bcl-2

Interaction between obatoclax and Bcl-2 family proteins

S łowa kluczowe: obatoklaks, apoptoza, rodzina białek Bcl-2, baza danych.

K ^{ey words:} obatoklaks, apoptosis, Bcl-2

family, data bank.

.N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018

Wstęp

B ioinformatyka to dziedzina nauki konstruująca, wykorzystująca i doskonaląca metody i narzędzia informatyczne do rozwiązywania problemów z zakresu nauk biologicznych i medycznych. Do zadań bio- informatyki należy rozwój metod obliczenio- wych służących do badania struktury, funk- cji i ewolucji genów, genomów i białek. Z tą dziedziną ściśle powiązane są biochemia, gene- tyka, statystyka, biologia molekularna, matema- tyka oraz eksploracja danych (Rys. 1). Rosnąca popularność bioinformatyki jest związana ze wzrostem mocy obliczeniowej niezbędnej do wykonania analiz. Zapotrzebowanie to jest rozładowywane przy pomocy narzędzi oraz algorytmów, umożliwiających głębsze zro- zumienie procesów i zależności występujących w żywych organizmach (SOUALMIA I LEC- ROQ, 2015).

Szczególnie istotną rolę bioinformatyka pełni w modelowaniu molekularnym. Ten dział jest wykorzystywany w celu poznawania funkcji

A

B

, M

G

struktur biologicznych o znanej budowie (m.in.

na podstawie badań katalizy enzymatycznej, oddziaływań molekularnych, stabilności białek), a także do projektowania leków (ang. drug de- sign). XXI wiek przeniósł cyfryzację społeczną na użytek nauki. Stworzenie nowych leków nie wymaga obecnie przesiewu tysięcy związków aktywnych – ten etap zastąpiony został zdalną identyfikacją grupy farmakoforowej na pod- stawie znanej struktury wiodącej działającej specyficznie względem sekwencji celu leczenia (ang. target), która zgromadzona jest w ba- zach danych (TERSTAPPEN I REGGIANI, 2001). Metoda ta pozwala na ograniczenie czasu oraz kosztów badań przedklinicznych, ponieważ jednoznacznie selekcjonuje związki (na podstawie modelowania aktywności oraz ADME-Tox), które nie wykazują korzystnych właściwości (AFSHARI I IN., 2011). Badania bioinformatyczne zawsze muszą być potwierd- zone trzema fazami badań klinicznych przed wejściem leku do obrotu.

Apoptoza jest zaprogramowanym pro- cesem eliminacji uszkodzonych lub nadmiar-

s

. 11- 23

R

.N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018

owych komórek poprzez aktywację kaskady kaspaz (proteaz cysteinowych tnących wiązanie peptydowe za resztą Asp) (LI I YUAN, 2008).

Wyróżniamy zewnętrzny oraz wewnętrzny szlak apoptozy. Aktywacja szlaku zewnętrznego związana jest z prezentacją specyficznych li- gandów proapoptotycznych receptorom Fas, TRAIL-R (ang. Tumor necrosis factor-Re- lated Apoptosis-Inducing Ligand Receptor) i TNFR-1 (ang. Tumor Necrosis Factor Recep- tor 1), które znajdują się na powierzchni komórek i zawierają domenę śmierci (DD, ang. Death Domain) (THORBURN, 2007; HONGMEI, 2012). Receptory te, działając na białka adap- torowe poprzez wewnątrzkomórkową domenę, wiążą m.in. proteazy cysteinowe jak np. kas- paza 8 (SCHNEIDER I TSCHOPP, 2000).

Wiązanie ligandu do domeny śmierci powodu- je powstanie miejsca wiązania dla białka adap- torowego, a cały kompleks białkowy ligand-re- ceptor jest znany jako kompleks sygnalizacyjny indukujący śmierć komórki (DISC, ang. Death Inducing Signaling Complex), który uczynnia

prokaspazę 8 do formy aktywnej (CHANG I IN., 2003). Jest to bezpośredni aktywator kas- pazy 3. W ten sposób uruchomiona zostaje kaskada kaspaz. Jednocześnie szlak zewnętrzny uruchamia szlak sygnałowy NF- B, co prowadzi do degradacji DNA (HOESEL I SCHMID, 2013).

Do podstawowych czynników proapop- totycznych można zaliczyć uszkodzenia DNA, niedobór specyficznych hormonów, stres oksy- dacyjny powstały w wyniku działania wolnych rodników, zakażenia wirusowe oraz promien- iowanie jonizujące (GERSPACH I IN., 2009;

HONGMEI, 2012; NAIR I IN., 2014).

