INVESTIGATIONS ON SECRETIN
AND ANALOGUES
DICK VOSKAMP
INVESTIGATIONS ON SECRETIN AND ANALOGUES
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B I B L I O T H E E K T U Delft P 1674 4 2 4 2 C 4 9 7 0 2 8INVESTIGATIONS ON SECRETIN
AND ANALOGUES
Proefschrift ter verkrijging van
de graad van doctor in de
technische wetenschappen
aan de Technische Hogeschool Delft,
op gezag van de rector magnificus
prof. ir. B.P.Th. Veltman,
voor een commissie aangewezen door
het college van dekanen
te verdedigen op dinsdag 27 oktober 1981
te 14.00 uur door
Dirk Voskamp
scheikundig ingenieur
geboren te 's-Gravenzande
Dit proefschrift is goedgekeurd door de promotor
PROF. DR. H.C. B E Y E R M A N
Aan mijn ouders
Voor Ineke
The investigation described in this thesis has been supported by the
Netherlands Foundation for Chemical Research (SON) with financial aid from the
Netherlands Organization for the Advancement of Pure Research.
CONTENTS A B B R E V I A T I O N S INTRODUCTION 1 1. THE G A S T R O I N T E S T I N A L HORMDNE S E C R E T I N 3 1.1 D i s c o v e r y , s t r u c t u r e e l u c i d a t i o n , a n d s y n t h e s i s 3 1.2 T h e b i o l o g i c a l r o l e o f s e c r e t i n 5 1.3 N a t u r a l p e p t i d e s , r e l a t e d t o s e c r e t i n 7 1.4 S y n t h e t i c p e p t i d e s , r e l a t e d t o p o r c i n e s e c r e t i n 7
2. S Y N T H E S I S OF S E C R E T I N BY THE R E P E T I T I V E E X C E S S MIXED ANHYDRIDE ( R E M A ) 11 METHOD 2.1 I n t r o d u c t i o n 11 2.2 E x p e r i m e n t s a n d r e s u l t s 16 2.2.1 S y n t h e s i s o f p r o t e c t e d s e c r e t i n 16 2.2.2 H i g h - p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ( H P L C ) i n t h e s y n t h e s i s o f p r o t e c t e d s e c r e t i n 16 2.2.3 D e p r o t e c t i o n o f p r o t e c t e d s e c r e t i n b y a c i d o l y s i s w i t h l i q u i d h y d r o g e n f l u o r i d e 18 2.2.4 A n a l y s i s o f s e c r e t i n b y HPLC 18 2.2.5 P u r i f i c a t i o n o f s e c r e t i n 18 2.2.6 D e t e r m i n a t i o n o f t h e b i o l o g i c a l p o t e n c y o f s e c r e t i n 21 2.2.7 D e t e r m i n a t i o n o f t h e i m m u n o l o g i c a l p o t e n c y o f s e c r e t i n 2 2 2.3 E x p e r i m e n t a l p a r t 23 2.3.1 S y n t h e s i s o f p r o t e c t e d s e c r e t i n b y t h e REMA m e t h o d 23 2.3.2 D e p r o t e c t i o n o f p r o t e c t e d s e c r e t i n b y a c i d o l y s i s w i t h 24 H F / a n i s o l e 2.3.3 P u r i f i c a t i o n o f s e c r e t i n b y i o n - e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y 24 2.3.4 P u r i f i c a t i o n o f s e c r e t i n b y HPLC 24 2.3.5 A n a l y s i s o f p e p t i d e s b y HPLC 25 2.3.6 A n a l y s i s o f p e p t i d e s b y t h i n - l a y e r c h r o m a t o g r a p h y ( T L C ) 25 2.3.7 A n a l y s i s o f p e p t i d e s a f t e r a c i d i c a n d e n z y m i c h y d r o l y s i s 25 2.3.8 D e t e r m i n a t i o n o f b i o l o g i c a l p o t e n c y 26 2 . 3 . 9 D e t e r m i n a t i o n o f i m m u n o l o g i c a l p o t e n c y 27 2.4 C o n c l u s i o n s a n d d i s c u s s i o n 27
3 . ON THE I N S T A B I L I T Y OF S E C R E T I N 2 9 3.1 I n t r o d u c t i o n 2 9 3.2 L o s s o f b i o l o g i c a l p o t e n c y o f s e c r e t i n 32 3.3 A d s o r p t i o n o f s e c r e t i n o n g l a s s o r s y n t h e t i c m a t e r i a l s 33 3.4 C h e m i c a l r e a c t i o n s i n m o d e l p e p t i d e s a n d s e c r e t i n 33 3.5 E x p e r i m e n t a l p a r t 41 3.6 C o n c l u s i o n s 4 2
4. S Y N T H E S I S AND SOME P R O P E R T I E S OF MODEL P E P T I D E S 4 3
4.1 I n t r o d u c t i o n 43 4.2 E x p e r i m e n t s a n d r e s u l t s 4 4 4.3 E x p e r i m e n t a l p a r t 51 4.4 C o n c l u s i o n s 53 5. S Y N T H E S I S AND SOME P R O P E R T I E S OF [ A S P A R T O Y L3] - S E C R E T I N , [ 8 - A S P3] - 55 S E C R E T I N , AND S E C R E T I N ( 4 - 2 7 ) 5.1 I n t r o d u c t i o n 55 5.2 E x p e r i m e n t s a n d r e s u l t s 55 5.3 E x p e r i m e n t a l p a r t 6 0 5.4 C o n c l u s i o n s 61
6. S Y N T H E S I S AND SOME P R O P E R T I E S OF [ A L A4] - S E C R E T I N AND [ S A R4] - S E C R E T I N 63
6.1 I n t r o d u c t i o n 63 6.2 E x p e r i m e n t s a n d r e s u l t s 6 3
6.3 E x p e r i m e n t a l p a r t 68 6.4 C o n c l u s i o n s 7 0
7. S Y N T H E S I S AND SOME P R O P E R T I E S OF ANALOGUES OF S E C R E T I N AND THE 71 V A S O A C T I V E I N T E S T I N A L P E P T I D E ( V I P ) : THE V A S E C T R I N S 7.1 I n t r o d u c t i o n 71 7.2 R e s u l t s a n d d i s c u s s i o n 73 7.3 E x p e r i m e n t a l p a r t 78 SUMMARY 81 SAMENVATTING 8 5 R E F E R E N C E S 89
A B B R E V I A T I O N S A b b r e v i a t i o n s h a v e g e n e r a l l y b e e n u s e d a c c o r d i n g t o t h e r e c o m m e n d a t i o n s o f t h e I U P A C - I U B C o m m i s s i o n o n B i o c h e m i c a l N o m e n c l a t u r e ( 1 0 4 ) . A l l a m i n o a c i d s u s e d , e x c e p t g l y c i n e a n d s a r c o s i n e , a r e o f t h e L - c o n f i g u r a t i o n u n l e s s o t h e r w i s e s t a t e d . T h e p r o p o s a l s o f M. B o d a n s z k y , c o n c e r n i n g t h e u s e o f a n A r a b i c i n s t e a d o f a G r e e k n u m e r a l p r e c e d i n g t h e w o r d p e p t i d e , t o i n d i c a t e t h e l e n g t h o f a p e p t i d e a n d t h e u s e o f t h e w o r d s e g m e n t i n s t e a d o f f r a g m e n t , h a v e b e e n f o l l o w e d ( 1 0 5 ) . A l a a l a n i n e A r g a r g i n i n e A s n a s p a r a g i n e A s p a s p a r t i c a c i d a u a b s o r b a n c e u n i t B o c t - b u t y l o x y c a r b o n y l t B u t - b u t y l B S A b o v i n e s e r u m a l b u m i n B z l b e n z y l CD c i r c u l a r d i c h r o i s m CHA 3 - ( c y c l o h e x y l ) - a l a n i n e D C C I N , N ' - d i c y c l o h e x y l c a r b o d i i m i d e DCHA d i c y c l o h e x y l a m i n e DMF N , N - d i m e t h y l f o r m a m i d e G I P g a s t r i c i n h i b i t o r y p e p t i d e ; g l u c o s e - d e p e n d e n t i n s u l i n o t r o p i c p e p t i d e G i n g l u t a m i n e G l u g l u t a m i c a c i d G l y g l y c i n e HC1 h y d r o c h l o r i c a c i d HF h y d r o g e n f l u o r i d e H i s h i s t i d i n e HOBt 1 - h y d r o x y b e n z o t r i a z o l e H P L C h i g h - p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y
