11-23. Badania interakcji obatoklaksu z białkami z rodziny Bcl-2 Autor: Aleksandra Buchaj, Monika Garbacz

.N A UK O W CY .OR G .PL 2 (16)/2017 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 2 (16)/2017 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 2 (16)/2017 .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018

3-10. The effect of fertilizing potato with micronutrients foliar fertilizers

Autor: Ali Hulail Noaema, Barbara Sawicka University of Life Sciences in Lublin

11-23. Badania interakcji obatoklaksu z białkami z rodziny Bcl-2 Autor: Aleksandra Buchaj, Monika Garbacz

Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie

24-31. Ocena lekowrażliwości szczepów Staphylococcus aureus izolowanych z górnych dróg oddechowych a antybiotykoterapia zakażeń gronkowcowych

Autor: Monika Hałgas, Rafał Kuś, Małgorzata Kozioł, Tomasz Zuzak, Alina Olender

Uniwersytet Medyczny w Lublinie

32-44. Infekcje powodowane przez Clostridium difficile - wpływ na organizm człowieka, diagnostyka i leczenie

Autor: Ilona Drąg, Karolina Baryła, Magdalena Michalak

Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie

45-52. Związek probiotyków ze stanem zdrowia sportowców Autor: Jachimowicz Karolina, Jamroży Marzena, Konarska Jagoda

Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie Uniwersytet Medyczny w Lublinie

53-62. Zastosowanie testów behawioralnych w badaniach nad aktywnością lokomotoryczną, równowagą i koordynacją u zwierząt laboratoryjnych

Autor: Mateusz Grabowski, Konstancja Jabłońska Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach 63-73. Znaczenie enolazy jako białka „moonlighting”

Autor: Klaudia Gustaw, Ewa Habza, Adam Waśko

Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie

.N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018

RedaktoR naczelny Mateusz Gortat

zastępca RedaktoRa naczelneGo dariusz Wolski

RedaktoR techniczny paweł kuś

Rada naukoWa:

dr anna stępniowska

(uniwersytet przyrodniczy w lublinie) lek. wet. mgr inż. dariusz Wolski

(uniwersytet przyrodniczy w lublinie) dr Mateusz Gortat

(stowarzyszenie Młodych naukowców) lek. med. Łukasz pastuszak

(Mazowiecki szpital Bródnowski w Warszawie) pRojekt okŁadki

Robert Giza

adRes do koRespondencji stowarzyszenie Młodych naukowców

ul. Wyżynna 20/56, 20-560 lublin e-mail: kontakt@naukowcy.org.pl

www.naukowcy.org.pl

odpowiedzialność za treść i materiały graficzne ponoszą autorzy.

.N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018

abstract

P otato tubers are an important source of minerals. They contain 0.5 to 2.0% of the mineral components, such as nitrogen, potassi- um, phosphorus, magnesium, calcium, sodium, chlorine, copper, zinc, iron, iodine and others.

The problem of low soil fertility and plant mal- nutrition affects not only potato yields, but also the quality of potatoes. This study as a review of many refereed authors was conducted with the aim of highlighting the effects of plant nu- trition on the yield and quality of potato tu- bers. Emphasis was placed on job clarification through which the elements of different nutri- ents affect biochemical processes and eventu- ally affect the total quality of potato tubers and their products. Nutrients reviewed in this paper included microelements such as zinc (Zn), so- dium (Na), iron (Fe), manganese (Mn), copper (Cu), molybdenum (Mo), chlorine (Cl), and nickel (Ni). Moreover, there are some trace el- ements such as, aluminium (Al), silicon (Si), vanadium (V), cobalt (Co) and others. The po- tato quality characteristics mostly reported to be affected by plant nutrition include proteins, carbohydrate, sucrose content in tubers of po- tato; vitamins like vitamin C content in tubers;

potato tuber density; and frying colours. Also application of foliar-fertilization with fertiliz- ers containing micronutrients affects the nitro- gen economy of plants. For example, effects of elements such as magnesium, iron, and zinc are

Ali Hulail Noaema Barbara Sawicka

University of Life Sciences in Lublin

Department of Technology and Commodity Plant Production ul. Akademicka street 15, 20-950 Lublin, Poland

e-mail: ali.algayashe@gmail.com

The effect of fertilizing potato with micronutrients foliar fertilizers

Efekt nawożenia ziemniaka dolistnymi nawozami mikroelementowymi

streszczenie

B ulwy ziemniaka są ważnym źródłem minerałów. Zawierają 0,5 do 2,0% składników mineralnych, takich jak azot, potas, fosfor, magnez, wapń, sód, chlor, miedź, cynk, żelazo, jod i inne. Problem niskiej żyzności gleby Key words: potato quality, micronutrients, nutrition value, potato tubers, foliar fertiliza- tion.

enhanced by the effect of photosynthesis, while zinc, manganese, copper, boron, and iron man- ganese, increase the plant resistance to diseases.

It has been noted that essential and beneficial

nutrient elements contribute to potato qual-

ity through functioning as raw materials for

the synthesis of various plant components that

have food value to humans and animals. The el-

ements like Zn and Fe are involved in enzyme

synthesis, activation or as electron carriers and

hence affect quality of tubers greatly. It has been

noted that potato quality is also greatly influ-

enced by the synergistic and antagonistic inter-

actions in various nutrients uptake and utiliza-

tion. Therefore, balanced nutrition is noted to

be of paramount importance. From this review,

it can be concluded that potato quality is a very

important area to consider advancing and put-

ting up resources for research since it has a huge

bearing on human health and socioeconomic

effect on farmers through its influence on the

marketability of potato tubers and products.

.N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 i niedożywienie roślin mają wpływ nie tylko na

plony ziemniaków, ale również na ich jakość.

Niniejsze badanie jako przegląd wielu recen- zowanych autorów zostało przeprowadzone w celu podkreślenia wpływu odżywiania roślin na plon i jakość bulw ziemniaka. Położono nacisk na wyjaśnianie działań dzięki którym elementy różnych składników odżywczych wpływają na procesy biochemiczne i ostatecznie wpływają na całkowitą jakość bulw ziemniaka i ich produktów. Przegląd składników odżywczych w tym artykule obejmuje mikroelementy, takie jak: cynk (Zn), sód (Na), żelazo (Fe), man- gan (Mn), miedź (Cu), molibden (Mo), chlor (Cl) i nikiel (Ni). Ponadto istnieją pierwiastki śladowe, takie jak aluminium (Al), krzem (Si), wanad (V), kobalt (Co) i inne. Cechy jakości ziemniaków, o których najczęściej donoszono, że mają wpływ na odżywianie roślin obejmują białko, węglowodany, sacharozę w bulwach ziemniaka; witaminy, takie jak: zawartość witaminy C w bulwach; gęstość bulw ziem- niaka i smażone frytki. Również zastosowanie nawożenia dolistnego nawozami zawierającymi mikroelementy wpływa na gospodarkę azotową roślin. Na przykład efekty działania takich pierwiastków, jak: magnez, żelazo i cynk są wzmacniane przez efekt fotosyntezy, podczas gdy cynk, mangan, miedź, bor, żelazo i man- gan zwiększają odporność roślin na choroby.

Zauważono, że niezbędne i korzystne składniki odżywcze przyczyniają się do wzrostu jakości ziemniaka poprzez funkcjonowanie, jako surow- iec do syntezy różnych składników roślinnych, które mają wartość pokarmową dla ludzi i zwierząt. Pierwiastki, takie jak: Zn i Fe biorą udział w syntezie enzymów, aktywacji lub jako nośniki elektronów, a tym samym w znacznym stopniu wpływają na jakość bulw. Zauważono, że na jakość ziemniaka duży wpływ mają również synergistyczne i antagonistyczne in- terakcje w pobieraniu i wykorzystaniu różnych składników odżywczych. Z tego względu zbi- lansowane odżywianie ma ogromne znaczenie.

A ^li H ^ulAil N ^oAemA , B ^ArBArA S ^AwickA

Z przeglądu można wywnioskować, że jakość ziemniaków jest bardzo ważnym obszarem, który należy rozważyć w zakresie zwiększania środków na badania, ponieważ ma to ogromny wpływ na zdrowie ludzi i społeczno-ekonom- iczny stan rolników poprzez ich wpływ na zbywalność bulw ziemniaka i jego produktów.

S ^tr . 3 - 10

Słowa kluczowe: jakość ziemniaka, mik- roelementy, wartość odżywcza, bulwy ziem- niaka, nawożenie dolistne.

