Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu Wydział Medycyny Weterynaryjnej
mgr Katarzyna Ćwiek
Ocena zdolności tworzenia biofilmu oraz profile oporności szczepów Salmonella Enteritidis wyizolowanych od drobiu i ludzi
w aspekcie zagrożenia zoonotycznego
Assessment of biofilm formation capacity and resistance profiles of Salmonella Enteritidis isolated from poultry and humans in the aspect of zoonotic threat
Rozprawa doktorska
Promotor pracy:
prof. dr hab. dr h.c. Alina Wieliczko
Promotor pomocniczy dr n. med. Kamila Korzekwa
Wrocław 2019
Ocena zdolności tworzenia biofilmu oraz profile oporności szczepów Salmonella Enteritidis wyizolowanych od drobiu i ludzi w aspekcie zagrożenia zoonotycznego
Według Raportów EFSA, bakterie z rodzaju Salmonella są drugim, po Campylobacter spp., czynnikiem zakaźnym o charakterze zoonotycznym. Salmonella Enteritidis jest najczęściej wykrywanym serowarem w badaniu salmonelloz u ludzi a głównym źródłem zakażenia są produkty pochodzenia drobiowego, takie jak mięso czy jaja. Ponadto, stosowanie antybiotyków m.in. w rolnictwie i hodowli zwierząt przyczynia się do tworzenia presji selekcyjnej powodującej ewolucję drobnoustrojów, w tym pałeczek Salmonella, w kierunku narastania oporności na związki bakteriobójcze. Oprócz problemu narastającej oporności wśród drobnoustrojów oraz ryzyka transmisji patogenów ze zwierząt i żywności pochodzenia zwierzęcego na ludzi, warto mieć na uwadze zdolność tworzenia przez pałeczki Salmonella struktury biofilmu. Fakt ten, może utrudniać eradykację drobnoustrojów w hodowli zwierzęcej, czy linii produkcyjnej w przemyśle żywnościowym, ale również może się przyczynić do długotrwałego pozostawania drobnoustrojów na różnych powierzchniach a w konsekwencji mikrobiologiczną kontaminację żywności.
Głównym celem pracy jest porównanie dwóch grup szczepów S. Enteritidis pochodzących ze środowiska ferm drobiu oraz wyizolowanych z kału ludzkiego pod względem profili oporności, prewalencji wybranych genów oporności oraz potencjału tworzenia biofilmu, poprzez ocenę intensywności jego wzrostu, ocenę prewalencji i ekspresji wybranych genów związanych z tym zjawiskiem. Istotnym celem rozprawy jest również analiza pokrewieństwa filogenetycznego badanych szczepów oraz ocena korelacji pomiędzy zwiększoną opornością na środki przeciwdrobnoustrojowe a zdolnością tworzenia biofilmu.
Przeprowadzone badania wykazały zróżnicowanie pod względem oporności na antybiotyki i chemioterapeutyki pomiędzy dwoma grupami szczepów, jednak większość szczepów o fenotypie wielolekoopornym (MDR) pochodziła od drobiu. Najczęściej występującym profilem wielolekooporności był COL NAL SMX. Wykazano również różnice w prewalencji genów oporności a najczęściej występującym genem wśród szczepów od drobiu był gen floR a wśród szczepów od ludzi blaTEM. Szczepy S. Enteritidis pochodzące od drobiu w testowanych warunkach inkubacji (podłoże TSB i M9; 28°C, 37°C i 6°C) charakteryzowały się lepszym wzrostem biofilmu. Wzrost ekspresji genów związanych z produkcją celulozy, istotnego komponentu biofilmu Salmonella, dotyczył jedynie szczepu S48 pochodzącego od drobiu. Natomiast wzrost ekspresji genów związanych ze zjawiskiem quorum-sensing
Pobrano z https://bazawiedzy.upwr.edu.pl / Downloaded from Repository of Wrocław University of Environmental and Life Sciences 2022-03-05
zaobserwowano u szczepów A12 i A19 wyizolowanych ze środowiska ferm drobiu i szczepu L38, pochodzącego z kału ludzkiego.