i .m. i n t r a m u s c u l a r LAO L - a m i n o a c i d o x i d a s e L A P l e u c i n e a m i n o p e p t i d a s e L e u l e u c i n e L y s l y s i n e N i e n o r l e u c i n e NMM N - m e t h y l m o r p h o l i n e NMR n u c l e a r m a g n e t i c r e s o n a n c e Np p - n i t r o p h e n y l Nps o - n i t r o p h e n y l s u l f e n y l ORD o p t i c a l r o t a t o r y d i s p e r s i o n O r n o r n i t h i n e P h e p h e n y l a l a n i n e RE MA r e p e t i t i v e e x c e s s m i x e d a n h y d r i d e R I A r a d i o i m m u n o a s s a y RP r e v e r s e - p h a s e S a r s a r c o s i n e S e r s e r i n e T F A ! t r i f l u o r o a c e t i c a c i d T h r t h r e o n i n e T L C t h i n - l a y e r c h r o m a t o g r a p h y T o s t o s y l ( p - t o l u e n e s u l f o n y l ) T r p : t r y p t o p h a n T y r t y r o s i n e V a l : v a l i n e V I P : v a s o a c t i v e i n t e s t i n a l p e p t i d e Z b e n z y l o x y c a r b o n y 1
I N T R O D U C T I O N
1
S e c r e t i n i s a h o r m o n e t h a t i s p r o d u c e d by a s p e c i f i c e n d o c r i n e c e l l t y p e i n t h e d u o d e n u m a n d j e j e n u m o f many a n i m a l s a n d man. I t s m o s t c o n s p i c i o u s a c t i o n i s t h e s t i m u l a t i o n o f t h e p a n c r e a s t o s e c r e t e a b a s i c , e n z y m e s - c o n t a i n i n g p a n c r e a t i c j u i c e . S e c r e t i n i s s e c r e t e d i n t o t h e b l o o d s t r e a m o n a c i d i f i c a t i o n o f t h e c o n t e n t s o f t h e u p p e r p a r t o f t h e g u t . S e c r e t i n was f i r s t i s o l a t e d f r o m h o g s . P o r c i n e s e c r e t i n a p p e a r e d t o be a l i n e a r 2 7 - p e p t i d e a m i d e . I t was s y n t h e s i z e d i n t h i s l a b o r a t o r y * v i a t h e r e p e t i t i v e e x c e s s m i x e d a n h y d r i d e ( R E M A ) m e t h o d , i n o r d e r t o s t u d y t h e s c o p e o f t h i s m e t h o d i n t h e s y n t h e s i s o f p e p t i d e s i n s o l u t i o n . I t s e e m e d a t t r a c t i v e t o i n v e s t i g a t e t h e u s e o f p o r c i n e s e c r e t i n a s a t h e r a p e u t i c a g e n t f o r u l c e r s o f t h e g a s t r o i n t e s t i n a l t r a c t o r a s a d i a g n o s t i c a g e n t f o r , e . g . , t h e f u n c t i o n o f t h e p a n c r e a s . A b i g p r o b l e m , h o w e v e r , was t h e i n s t a b i l i t y o f t h e p e p t i d e i n v i t r o . A n u m b e r o f i n v e s t i g a t o r s h a d r e p o r t e d a r a p i d l o s s o f p o t e n c y , e s p e c i a l l y i n a q u e o u s s o l u t i o n . The c a u s e o f t h i s p h e n o m e n o n was n o t k n o w n . The o b j e c t o f t h e i n v e s t i g a t i o n s d e s c r i b e d i n t h i s t h e s i s was t o a s c e r t a i n t h e c a u s e o f t h e r a p i d i n a c t i v a t i o n o f p o r c i n e s e c r e t i n i n v i t r o a t t h e m o l e c u l a r l e v e l a n d t h e f i n d i n g o f a p r a c t i c a l r e m e d y . L a b o r a t o r y o f O r g a n i c C h e m i s t r y , D e l f t U n i v e r s i t y o f T e c h n o l o g y , J u l i a n a l a a n 1 3 6 , 2 6 2 8 BL D e l f t , The N e t h e r l a n d s .1. THE G A S T R O I N T E S T I N A L HORMONE S E C R E T I N 1.1 D I S C O V E R Y , STRUCTURE E L U C I D A T I O N , AND S Y N T H E S I S I n 1 9 0 2 , o n J a n u a r y 1 6 t h , B a y l i s s a n d S t a r l i n g d i s c o v e r e d t h a t t h e p a n c r e a t i c s e c r e t i o n i n a d o g c o u l d b e s t i m u l a t e d b y i n t r o d u c i n g d i l u t e h y d r o c h l o r i c a c i d i n t o t h e j e j u n u m f r o m w h i c h a l l n e r v e c o n n e c t i o n s w i t h t h e b o d y h a d b e e n c u t ( 1 ) . T h e y a l s o d i s c o v e r e d t h a t a n e x t r a c t o f t h e m u c o s a o f t h e j e j u n u m , a f t e r i n j e c t i o n i n t o t h e b l o o d s t r e a m , s t i m u l a t e d t h e p a n c r e a t i c s e c r e t i o n . F r o m t h e s e a n d f o l l o w i n g e x p e r i m e n t s t h e y c o n c l u d e d t h a t t h e s t i m u l a t i o n o f t h e p a n c r e a s was c a u s e d b y a c h e m i c a l m e s s e n g e r , t h a t was t r a n s p o r t e d f r o m t h e j e j u n u m t o t h e p a n c r e a s v i a t h e b l o o d s t r e a m . T h e y p r o p o s e d t h e name " s e c r e t i n " f o r t h e c o m p o u n d c o n c e r n e d . S o o n t h i s name h a d b e e n g e n e r a l l y a c c e p t e d . T h i s was t h e f i r s t t i m e t h a t b o d y r e g u l a t i o n v i a c o m p o u n d s , t r a n s p o r t e d b y t h e b l o o d , was s u g g e s t e d . L a t e r i t w o u l d a p p e a r t h a t many f u n c t i o n s i n t h e b o d y a r e r e g u l a t e d i n t h i s w a y . T h e c o m p o u n d s c o n c e r n e d w e r e c a l l e d h o r m o n e s . S o , s e c r e t i n was t h e f i r s t h o r m o n e r e c o g n i z e d a s s u c h . S e c r e t i n was f o u n d i n many a n i m a l s p e c i e s a n d i n m a n . I t i s i n t e r e s t i n g t o r e c a l l h e r e t h a t t h e f i r s t p e r s o n who s u c c e e d e d i n o b t a i n i n g t h e p a n c r e a t i c j u i c e , i n 1 6 6 4 , was t h e D u t c h s c i e n t i s t R e i n i e r d e G r a a f , who l a t e r l i v e d i n D e l f t a s a p h y s i c i a n ( 2 ) . T h e h o r m o n e s e c r e t i n was f i r s t i s o l a t e d f r o m h o g s . I n 1 9 6 1 J o r p e s a n d M u t t i s o l a t e d 10 mg o f p u r e s e c r e t i n f r o m t h e u p p e r i n t e s t i n e s o f 1 0 , 0 0 0 h o g s ( 3 ) . I t w a s p r o v e d t o b e a l i n e a r p e p t i d e a m i d e , c o n s i s t i n g o f 27 a m i n o a c i d r e s i d u e s . I n 1 9 6 6 J o r p e s a n d M i t t p r o p o s e d t h e f o l l o w i n g s e q u e n c e f o r p o r c i n e s e c r e t i n ( F i g . 1.1) ( 3 ) : H i s S e r A s p G l y T h r P h e T h r S e r G l u L e u S e r A r g L e u A r g -1 2 3 4 5 6 7 8 9 -10 -1-1 -12 -13 -14 - A s p - S e r - A l a - A r g - L e u - G l n - A r g - L e u - L e u - G l n - G l y - L e u - V a l - N H 2 15 16 17 18 19 20 21 2 2 23 24 25 26 27 F i g . 1.1 T h e s e q u e n c e o f p o r c i n e s e c r e t i n