Introduction

I n general, potato plant requires 17 nu- trients to complete their life cycle. Basic plant nutrients are divided into macro and micronu- trient groups. The macronutrients are nitrogen (N), phosphorus (P), potassium (K), carbon (C), hydrogen (H), oxygen (O), calcium (Ca), magnesium (Mg) and sulphur (S). Moreover, the micronutrients include manganese (Mg), boron (B), molybdenum (Mo), zinc (Zn), cop- per (Cu), iron (Fe), chlorine (Cl), and nickel (Ni) (BRADY AND WEIL, 2002). More- over, there are some trace elements such as sodium (Na), aluminium (Al), silicon (Si), va- nadium (V) and cobalt (Co)) (WADAS AND DZIUGIEL, 2013). However, depending on essentiality point of view in the plant, all nu- trients are equally important for plant growth.

The air and water supply the first three macro-

nutrients (C, H, O) to plants. Thus, their supply

to plants is not a problem. Thus, the remaining

14 nutrients must be present to plant growth in

sufficient quantity and proportion for growth

(QADRI ET AL., 2015). Deficiency of nutri-

ents during vegetation, caused by various causes,

such as intensive plant development, drought,

agricultural errors, etc., lack of element, may

occur in the case of inadequate quantity in

the environment or in the inability to absorb

the component of unfavourable environmen-

tal conditions when roots cannot provide the

necessary food (SZEWCZUK AND MICH-

.N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018

ALOJC, 2003; TRAWCZYNSKI, 2015). In addition to deficiency of nutrients during the vegetation period, symptoms of nutrient defi- ciency in potato plants first appear on the up- per or lower parts of the plant. The older leaves are not severely affected due to the fact that the immobile ingredients (calcium, boron, copper, iron, manganese, molybdenum) are not mov- ing from the older to younger parts of the plant (FERNANDEZ ET AL., 2013).

The objective of this review is to criti- cally discuss the effects of some micronutrients (Zn, Fe, Mo, Mn, Cu and Na) on in some of quantity and quality characteristics of potato tubers.

Foliar fertilization

F oliar fertilization is the spraying of liquid fertilizer (a mineral salt solution or a chelate with a surface tension reducing agent) on plant leaves and stems and the absorption of nutrients at these sites. It is a supplying complementary dose of minor or major nutri- ents to plants (FERNANDEZ ET AL., 2013;

TRAWCZYNSKI, 2015). Using it in the situ- ation of difficult nutrient uptake of soil repre- sents an alternative way to supply plants with missing macronutrients and micronutrients (SAWICKA AND SKIBA, 2009). It is the most efficient way to deliver a plant the trace elements and micronutrients. The use of tim- ing of foliar fertilization coincides with specific growth periods, using specific fertilizer fittings depending on crops and location (FAGERIA ET AL., 2009). It has been shown that foliar fertilization is an excellent way to supply plant requirements for secondary nutrients (magne- sium, calcium, and sulphur) and micronutrients (manganese, zinc, copper, iron, molybdenum, and boron) while completing the NPK needs for critical periods of growth. Foliar fertiliza- tion affects the yield, both quantitatively and qualitatively (TRAWCZYNSKI, 2015; PAR-

MAR ET AL., 2016).

Research on foliar fertilization was start- ed in the last 1940s and early 1950s (GIRMA ET AL., 2007). At the beginning of the 1980s, studies on the foliar fertilization of fertilizers investigated for selected crops, especially to mi- cronutrients in high-value crops such as potato (Solanum L.), began (LEWIS AND KET- TLEWELL, 1993).

Importance of foliar fertilization with micronutrients of potato

F oliar fertilization is essential when soil absorption is limited. The shortage or pres- ence of a nutrient in a frighteningly soluble form becomes a cause of stress and affects dis- turbances in plant metabolism, which prevent the full use of the potential yield (FERNAN- DEZ ET AL., 2013). This is often the case with metallic micronutrients (Fe, Cu, and Mn);

these components are purely ineffectually inoc-

ulated by soil particles and become difficult to

access by plants. Application of foliar-fertiliza-

tion with fertilizers containing micronutrients

affects the nitrogen economy of plants. For ex-

ample, effects of elements such as magnesium,

manganese, iron, and zinc (WADAS AND

DZIUGIEL, 2013) are enhanced by the effect

of photosynthesis, while zinc, manganese, cop-

per, boron, and iron manganese, increase the

plant resistance to diseases. Among plant crops,

respond best to foliar fertilization. According

to SZYUKZUK AND MJOLJEK (2003), the

precise elements used as a foliar treatment are

10, some of which are 30 times more effective

than plants compared to soil fertilization. Foliar

fertilization can also affect the degree of weed

infestation in potato farms. In addition, foliar

fertilizers can be used in conjunction with crop

protection agents to the Colorado beetle and

late blight, which reduces the cost of fertiliza-

.N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 tion and the overall costs of potato production.

The foliar fertilization of plants has also ben- eficial effects on plant resistance to pathogens (TRAWCZYNSKI, 2014). BOLIGLOWA (2003) recorded an increase in the proportion of tubers with the symptoms of normal scab under the influence of the application of the aqueous solution of urea, but limiting them to 2-fold by Ekosol K fertilizer did not result in Rhizoctonia solani. JABLONSKI (2009A), af- ter application Yaravita, observed reduction in 40% of common scab infestation in the number of tubers with symptoms of spotted brown. Re- search by MILLS ET AL. (2006) and MAH- MOUD ET AL. (2007), has shown that foliar inorganic salts are used to reduce tuber infes- tation by Ralstonia solanacearum and Erwinia spp. during storage. CWALINA-AMBRO- ZIAK ET AL. (2010) also showed that foliar fertilizers contribute to a weaker tuber infec- tion by Rhizoctonia solani and Streptomyces scabies.TRAWCZYNSKI (2014), after apply- ing the foliar fertilizers (type Ekosol) showed a reduction in the share of tubers infected with common scab. Also, the same author (2015) found that foliar fertilizers affect the reduction of the share in the total yield of tubers with defects appearance (greening, deformations).

Research by JABLONSKI (2009c) have shown that the use of foliar fertilizers reduces paral- ysis virus diseases, reduces infection with the common scab, rust spots. SAWICKA (2003) claims that the use of bio-stimulator Asahi SL and foliar fertilization allows delaying the ap- pearance of Phytophthora infection on the po- tato plantation and extending plant vegetation, depending on the variety, by 2-14 days. Stud- ies by MILLER ET AL. (2005) have shown that the combined use of foliar fertilizers and fungicides increase the efficiency of potato protection against pathogenic agents, thereby contributing to an increase in tuber yield, due to the reduction of labour costs and thus the reduction of production costs.

Important synergistic interactions for

micronutrients

T here are important synergistic inter- actions where effects of two or more nutrients are involved to bring out an effect on yield and quality potato tubers. Micronutrients such as Zn, Fe, Mo, Cu, Mn and Na are known to be es- sential for plant growth. For example, zinc (Zn) and iron (Fe) are the most important micronu- trients necessary for plant growth (EPSTEIN AND BLOOM, 2005). Iron is involved in chemical reactions that are a source of energy;

it is also a component of many proteins and

enzymes, it is part of haemoglobin and myo-

globin, which allows the transport of oxygen in

the body (KURAS ET AL., 2015), hence its

content in the foods is very important. Zinc is

one of the main metal components and is an

active promoter of several enzymes involved in

metabolic activities and biochemical pathways

(BRADY AND WEIL, 2002). The average

zinc content, which regulates normal growth

and development in the body, influences on

the activity of the immune system, and is pres-

ent in the active centres of approximately 200

enzymes (KURAS ET AL., 2015). Also, man-

ganese is an element necessary for the proper

functioning of the body, activating enzymes in-

volved in the metabolism of proteins, lipids and

sugars (ZAWADZKI ET AL., 2008). Copper,

which is responsible in the body for the pro-

duction of energy in cells, removal of free radi-

cals, formation of collagen and elastic, involved

in the transmission of nerve impulses (KRZ-

EPTOWSKI ET AL., 2014). Molybdenum is

a component of nitrate reductase enzyme; it is

known to play an important role in the metabo-

lism of nitrate in the plant (CHAIRIDCHAI,

2000). In case of, sodium in dry matter of po-

tato tubers, which regulates the body’s water

balance, is responsible for the hydration status

A ^li H ^ulAil N ^oAemA , B ^ArBArA S ^AwickA S ^tr . 3 - 10

.N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018

of cells and tissues, and together with potas- sium, is responsible for maintaining the proper osmotic pressure in the blood.

Effect of foliar fertilization with micronutrients on the yield of potato tubers

T he foliar fertilizers have varied im- pact on total and commercial yield of tubers, its structure, chemical composition and con- sumption quality of tubers in many stud- ies. According to many authors (SAWICKA AND SKIBA, 2009; JABLONSKI, 2009A;

TRAWCZYNSKI, 2014), the use of foliar fer- tilizers causes a significant increase in the yield of potato tubers. In many studies of TRAW- CZYNSKI (2014, 2015), an increase in yield by 5-20%, after application of foliar fertilizers, depending on the fertilizer used, was reported.