Wewnętrzny szlak apoptozy związany jest z mitochondriami komórki. W tym przy- padku sygnałem proapoptotycznym zwykle jest stres oksydacyjny o pochodzeniu wewnętrznym (powodujący także uszkodzenie DNA) lub zewnętrznym (sygnał śmierci przekazany ze szlaku zewnętrznego). Proces apoptozy jest regulowany przez białko p53, “strażnik geno- mu”, które kontroluje ekspresję białek z rodziny

R ys. 2. Przebieg procesu apoptozy (KEGG Pathway, zmod.).

.N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 Bcl-2, odpowiadających za potencjał błonowy

mitochondrium (PIETSCH I IN., 2008; PAR- SONS I GREEN, 2010). W wyniku działania tego szlaku zwiększona zostaje produkcja białek proapoptotycznych, m.in. białek Bax i Bak, które uczestniczą w powstaniu porów w zewnętrznej błonie mitochondrialnej (MOMP, ang. Mi- tochondria Outer Membrane Pearmabiliza- tion). Przez pory do cytoplazmy wydostaje się cytochrom c, który łącząc się z prokaspazą 9 i białkiem Apaf-1 buduje efektorowy czynnik szlaku wewnętrznego - apoptosom (BROWN I BORUTAITE, 2008). Struktura ta przeprow- adza aktywację do kaspazy 9 i kontynuację kaskady kaspaz. Elementem wspólnym szlaku wewnętrznego i zewnętrznego apoptozy są kas- pazy efektorowe (kaspaza 3, kaspaza 7) (Rys. 2) (ICHIM I TAIT, 2016). Końcowym skutkiem apoptozy jest utworzenie ciałek apoptotyc- znych, powstałych na skutek zniszczenia cytosz- kieletu, kondensacji chromatyny, zmniejszenia integralności i zaniku kariolemmy, odwod- nienia cytoplazmy, zniszczenia białek struk- turalnych i enzymatycznych, czego końcowym efektem jest uwypuklanie błony komórkowej (ang. membrane blebbing) (ELMORE, 2007).

Makrofagi rozpoznają komórki apoptotyczne dzięki obecności w błonie komórkowej fosfa- tydyloseryny (zmodyfikowanego aminokwasu, który w zdrowych komórkach występuje tylko w monowarstwie cytoplazmatycznej) (FADOK I IN., 2001) oraz sygnałowi trombospondyny (MOODLEY I IN., 2003).

Wysoka ekspresja białek antyapoptotyc- znych i jednoczesna niska ekspresja białek pro- apoptotycznych jest cechą charakterystyczną komórek nowotworowych (WONG, 2011).

Stwierdzenie tego stanu może pomóc w ocenie zaburzeń cyklu komórkowego prowadzących do zmian nowotworowych. Zapobieganie temu procesowi jest jednym z możliwych rozwiązań zahamowania procesu nowotworzenia (REED, 2003). O wysokim znaczeniu apoptozy w donie- sieniach naukowych świadczy Nagroda Nobla w

dziedzinie fizjologii lub medycyny 2002, która została przyznana Johnowi Sulstonowi, Syd- neyowi Brennerowi, Howardowi Horvitzowi za ich odkrycia z dziedziny genetycznej regu- lacji organogenezy i zaprogramowanej śmierci komórki (HORVITZ, 2003).

Obatoklaks (GX015-070) (Rys. 3) jest syntetyczną pochodną prodiginin, grupy, u której wykazano przeciwnowotworowe i im- munosupresyjne właściwości (WILLIAM- SON I IN., 2007; VAN ROSSOM I IN., 2016). Zalicza się go do niskocząsteczkowych antagonistów domeny BH3 antyapoptotyc- znych białek z rodziny Bcl-2 (SHORE I VI- ALLET, 2005; CAMPAS I IN., 2006; MAR- ZO I NAVAL, 2008; NI CHONGHAILE I LETAI, 2008; SHUKLA I IN., 2017). Wiąże się on do bruzdy hydrofobowej domeny BH3 i wypiera z tego miejsca domenę transbłonową.

Jej oddziaływanie z błoną mitochondrialną po- woduje oligomeryzację białek i permeabilizację błony zewnętrznej mitochondrium (DEW- SON I KLUCK, 2009). Zwykle w badaniach stosowana jest stabilna pochodna metanosulfo- nianowa obatoklaksu, która posiada wskazane powyżej aktywności proapoptotyczne. Obecnie środek ten należy do firmy Teva Pharmaceu- tical Industries, która wykupiła go od odkry- wców tego leku, Gemin X Biotech.