T h e c o r r e c t n e s s o f t h i s s e q u e n c e was p r o v e d i n 1967 a f t e r t h e s y n t h e s i s o f a p e p t i d e w i t h t h e p r o p o s e d s e q u e n c e b y B o d a n s z k y e t a l . ( 4 ) . T h e y o b t a i n e d a p r o d u c t t h a t was i d e n t i c a l w i t h n a t u r a l p o r c i n e s e c r e t i n . T h e p e p t i d e h a s s i n c e b e e n s y n t h e s i z e d s e v e r a l t i m e s . I n T a b l e 1.1 t h e s u c c e s s f u l s y n t h e s e s a r e s u m m a r i z e d . T a b l e 1.1 S y n t h e s e s o f p o r c i n e s e c r e t i n3 Y e a r S t r a t e g y R e f e r e n c e B o d a n s z k y e t a l . 1967 s e q u e n t i a l s y n t h e s i s '3'0 4 O n d e t t i e t a l . 1968 f r a g m e n t c o n d e n s a t i o n *5 5 W ü n s c h e t a l . 1972 f r a g m e n t c o n d e n s a t i o n '3 6 Jäger e t a l . 1974 f r a g m e n t c o n d e n s a t i o n *3 7 V a n Z o n a n d B e y e r m a n 1976 s e q u e n t i a l s y n t h e s i s '3' ^ 8 Y a n a i h a r a e t a l . 1977 f r a g m e n t c o n d e n s a t i o n '5 9 Hemmas! a n d B a y e r 1977 s e q u e n t i a l s y n t h e s i se' ^ 10 a S e v e r a l a p p r o a c h e s d i d n ' t l e a d t o a s u c c e s s f u l s y n t h e s i s . b S y n t h e s i s i n s o l u t i o n . c C o u p l i n g v i a a c t i v e e s t e r s . d C o u p l i n g v i a m i x e d a n h y d r i d e s . e S o l i d p h a s e p e p t i d e s y n t h e s i s . f C o u p l i n g v i a t h e D C C I - m e t h o d . M u t t r e p o r t e d t h e i s o l a t i o n o f b o v i n e a n d c h i c k e n s e c r e t i n ( 7 9 ) . The i s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f c h i c k e n s e c r e t i n h a s r e c e n t l y b e e n d e s c r i b e d ( 1 0 7 ) . I t was f o u n d t o be a l i n e a r 2 7 - p e p t i d e a m i d e , w i t h g r e a t s e q u e n c e s i m i l a r i t i e s w i t h p o r c i n e s e c r e t i n ( 1 4 i d e n t i c a l a m i n o a c i d r e s i d u e s i n c o r r e s p o n d i n g p o s i t i o n s ) . M u t t e t a l . i s o l a t e d a p e p t i d e f r o m e x t r a c t s o f p o r c i n e b r a i n t i s s u e t h a t h a d c h e m i c a l , p h a r m a c o l o g i c a l a n d c h r o m a t o g r a p h i c p r o p e r t i e s l i k e p o r c i n e s e c r e t i n ( 8 7 ) . The s e q u e n c e o f t h i s p e p t i d e h a s n o t b e e n p u b l i s h e d a s y e t . The c o n f o r m a t i o n o f p o r c i n e s e c r e t i n i n s o l u t i o n h a s b e e n s t u d i e d b y s e v e r a l g r o u p s . A f t e r CD-, 0RD-, a n d N M R - m e a s u r e m e n t s o n p o r c i n e s e c r e t i n , p a r t i a l s e q u e n c e s o f p o r c i n e s e c r e t i n , a n d a n a l o g u e s t h e r e o f , B o d a n s z k y e t a l . ( 1 2 - 1 4 ) a n d P a t e l e t a l . ( 1 5 ) c o n c l u d e d t h a t t h e p e p t i d e e x i s t e d i n a p r e f e r r e d c o n f o r m a t i o n i n a q u e o u s s o l u t i o n . A t f i r s t , B o d a n s z k y e t a l . s t a t e d t h a t t h e N - t e r m i n a l p a r t o c c u r r e d a s a n c t - h e l i x , w h i l e t h e C - t e r m i n a l p a r t was n e c e s s a r y f o r t h e s t a b i l i z a t i o n o f t h i s c o n f o r m a t i o n . L a t e r , a l s o b a s e d u p o n
a n a l y s i s o f t h e s e q u e n c e w i t h t h e s e c o n d a r y s t r u c t u r e c o n f o r m a t i o n a l p a r a m e t e r s o f C h o u a n d F a s m a n , t h e y s t a t e d t h a t t h e C - t e r m i n a l p a r t o c c u r r e d a s a n o t - h e l i x , w h i l e a p a r t o f t h e r e m a i n i n g s e q u e n c e was n e c e s s a r y f o r t h e s t a b i l i z a t i o n o f t h e c o n f o r m a t i o n . E s p e c i a l l y t h e s i d e c h a i n s o f t h e G l u ^ - a n d A s p ^ - r e s i d u e s s h o u l d p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e s t a b i l i z a t i o n , p r o b a b l y v i a f o r m a t i o n o f i o n p a i r s w i t h t h e s i d e c h a i n s o f A r g - r e s i d u e s , p r e s e n t i n p o r c i n e s e c r e t i n i n f o u r p o s i t i o n s . T h e N - t e r m l n a l t e t r a p e p t i d e d i d n o t i n f l u e n c e t h e c o n f o r m a t i o n . T h e c o n f o r m a t i o n w a s c h a n g e d b y c h a n g i n g t h e t e m p e r a t u r e . J a e g e r e t a l . ( 1 6 ) f o u n d t h a t t h e c o n f o r m a t i o n o f p o r c i n e s e c r e t i n i n s o l u t i o n c h a n g e d g r a d u a l l y o n c h a n g i n g t h e pH f r o m pH 6.8 t o pH 2 . 0 . A c c o r d i n g t o C D - m e a s u r e m e n t s l o w e r i n g o f t h e pH c a u s e d a d e c r e a s e i n t h e o r d e n i n g o f t h e p e p t i d e . T h e s e r e s u l t s s u p p o r t B o d a n s z k y ' s h y p o t h e s i s t h a t i o n p a i r s s t a b i l i z e t h e c o n f o r m a t i o n o f s e c r e t i n . Y a n a i h a r a e t a l . ( 1 7 ) f o u n d n o s i g n i f i c a n t d e p e n d e n c e o f t h e C D - s p e c t r a o f p o r c i n e s e c r e t i n o n t h e pH i n t h e r a n g e b e t w e e n pH 5.3 a n d 8 . 0 . T h e t h r e e - d i m e n s i o n a l p o l y p e p t i d e f o l d i n g o f s e c r e t i n i n a q u e o u s s o l u t i o n h a s a l s o b e e n s t u d i e d ( 1 8 ) , u s i n g a c o m b i n a t i o n o f d a r k f i e l d e l e c t r o n m i c r o g r a p h s , t h e p a r a m e t e r s o f C h o u a n d F a s m a n , a n d a h i e r a r c h y o f i n t e r a c t i o n t y p e s c o m p r i s i n g t h e t e r t i a r y s t r u c t u r e . T h e p r o p o s e d s t r u c t u r e c o n t a i n s f o u r B - t u r n s a t t e t r a p e p t i d e s 1-4, 1 0 - 1 3 , 1 3 - 1 6 , a n d 1 6 - 1 9 , B - s h e e t f r o m r e s i d u e s 4 - 1 0 , a n d o t - h e l i x f r o m 1 9 - 2 7 . T h i s m o d e l i s c o n s i s t e n t w i t h t h e d a t a o b t a i n e d b y t h e o t h e r w o r k e r s m e n t i o n e d . P o r c i n e s e c r e t i n h a s n o t b e e n c r y s t a l l i z e d u n t i l now. P r o b a b l y , t h e i n s t a -b i l i t y o f t h e p e p t i d e i n s o l u t i o n a l r e a d y m e n t i o n e d , h a s p l a y e d a n i m p o r t a n t r o l e . T h e c o n f o r m a t i o n o f s e c r e t i n i n c r y s t a l l i n e f o r m i s t h e r e f o r e u n k n o w n . 1.2 THE B I O L O G I C A L ROLE OF S E C R E T I N Much h a s b e e n d o n e a n d i s b e i n g d o n e t o e l u c i d a t e t h e b i o l o g i c a l r o l e o f s e c r e t i n . T h e h o r m o n e p l a y s , t o p r e s e n t k n o w l e d g e , a n i m p o r t a n t r o l e o n l y i n t h e g a s t r o i n t e s t i n a l t r a c t o f many a n i m a l s p e c i e s a n d man. T o g e t h e r w i t h many o t h e r c o m p o u n d s i t i s i m p o r t a n t i n t h e d i g e s t i o n o f f o o d , a v e r y c o m p l i c a t e d p r o c e s s . I t i s d i f f i c u l t , i f p o s s i b l e a t a l l , t o e l u c i d a t e t h e e x a c t r o l e o f s e c r e t i n . T h e m o s t i m p o r t a n t f u n c t i o n w o u l d a p p e a r t o b e t h e s t i m u l a t i o n o f t h e p a n c r e a s t o s e c r e t e a w e a k l y b a s i c , e n z y m e s - c o n t a i n i n g j u i c e . T a b l e 1.2 s u m m a r i z e s a n u m b e r o f f u n c t i o n s t h a t a r e i n f l u e n c e d b y s e c r e t i n . T h e m o s t i m p o r t a n t s t i m u l a n t f o r t h e r e l e a s e o f s e c r e t i n i n t o t h e b l o o d s t r e a m i s t h e a c i d i f i c a t i o n o f t h e u p p e r p a r t o f t h e g u t . A n e x t e n s i v e r e v i e w o f t h e i n v e s t i g a t i o n s i n t h i s f i e l d i s b e y o n d t h e s c o p e o f t h i s t h e s i s . H e r e o n l y some b o o k s o r a r t i c l e s c o n c e r n i n g t h e s u b j e c t a r e r e f e r r e d t o ( 1 9 - 2 4 , 7 9 ) .