After applying the foliar fertilizers of manga- nese in the conditions of Colombia, VILLA ET AL. (2011) obtained significant results de- pending on the cultivar increasing the yield of potato tubers. ACCORDING TO JABLON- SKI (2007), who found an increase in yield by only 4%, compared to the standard object after applying fertilizers Sonata and Symbol- Vita, while in JABLONSKI’S studies (2009b), the use of Sonata Z and Alkalin PK fertilizers 10:20 contributed to the increase in the total yield by 16.1-19.5%, depending on the culti- var. Moreover, study by AL-FADHLY (2016) examining applying foliar manganese and zinc (together or separately), noted significant in- crease in the tubers yield. MONA ET AL.

(2012) argued, using the elements supplied to the plant in the form of spraying that it affects the efficiency of potato plants because it will be the cause of more intensive vegetative growth,

more intensive photosynthesis, and increased carbohydrate production.

Impact of

foliar fertilization on nutritional value of potato tubers

Q uality of potato tubers is associ- ated primarily with their chemical composi- tion. The most important feature of chemical composition of potato tubers is the content of dry matter. The application of foliar micronu- trients fertilization can have significant impact on the content of dry matter in potato tubers.

MOUSAVI ET AL. (2007), applying zinc and manganese in the form foliar fertilization and ALJOBORI AND AL-HADITHY (2014) using iron, manganese, copper and zinc, also observed an increased content of dry matter in potato tubers. MONA ET AL. (2012) noted that applying foliar fertilization also caused an increase in the content of both types of sugars.

PARMAR ET AL. (2016) have shown that us- ing foliar zinc has increased the content of total sugars in potato tubers. In addition, the appli- cation of micronutrient fertilizers and Mikro- chelat Gama fertilizer, in studies by KOZERA AND BARCZAK (2007), helped to increase the proportion of albumin, and the foliar appli- cation of copper and zinc solutions to increase the participation of albumin and globulins.

MOUSAVI ET AL. (2007) and PARMAR ET AL. (2016) after foliar zinc and manganese applications, also observed increased protein in potato tubers. In case of starch content in tu- bers, MOUSAVI ET AL. (2007), after foliar application of zinc and manganese, also noted an increased content of starch in potato tubers.

TRAWCZYNSKI (2015), after the use of Eu-

rofertil 33 fertilizer together with foliar fertiliz-

ers Fertiliser Gold and Fertiliser Axis, stated an

.N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 increase in starch content. According to these

authors, the increase in the starch content may result from the supply of potassium, sulphur and magnesium to the plant, which improves the process of photosynthesis and affects the formation of carbohydrates. Content of vita- min C in potato tubers is important because of its health importance. The use of foliar fertil- izers, according to many authors (MONA ET AL. (2012) and TRAWCZYNSKI (2014), has beneficial effect on the content of vitamin C in potato tubers, This coincides with the obtained by MONA ET AL. (2012), who noted the highest content of vitamin C after the appli- cation of Folifertile fertilizer with higher con- tent of macro- and micronutrients in its com- position, may be the result of providing potato plants with micronutrients necessary for carry- ing out enzymatic reactions.

Conclusions

1. The response of potatoes to foliar fertil- ization varies with micronutrients depending on the environmental conditions, cultivars and the type of elements contained in the fertilizers.

2. From this review, it can be con- cluded that all micronutrients focused in this study (Fe, Zn, Mn, Cu, Mo, Na) af- fect quantity and quality of potato tubers.

3. Several previous studies have in- dicated an increase in the yield and qual- ity of potato tubers due to the use of fo- liar fertilization with micro-nutrients

References

AL-JOBORI K., AL-HADITHY S. 2014.

Response of potato (Solanum tuberosum) to foliar application of iron, manganese, copper and zinc. International Journal of Agriculture

and Crop Sciences. 7 (7), 358–363.

BOLIGLOWA E. 2003. Effect of foliar feed- ing of potato on yield, its structure, health and storage stability of tubers. Acta Agrophysica.

(85): 99–106, ISSN: 1234-4125. (in Polish).

BRADY N.C., WEIL R. R. 2002. Soil phos- phorus and potassium. The Nature and Proper- ties of Soils (13th Ed.). Upper Saddle River.

NJ: Prentice-Hall. Inc. pp. 598, doi: # 1 | 11.10 x 1.64 x 8.58l, 4.92.

CHAIRIDCHAI P. 2000. The relationships between nitrate and molybdenum contents in pineapple grown on an incept sol soil. Acta Horticulture. 529, 211–216.

CWALINA-AMBROZIAK B., BOGUCKA B. 2010. Potato tuber tubers fertilized with fo- liar fertilizers of multi-component microele- ments. Problematic Journals of Agricultural Sciences. 557, 163–172. (in Polish).

EPSTEIN E., BLOOM A. J. 2005. Mineral nutrition of plants: principles and perspectives, 2nd Edn. Sinecure Assoc. Inc., Sunderland, UK: 243-266. ISBN: 978-0-471-01783-7.

FAGERIA N. K., FILHO M. P. B., MOREIRA A., GUIMARAES C. M. 2009. Foliar fertil- ization of crop plants. Journal of Plant Nutri- tion. 32 (6), 1044–1064.

FERNANDEZ V., SOTIROPOULOS T., BROWN P. H. 2013. Foliar Fertilization: Sci- entific Principles and Field Practices. Interna- tional Fertilizer Industry Association (IFA).

Paris. France. pp: 144. ISBN: 979-10-92366- 00-6.

GIRMA K., MARTIN K. L., FREEMAN K.

W., MOSALI J., TEAL R. K., RAUN W. R.,

MOGES S. M., ARNALL D. B. 2007. Deter-

A ^li H ^ulAil N ^oAemA , B ^ArBArA S ^AwickA S ^tr . 3 - 10

.N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018

mination of optimum rate and growth stage for foliar-applied phosphorus in corn. Communi- cations in Soil Science and Plant Analysis. 38 (9–10), 1137–1154.

JABLONSKI K. 2007. Effect of foliar fertil- ization on Alkalin PK 10: 20 potatoes on yield, potato contagion and some quality character- istics of tubers. Progress in Plant Protection. 2 (47), 114–118.

JABLONSKI K. 2009a. Effects of foliar fertil- ization YaraVita Potato and Red Nutrifol. Pol- ish Potato. 3(19), 24–27. (in Polish).

JABLONSKI K. 2009b. Production and quality effects of foliar fertilization of Sonatina Z and Alkalin Potatoes PK 10: 20. Ann. Univ. Mariae Curie-Sklodowska. 64, 59–67. (in Polish).

JABLONSKI K. 2009c. The influence of the level of nitrogen fertilization on the yields of new starchy potato varieties and their quality.

Problematic Journals of Agricultural Sciences.

(538), 85–91. (in Polish).

JAWAD T., AL-FADHLY. 2016. Response of potato (Solanum tuberosum) to foliar applica- tion of zinc and manganese which fertilized by organic fertilizer. Journal of Agriculture and Veterinary Science. 9 (4), 87–91.

KOZERA W., BARCZAK B. 2007. Effect of foliar fertilization with potato plant micronu- trients on the fractional composition of tubers.

Bulletin of the Institute of Plant Breeding and Acclimatization. (243), 167–177. (in Polish).

KRZEPTOWSKI W., PIERZCHALA O., LENARTOWICZ M. 2014. Metabolism of copper and characterization of hereditary dis- ease syndromes against the background of cop- per deficiency caused by disturbances in AT- P7A protein activity. Kosmos. 3 (63), 395–413.

KURAS M., ZIELINSKA-PISKLAK M. P.

K. 2015. Iron and zinc the main micronutri- ents necessary for the proper functioning of the body. The drug in Poland. 25 (288), 6-13.

LEWIS D. J., KETTLEWELL P.S. 1993. A comparison of the uptake of phosphorus from foliar-applied phosphate by the leaves of eleven varieties of potato. Aspects of Applied Biology (United Kingdom). 34, 243–248.

MAHMOUD S. M. 2007. Management of brown rot disease of potato. Arab Universities Journal of Agricultural Sciences. 15 (2), 457–

463.

MICHALOJC Z., SZEWCZUK C. 2003.

Theoretical aspects of foliar nutrition of plants.

Acta Agrophysica. 85, 9–17.

MILLER J. S., ROSEN C. J. 2005. Interac- tive effects of fungicide programs and nitro- gen management on potato yield and quality.

American Journal of Potato Research. 82(5), 399–409.