W testach in vitro wykazano, że obatoklaks wywołuje apoptozę komórek chłoniaka (linie komórkowe: L428, Granta- A

B

, M

G

s

. 11- 23

R ys. 3. Struktura chemiczna obatoklaksu

.N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018

519, CRO, Karpas-422) (CAMPAS I IN., 2006; O’BRIEN I IN., 2009; SAMUEL I IN., 2010; GOY I IN., 2014), nowotworu piersi (linie komórkowe: MCF-7, MCF/18, MTR-3) (WITTERS I IN., 2007; CRUICK- SHANKS I IN., 2012), szpiczaka mnogiego (linia komórkowa HMCLs) (TRUDEL I IN., 2007), czerniaka złośliwego (linie komórkowe:

B16-F1, Mel-RM, MM200, IgR3, Me1007, Me4405, SKMel-28) (NGUYEN I IN., 2007;

WATANABE I IN., 2013; WRÓBLEWSKI I IN., 2013), ostrej białaczki szpikowej (linia komórkowa OCI-AML3) (KONOPLEVA I IN., 2008), drobnokomórkowego nowot- woru płuc (PAIK I IN., 2011; DEAN I IN., 2011), raka płaskonabłonkowego głowy i szyi (linie komórkowe: UMSCC-1, Cal33, UM- SCC-22A) (YAZBECK I IN., 2014), raka trzustki (linie komórkowe: HPAC, MIA PaCa-2, PANC-1, AsPC-1, BxPC-3, CF- PAC-1) (WANG I IN., 2014). Stwierdzono także zatrzymanie cyklu komórkowego w fazie S/G2 indukowane nawet niewielkimi ilościami obatoklaksu (KONOPLEVA I IN., 2008).

Wyniki badań II fazy testów klinicznych były przyczyną wykluczenia obatoklaksu z dalszych testów. Wykazano ograniczoną aktywność kliniczną m.in. u pacjentów z nawrotowym lub opornym na leczenie klasycznym chłoniakiem Hodgkina i nawrotowym drobnokomórkowym raku płuc (BAYES I IN., 2007; PAIK I IN., 2011; CRUICKSHANKS I IN., 2012; OKI I IN., 2012; GOY I IN., 2014). Występują próby wykorzystania innych antagonistów białek z rodziny Bcl-2 w leczeniu skojarzonym (GOARD I SCHIMMER, 2013; OR I IN., 2017). Celem przeprowadzonych badań było poznanie interakcji obatoklaksu z wybranymi białkami proapoptotycznymi z rodziny Bcl-2.

Metodyka badań

S trukturę przestrzenną obatokla- ksu pobrano z serwisu PubChem, a następnie

przetworzono do konformacji 3D przy pomo- cy narzędzia icn3D, udostępnionego w wolnym dostępie przez NCBI (ang. National Center of Biotechnology Information).

Do selekcji badanych białek z rodz- iny Bcl-2 wykorzystano bazę danych KEGG (podbaza PATHWAY), która zawiera dostępne informacje na temat oddziaływań między białkami oraz graficzne reprezentacje procesów komórkowych (KANEHISA I GOTO, 2000), które są szczególnie użyteczne w przewidywa- niu działania leków na komórkę.

Wizualizację struktur stworzono przy pomocy programu NGL Protein Viewer kom- patybilnego z bazą danych PDB (ang. Pro- tein Data Bank) (ROSE I HILDEBRAND, 2015). Interakcje między wizualizowanymi białkami i obatoklaksem przewidywano na podstawie porównania cech białek oraz ich powinowactwa do cząsteczki leku. W tym celu wykorzystano dane zgromadzone w serwisie UniProtKB. Badania lokalnego podobieństwa między białkami z rodziny Bcl-2 wykonano przy pomocy narzędzia BLAST (ang. Basic Local Alignment Search Tool) oraz Align.

Dyskusja i wyniki

B iałka należące do rodziny Bcl-2

odpowiadają przede wszystkim za regulację

szlaku wewnętrznego apoptozy poprzez

permeabilizację błony zewnętrznej mitochon-

dium (SHAMAS-DIN I IN., 2013). Białka

należące do rodziny Bcl-2 zawierają cztery

funkcjonalne domeny: BH1, BH2, BH3 lub

BH4 (CORY I IN., 2003). Wszystkie białka

antyapoptotyczne zawierają domeny BH1 i

BH2, a niektóre z nich zawierają dodatkową

N-końcową domenę BH4 (Bcl-2, Bcl-xL i

Bcl-w), która jest również widoczna w niek-

tórych białkach proapoptotycznych, takich

jak Bcl-xS, Bok-L i Bok-S. Z drugiej strony,

wszystkie białka proapoptotyczne zawierają

domenę BH3, która jest niezbędna do dimery-

.N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 zacji z innymi białkami z rodziny Bcl-2 i pełni