T a b l e 1.2 B i o l o g i c a l a c t i v i t i e s t h a t c a n be i n f l u e n c e d by s e c r e t i n ( 2 3 ) 1. P a r o t i d S t i m u l a t i o n o f f l u i d a n d e l e c t r o l y t e 2. G a s t r o e s o p h a g e a l s p h i n c t e r R e l a x a t i o n by c o m p e t i t i v e i n h i b i t i o n o f g a s t r i n 3. S t o m a c h a . I n h i b i t i o n o f p a r i e t a l c e l l s e c r e t i o n b . R e l a x a t i o n o f m u s c u l a r a c t i v i t y c . A n t i t r o p h l c 4. D u o d e n u m a . S t i m u l a t i o n o f m u c o u s s e c r e t i o n b y B r u n n e r g l a n d s b . R e l a x a t i o n o f t h e s p h i n c t e r o f O d d i c . R e l a x a t i o n o f m u s c u l a r a c t i v i t y 5. P a n c r e a s a . S t i m u l a t i o n o f f l u i d a n d e l e c t r o l y t e b . S y n e r g i s t i c f a c i l i t a t i o n o f e n z y m e r e s p o n s e t o p a n c r e o z y m i n ( c h o l e c y s t o k i n i n ) c . R e l e a s e o f i n s u l i n d . I n c r e a s e i n b l o o d f l o w 6. L i v e r a n d g a l l b l a d d e r a . A l t e r a t i o n o f h e p a t i c f l u i d a n d e l e c t r o l y t e s e c r e t i o n b . S t i m u l a t i o n o f w a t e r a n d b i c a r b o n a t e by l i v e r d u c t s c . R e l a x a t i o n o f t h e g a l l b l a d d e r d . I n c r e a s e i n p e r m e a b i l i t y o f g a l l b l a d d e r m u c o s a 7. S m a l l a n d l a r g e i n t e s t i n e s a . I n c r e a s e i n m u c o s a l t r a n s p o r t o f f l u i d a n d e l e c t r o l y t e b . I n c r e a s e i n s e c r e t i o n o f f l u i d a n d e l e c t r o l y t e by i n t e s t i n a l g l a n d s c . D e c r e a s e i n m o t o r a c t i v i t y
1.3 NATURAL P E P T I D E S , R E L A T E D TO S E C R E T I N A c o n s i d e r a b l e n u m b e r o f p e p t i d e s h a v e b e e n i s o l a t e d f r o m many a n i m a l s a n d man. E l u c i d a t i o n o f t h e p r i m a r y s t r u c t u r e s s h o w e d t h a t a n u m b e r o f p e p t i d e s , i s o l a t e d f r o m t h e same s p e c i e s , p o s s e s s g r e a t s i m i l a r i t i e s i n t h e i r s e q u e n c e s ( 2 1 , 2 4 , 2 5 ) . F i g . 1.2 s h o w s t h e s e q u e n c e s o f f o u r p e p t i d e s t h a t h a v e b e e n i s o l a t e d f r o m h o g s : t h e v a s o a c t i v e i n t e s t i n a l p e p t i d e ( V I P ) , s e c r e t i n , p a n c r e a t i c g l u c a g o n , a n d t h e g a s t r i c I n h i b i t o r y p e p t i d e ( G I P ) . R e c e n t l y , a new member was a d d e d t o t h i s f a m i l y ( 2 6 ) . The s e q u e n c e o f t h i s 2 7 - p e p t i d e , named P H I b y t h e d i s c o v e r e r s ( P e p t i d e w i t h N t e r m i n a l a H i s r e s i d u e (_H) a n d C t e r m i n a l a H e -r e s i d u e ( I ) ) , h a s n o t b e e n f u l l y e l u c i d a t e d a s y e t . P o r c i n e s e c r e t i n a n d c h i c k e n s e c r e t i n h a v e 14 i d e n t i c a l a m i n o a c i d r e s i d u e s i n c o r r e s p o n d i n g p o s i t i o n s . The p r o p o s e d s e q u e n c e o f c h i c k e n s e c r e t i n i s a l s o s h o w n i n F i g . 1.2. 1.4 S Y N T H E T I C P E P T I D E S , R E L A T E D TO PORCINE S E C R E T I N * S e c r e t i n , p a r t i a l s e q u e n c e s o f s e c r e t i n , a n a l o g u e s o f t h e s e , a n d e l o n g a t e d s e q u e n c e s o f s e c r e t i n h a v e b e e n s y n t h e s i z e d b y s e v e r a l g r o u p s . T h e s y n t h e t i c p e p t i d e s c a n be c l a s s i f i e d i n t o g r o u p s , b a s e d u p o n t h e r e a s o n i n g b e h i n d t h e s y n t h e s i s : 1. Some p e p t i d e s w e r e s y n t h e s i z e d w i t h t h e i n t e n t i o n o f o b t a i n i n g a b i o l o g i c a l l y p o t e n t p r o d u c t t h a t s h o w s a n p r o t r a c t e d a c t i v i t y c o m p a r e d w i t h s e c r e t i n . T h i s m i g h t be o f p r a c t i c a l i m p o r t a n c e f o r t h e a p p l i c a t i o n o f s e c r e t i n a s a t h e r a p e u t i c o r d i a g n o s t i c a g e n t . 2 . I n o r d e r t o f i n d t h e c a u s e ( s ) o f t h e i n a c t i v a t i o n o f s e c r e t i n a l r e a d y m e n t i o n e d , s e v e r a l p e p t i d e s w e r e s y n t h e s i z e d i n o r d e r t o i n v e s t i g a t e r e l a t e d p h y s i c a l , c h e m i c a l , a n d p h a r m a c o l o g i c a l p h e n o m e n a . 3. Some p e p t i d e s w e r e d e s i r e d f o r s t u d i e s o n s t r u c t u r e - a c t i v i t y r e l a t i o n s h i p s i n g a s t r o i n t e s t i n a l h o r m o n e s . 4. Some p e p t i d e s w e r e s y n t h e s i z e d i n o r d e r t o e v a l u a t e a r a d i o i m m u n o a s s a y ( R I A ) f o r s e c r e t i n . T h e name " s e c r e t i n " w i l l be u s e d h e n c e f o r t h , u n l e s s o t h e r w i s e s t a t e d , w h e n p o r c i n e s e c r e t i n i s m e a n t . O f t e n s e c r e t i n w i l l be a b b r e v i a t e d a s S. P a r t i a l s e q u e n c e s w i l l be named S ( n - m ) , i n w h i c h n a n d m i n d i c a t e t h e p l a c e o c c u p i e d i n s e c r e t i n b y c o r r e s p o n d i n g a m i n o - a c i d r e s i d u e s , i f H i s o c c u p i e s p o s i t i o n 1 a n d V a l p o s i t i o n 27 ( s e e F i g . 1 . 1 ) .