MILLS A. A. S., HURTA R. A. R. 2006. Sen- sitivity of Erwinia spp. to salt compounds in vitro and their effect on the development of soft rot in potato tubers in storage. Postharvest Biology and Technology. 41(2), 208–214.

MONA E. E., IBRAHIM S. A., MANAL M. 2012. Combined effect of NPK levels and foliar nutritional compounds on growth and yield parameters of potato plants (Solanum tu- berosum L.). African Journal of Microbiology Research. 6 (24), 5100–5109.

MOUSAVI S. R., GALAVI M., AHMAD-

VAND G. 2007. Effect of zinc and manganese

foliar application on yield, quality and enrich-

ment on potato (Solanum tuberosum L.). Asian

Journal of Plant Sciences. 6, 1256–1260.

.N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 PARMAR M., NANDRE B. M., PAWAR

Y. 2016. Influence of foliar supplementation of zinc and manganese on yield and quality of potato, Solanum tuberosum L. International Journal of Farm Sciences. 6 (1), 69–73.

QADRI R.W. K., KHAN I., JAHANGIR M.

M., ASHRAF U., SAMIN G., ANWER A., ADNAN M., BASHIR M. 2015. Phosphorous and foliar applied nitrogen improved produc- tivity and quality of potato. American Journal of Plant Sciences. 6 (1), 144-149.

SAWICKA B. 2003. Effect of foliar applica- tion of growth promoters on pike propagation rate of Phytophthora infestans on potato plants.

Acta Agrophysica. 85, 157–168. (in Polish).

SAWICKA B., SKIBA D. 2009. Influence of foliar nutrition on plant sanitary conditions in vegetation period of potato. Annales Universi- tatis Mariae Curie-Sklodowska. Sectio E, Ag- ricultura. 64 (2), 39–51. DOI: 10.2478/v10081- 009-001-y. (in Polish).

TRAWCZYNSKI C. 2014. Application of macro- and microelement chelate fertilizers in foliar feeding of potato. Bulletin of the In- stitute of Plant Breeding and Acclimatization.

Bulletin of the Breeding and Acclimatization Institute. 271, 65-77. (in Polish).

TRAWCZYNSKI C. 2015. Comprehensive potato nutrition on the basis of new genera- tion fertilizers. Polish Potato. 25 (3), 14-18. (in Polish).

WADAS W., DZIUGIEL T. 2013. Effect of multi-nutrient complex fertilizers on growth and tuber yield of very early potato (Solanum tuberosum L.) cultivars. Acta Agrobotanica. 66 (3), 55–66.

VILLA M. R., RODRIGUEZ L. E., GO-

MEZ M. I. 2011. Effect of edaphic and foliar management of manganese on the yield of the Criolla Colombia cultivar. Agronomia Colom- biana. 29 (3), 447–454.

ZAWADZKI M., GAC P., PORKEBA R., ANDRZEJAK R. 2008. Changes in the car- diovascular system of animals subjected to in- toxication with manganese contamination. Oc- cupational Medicine. 59 (5), 387–393.

A ^li H ^ulAil N ^oAemA , B ^ArBArA S ^AwickA S ^tr . 3 - 10

.N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018

streszczenie

O batoklaks jest antagonistą białek należących do rodziny Bcl-2, zawierających cz- tery domeny homologiczne. Wiąże się on do domeny BH3 białek należących do rodziny Bcl-2, uniemożliwiając wiązanie białek anty- apoptotycznych z białkami proapoptotycznymi (Bax i Bak), skutkując aktywację szlaku apop- totycznego w komórce. Białka z rodziny Bcl-2 (Bcl-2, Bcl-xL i Mcl-1) ulegają nadekspresji w przypadku wielu nowotworów. Komórki nowotworowe nabyły sposoby unikania pro- gramowanej śmierci komórki. Badania kliniczne II fazy prowadzone w innych jednostkach nau- kowych potwierdziły możliwość zastosowania obatoklaksu w leczeniu białaczki, chłoniaka oraz włóknienia szpiku. Celem przeprowad- zonych badań in silico było zobrazowanie in- terakcji obatoklaksu z wybranymi białkami proapoptotycznymi. Wykonano je przy pomocy narzędzi bioinformatycznych udostępnionych na zasadach bezpłatnej licencji (icn3D, NGL Protein Viewer, BLAST). Potwierdzono spe- cyficzne wiązanie się obatoklaksu do domeny BH3 białek Bcl-xL, Bcl-xS oraz Mcl-1.

abstract

O batoclax is an antagonist of Bcl-2 family members containing four homology do- mains. It binds to BH3 domain in members of the Bcl-2 protein family, preventing the bind- ing of these anti-apoptotic proteins to the pro- apoptotic proteins (Bax and Bak) and so pro- moting the activation of the apoptotic pathway in Bcl-2-overexpressing cells. The Bcl-2 fam- ily of proteins (Bcl-2, Bcl-xL and Mcl-1) are overexpressed in a wide variety of cancers.

Cancer cells acquire instruments to circum- vent programmed cell Heath. Several Phase II clinical trials were completed that investigated use of Obatoclax in the treatment of leukemia, lymphoma and myelofibrosis. In silico research was performed using bioinformatic software (icn3D, NGL Protein Viewer, BLAST). Spe- cific binding of obatoklaks to the BH3 doment of the Bcl-xL, Bcl-xS and Mcl-1 proteins was confirmed.

Aleksandra Buchaj Monika Garbacz

Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie Wydział Biologii i Biotechnologii UMCS

Studenckie Koło Naukowe Biotechnologów „Mikron”

ul. Akademicka 19, 20-033 Lublin e-mail: aleksandra.buchaj@gmail.com

Badania interakcji obatoklaksu z białkami z rodziny Bcl-2

Interaction between obatoclax and Bcl-2 family proteins

S łowa kluczowe: obatoklaks, apoptoza, rodzina białek Bcl-2, baza danych.

K ^{ey words:} obatoklaks, apoptosis, Bcl-2

family, data bank.

.N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018

Wstęp

B ioinformatyka to dziedzina nauki konstruująca, wykorzystująca i doskonaląca metody i narzędzia informatyczne do rozwiązywania problemów z zakresu nauk biologicznych i medycznych. Do zadań bio- informatyki należy rozwój metod obliczenio- wych służących do badania struktury, funk- cji i ewolucji genów, genomów i białek. Z tą dziedziną ściśle powiązane są biochemia, gene- tyka, statystyka, biologia molekularna, matema- tyka oraz eksploracja danych (Rys. 1). Rosnąca popularność bioinformatyki jest związana ze wzrostem mocy obliczeniowej niezbędnej do wykonania analiz. Zapotrzebowanie to jest rozładowywane przy pomocy narzędzi oraz algorytmów, umożliwiających głębsze zro- zumienie procesów i zależności występujących w żywych organizmach (SOUALMIA I LEC- ROQ, 2015).

Szczególnie istotną rolę bioinformatyka pełni w modelowaniu molekularnym. Ten dział jest wykorzystywany w celu poznawania funkcji

A ^leksAndrA B ^uchAj , M ^onikA G ^ArBAcz

struktur biologicznych o znanej budowie (m.in.

na podstawie badań katalizy enzymatycznej, oddziaływań molekularnych, stabilności białek), a także do projektowania leków (ang. drug de- sign). XXI wiek przeniósł cyfryzację społeczną na użytek nauki. Stworzenie nowych leków nie wymaga obecnie przesiewu tysięcy związków aktywnych – ten etap zastąpiony został zdalną identyfikacją grupy farmakoforowej na pod- stawie znanej struktury wiodącej działającej specyficznie względem sekwencji celu leczenia (ang. target), która zgromadzona jest w ba- zach danych (TERSTAPPEN I REGGIANI, 2001). Metoda ta pozwala na ograniczenie czasu oraz kosztów badań przedklinicznych, ponieważ jednoznacznie selekcjonuje związki (na podstawie modelowania aktywności oraz ADME-Tox), które nie wykazują korzystnych właściwości (AFSHARI I IN., 2011). Badania bioinformatyczne zawsze muszą być potwierd- zone trzema fazami badań klinicznych przed wejściem leku do obrotu.

Apoptoza jest zaprogramowanym pro- cesem eliminacji uszkodzonych lub nadmiar-

s ^tr . 11- 23

R

.N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018

owych komórek poprzez aktywację kaskady kaspaz (proteaz cysteinowych tnących wiązanie peptydowe za resztą Asp) (LI I YUAN, 2008).