kluczową rolę w ich aktywności promującej apoptozę (ZHA I IN., 1997; KELEKAR I THOMPSON, 1998). Trzy funkcjonalnie ważne regiony homologiczne Bcl-2 (BH1, BH2 i BH3) znajdują się w swoim bliskim sąsiedztwie przestrzennym i tworzą wydłużoną szczelinę, która może stanowi miejsce wiązania dla innych członków rodziny Bcl-2. Właśnie w to miejsce trafia obatoklaks, który łącząc się z białkami antyapoptotycznymi, uniemożliwia ich wiązanie z białkami proapoptotycznymi (odpowiedzialnymi za wytworzenie MOMP), promując aktywację kaskady kaspaz (NGUY- EN I IN., 2007; SULKSHANE I TENI, 2016.; SHUKLA I IN., 2017). Kluczowa w kontekście interakcji z obatoklaksem domena BH3 posiada w swojej strukturze hydrofobową bruzdę, która jest miejscem wiązania dome- ny transbłonowej białek z rodziny Bcl-2 (KELEKAR I THOMPSON, 1998). Jest to miejsce niezbędne do aktywacji procesu apop- tozy mitochondrialnej, więc często określa się domenę BH3 jako silny mediator śmierci komórki. Skutkiem działania antagonistów tej domeny jest permeabilizacja błony zewnętrznej mitochondrium, na skutek którego cytochrom c przechodzi do cytozolu (LOMONOSOVA I CHINNADURAI, 2008).

Znaczne różnice w sekwencji aminok- wasowej białek z rodziny Bcl-2 odpowiadają za ich różne funkcje. Wstępne badanie wykazało, że Bcl-xS nie posiada fragmentu 126-188, który występuje w sekwencji białka Bcl-xL.

Jednocześnie ich domena transmembranowa jest dokładnie tożsama (Rys. 4A). W przy- padku porównania z białkiem Mcl-1 różnice są znacznie większe: zmienia się struktura drugo- i trzeciorzędowa, stosunek struktur alfa do beta oraz sekwencja domeny transmembra- nowej (Rys. 4B). Białko Bcl-xS pozbawione jest przedostatniego z motywów struktural- nych, a także dużego fragmentu ostatniego z motywów (Rys. 4C). Sekwencje motywów

białka Mcl-1 i Bcl-xL różnią się, a pierwszy z nich jest dodatkowo powiększony o frag- ment długości 9 aminokwasów (Rys. 4D).

R ys. 5. Interakcja obatoklaksu z białkiem Bcl-xL (opracowanie własne autorów).

Dokładny szlak przekazywania sygnału antyapoptotycznego przez Bcl-xL wciąż nie jest znany, jednak na podstawie obecnej wiedzy uważa się, że różni się on znacznie pod względem mechanizmu hamowania apopto- zy od szlaku, któremu podlega Bcl-2. Bcl-xL może specyficznie wiązać się z resztami cyto- chromu C (BERTINI I IN., 2011) oraz czyn- nikiem Apaf-1 (HU I IN., 1998), zapobiegając dalszym etapom apoptozy. Izoforma ta została wybrana na kanoniczną dla rodziny Bcl-2 pod względem sekwencji aminokwa- sowej. Obatoklaks wiąże się z domeną BH3 w płaszczyźnie bruzdy hydrofobowej (Rys. 5).

Sygnał proapoptotyczny nie zostaje zatrzymany i dochodzi do programowanej śmierci komór- ki (SCHWARTZ-ROBERTS I IN., 2013).

Białko Bcl-xS zawiera domenę BH3,

co sprawia, że wykazuje oddziaływanie z oba-

toklaksem. Jego aktywność proapoptotyc-

zna jest związana z wiązaniem białek Bcl-xL

i Bcl-2, co wykazano na linii komórkowej

PC12 (komórki guza chromochłonnego nad-

nercza) (LINDENBOIM I IN., 2000). Mimo

przeciwstawnych funkcji wykazano na pod-

stawie struktury, że białko Bcl-xS jest krótszą

A

B

, M

G

s

. 11- 23

.N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018

R ys. 4. Porównanie sekwencji aminokwasowych Bcl-xL (Q07817), Bcl-xS (Q07817-2) oraz

Mcl-1 (Q07820). Jako sekwencję wzorcową, do której odnoszono pozostałe sekwencje wybrano

Bcl-xL. W schematach A i C porównywana jest ona do sekwencji białka Bcl-xS, natomiast w

schematach B i D do sekwencji białka Mcl-z. Schematy A i B obrazują strukturę drugorzędową

badanych białek. Schematy C i D przedstawiają motywy struktury trzeciorzędowej. Kolorami

oznaczono helisy (różowy), struktury beta (pomarańczowy), zakręty (szary), fragmenty trans-

membranowe (żółty) oraz strukturalne motywy (czerwony) zlokalizowane w sekwencjach.