8
H H H H H H
1 His 1 His 1 His — 1 His 1 His 1 Tyr
Ala Ser Ser — Ser Ser Ala
Asp Asp Asp — Asp Gin Glu
Gty Ala Gly Gly Gly — Gly
Val — Val Thr Leu Thr Thr
Phe Phe Phe — Phe Phe Phe
Thr — Thr Thr Thr Thr He
* Asp Ser Ser Ser Ser
•
A s n Glu Glu Asp — Aspe Tyr Leu Tyr Tyr — — Tyr
•
Thr Ser Ser — Ser — Ser•
Arg Arg Lys Lys He•
Leu — Leu Met Tyr Ala•
Arg Arg — Arg Leu Met•
Lys Asp Gly Asp — Asp* Gin Ser Asn Ser Lys
« Met Ala A l a Arg Ile
•
Ala Arg Gin Arg Arg 31 Gly•
Val Leu Val Ala Gin Lys•
Lys Gin — Gin — Gin Gin Lys* Lys Arg Lys Asp Asp Ser
* Tyr Leu Phe — Phe — Phe Asp
•
Leu Leu He Val — Val Trp•
Asn Gin — Gin Gin A s n Lys•
Ser Gly Asn Trp — Trp HisLeu He Leu — Leu — Leu — Leu Asn
27 lie Leu 27 Val 27 Met — Met Leu He
N H2 28 A s n N H2 N H2 A s n Ala Thr
NH2 29 Thr Gin 42 Gin
OH 30 Lys OH
porcine porcine porcine chicken porcine porcine PHI VIP Secretin Secretin Glucagon GIP
F i g . 1.2 T h e s e q u e n c e s o f p o r c i n e V I P , p o r c i n e a n d c h i c k e n s e c r e t i n , p o r c i n e g l u c a g o n , a n d p o r c i n e G I P . T h e h o r i z o n t a l b a r s i n d i c a t e t h a t t h e same a m i n o a c i d r e s i d u e s a r e p r e s e n t i n t h a t p o s i t i o n i n n e i g h b o r i n g p e p t i d e s . T h e k n o w n a m i n o a c i d r e s i d u e s i n p o r c i n e P H I a r e a l s o s h o w n ( s e e c h a p t e r 1 . 3 ) .
O f c o u r s e , t h i s c l a s s i f i c a t i o n h a s no s h a r p b o u n d a r i e s . Some p r o d u c t s m i g h t b e s y n t h e s i z e d f o r s e v e r a l o f t h e r e a s o n s m e n t i o n e d o r m i g h t b e u s e d f o r v a r i o u s p u r p o s e s . A n u m b e r o f p e p t i d e s h a v e b e e n s y n t h e s i z e d b y d i f f e r e n t g r o u p s . T h e p h a r m a c o l o g i c a l p r o p e r t i e s , a l w a y s c o m p a r e d w i t h p u r e s e c r e t i n , w e r e s o m e t i m e s h a r d t o c o m p a r e . M e t h o d o l o g i c a l d i f f e r e n c e s i n t h e b i o a s s a y s u s e d c o u l d b e r e s p o n s i b l e f o r t h i s , a s w e l l a s d i f f e r e n t q u a l i t i e s o f t h e p r o d u c t s . I n T a b l e 1.3 a s u r v e y i s g i v e n o f s y n t h e t i c p e p t i d e s , t h a t a r e r e l a t e d t o s e c r e t i n . T h i s f i e l d h a s r e c e n t l y b e e n r e v i e w e d b y K b n i g e t a l . ( 2 7 ) .
T a b l e 1.3 S y n t h e t i c p e p t i d e s , r e l a t e d t o s e c r e t i n P e p t i d e B i o l o g i c a l p o t e n c y3 R e f e r e n c e s S ( 2 - 2 7 ) v a r i o u s f r a g m e n t s 0 r n1 2 , H » l 8 . 2 1 , _s A l a2] - S D - S e r ^ ] - S 8 - A s p3j - S A s p a r t o y l3] - S A s n3] - S G l n3] - S G l u3] - S A l a4] - S D - A l a4] - S P y r ( 3 ) A l a1] - S A l a4, V a l5] - S D - A l a4, V a l5] - S A l a5] - S T y r1, A l az, G l u ': >] - S P h e ^ . T r p ^ . L y s ^ J - S D — T r p ]-S T^ 38]-S1 0 G l nJ, T y ri u] - S G l u3, T y r j ° l - S A l a4, T y ri u] - S D - P h e6] - S C H A6] - S A l an] - S d e s a m i n o H i s ]-S N -X-S X: v a r i o u s c o m p o u n d s N - G l y - G l n - S Na- G l y - L y s - S Na- G l y - G l y - G l y - S [ 8 - X ] - S X: H i s1, S e r2, P h e6, A r g1 2>1 4»l i [ T y r M - S [ T y rb] - S N - T y r - S ox N - d e s a m i n o T y r - S Na- ( d e s a m i n o T y r - 6 - A l a ) - S [ X s p ^ ] - S ( 5 - 2 7 ) [ G l nyl - S ( 5 - 2 7 ) [ A s n l5] - S f 5 - 2 7 ) [ G l ny, A s ni ; >] - S ( 5 - 2 7 ) [ L y s ^ ] -S( 5 - 2 7 ) [ L y s2 1] - S ( 5 - 2 7 ) [ A s p9, L y s2 1] - S ( 5 - 2 7 ) l o w p o t e n c y , 1 l o w p o t e n c y b,e p o t e n t 5 0f c l o w p o t e n c y , 1 2b lb, 7d p o t e n tb'f, 0 . 1b 2b, 3 3 - 5 0d 2b, 1 0 0d 8b. 3 7b, 1 0 0d 8 8b p o t e n tb»f, 1 0b l lb 3 5b 6 5b, 1 0 0d p o t e n tb» f p o t e n tb»f ^ b p o t e n t p o t e n tb p o t e n tb p o t e n tb l gb, l o w p o t e n c yb 8 0b 2 5b p o t e n t ^ 8b 31 h 9b p o t e n t ^ 11 ' i n v a r i o u s c o m b i n a t i o n s 4b lb, p o t e n tb'd 2 6b, 8b 45 p o t e n tc> ^ » ^ c d f p o t e n t t-»a»L p o t e n tc> ^ ' ^ c A f p o t e n tc»a>1 1 2 , 2 8 2 7 , 2 9 - 3 4 , 3 9 , 9 2 3 5 27 27 1 2 . 3 7 16 3 8 , 3 9 1 6 . 3 8 3 8 . 3 9 3 3 , 3 8 , 3 9 1 7 , 3 8 , 3 9 17 1 6 , 3 3 , 8 4 27 27 2 7 , 3 9 16 16 17 40 40 40 4 0 1 7 , 2 7 27 27 27 41 36 36 36 42 9 9,44 9,27 9 43 14 29 29 29 29 106 106 a O n l y r e s u l t s o f i n v i v o e x p e r i m e n t s h a v e b e e n g i v e n . T h e p o t e n c y o f t h e p e p t i d e t o s t i m u l a t e t h e e x o c r i n e p a n c r e a t i c s e c r e t i o n w a s d e t e r m i n e d . T h i s p o t e n c y was c o m p a r e d w i t h t h a t o f s e c r e t i n . T h e b i o l o g i c a l p o t e n c y o f s e c r e t i n was a s s u m e d 1 0 0 . b E x p e r i m e n t s w i t h d o g s , c E x p e r i m e n t s w i t h G u i n e a p i g s . d E x p e r i m e n t s w i t h r a t s , e E x p e r i m e n t s w i t h c a t s , f N o n p a r a l l e l d o s e - r e s p o n s e c u r v e s o f p e p t i d e a n d s e c r e t i n , g P r o t r a c t e d a c t i v i t y i n c o m p a r i s o n w i t h s e c r e t i n .