Wyróżniamy zewnętrzny oraz wewnętrzny szlak apoptozy. Aktywacja szlaku zewnętrznego związana jest z prezentacją specyficznych li- gandów proapoptotycznych receptorom Fas, TRAIL-R (ang. Tumor necrosis factor-Re- lated Apoptosis-Inducing Ligand Receptor) i TNFR-1 (ang. Tumor Necrosis Factor Recep- tor 1), które znajdują się na powierzchni komórek i zawierają domenę śmierci (DD, ang. Death Domain) (THORBURN, 2007; HONGMEI, 2012). Receptory te, działając na białka adap- torowe poprzez wewnątrzkomórkową domenę, wiążą m.in. proteazy cysteinowe jak np. kas- paza 8 (SCHNEIDER I TSCHOPP, 2000).

Wiązanie ligandu do domeny śmierci powodu- je powstanie miejsca wiązania dla białka adap- torowego, a cały kompleks białkowy ligand-re- ceptor jest znany jako kompleks sygnalizacyjny indukujący śmierć komórki (DISC, ang. Death Inducing Signaling Complex), który uczynnia

prokaspazę 8 do formy aktywnej (CHANG I IN., 2003). Jest to bezpośredni aktywator kas- pazy 3. W ten sposób uruchomiona zostaje kaskada kaspaz. Jednocześnie szlak zewnętrzny uruchamia szlak sygnałowy NF- B, co prowadzi do degradacji DNA (HOESEL I SCHMID, 2013).

Do podstawowych czynników proapop- totycznych można zaliczyć uszkodzenia DNA, niedobór specyficznych hormonów, stres oksy- dacyjny powstały w wyniku działania wolnych rodników, zakażenia wirusowe oraz promien- iowanie jonizujące (GERSPACH I IN., 2009;

HONGMEI, 2012; NAIR I IN., 2014).

Wewnętrzny szlak apoptozy związany jest z mitochondriami komórki. W tym przy- padku sygnałem proapoptotycznym zwykle jest stres oksydacyjny o pochodzeniu wewnętrznym (powodujący także uszkodzenie DNA) lub zewnętrznym (sygnał śmierci przekazany ze szlaku zewnętrznego). Proces apoptozy jest regulowany przez białko p53, “strażnik geno- mu”, które kontroluje ekspresję białek z rodziny

R ys. 2. Przebieg procesu apoptozy (KEGG Pathway, zmod.).

.N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 Bcl-2, odpowiadających za potencjał błonowy

mitochondrium (PIETSCH I IN., 2008; PAR- SONS I GREEN, 2010). W wyniku działania tego szlaku zwiększona zostaje produkcja białek proapoptotycznych, m.in. białek Bax i Bak, które uczestniczą w powstaniu porów w zewnętrznej błonie mitochondrialnej (MOMP, ang. Mi- tochondria Outer Membrane Pearmabiliza- tion). Przez pory do cytoplazmy wydostaje się cytochrom c, który łącząc się z prokaspazą 9 i białkiem Apaf-1 buduje efektorowy czynnik szlaku wewnętrznego - apoptosom (BROWN I BORUTAITE, 2008). Struktura ta przeprow- adza aktywację do kaspazy 9 i kontynuację kaskady kaspaz. Elementem wspólnym szlaku wewnętrznego i zewnętrznego apoptozy są kas- pazy efektorowe (kaspaza 3, kaspaza 7) (Rys. 2) (ICHIM I TAIT, 2016). Końcowym skutkiem apoptozy jest utworzenie ciałek apoptotyc- znych, powstałych na skutek zniszczenia cytosz- kieletu, kondensacji chromatyny, zmniejszenia integralności i zaniku kariolemmy, odwod- nienia cytoplazmy, zniszczenia białek struk- turalnych i enzymatycznych, czego końcowym efektem jest uwypuklanie błony komórkowej (ang. membrane blebbing) (ELMORE, 2007).

Makrofagi rozpoznają komórki apoptotyczne dzięki obecności w błonie komórkowej fosfa- tydyloseryny (zmodyfikowanego aminokwasu, który w zdrowych komórkach występuje tylko w monowarstwie cytoplazmatycznej) (FADOK I IN., 2001) oraz sygnałowi trombospondyny (MOODLEY I IN., 2003).

Wysoka ekspresja białek antyapoptotyc- znych i jednoczesna niska ekspresja białek pro- apoptotycznych jest cechą charakterystyczną komórek nowotworowych (WONG, 2011).

Stwierdzenie tego stanu może pomóc w ocenie zaburzeń cyklu komórkowego prowadzących do zmian nowotworowych. Zapobieganie temu procesowi jest jednym z możliwych rozwiązań zahamowania procesu nowotworzenia (REED, 2003). O wysokim znaczeniu apoptozy w donie- sieniach naukowych świadczy Nagroda Nobla w

dziedzinie fizjologii lub medycyny 2002, która została przyznana Johnowi Sulstonowi, Syd- neyowi Brennerowi, Howardowi Horvitzowi za ich odkrycia z dziedziny genetycznej regu- lacji organogenezy i zaprogramowanej śmierci komórki (HORVITZ, 2003).

Obatoklaks (GX015-070) (Rys. 3) jest syntetyczną pochodną prodiginin, grupy, u której wykazano przeciwnowotworowe i im- munosupresyjne właściwości (WILLIAM- SON I IN., 2007; VAN ROSSOM I IN., 2016). Zalicza się go do niskocząsteczkowych antagonistów domeny BH3 antyapoptotyc- znych białek z rodziny Bcl-2 (SHORE I VI- ALLET, 2005; CAMPAS I IN., 2006; MAR- ZO I NAVAL, 2008; NI CHONGHAILE I LETAI, 2008; SHUKLA I IN., 2017). Wiąże się on do bruzdy hydrofobowej domeny BH3 i wypiera z tego miejsca domenę transbłonową.

Jej oddziaływanie z błoną mitochondrialną po- woduje oligomeryzację białek i permeabilizację błony zewnętrznej mitochondrium (DEW- SON I KLUCK, 2009). Zwykle w badaniach stosowana jest stabilna pochodna metanosulfo- nianowa obatoklaksu, która posiada wskazane powyżej aktywności proapoptotyczne. Obecnie środek ten należy do firmy Teva Pharmaceu- tical Industries, która wykupiła go od odkry- wców tego leku, Gemin X Biotech.

W testach in vitro wykazano, że obatoklaks wywołuje apoptozę komórek chłoniaka (linie komórkowe: L428, Granta- A ^leksAndrA B ^uchAj , M ^onikA G ^ArBAcz s ^tr . 11- 23

R ys. 3. Struktura chemiczna obatoklaksu

.N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018

519, CRO, Karpas-422) (CAMPAS I IN., 2006; O’BRIEN I IN., 2009; SAMUEL I IN., 2010; GOY I IN., 2014), nowotworu piersi (linie komórkowe: MCF-7, MCF/18, MTR-3) (WITTERS I IN., 2007; CRUICK- SHANKS I IN., 2012), szpiczaka mnogiego (linia komórkowa HMCLs) (TRUDEL I IN., 2007), czerniaka złośliwego (linie komórkowe:

B16-F1, Mel-RM, MM200, IgR3, Me1007, Me4405, SKMel-28) (NGUYEN I IN., 2007;

WATANABE I IN., 2013; WRÓBLEWSKI I IN., 2013), ostrej białaczki szpikowej (linia komórkowa OCI-AML3) (KONOPLEVA I IN., 2008), drobnokomórkowego nowot- woru płuc (PAIK I IN., 2011; DEAN I IN., 2011), raka płaskonabłonkowego głowy i szyi (linie komórkowe: UMSCC-1, Cal33, UM- SCC-22A) (YAZBECK I IN., 2014), raka trzustki (linie komórkowe: HPAC, MIA PaCa-2, PANC-1, AsPC-1, BxPC-3, CF- PAC-1) (WANG I IN., 2014). Stwierdzono także zatrzymanie cyklu komórkowego w fazie S/G2 indukowane nawet niewielkimi ilościami obatoklaksu (KONOPLEVA I IN., 2008).

Wyniki badań II fazy testów klinicznych były przyczyną wykluczenia obatoklaksu z dalszych testów. Wykazano ograniczoną aktywność kliniczną m.in. u pacjentów z nawrotowym lub opornym na leczenie klasycznym chłoniakiem Hodgkina i nawrotowym drobnokomórkowym raku płuc (BAYES I IN., 2007; PAIK I IN., 2011; CRUICKSHANKS I IN., 2012; OKI I IN., 2012; GOY I IN., 2014). Występują próby wykorzystania innych antagonistów białek z rodziny Bcl-2 w leczeniu skojarzonym (GOARD I SCHIMMER, 2013; OR I IN., 2017). Celem przeprowadzonych badań było poznanie interakcji obatoklaksu z wybranymi białkami proapoptotycznymi z rodziny Bcl-2.