.N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 przecięcia większej cząsteczki lub modyfikacji

ekspresji genu będącej wynikiem działania pro- apoptotycznych regulatorów (WILLIMOTT I IN., 2011). Podobnie jak w przypadku białka Bcl-xL interakcja obatoklaksu wystąpiła w obrębie bruzdy hydrofobowej (Rys. 6).

R ys. 6. Interakcja obatoklaksu z białkiem Bcl-xS (opracowanie własne autorów).

Cechujące się inną strukturą białko Mcl-1 ze względu na alternatywny splic- ing może występować w dwóch izoformach.

Dłuższa z nich hamuje apoptozę, natomiast krótsza jest białkiem proapoptotycznym (ze względu na zmienioną sekwencję we fragmen- cie 231-271 i usunięty końcowy fragment 272- 350). Dłuższa izoforma wykazuje skłonność do heterodimeryzacji m.in. z Bid (MOHAM- MAD I IN., 2008) i Bad (BAE I IN., 2001).

Prowadzi to do blokowania inicjacji kaskady kaspaz. Krótsza izoforma może powstać nie tylko poprzez alternatywny splicing, ale także poprzez rozcięcie dłużej cząsteczki przez kas- pazy efektorowe w procesie rozpoczętej już apoptozy. Obatoklaks wiąże się z domeną BH3 i uniemożliwia stworzenie dimeru antyapopto- tycznego (Rys. 7), ale również ogranicza dostęp specyficznych enzymów do miejsca izoformic- znego cięcia białka prowadząc do jego destruk- cji przy pomocy egzoproteaz. W wyniku in- terakcji białko Mcl-1 traci swoje właściwości antyapoptotyczne (NGUYEN I IN., 2015).

R ys. 7. Interakcja obatoklaksu z białkiem Mcl- 1 (opracowanie własne autorów).

Podsumowanie

W badaniach in silico potwierdzono interakcje obatoklaksu z białkami antyapoptyc- znymi z rodziny Bcl-2 na przykładzie białek Bcl- xL, Bcl-xS i Mcl-1. We wszystkich przykładach zaobserwowano związanie cząsteczki leku do domeny BH3 białka. Związany z tym spadek aktywności wykazywany w literaturze przed- miotu wskazuje na wpływ obatoklaksu na proces apoptozy wewnętrznej. W analizie in silico nie przebadano natury oddziaływania z białkami z rodziny Bcl-2. Przypuszczalnie in- terakcje uniemożliwiają wiązanie białek anty- apoptotycznych z białkami proapoptotycznymi (Bax i Bak), a zatem promują aktywację kaskady kaspaz. Ze względu na metodę powyższego badania (in silico) należy odnosić je do badań klinicznych, które zatrzymały się na II fazie.

Podziękowania

P ragniemy serdecznie podziękować mgr Jakubowi Knurkowi, doktorantowi Uniwersytetu Medycznego w Lublinie za kry- tyczne uwagi w czasie dyskusji, komentarze dotyczące roboczej wersji naszego tekstu, prow- adzenie w argumentacji oraz udzielone wspar- cie bioinformatyczne i edytorskie.

A

B

, M

G

s

. 11- 23

.N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 Literatura

AFSHARI C. A., HAMADEH H. K., BUSH- EL P. R. 2011. The evolution of bioinformatics in toxicology: advancing toxicogenomics. Toxi- cological Sciences. 120(S1), 225-S237.

BAE J., HSU S. Y., LEO C. P., ZELL K., HSUEH A. J. 2001. Underphosphorylated BAD interacts with diverse antiapoptotic Bcl- 2 family proteins to regulate apoptosis. Apop- tosis. 6, 319-330.

BAYES M., RABASSEDA X., PROUS J. R.

2007. Gateways to clinical trials. Methods and Findings in Experimental and Clinical Phar- macology. 29, 427-437.

BERTINI I., CHEVANCE S., DEL CON- TE R., LALLI D., TURANO P. 2011. The anti-apoptotic Bcl-x(L) protein, a new piece in the puzzle of cytochrome c interactome. PLoS One 6, e18329.

BROWN G. C., BORUTAITE V. 2008.

Regulation of apoptosis by the redox state of cytochrome c. Biochimica et Biophysica Acta.

1777, 877-881.

CAMPAS C., COSIALLS A. M., BARRA- GAN M., IGLESIAS-SERRET D., SAN- TIDRIAN A. F., COLL-MULET L., DE FRIAS M., DOMINGO A., PONS G., GIL J. 2006. Bcl-2 inhibitors induce apoptosis in chronic lymphocytic leukemia cells. Expimen- tal Hematology. 34, 1663-1669.

CHANG D. W., XING Z., CAPACIO V. L., PETER M. E., YANG X. 2003. Interdimer processing mechanism of procaspase-8 activa- tion. EMBO Journal. 22, 4132-4142.