Metoda ERIC-PCR podzieliła badane szczepy na dwa główne klastry ze względu na ich pochodzenie. Natomiast metoda RA-PFGE wykazała duże zróżnicowanie pokrewieństwa filogenetycznego badanych szczepów S. Enteritidis. Charakterystyka szczepów z wykorzystaniem techniki MLST, przyporządkowała badane szczepy do jednego typu sekwencyjnego ST11. Ponadto, w dwóch analizowanych grupach szczepów S. Enteritidis nie wykazano istotnej statystycznie zależności pomiędzy występowaniem fenotypu MDR a zdolnością tworzenia biofilmu w testowanych warunkach. Statystycznie istotną zależność zaobserwowano jedynie między morfotypem (RDAR, PDAR, BDAR i SAW) szczepów S.
Enteritidis pochodzących od ludzi a tworzeniem biofilmu w podłożu TSB w 6°C. Dla szczepów wyizolowanych ze środowiska ferm drobiu została odnotowana zależność między rodzajem morfotypu a hodowlą szczepów w podłożu minimalnych M9 w temperaturze 28°C i 37°C oraz między obecnością genów oporności a zdolnością tworzenia biofilmu przez te szczepy w podłożu M9 w temperaturze 6°C.
Assessment of biofilm formation capacity and resistance profiles of Salmonella Enteritidis isolated from poultry and humans in the aspect of zoonotic threat According to EFSA reports, Salmonella spp. are the second, after Campylobacter spp., the most common zoonotic infectious agent. Salmonella Enteritidis is the most frequently detected serovar in human salmonellosis and the main source of infection is poultry products such as meat and eggs. In addition, the use of antibiotics, in agriculture and animal husbandry, contributes to the occurance of selective pressure causing the evolution of microorganisms towards the increase of resistance to antimicrobials. The problem of increasing resistance among microorganisms and the risk of transmission of pathogens from animals and food of animal origin to humans are very significant. It is worth taking into consideration the ability of Salmonella to produce a biofilm as well. This fact may constrict the eradication of microorganisms from the animal husbandry environment or production line in the food industry. What could contribute to the long-term staying of microorganisms on a variety of surfaces additionally and as a consequence, microbiological contamination of food.
The main aim of the work is comparision two groups of S. Enteritidis strains isolated from poultry farm environment and human feces in terms of resistance profiles, prevalence of selected resistance genes and their potential for biofilm formation, by assesment its biofilm growth intensity, the prevalence and expression of selected genes associated with this phenomenon. The other important goal of this thesis is the analysis of the phylogenetic relationship of the tested strains and assessment of the correlation between increased antimicrobial resistance and the ability to produce biofilm.
The study showed a difference in antimicrobial resistance between the two groups of strains, however, the majority of the multi-drug resistant phenotype (MDR) strains came from poultry environment. The COL NAL SMX profile was the most common multi-drug resistance profile among noted ones. Moreover, differences in the prevalence of resistance genes were presented and the most common gene among poultry strains was the floR and among strains from humans blaTEM. S. Enteritidis strains isolated from poultry under the tested incubation conditions (TSB and M9 medium; 28°C, 37°C and 6°C) exhibited better biofilm growth. The expression increase of genes associated with the production of cellulose, an important component of Salmonella biofilm, was only detected in the S48 strain isolated from poultry.
On the other hand, the expression increase of gene associated with the quorum-sensing was observed in A12 and A19 strains isolated from the poultry farms environment and L38 strain isolated from human feces.
Pobrano z https://bazawiedzy.upwr.edu.pl / Downloaded from Repository of Wrocław University of Environmental and Life Sciences 2022-03-05
The ERIC-PCR method divided the studied strains into two main clusters due to their origin. In contrast, the RA-PFGE method presented a large variation in the phylogenetic relationship of the tested S. Enteritidis strains. Characterization of strains using the MLST technique, assigned the all tested strains to one sequnece type ST11. In addition, in the analyzed groups of S. Enteritidis strains, a statistically significant correlation between the occurrence of the MDR phenotype and the ability to produce biofilm under the tested conditions was not found. A statistically significant relationship was observed only between the morphotype (RDAR, PDAR, BDAR and SAW) of S. Enteritidis strains isolated from humans and biofilm formation in TSB medium at 6°C. For strains isolated from the poultry farms environment, a relationship between the morphotype and the ability to produce biofilm in M9 minimal medium at 28°C and 37°C and between the prevalence of resistance genes and the ability of biofilm formation by these strains in M9 medium at 6 ° C as well were noted.