Metodyka badań

S trukturę przestrzenną obatokla- ksu pobrano z serwisu PubChem, a następnie

przetworzono do konformacji 3D przy pomo- cy narzędzia icn3D, udostępnionego w wolnym dostępie przez NCBI (ang. National Center of Biotechnology Information).

Do selekcji badanych białek z rodz- iny Bcl-2 wykorzystano bazę danych KEGG (podbaza PATHWAY), która zawiera dostępne informacje na temat oddziaływań między białkami oraz graficzne reprezentacje procesów komórkowych (KANEHISA I GOTO, 2000), które są szczególnie użyteczne w przewidywa- niu działania leków na komórkę.

Wizualizację struktur stworzono przy pomocy programu NGL Protein Viewer kom- patybilnego z bazą danych PDB (ang. Pro- tein Data Bank) (ROSE I HILDEBRAND, 2015). Interakcje między wizualizowanymi białkami i obatoklaksem przewidywano na podstawie porównania cech białek oraz ich powinowactwa do cząsteczki leku. W tym celu wykorzystano dane zgromadzone w serwisie UniProtKB. Badania lokalnego podobieństwa między białkami z rodziny Bcl-2 wykonano przy pomocy narzędzia BLAST (ang. Basic Local Alignment Search Tool) oraz Align.

Dyskusja i wyniki

B iałka należące do rodziny Bcl-2

odpowiadają przede wszystkim za regulację

szlaku wewnętrznego apoptozy poprzez

permeabilizację błony zewnętrznej mitochon-

dium (SHAMAS-DIN I IN., 2013). Białka

należące do rodziny Bcl-2 zawierają cztery

funkcjonalne domeny: BH1, BH2, BH3 lub

BH4 (CORY I IN., 2003). Wszystkie białka

antyapoptotyczne zawierają domeny BH1 i

BH2, a niektóre z nich zawierają dodatkową

N-końcową domenę BH4 (Bcl-2, Bcl-xL i

Bcl-w), która jest również widoczna w niek-

tórych białkach proapoptotycznych, takich

jak Bcl-xS, Bok-L i Bok-S. Z drugiej strony,

wszystkie białka proapoptotyczne zawierają

domenę BH3, która jest niezbędna do dimery-

.N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 zacji z innymi białkami z rodziny Bcl-2 i pełni

kluczową rolę w ich aktywności promującej apoptozę (ZHA I IN., 1997; KELEKAR I THOMPSON, 1998). Trzy funkcjonalnie ważne regiony homologiczne Bcl-2 (BH1, BH2 i BH3) znajdują się w swoim bliskim sąsiedztwie przestrzennym i tworzą wydłużoną szczelinę, która może stanowi miejsce wiązania dla innych członków rodziny Bcl-2. Właśnie w to miejsce trafia obatoklaks, który łącząc się z białkami antyapoptotycznymi, uniemożliwia ich wiązanie z białkami proapoptotycznymi (odpowiedzialnymi za wytworzenie MOMP), promując aktywację kaskady kaspaz (NGUY- EN I IN., 2007; SULKSHANE I TENI, 2016.; SHUKLA I IN., 2017). Kluczowa w kontekście interakcji z obatoklaksem domena BH3 posiada w swojej strukturze hydrofobową bruzdę, która jest miejscem wiązania dome- ny transbłonowej białek z rodziny Bcl-2 (KELEKAR I THOMPSON, 1998). Jest to miejsce niezbędne do aktywacji procesu apop- tozy mitochondrialnej, więc często określa się domenę BH3 jako silny mediator śmierci komórki. Skutkiem działania antagonistów tej domeny jest permeabilizacja błony zewnętrznej mitochondrium, na skutek którego cytochrom c przechodzi do cytozolu (LOMONOSOVA I CHINNADURAI, 2008).

Znaczne różnice w sekwencji aminok- wasowej białek z rodziny Bcl-2 odpowiadają za ich różne funkcje. Wstępne badanie wykazało, że Bcl-xS nie posiada fragmentu 126-188, który występuje w sekwencji białka Bcl-xL.

Jednocześnie ich domena transmembranowa jest dokładnie tożsama (Rys. 4A). W przy- padku porównania z białkiem Mcl-1 różnice są znacznie większe: zmienia się struktura drugo- i trzeciorzędowa, stosunek struktur alfa do beta oraz sekwencja domeny transmembra- nowej (Rys. 4B). Białko Bcl-xS pozbawione jest przedostatniego z motywów struktural- nych, a także dużego fragmentu ostatniego z motywów (Rys. 4C). Sekwencje motywów

białka Mcl-1 i Bcl-xL różnią się, a pierwszy z nich jest dodatkowo powiększony o frag- ment długości 9 aminokwasów (Rys. 4D).

R ys. 5. Interakcja obatoklaksu z białkiem Bcl-xL (opracowanie własne autorów).

Dokładny szlak przekazywania sygnału antyapoptotycznego przez Bcl-xL wciąż nie jest znany, jednak na podstawie obecnej wiedzy uważa się, że różni się on znacznie pod względem mechanizmu hamowania apopto- zy od szlaku, któremu podlega Bcl-2. Bcl-xL może specyficznie wiązać się z resztami cyto- chromu C (BERTINI I IN., 2011) oraz czyn- nikiem Apaf-1 (HU I IN., 1998), zapobiegając dalszym etapom apoptozy. Izoforma ta została wybrana na kanoniczną dla rodziny Bcl-2 pod względem sekwencji aminokwa- sowej. Obatoklaks wiąże się z domeną BH3 w płaszczyźnie bruzdy hydrofobowej (Rys. 5).

Sygnał proapoptotyczny nie zostaje zatrzymany i dochodzi do programowanej śmierci komór- ki (SCHWARTZ-ROBERTS I IN., 2013).

Białko Bcl-xS zawiera domenę BH3,

co sprawia, że wykazuje oddziaływanie z oba-

toklaksem. Jego aktywność proapoptotyc-

zna jest związana z wiązaniem białek Bcl-xL

i Bcl-2, co wykazano na linii komórkowej

PC12 (komórki guza chromochłonnego nad-

nercza) (LINDENBOIM I IN., 2000). Mimo

przeciwstawnych funkcji wykazano na pod-

stawie struktury, że białko Bcl-xS jest krótszą

A ^leksAndrA B ^uchAj , M ^onikA G ^ArBAcz s ^tr . 11- 23

.N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018

R ys. 4. Porównanie sekwencji aminokwasowych Bcl-xL (Q07817), Bcl-xS (Q07817-2) oraz

Mcl-1 (Q07820). Jako sekwencję wzorcową, do której odnoszono pozostałe sekwencje wybrano

Bcl-xL. W schematach A i C porównywana jest ona do sekwencji białka Bcl-xS, natomiast w

schematach B i D do sekwencji białka Mcl-z. Schematy A i B obrazują strukturę drugorzędową

badanych białek. Schematy C i D przedstawiają motywy struktury trzeciorzędowej. Kolorami

oznaczono helisy (różowy), struktury beta (pomarańczowy), zakręty (szary), fragmenty trans-

membranowe (żółty) oraz strukturalne motywy (czerwony) zlokalizowane w sekwencjach.

.N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 przecięcia większej cząsteczki lub modyfikacji

ekspresji genu będącej wynikiem działania pro- apoptotycznych regulatorów (WILLIMOTT I IN., 2011). Podobnie jak w przypadku białka Bcl-xL interakcja obatoklaksu wystąpiła w obrębie bruzdy hydrofobowej (Rys. 6).

R ys. 6. Interakcja obatoklaksu z białkiem Bcl-xS (opracowanie własne autorów).

Cechujące się inną strukturą białko Mcl-1 ze względu na alternatywny splic- ing może występować w dwóch izoformach.

Dłuższa z nich hamuje apoptozę, natomiast krótsza jest białkiem proapoptotycznym (ze względu na zmienioną sekwencję we fragmen- cie 231-271 i usunięty końcowy fragment 272- 350). Dłuższa izoforma wykazuje skłonność do heterodimeryzacji m.in. z Bid (MOHAM- MAD I IN., 2008) i Bad (BAE I IN., 2001).

Prowadzi to do blokowania inicjacji kaskady kaspaz. Krótsza izoforma może powstać nie tylko poprzez alternatywny splicing, ale także poprzez rozcięcie dłużej cząsteczki przez kas- pazy efektorowe w procesie rozpoczętej już apoptozy. Obatoklaks wiąże się z domeną BH3 i uniemożliwia stworzenie dimeru antyapopto- tycznego (Rys. 7), ale również ogranicza dostęp specyficznych enzymów do miejsca izoformic- znego cięcia białka prowadząc do jego destruk- cji przy pomocy egzoproteaz. W wyniku in- terakcji białko Mcl-1 traci swoje właściwości antyapoptotyczne (NGUYEN I IN., 2015).