CORY S., HUANG D. C., ADAMS J. M.

2003. The Bcl-2 family: roles in cell survival

CRUICKSHANKS N., TANG Y., BOOTH L., HAMED H., GRANT S., DENT P. 2012.

Lapatinib and obatoclax kill breast cancer cells through reactive oxygen species-dependent endoplasmic reticulum stress. Molecular Phar- macology. 82, 1217-1229.

DEAN E. J., CUMMINGS J., ROULSTON A., BERGER M., RANSON M., BLACK- HALL F., DIVE C. 2011. Optimization of cir- culating biomarkers of obatoclax-induced cell death in patients with small cell lung cancer.

Neoplasia. 13, 339-347.

DEWSON G., KLUCK R. M. 2009. Mecha- nisms by which Bak and Bax permeabilise mi- tochondria during apoptosis. Journal of Cell Science. 122, 2801-2808.

ELMORE S. 2007. Apoptosis: a review of pro- grammed cell death. Toxicologic Pathology. 35, 495-516.

FADOK V. A., DE CATHELINEAU A., DALEKE D. L., HENSON P. M., BRAT- TON D. L. 2001. Loss of phospholipid asym- metry and surface exposure of phosphatidyl- serine is required for phagocytosis of apoptotic cells by macrophages and fibroblasts. Journal of Biological Chemistry. 276, 1071-1077.

GERSPACH J., WAJANT H., PFIZENMA- IER K. 2009. Death ligands designed to kill:

development and application of targeted can- cer therapeutics based on proapoptotic TNF family ligands. Results and Problems in Cell Differntiation. 49, 241-273.

GOARD C. A., SCHIMMER A. D. 2013. An evidence-based review of obatoclax mesylate in the treatment of hematological malignancies.

Core Evidence. 8, 15-26.

GOY A., HERNANDEZ-ILZALITURRI F.

.N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 J., KAHL B., FORD P., PROTOMASTRO

E., BERGER M. 2014. A phase I/II study of the pan Bcl-2 inhibitor obatoclax mesylate plus bortezomib for relapsed or refractory mantle cell lymphoma. Leukemia and Lymphoma. 55, 2761-2768.

GRUCA A. 2010. Bioinformatyczne bazy danych. Wydawnictwo PJWSTK. Warszawa.

HOESEL B., SCHMID J. A. 2013. The com- plexity of NF- B signaling in inflammation and cancer. Molecular Cancer. 12, 86.

HONGMEI Z. 2012. Extrinsic and Intrinsic Apoptosis Signal Pathway Review.[w:] Apop- tosis and Medicine. Ntuli T. M. (red.). InTech.

New York. 3-22.

HORVITZ H. R. 2003. Worms, life, and death (Nobel lecture). Chembiochem. 4, 697-711.

HU Y., BENEDICT M. A., WU D., INO- HARA N., NÚÑEZ G. 1998. Bcl-XL inter- acts with Apaf-1 and inhibits Apaf-1-depen- dent caspase-9 activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of USA. 95, 4386-4391.

ICHIM G., TAIT S. W. 2016. A fate worse than death: apoptosis as an oncogenic process.

Nature Reviews Cancer. 16, 539-548.

KANEHISA M., GOTO S. 2000. KEGG:

kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nu- cleic Acids Research. 28, 27-30.

KEGG Pathway: Apoptosis – Homo sapi- ens (human). http://www.genome.jp/kegg- bin/show_pathway?map=hsa04210&show_

description=show

KELEKAR A., THOMPSON C. B. 1998.

Bcl-2-family proteins: the role of the BH3 do- main in apoptosis. Trends in Cell Biology. 8, 324-330.

KONOPLEVA M., WATT J., CONTRAC- TOR R., TSAO T., HARRIS D., ESTROV Z., BORNMANN W., KANTARJIAN H., VIALLET J., SAMUDIO I., ANDREEFF M.

2008. Mechanisms of antileukemic activity of the novel Bcl-2 homology domain-3 mimetic GX15-070 (obatoklax). Cancer Research. 68, 3413-3420.

LI J., YUAN J. 2008. Caspases in apoptosis and beyond. Oncogene. 27, 6194-6206.

MARZO I., NAVAL J. 2008. Bcl-2 family members as molecular targets in cancer therapy.

Biochemical Pharmacology. 76, 939-946.

LINDENBOIM L., YUAN J., STEIN R.

2000. Bcl-xS and Bax induce different apop- totic pathways in PC12 cells. Oncogene. 19, 1783-1793.

LOMONOSOVA E., CHINNADURAI G.

2008. BH3-only proteins in apoptosis and be- yond: an overview. Oncogene. 27, S2-S19.

MOHAMMAD R., GIRI A., GOUSTIN A.