2 S Y N T H E S I S OF S E C R E T I N BY THE R E P E T I T I V E E X C E S S MIXED ANHYDRIDE ( R E M A ) METHOD 2.1 INTRODUCTION S e c r e t i n h a s b e e n s y n t h e s i z e d b y V a n Z o n a n d B e y e r m a n ( 8 , 4 5 ) v i a t h e a l l - R E M A m e t h o d , a s s h o w n i n F i g . 2 . 1 a . C a t a l y t i c h y d r o g e n o l y s i s was u s e d t o r e m o v e a l l t h e p r o t e c t i n g g r o u p s i n one o p e r a t i o n a n d p u r i f i c a t i o n was e f f e c t e d b y i o n - e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y . R E M A - s y n t h e t i c s e c r e t i n p r o v e d t o be h i g h l y p o t e n t i n d o g , c a t , a n d r a t b l o a s s a y s f o r e x o c r i n e p a n c r e a t i c s e c r e t i o n . I n t h e s y n t h e s i s t h e f o l l o w i n g p r o b l e m s w e r e m e t : 1. S e v e r a l b y - p r o d u c t s w e r e f o r m e d , a c c o r d i n g t o t h e a m i n o a c i d c o m p o s i t i o n o f i n t e r m e d i a t e s , a f t e r a c i d i c h y d r o l y s i s . P r o b a b l y t h e s e b y - p r o d u c t s a r e " t e r m i n a t e d s e q u e n c e s " , a s a r e s u l t o f c o u p l i n g o f t h e s i d e - c h a i n p r o t e c t e d p e p t i d e s w i t h t h e u n d e s i r e d s i d e o f t h e m i x e d a n h y d r i d e , t h e s i d e o f t h e a u x i l i a r y a c i d ( F i g . 2 . 2 ) . T h e s e p r o d u c t s c o u l d be r e m o v e d d u r i n g t h e p u r i f i c a t i o n o f s e c r e t i n . 0 H R2 0 0 II I I II II R - C - N - C H - C - O H + R j - O - C - C l F i g . 2.2 The f o r m a t i o n o f t h e p e p t i d e b o n d ( ) a n d t h e c o u p l i n g w i t h t h e 0 H R2 0 a u x i l i a r y a c i d ( ) . 2. S e c r e t i n c o n t a i n s t h e s e q u e n c e - A s p - G l y - . I f s e c r e t i n i s s y n t h e s i z e d a s s h o w n i n F i g . 2 . 1 , t h e s e q u e n c e - A s p ( O B z l ) - G l y - o c c u r s i n t h e p r o t e c t e d 2 5 - , 2 6 - , a n d 2 7 - p e p t i d e . T h i s s e q u e n c e h a s a g r e a t t e n d e n c y t o f o r m r a p i d l y t h e
12
D e p r o t e c t i o n H2 P d / Cd TFA A m i n o a c i d Y i e l d d e r i v a t i v e ( % )c D e p r o t e c t i o n H B r / a c e t i c a c i d T F A H B r / a c e t i c a c i d A m i n o a c i d d e r i v a t i v e Y i e l d ( % )cz
H i s Z 94 HF B o c H i s T o s 89 B o c S e r B z l 96 B o c S e r B z l 96 B o c A s p B z l 97 B o c A s p B z l 96 B o c G l y 95 B o c G l y 93 B o c T h r B z l 97 B o c T h r B z l 94 B o c P h e 9 5 B o c P h e 91 B o c T h r B z l 1 0 0 B o c T h r B z l 100 B o c S e r B z l 97 B o c S e r B z l 100 B o c G l u B z l 100 B o c G l u B z l 9 8 B o c L e u 99 B o c L e u 98 B o c S e r B z l 96 B o c S e r B z l 98 B o c A r g N 02 97 B o c A r g N 02 98 B o c L e u 93 T F A B o c L e u 95 B o c A r g N 02 99 B o c A r g N 02 99 B o c A s p B z l 85 B o c A s p B z l 99 B o c S e r B z l 89 B o c S e r B z l 84 Z A l a 93 B o c A l a 96 Z A r g N 02 94 B o c A r g N 02 84z
L e u 87 B o c L e u 95z
G i n 98 B o c G i n 83z
A r g NO2
93 B o c A r g N 02 95z
L e u 91 B o c L e u 94z
L e u 89 B o c L e u 5 8ez
G i n 98 B o c G i n 92 B o c G l y 97 B o c G l y 98 Z L e u 96 Z L e u 99z
V a l N H2 90 2 2f H B r / a c e t i c a c i d Z V a l N H2 95 1 3f F i g . 2.1 T h e s y n t h e s e s o f s e c r e t i n b y t h e REMA m e t h o d a S y n t h e s i s a c c o r d i n g t o V a n Z o n a n d B e y e r m a n ( 8 , 4 5 ) . b M o d i f i e d s y n t h e s i s . c C a l c u l a t e d o n p r e c e d i n g p r o t e c t e d p e p t i d e . d R e a c t i o n t i m e : 4 0 h ; s o l v e n t : 8 0 % a q u e o u s a c e t i c a c i d . e D u r i n g t h e c o u p l i n g o f B o c - L e u t o t h e u n p r o t e c t e d t e t r a p e p t i d e p r o b a b l y < G l u - G l y - L e u - V a l - N H2 h a d b e e n f o r m e d . T h i s was r e m o v e d d u r i n g w o r k i n g u p . I f t h i s s t e p i s i g n o r e d , t h e y i e l d o f c r u d e p r o t e c t e d s e c r e t i n i s 2 3 % . I n a n i n d e p e n d e n t s y n t h e s i s o f p r o t e c t e d S ( 2 2 - 2 7 ) - N H2 t h e c o u p l i n g s o f B o c - G l n a n d B o c - L e u w e r e p e r f o r m e d w i t h y i e l d s o f 9 7 % . f O v e r a l l y i e l d , c a l c u l a t e d o n t h e a s s u m p t i o n t h a t a l l p r o d u c t s w e r e p u r e , b a s e d o n Z - V a l .s e q u e n c e - a s p a r t o y l - G l y - , b o t h u n d e r a c i d i c a n d b a s i c c o n d i t i o n s ( 4 5 - 5 0 ) . S u c h a s e q u e n c e c a n f a l l a p a r t i n t o a m i x t u r e o f - B - A s p - G l y - a n d - a - A s p - G l y - ( F i g . 2 . 3 ) . S e v e r a l i n v e s t i g a t o r s who u s e d o t h e r c o u p l i n g m e t h o d s t h a n t h e REMA m e t h o d , w e r e n o t a b l e t o o b t a i n s e c r e t i n o r a n a l o g u e s t h e r e o f , b e c a u s e o f d i f f i c u l t i e s i n t h e l a s t s t a g e o f t h e s y n t h e s i s . o xC - 0 R H Ç H2 - N - C H 0 SC N C H C -II i 2 0 H 9H H C H A - N - C H \ 0 SC N C H C -Ô H H ?H2 \ • N - C H I N - C H . O H 0 ^ C N C H C -H Ç -H? - N - C H XC - 0 H Ô 3 - A s p - p e p t i d e 0 ^ C - OH H C H2 - N - C H H 0 NC - N - C HfC
-6
a - A s p - p e p t i d e F i g . 2.3 T h e A s p ( a + 8 ) - G l y - r e a r r a n g e m e n t i n p e p t i d e s . V a n Z o n f o u n d , i n e x p e r i m e n t s w i t h m o d e l p e p t i d e s ( 4 5 ) , t h a t i t w a s p o s s i b l e t o p r e v e n t t h e f o r m a t i o n o f [ a s p a r t o y l ] - p e p t i d e s w h e n t h e REMA m e t h o d w a s u s e d . I t w a s n o t p o s s i b l e , h o w e v e r , t o f o l l o w t h i s r e a c t i o n d i r e c t l y d u r i n g t h e s y n t h e s i s o f s e c r e t i n . O n l y a f t e r d e p r o t e c t i o n o f t h e p r o t e c t e d p e p t i d e c o u l d t h e p o s s i b l e f o r m a t i o n o f [ a s p a r t o y l ] - p e p t i d e d u r i n g t h e s y n t h e s i s b e d e t e r m i n e d , b y a m i n o a c i d a n a l y s i s a f t e r e n z y m i c h y d r o l y s i s b y l e u c i n e a m i n o -p e -p t i d a s e ( L A P ) . 3. T h e r e m o v a l o f t h e p r o t e c t i n g g r o u p s b y c a t a l y t i c h y d r o g e n o l y s i s s o m e t i m e s g a v e r i s e t o s e r i o u s p r o b l e m s . I n o r d e r t o b e s u r e t h a t a l l p r o t e c t i n g g r o u p s h a d b e e n r e m o v e d , t h e p e p t i d e m a t e r i a l h a d t o b e e x p o s e d t o t h e c o n d i t i o n s u s e d f o r a r a t h e r l o n g t i m e ( 2 4 - 4 8 h ) . O c c a s i o n a l l y , t h e P h e ^ - r e s i d u e w a s f o u n d t o b e h y d r o g e n a t e d , a n d a c y c l o h e x y l a l a n i n e ( C H A ) - r e s l d u e h a d b e e n f o r m e d ( u p t o 5 0 % C H A ) . T h i s p h e n o m e n o n was n o t r e p r o d u c i b l e . T h e [ C H A ^ ] -p e -p t i d e c o u l d n o t b e s e -p a r a t e d f r o m t h e [ P h e ^ ] - -p e -p t i d e .14 A n o t h e r s i d e r e a c t i o n d u r i n g t h e f i n a l h y d r o g e n o l y s i s was t h e f o r m a t i o n o f a c o n s i d e r a b l e a m o u n t o f o r n i t h i n e ( O r n ) - r e s i d u e s f r o m A r g C N C ^ - r e s i d u e s . T h e b y - p r o d u c t s t h u s f o r m e d c o u l d be s e p a r a t e d f r o m t h e d e s i r e d p e p t i d e i n t h e f i n a l p u r i f i c a t i o n . V a n Z o n m o n i t o r e d t h e s y n t h e s i s o f s e c r e t i n b y t h i n - l a y e r c h r o m a t o g r a p h y ( T L C ) a n d a m i n o a c i d a n a l y s i s a f t e r a c i d i c h y d r o l y s i s . F u r t h e r m o r e , i n h i s s y n t h e s i s t h e p r o t e c t i n g g r o u p s w e r e c h o s e n i n p a r t s o a s t o a l l o w c o m p a r i s o n o f t h e p h y s i c a l c o n s t a n t s o f t h e i n t e r m e d i a t e p r o d u c t s w i t h t h o s e r e p o r t e d i n t h e l i t e r a t u r e . F o r s e q u e n c e s l o n g e r t h a n a b o u t 10 a m i n o a c i d r e s i d u e s o n l y t h e a m i n o a c i d a n a l y s i s g i v e s v a l u a b l e i n f o r m a t i o n . I t was t h e r e f o r e d e s i r a b l e t o u s e a b e t t e r a n a l y t i c a l t e c h n i q u e f o r m o n i t o r i n g t h e s y n t h e s i s . T h i s b e c a m e p o s s i b l e a f t e r t h e d e v e l o p m e n t o f h i g h - p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ( H P L C ) s y s t e m s . B e s i d e s b y h y d r o g e n o l y s i s , p r o t e c t e d s e c r e t i n c a n a l s o be d e p r o t e c t e d b y a c i d o l y s i s , e . g . i n l i q u i d h y d r o g e n f l u o r i d e ( H F ) . H e m m a s i a n d B a y e r u s e d H F / a n i s o l e f o r t h e d e p r o t e c t i o n o f p r o t e c t e d s e c r e t i n . A f t e r p u r i f i c a t i o n b y i o n - e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y , t h e y o b t a i n e d b i o l o g i c a l l y f u l l y p o t e n t s e c r e t i n ( 1 0 ) . G u i d u c c i d e p r o t e c t e d p r o t e c t e d s e c r e t i n i n a s i m i l a r way ( 5 1 ) . T h e s e i n v e s t i g a t o r s d i d n o t m e n t i o n s i d e r e a c t i o n s . W r i g h t s t u d i e d t h e b e h a v i o u r o f p r o t e c t e d s e c r e t i n s e q u e n c e s i n HF ( 3 0 ) . He f o u n d t h a t a f u l l y a c t i v e m o l e c u l e was o b t a i n e d a f t e r a s h o r t r e a c t i o n t i m e ( 3 0 m i n ) , w h i l e s e v e r a l b y - p r o d u c t s h a d b e e n f o r m e d a f t e r l o n g e r p e r i o d s . I n a l l o f t h e e x a m p l e s m e n t i o n e d h e r e s e c r e t i n was s y n t h e s i z e d o n a s o l i d s u p p o r t . S e v e r a l s i d e r e a c t i o n s a r e k n o w n t o o c c u r a s a r e s u l t o f t h e t r e a t m e n t o f p e p t i d e s w i t h HF. The m o s t c o n s p l c i o u s r e a c t i o n i s t h e f o r m a t i o n o f [ a s p a r t o y l ] - p e p t i d e s f r o m p r o t e c t e d s e q u e n c e s w i t h A s p - r e s i d u e s ( F i g . 2 . 3 ) . E s p e c i a l l y t h e s e q u e n c e - A s p ( 0 B z l ) - G l y - c a n u n d e r g o t h i s r e a c t i o n . Y a n g a n d M e r r i f i e l d ( 4 7 ) f o u n d t h a t a p e p t i d e w i t h t h i s s e q u e n c e c o u l d g i v e up t o 9 9 % o f [ a s p a r t o y l ] - p e p t i d e . The o c c u r r e n c e o f t h i s r e a c t i o n g r e a t l y d e p e n d s o n t h e n e i g h b o r i n g r e s i d u e s i n t h e p e p t i d e s e q u e n c e . A l s o t h e s e q u e n c e - A s p ( O B z l ) - S e r ( B z l ) - , p r e s e n t i n p r o t e c t e d s e c r e t i n i n V a n Z o n ' s a p p r o a c h , c a n g i v e a c o n s i d e r a b l e a m o u n t o f a [ a s p a r t o y l ] - p e p t i d e . We i n v e s t i g a t e d w h e t h e r t h e d e p r o t e c t i o n o f p r o t e c t e d s e c r e t i n b y HF i s a s u i t a b l e a l t e r n a t i v e f o r t h e h y d r o g e n o l y s i s .
T h e f i n a l p u r i f i c a t i o n o f s e c r e t i n h a s b e e n p e r f o r m e d i n t h r e e w a y s : 1. C o u n t e r c u r r e n t d i s t r i b u t i o n , i n t h e s y s t e m 1 - b u t a n o l / f o s f a t e b u f f e r , pH 7.0 ( 1 : 1 ) ( 4 , 5 ) . 2. I o n - e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y w i t h d i l u t e N H i H C O j - b u f f e r s ( 6 - 1 0 ) . 3. G e l f i l t r a t i o n o n S e p h a d e x L H - 2 0 w i t h d i l u t e h y d r o c h l o r i c a c i d ( 5 3 ) . Some o t h e r m e t h o d s o f p u r i f i c a t i o n c a u s e d a c o n s i d e r a b l e l o s s o f b i o l o g i c a l p o t e n c y ( 4 , 5 3 ) . HPLC l o o k e d a p r o m i s i n g m e t h o d f o r t h e f i n a l p u r i f i c a t i o n o f s e c r e t i n . S e v e r a l o t h e r p e p t i d e s h a d a l r e a d y b e e n s u c c e s s f u l l y p u r i f i e d b y HPLC ( 5 4 , 5 5 ) . We s t u d i e d t h e p o s s i b i l i t y o f p u r i f y i n g s e c r e t i n by H P L C . B e f o r e t h e s y n t h e s i s o f a p e p t i d e c a n be c o n s i d e r e d a s s u c c e s s f u l , i t i s n e c e s s a r y t o h a v e o b s e r v e d a s a t i s f a c t o r y b i o l o g i c a l a n d i m m u n o l o g i c a l p o t e n c y , i n a d d i t i o n t o c h r o m a t o g r a p h i c h o m o g e n e i t y i n v a r i o u s s y s t e m s a n d a c o r r e c t a m i n o a c i d c o m p o s i t i o n a f t e r a c i d i c a n d e n z y m i c h y d r o l y s i s . T h e d e t e r m i n a t i o n o f t h e b i o l o g i c a l p o t e n c y o f s e c r e t i n was o f t e n t r o u b l e s o m e . T h i s was m a i n l y c a u s e d b y t h e r a p i d l o s s o f t h e b i o l o g i c a l p o t e n c y o f s e c r e t i n i n d i l u t e a q u e o u s s o l u t i o n s . T h i s p h e n o m e n o n w i l l be d i s c u s s e d e x t e n s i v e l y i n c h a p t e r 3. I n m o s t c a s e s t h e p o t e n c y o f t h e u n k n o w n s a m p l e s t o s t i m u l a t e t h e e x o c r i n e p a n c r e a t i c a c t i v i t y i n a n i m a l s i s c o m p a r e d w i t h t h e p o t e n c y o f a k n o w n s a m p l e , w h i c h h a d b e e n c o m p a r e d w i t h p u r e n a t u r a l s e c r e t i n . S e v e r a l a n i m a l s p e c i e s , e . g . f e r r e t s , G u i n e a p i g s , d o g s , c a t s , a n d r a t s , a r e u s e d i n t h e b i o a s s a y s . B e s i d e s t h e s t i m u l a t i o n o f t h e p a n c r e a t i c s e c r e t i o n o t h e r b i o l o g i c a l a c t i v i t i e s ( T a b l e 1.2) o f s e c r e t i n c a n a l s o be u s e d i n b i o a s s a y s . I t i s p o s s i b l e t o d e t e r m i n e t h e i m m u n o l o g i c a l p o t e n c y o f s e c r e t i n . A t f i r s t t h e s y n t h e s i s o f r a d i o a c t i v e l y l a b e l e d s e c r e t i n , w h i c h i s u s e d i n t h e r a d i o i m m u n o a s s a y ( R I A ) , g a v e p r o b l e m s . T h i s was c a u s e d b y t h e f a c t t h a t s e c r e t i n c o n t a i n s no T y r - r e s i d u e , i n w h i c h a ^ •2- ' l - a t o m c a n e a s i l y b e i n c o r p o r a t e d . I n s e c r e t i n t h e H i s - r e s i d u e h a s t o be i o d i n a t e d . S e v e r a l i n v e s t i g a t o r s h a v e s o l v e d t h i s p r o b l e m a n d h a v e d e v e l o p e d a R I A ( s e e f o r a r e c e n t r e v i e w r e f . 5 7 ) . The i m m u n o l o g i c a l p o t e n c y o f t h e u n k n o w n s a m p l e i s c o m p a r e d w i t h t h a t o f p u r e s e c r e t i n .