R ys. 7. Interakcja obatoklaksu z białkiem Mcl- 1 (opracowanie własne autorów).

Podsumowanie

W badaniach in silico potwierdzono interakcje obatoklaksu z białkami antyapoptyc- znymi z rodziny Bcl-2 na przykładzie białek Bcl- xL, Bcl-xS i Mcl-1. We wszystkich przykładach zaobserwowano związanie cząsteczki leku do domeny BH3 białka. Związany z tym spadek aktywności wykazywany w literaturze przed- miotu wskazuje na wpływ obatoklaksu na proces apoptozy wewnętrznej. W analizie in silico nie przebadano natury oddziaływania z białkami z rodziny Bcl-2. Przypuszczalnie in- terakcje uniemożliwiają wiązanie białek anty- apoptotycznych z białkami proapoptotycznymi (Bax i Bak), a zatem promują aktywację kaskady kaspaz. Ze względu na metodę powyższego badania (in silico) należy odnosić je do badań klinicznych, które zatrzymały się na II fazie.

Podziękowania

P ragniemy serdecznie podziękować mgr Jakubowi Knurkowi, doktorantowi Uniwersytetu Medycznego w Lublinie za kry- tyczne uwagi w czasie dyskusji, komentarze dotyczące roboczej wersji naszego tekstu, prow- adzenie w argumentacji oraz udzielone wspar- cie bioinformatyczne i edytorskie.

A ^leksAndrA B ^uchAj , M ^onikA G ^ArBAcz s ^tr . 11- 23

.N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 Literatura

AFSHARI C. A., HAMADEH H. K., BUSH- EL P. R. 2011. The evolution of bioinformatics in toxicology: advancing toxicogenomics. Toxi- cological Sciences. 120(S1), 225-S237.

BAE J., HSU S. Y., LEO C. P., ZELL K., HSUEH A. J. 2001. Underphosphorylated BAD interacts with diverse antiapoptotic Bcl- 2 family proteins to regulate apoptosis. Apop- tosis. 6, 319-330.

BAYES M., RABASSEDA X., PROUS J. R.

2007. Gateways to clinical trials. Methods and Findings in Experimental and Clinical Phar- macology. 29, 427-437.

BERTINI I., CHEVANCE S., DEL CON- TE R., LALLI D., TURANO P. 2011. The anti-apoptotic Bcl-x(L) protein, a new piece in the puzzle of cytochrome c interactome. PLoS One 6, e18329.

BROWN G. C., BORUTAITE V. 2008.

Regulation of apoptosis by the redox state of cytochrome c. Biochimica et Biophysica Acta.

1777, 877-881.

CAMPAS C., COSIALLS A. M., BARRA- GAN M., IGLESIAS-SERRET D., SAN- TIDRIAN A. F., COLL-MULET L., DE FRIAS M., DOMINGO A., PONS G., GIL J. 2006. Bcl-2 inhibitors induce apoptosis in chronic lymphocytic leukemia cells. Expimen- tal Hematology. 34, 1663-1669.

CHANG D. W., XING Z., CAPACIO V. L., PETER M. E., YANG X. 2003. Interdimer processing mechanism of procaspase-8 activa- tion. EMBO Journal. 22, 4132-4142.

CORY S., HUANG D. C., ADAMS J. M.

2003. The Bcl-2 family: roles in cell survival

CRUICKSHANKS N., TANG Y., BOOTH L., HAMED H., GRANT S., DENT P. 2012.

Lapatinib and obatoclax kill breast cancer cells through reactive oxygen species-dependent endoplasmic reticulum stress. Molecular Phar- macology. 82, 1217-1229.

DEAN E. J., CUMMINGS J., ROULSTON A., BERGER M., RANSON M., BLACK- HALL F., DIVE C. 2011. Optimization of cir- culating biomarkers of obatoclax-induced cell death in patients with small cell lung cancer.

Neoplasia. 13, 339-347.

DEWSON G., KLUCK R. M. 2009. Mecha- nisms by which Bak and Bax permeabilise mi- tochondria during apoptosis. Journal of Cell Science. 122, 2801-2808.

ELMORE S. 2007. Apoptosis: a review of pro- grammed cell death. Toxicologic Pathology. 35, 495-516.

FADOK V. A., DE CATHELINEAU A., DALEKE D. L., HENSON P. M., BRAT- TON D. L. 2001. Loss of phospholipid asym- metry and surface exposure of phosphatidyl- serine is required for phagocytosis of apoptotic cells by macrophages and fibroblasts. Journal of Biological Chemistry. 276, 1071-1077.

GERSPACH J., WAJANT H., PFIZENMA- IER K. 2009. Death ligands designed to kill:

development and application of targeted can- cer therapeutics based on proapoptotic TNF family ligands. Results and Problems in Cell Differntiation. 49, 241-273.

GOARD C. A., SCHIMMER A. D. 2013. An evidence-based review of obatoclax mesylate in the treatment of hematological malignancies.

Core Evidence. 8, 15-26.

GOY A., HERNANDEZ-ILZALITURRI F.

.N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 J., KAHL B., FORD P., PROTOMASTRO

E., BERGER M. 2014. A phase I/II study of the pan Bcl-2 inhibitor obatoclax mesylate plus bortezomib for relapsed or refractory mantle cell lymphoma. Leukemia and Lymphoma. 55, 2761-2768.

GRUCA A. 2010. Bioinformatyczne bazy danych. Wydawnictwo PJWSTK. Warszawa.

HOESEL B., SCHMID J. A. 2013. The com- plexity of NF- B signaling in inflammation and cancer. Molecular Cancer. 12, 86.

HONGMEI Z. 2012. Extrinsic and Intrinsic Apoptosis Signal Pathway Review.[w:] Apop- tosis and Medicine. Ntuli T. M. (red.). InTech.

New York. 3-22.

HORVITZ H. R. 2003. Worms, life, and death (Nobel lecture). Chembiochem. 4, 697-711.

HU Y., BENEDICT M. A., WU D., INO- HARA N., NÚÑEZ G. 1998. Bcl-XL inter- acts with Apaf-1 and inhibits Apaf-1-depen- dent caspase-9 activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of USA. 95, 4386-4391.

ICHIM G., TAIT S. W. 2016. A fate worse than death: apoptosis as an oncogenic process.

Nature Reviews Cancer. 16, 539-548.

KANEHISA M., GOTO S. 2000. KEGG:

kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nu- cleic Acids Research. 28, 27-30.

KEGG Pathway: Apoptosis – Homo sapi- ens (human). http://www.genome.jp/kegg- bin/show_pathway?map=hsa04210&show_

description=show

KELEKAR A., THOMPSON C. B. 1998.

Bcl-2-family proteins: the role of the BH3 do- main in apoptosis. Trends in Cell Biology. 8, 324-330.

KONOPLEVA M., WATT J., CONTRAC- TOR R., TSAO T., HARRIS D., ESTROV Z., BORNMANN W., KANTARJIAN H., VIALLET J., SAMUDIO I., ANDREEFF M.

2008. Mechanisms of antileukemic activity of the novel Bcl-2 homology domain-3 mimetic GX15-070 (obatoklax). Cancer Research. 68, 3413-3420.

LI J., YUAN J. 2008. Caspases in apoptosis and beyond. Oncogene. 27, 6194-6206.

MARZO I., NAVAL J. 2008. Bcl-2 family members as molecular targets in cancer therapy.

Biochemical Pharmacology. 76, 939-946.

LINDENBOIM L., YUAN J., STEIN R.

2000. Bcl-xS and Bax induce different apop- totic pathways in PC12 cells. Oncogene. 19, 1783-1793.

LOMONOSOVA E., CHINNADURAI G.

2008. BH3-only proteins in apoptosis and be- yond: an overview. Oncogene. 27, S2-S19.

MOHAMMAD R., GIRI A., GOUSTIN A.

S. 2008. Small-molecule inhibitors of Bcl-2 family proteins as therapeutic agents in cancer.

Recent Patents of Anticancer Drug Discovery.

3, 20-30.

MOODLEY Y., RIGBY P., BUNDELL C., BUNT S., HAYASHI H., MISSO N., MCANULTY R., LAURENT G., SCAFFI- DI A., THOMPSON P., KNIGHT D. 2003.

Macrophage recognition and phagocytosis of apoptotic fibroblasts is critically dependent on fibroblast-derived thrombospondin 1 and CD36. American Journal of Pathology. 162, 771-779.

NAIR P., LU M., PETERSEN S., ASHKE-

NAZI A. 2014. Apoptosis initiation through

the cell-extrinsic pathway. Methods in Enzy-

A ^leksAndrA B ^uchAj , M ^onikA G ^ArBAcz s ^tr . 11- 23

.N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018

mology. 544, 99-128.