S. 2008. Small-molecule inhibitors of Bcl-2 family proteins as therapeutic agents in cancer.

Recent Patents of Anticancer Drug Discovery.

3, 20-30.

MOODLEY Y., RIGBY P., BUNDELL C., BUNT S., HAYASHI H., MISSO N., MCANULTY R., LAURENT G., SCAFFI- DI A., THOMPSON P., KNIGHT D. 2003.

Macrophage recognition and phagocytosis of apoptotic fibroblasts is critically dependent on fibroblast-derived thrombospondin 1 and CD36. American Journal of Pathology. 162, 771-779.

NAIR P., LU M., PETERSEN S., ASHKE-

NAZI A. 2014. Apoptosis initiation through

the cell-extrinsic pathway. Methods in Enzy-

A

B

, M

G

s

. 11- 23

.N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018

mology. 544, 99-128.

NGUYEN M., CENCIC R., ERTEL F., BER- NIER C., PELLETIER J., ROULSTON A., SILVIUS J. R., SHORE G. C. 2015. Obato- clax is a direct and potent antagonist of mem- brane-restricted Mcl-1 and is synthetic lethal with treatment that induces Bim. BMC Can- cer. 15, 568.

NGUYEN M., MARCELLUS R. C., ROULSTON A., WATSON M., SERFASS L., MURTHY MADIRAJU S. R., GOU- LET D., VIALLET J., BÉLEC L., BILLOT X., ACOCA S., PURISIMA E., WIEG- MANS A., CLUSE L., JOHNSTONE R. W., BEAUPARLANT P., SHORE G. C. 2007.

Small molecule obatoclax (GX15-070) antag- onizes MCL-1 and overcomes MCL-1-medi- ated resistance to apoptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of USA. 104, 19512-19517.

NI CHONGHAILE T., LETAI A. 2008.

Mimicking the BH3 domain to kill cancer cells. Oncogene. 27(S1), 149-157.

O’BRIEN S. M., CLAXTON D. F., CRUMP M., FADERL S., KIPPS T., KEATING M.

J., VIALLET J., CHESON B. D. 2009. Phase I study of obatoclax mesylate (GX15-070), a small molecule pan-Bcl-2 family antagonist, in patients with advanced chronic lymphocytic leukemia. Blood. 113, 299-305.

OKI Y., COPELAND A., HAGEMEIS- TER F., FAYAD L. E., FANALE M., RO- MAGUERA J., YOUNES A. 2012. Experi- ence with obatoclax mesylate (GX15-070), a small molecule pan-Bcl-2 family antagonist in patients with relapsed or refractory classical Hodgkin lymphoma. Blood. 119, 2171-2172.

OR C. R., CHANG Y., LIN W., LEE W.,

SU H., CHEUNG M., HUANG C., HO C., CHANG C. 2017. Obatoclax, a Pan-BCL-2 Inhibitor, Targets Cyclin D1 for Degradation to Induce Antiproliferation in Human Colorectal Carcinoma Cells. International Journal of Mo- lecular Sciences. 18, 44.

PAIK P. K., RUDIN C. M., PIETANZA M.

C., BROWN A., RIZVI N. A., TAKEBE N., TRAVIS W., JAMES L., GINSBERG M. S., JUERGENS R., MARKUS S., TYSON L., SUBZWARI S., KRIS M. G., KRUG L. M.

2011. A phase II study of obatoclax mesylate, a Bcl-2 antagonist, plus topotecan in relapsed small cell lung cancer. Lung Cancer. 74, 481- 485.

PARSONS M. J., GREEN D. R. 2010. Mito- chondria in cell death. Essays in Biochemistry.

47, 99-114.

PIETSCH E. C., SYKES S. M., MCMA- HON S. B., MURPHY M. E. 2008. The p53 family and programmed cell death. Oncogene.

27, 6507-6521.

PubChem. Obatoclax. https://pubchem.ncbi.

nlm.nih.gov/compound/Obatoclax

REED J. C. 2003. Apoptosis-targeted thera- pies for cancer. Cancer Cell. 3, 17-22.

ROSE A. S., HILDEBRAND P. W. 2015.

NGL Viewer: a web application for molecular visualization. Nucleic Acids Research. 43, 576- 579.

SAMUEL S., TUMILASCI V. F., OLIERE S.,

NGUYEN T. L., SHAMY A., BELL J., HIS-

COTT J. 2010. VSV oncolysis in combination

with the BCL-2 inhibitor obatoclax overcomes

apoptosis resistance in chronic lymphocytic

leukemia. Molecular Therapy. 18, 2094-2103.

.N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 SCHNEIDER P., TSCHOPP J. 2000. Apop-

tosis induced by death receptors. Pharmaceu- tica Acta Helvetiae. 74, 281-286.

SHAMAS-DIN A., KALE J., LEBER B., ANDREWS D. W. 2013. Mechanisms of Ac- tion of Bcl-2 Family Proteins. Cold Spring Harbor Perspectives of Biology. 5, a008714.

SHORE G. C., VIALLET J. 2005. Modulat- ing the bcl-2 family of apoptosis suppressors for potential therapeutic benefit in cancer. He- matology American Society of Hematology.

Education Program. 2005, 226-230.

SHUKLA S., SAXENA S., SINGH B. K., KAKKAR P. 2017. BH3-only protein BIM:

An emerging target in chemotherapy. Euro- pean Journal of Cell Biology. 96, 728-738.

SCHWARTZ-ROBERTS J. L., SHAJAHAN A. N., COOK K. L., WARRI A., ABU-ASAB M., CLARKE R. 2013. GX15-070 (obato- clax) induces apoptosis and inhibits cathepsin D- and L-mediated autophagosomal lysis in antiestrogen-resistant breast cancer cells. Mo- lecular Cancer Therapeutics. 12, 448-459.

SOUALMIA L. F., LECROQ T. 2015. Bio- informatics Methods and Tools to Advance Clinical Care. Findings from the Yearbook 2015 Section on Bioinformatics and Transla- tional Informatics. Yearbook of Medicinal In- formatics. 10, 170-173.

SULKSHANE P, TENI T. 2016. BH3 mi- metic Obatoclax (GX15-070) mediates mi- tochondrial stress predominantly via MCL-1 inhibition and induces autophagy-dependent necroptosis in human oral cancer cells. Onco- target. 8, 60060-60079.

TERSTAPPEN G. C., REGGIANI A. 2001.

In silico research in drug discovery. Trends in

Pharmacological Sciences. 22, 23-26.

THORBURN A. 2007. Tumor necrosis factor- related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) pathway signaling. Journal of Thoracic Oncol- ogy. 2, 461-465.

TRUDEL S., LI Z. H., RAUW J., TIEDE- MANN R. E., WEN X. Y., STEWART A. K.

2007. Preclinical studies of the pan-Bcl inhibi- tor obatoclax (GX015-070) in multiple myelo- ma. Blood. 109, 5430-5438.

VAN ROSSOM W., ASBY D. J., TAVAS- SOLI A., GALE P. A. 2016. Perenosins: a new class of anion transporter with anti-cancer ac- tivity. Organic and Biomolecular Chemistry.

14, 2645-2650.

WATANABE M., UMEZAWA K., HI- GASHIHARA M., HORIE R. 2013. Com- bined inhibition of NF-κB and Bcl-2 triggers synergistic reduction of viability and induces apoptosis in melanoma cells. Oncology Re- search. 21, 173-180.

WILLIAMSON N. R., FINERAN P. C., GRISTWOOD T., CHAWRAI S. R., LEEP- ER F. J., SALMOND G. P. 2007. Anticancer and immunosuppressive properties of bacterial prodiginines. Future Microbiology. 2, 605-618.

WILLIMOTT S., MERRIAM T., WAG- NER S. D. 2011. Apoptosis induces Bcl-XS and cleaved Bcl-XL in chronic lymphocytic leukaemia. Biochemical and Biophysical Re- search Communications. 405, 480-485.

WITTERS L. M., WITKOSKI A., PLA- NAS-SILVA M. D., BERGER M., VIALLET J., LIPTON A. 2007. Synergistic inhibition of breast cancer cell lines with a dual inhibitor of EGFR-HER-2/neu and a Bcl-2 inhibitor.

Oncology Reports. 17, 465-469.

A

B

, M

G

s

. 11- 23

.N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018

WONG R. S. 2011. Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment. Journal of Experi- mental and Clinical Cancer Research. 30, 87.

WRÓBLEWSKI D., JIANG C. C., CROFT A., FARRELLY M. L., ZHANG X. D., HERSEY P. 2013. OBATOCLAX and ABT- 737 induce ER stress responses in human mel- anoma cells that limit induction of apoptosis.

PLoS One. 8, e84073.

YAZBECK V. Y., LI C., GRANDIS J. R., ZANG Y., JOHNSON D. E. 2014. Single- agent obatoclax (GX15-070) potently induces apoptosis and pro-survival autophagy in head and neck squamous cell carcinoma cells. Oral Oncology. 50, 120-127.

ZHA J., HARADA H., OSIPOV K., JOCK- EL J., WAKSMAN G., KORSMEYER S. J.

1997. BH3 domain of BAD is required for het- erodimerization with BCL-XL and pro-apop- totic activity. Journal of Biological Chemistry.

272, 24101-24104.