NGUYEN M., CENCIC R., ERTEL F., BER- NIER C., PELLETIER J., ROULSTON A., SILVIUS J. R., SHORE G. C. 2015. Obato- clax is a direct and potent antagonist of mem- brane-restricted Mcl-1 and is synthetic lethal with treatment that induces Bim. BMC Can- cer. 15, 568.

NGUYEN M., MARCELLUS R. C., ROULSTON A., WATSON M., SERFASS L., MURTHY MADIRAJU S. R., GOU- LET D., VIALLET J., BÉLEC L., BILLOT X., ACOCA S., PURISIMA E., WIEG- MANS A., CLUSE L., JOHNSTONE R. W., BEAUPARLANT P., SHORE G. C. 2007.

Small molecule obatoclax (GX15-070) antag- onizes MCL-1 and overcomes MCL-1-medi- ated resistance to apoptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of USA. 104, 19512-19517.

NI CHONGHAILE T., LETAI A. 2008.

Mimicking the BH3 domain to kill cancer cells. Oncogene. 27(S1), 149-157.

O’BRIEN S. M., CLAXTON D. F., CRUMP M., FADERL S., KIPPS T., KEATING M.

J., VIALLET J., CHESON B. D. 2009. Phase I study of obatoclax mesylate (GX15-070), a small molecule pan-Bcl-2 family antagonist, in patients with advanced chronic lymphocytic leukemia. Blood. 113, 299-305.

OKI Y., COPELAND A., HAGEMEIS- TER F., FAYAD L. E., FANALE M., RO- MAGUERA J., YOUNES A. 2012. Experi- ence with obatoclax mesylate (GX15-070), a small molecule pan-Bcl-2 family antagonist in patients with relapsed or refractory classical Hodgkin lymphoma. Blood. 119, 2171-2172.

OR C. R., CHANG Y., LIN W., LEE W.,

SU H., CHEUNG M., HUANG C., HO C., CHANG C. 2017. Obatoclax, a Pan-BCL-2 Inhibitor, Targets Cyclin D1 for Degradation to Induce Antiproliferation in Human Colorectal Carcinoma Cells. International Journal of Mo- lecular Sciences. 18, 44.

PAIK P. K., RUDIN C. M., PIETANZA M.

C., BROWN A., RIZVI N. A., TAKEBE N., TRAVIS W., JAMES L., GINSBERG M. S., JUERGENS R., MARKUS S., TYSON L., SUBZWARI S., KRIS M. G., KRUG L. M.

2011. A phase II study of obatoclax mesylate, a Bcl-2 antagonist, plus topotecan in relapsed small cell lung cancer. Lung Cancer. 74, 481- 485.

PARSONS M. J., GREEN D. R. 2010. Mito- chondria in cell death. Essays in Biochemistry.

47, 99-114.

PIETSCH E. C., SYKES S. M., MCMA- HON S. B., MURPHY M. E. 2008. The p53 family and programmed cell death. Oncogene.

27, 6507-6521.

PubChem. Obatoclax. https://pubchem.ncbi.

nlm.nih.gov/compound/Obatoclax

REED J. C. 2003. Apoptosis-targeted thera- pies for cancer. Cancer Cell. 3, 17-22.

ROSE A. S., HILDEBRAND P. W. 2015.

NGL Viewer: a web application for molecular visualization. Nucleic Acids Research. 43, 576- 579.

SAMUEL S., TUMILASCI V. F., OLIERE S.,

NGUYEN T. L., SHAMY A., BELL J., HIS-

COTT J. 2010. VSV oncolysis in combination

with the BCL-2 inhibitor obatoclax overcomes

apoptosis resistance in chronic lymphocytic

leukemia. Molecular Therapy. 18, 2094-2103.

.N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 SCHNEIDER P., TSCHOPP J. 2000. Apop-

tosis induced by death receptors. Pharmaceu- tica Acta Helvetiae. 74, 281-286.

SHAMAS-DIN A., KALE J., LEBER B., ANDREWS D. W. 2013. Mechanisms of Ac- tion of Bcl-2 Family Proteins. Cold Spring Harbor Perspectives of Biology. 5, a008714.

SHORE G. C., VIALLET J. 2005. Modulat- ing the bcl-2 family of apoptosis suppressors for potential therapeutic benefit in cancer. He- matology American Society of Hematology.

Education Program. 2005, 226-230.

SHUKLA S., SAXENA S., SINGH B. K., KAKKAR P. 2017. BH3-only protein BIM:

An emerging target in chemotherapy. Euro- pean Journal of Cell Biology. 96, 728-738.

SCHWARTZ-ROBERTS J. L., SHAJAHAN A. N., COOK K. L., WARRI A., ABU-ASAB M., CLARKE R. 2013. GX15-070 (obato- clax) induces apoptosis and inhibits cathepsin D- and L-mediated autophagosomal lysis in antiestrogen-resistant breast cancer cells. Mo- lecular Cancer Therapeutics. 12, 448-459.

SOUALMIA L. F., LECROQ T. 2015. Bio- informatics Methods and Tools to Advance Clinical Care. Findings from the Yearbook 2015 Section on Bioinformatics and Transla- tional Informatics. Yearbook of Medicinal In- formatics. 10, 170-173.

SULKSHANE P, TENI T. 2016. BH3 mi- metic Obatoclax (GX15-070) mediates mi- tochondrial stress predominantly via MCL-1 inhibition and induces autophagy-dependent necroptosis in human oral cancer cells. Onco- target. 8, 60060-60079.

TERSTAPPEN G. C., REGGIANI A. 2001.

In silico research in drug discovery. Trends in

Pharmacological Sciences. 22, 23-26.

THORBURN A. 2007. Tumor necrosis factor- related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) pathway signaling. Journal of Thoracic Oncol- ogy. 2, 461-465.

TRUDEL S., LI Z. H., RAUW J., TIEDE- MANN R. E., WEN X. Y., STEWART A. K.

2007. Preclinical studies of the pan-Bcl inhibi- tor obatoclax (GX015-070) in multiple myelo- ma. Blood. 109, 5430-5438.

VAN ROSSOM W., ASBY D. J., TAVAS- SOLI A., GALE P. A. 2016. Perenosins: a new class of anion transporter with anti-cancer ac- tivity. Organic and Biomolecular Chemistry.

14, 2645-2650.

WATANABE M., UMEZAWA K., HI- GASHIHARA M., HORIE R. 2013. Com- bined inhibition of NF-κB and Bcl-2 triggers synergistic reduction of viability and induces apoptosis in melanoma cells. Oncology Re- search. 21, 173-180.

WILLIAMSON N. R., FINERAN P. C., GRISTWOOD T., CHAWRAI S. R., LEEP- ER F. J., SALMOND G. P. 2007. Anticancer and immunosuppressive properties of bacterial prodiginines. Future Microbiology. 2, 605-618.

WILLIMOTT S., MERRIAM T., WAG- NER S. D. 2011. Apoptosis induces Bcl-XS and cleaved Bcl-XL in chronic lymphocytic leukaemia. Biochemical and Biophysical Re- search Communications. 405, 480-485.

WITTERS L. M., WITKOSKI A., PLA- NAS-SILVA M. D., BERGER M., VIALLET J., LIPTON A. 2007. Synergistic inhibition of breast cancer cell lines with a dual inhibitor of EGFR-HER-2/neu and a Bcl-2 inhibitor.

Oncology Reports. 17, 465-469.

A ^leksAndrA B ^uchAj , M ^onikA G ^ArBAcz s ^tr . 11- 23

.N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018 WWW .N A UK O W CY .OR G .PL 3 (21)/2018

WONG R. S. 2011. Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment. Journal of Experi- mental and Clinical Cancer Research. 30, 87.

WRÓBLEWSKI D., JIANG C. C., CROFT A., FARRELLY M. L., ZHANG X. D., HERSEY P. 2013. OBATOCLAX and ABT- 737 induce ER stress responses in human mel- anoma cells that limit induction of apoptosis.

PLoS One. 8, e84073.

YAZBECK V. Y., LI C., GRANDIS J. R., ZANG Y., JOHNSON D. E. 2014. Single- agent obatoclax (GX15-070) potently induces apoptosis and pro-survival autophagy in head and neck squamous cell carcinoma cells. Oral Oncology. 50, 120-127.

ZHA J., HARADA H., OSIPOV K., JOCK- EL J., WAKSMAN G., KORSMEYER S. J.

1997. BH3 domain of BAD is required for het- erodimerization with BCL-XL and pro-apop- totic activity. Journal of Biological Chemistry.

272, 24101-24104.