2.2 E X P E R I M E N T S AND R E S U L T S Some m i n o r t a c t i c a l c h a n g e s w e r e i n t r o d u c e d i n t h e a l l - R E M A s y n t h e s i s o f s e c r e t i n , c o m p a r e d w i t h t h e o r i g i n a l s y n t h e s i s o f V a n Z o n a n d B e y e r m a n ( 8 , 4 5 ) , a s s h o w n i n F i g . 2 . 1 . A l s o some new t e c h n i q u e s f o r a n a l y s i s a n d p u r i f i c a t i o n o f p r o d u c t s w e r e d e v e l o p e d . The p o i n t s m e n t i o n e d w i l l b e d i s c u s s e d c o n s e c u t i v e l y i n d e t a i l : 2.2.1 S Y N T H E S I S OF PROTECTED S E C R E T I N ( 1 ) P r o t e c t e d s e c r e t i n was s y n t h e s i z e d a s s h o w n i n F i g . 2 . 1 b . The f o l l o w i n g c h a n g e s w e r e made i n t h e c h o i c e o f p r o t e c t i n g g r o u p s , c o m p a r e d w i t h t h e s y n t h e s i s o f V a n Z o n a n d B e y e r m a n ( 8 , 4 5 ) : 1. S t a r t i n g w i t h L e u - V a l - N ^ , t h e p r o t e c t e d 2 7 - p e p t i d e was a s s e m b l e d b y u s i n g a m i n o a c i d d e r i v a t i v e s w i t h t h e t - b u t y l o x y c a r b o n y l ( B o c ) g r o u p a s N - p r o t e c t i o n e x c l u s i v e l y , i n o r d e r t o s i m p l i f y t h e p r o c e d u r e , a 2 . The N - t e r m l n a l H i s was c o u p l e d a s B o c - H i s ( T o s ) , b e c a u s e o f t h e b e t t e r s t a b i l i t y a n d a c c e s s i b i l i t y a s c o m p a r e d w i t h t h e Z - H i s ( Z ) u s e d f i r s t . B e y e r m a n e t a l . h a d f o u n d t h a t b o t h d e r i v a t i v e s c o u l d be c o u p l e d a s m i x e d a n h y d r i d e s w i t h o u t c o m p l i c a t i o n s ( 5 6 ) .
The s y n t h e s i s o f 1 was u n e v e n t f u l . The y i e l d s t h a t w e r e o b t a i n e d w e r e g e n e r a l l y h i g h ( F i g . 2 . 1 ) . T h e a m i n o a c i d c o m p o s i t i o n o f t h i s p r o d u c t i s g i v e n i n T a b l e 2 . 1 .
2.2.2 HIGH-PERFORMANCE L I Q U I D CHROMATOGRAPHY ( H P L C ) I N THE S Y N T H E S I S OF PROTECTED S E C R E T I N The s y n t h e s i s o f p r o t e c t e d s e c r e t i n was m o n i t o r e d b y r e v e r s e - p h a s e H P L C ( 9 4 ) . M e t h a n o l / w a t e r m i x t u r e s w e r e u s e d a s t h e e l u e n t s a n d o c t a d e c y l s i l y l - s i l i c a was u s e d a s t h e s t a t i o n a r y p h a s e . P e p t i d e s c o n t a i n i n g t h e s e q u e n c e A s p ( O B z l ) G l y -w e r e c h r o m a t o g r a p h e d -w i t h e l u e n t s t o -w h i c h 1% o f a c e t i c a c i d h a d b e e n a d d e d , b e c a u s e o f t h e g r e a t t e n d e n c y o f s u c h p e p t i d e s t o u n d e r g o a n A s p3( a+ 6 ) -r e a -r -r a n g e m e n t i n m e t h a n o l / w a t e -r m i x t u -r e s . T h i s -r e a c t i o n d i d n o t o c c u -r w h e n a c e t i c a c i d h a d b e e n a d d e d , w h i c h d i d n o t a p p r e c i a b l y c h a n g e t h e c h r o m a t o g r a p h i c b e h a v i o u r . F i g . 2.4 s h o w s t h e c h r o m a t o g r a m s o f p r o t e c t e d s e c r e t i n a n d o f r e a r r a n g e d p r o t e c t e d s e c r e t i n . I n p a r t i c u l a r t h e p o s s i b i l i t y t o m o n i t o r t h i s A s p3( a+B ) - r e a r r a n g e m e n t was a n i m p r o v e m e n t i n t h e s y n t h e s i s o f s e c r e t i n . T h i s made i t p o s s i b l e t o s y n t h e s i z e [ a s p a r t o y l3] - s e c r e t i n , a s w i l l be d e s c r i b e d i n c h a p t e r 5.
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30 tr(min) tr(min) F i g . 2.4 C h r o m a t o g r a m s o f p r o t e c t e d s e c r e t i n a n d p r o t e c t e d [ a s p a r t o y l ] -s e c r e t i n . P r o t e c t e d s e c r e t i n (_1_) w a s d i s s o l v e d i n DMF ( 1 mg/ml; A ) . NMM w a s a d d e d ( 1 0 p l / m l , p H = 9 ) . T h i s s o l u t i o n was s t o r e d f o r 3 0 m i n a t a m b i e n t t e m p e r a t u r e a n d a n a l y s e d ( B ) . C o l u m n : P o l y g o s i l C 1 8 , 10 |m ( 3 0 x 0.4 cm I . D . ) ; e l u e n t : m e t h a n o l / w a t e r / a c e t i c a c i d 9 3 : 7 : 1 ; U V - d e t e c t i o n a t 2 6 0 nm. O 5 10 15 20 , 0 5 10 15 20 » tr(min) tr(min) F i g . 2.5 C h r o m a t o g r a m s o f s e c r e t i n . I , I I : c r u d e u n p r o t e c t e d s e c r e t i n ( 2 ) . I l l , I V : p u r i f i e d s e c r e t i n ( 3 ) . C o l u m n : P o l y g o s i l C 1 8 , 10 pm ( 3 0 x 0.4 cm I . D . ) ; e l u e n t : m e t h a n o l / w a t e r / T F A 6 4 : 3 6 : 0 . 1 ( I , I I I ) , m e t h a n o l / w a t e r 8 2 : 1 8 w i t h 0 . 0 0 5 M p e r f l u o r o o c t a n o i c a c i d ( I I , I V ) ; U V - d e t e c t i o n a t 2 0 5 nm ( I , I I I ) o r 2 1 5 nm ( I I , I V ) .
18
2 . 2 . 3 D E P R O T E C T I O N OF PROTECTED S E C R E T I N BY A C I D O L Y S I S WITH L I Q U I D HYDROGEN F L U O R I D E P r e l i m i n a r y e x p e r i m e n t s s h o w e d t h a t s e c r e t i n , o b t a i n e d a f t e r d e p r o t e c t i o n o f c r u d e p r o t e c t e d s e c r e t i n , s y n t h e s i z e d a s s h o w n i n F i g . 2 . 1 a , h a d a b o u t t h e same b i o l o g i c a l p o t e n c y a f t e r d e p r o t e c t i o n e i t h e r b y c a t a l y t i c h y d r o g e n o l y s i s o r b y a c i d o l y s i s w i t h H F / a n i s o l e . A m i n o a c i d a n a l y s i s , a f t e r e n z y m i c h y d r o l y s i s w i t h L A P , s h o w e d t h a t no [ a s p a r t o y l ] - s e c r e t i n h a d b e e n f o r m e d a f t e r d e p r o t e c t i o n b y e i t h e r m e t h o d . P r o t e c t e d s e c r e t i n (J_) was t r e a t e d w i t h l i q u i d HF t o w h i c h 1 0 % a n i s o l e h a d b e e n a d d e d a s a n c a t i o n s c a v e n g e r . T h e c r u d e s e c r e t i n ( 2 ) t h u s o b t a i n e d p o s s e s s e d t h e same a m i n o a c i d c o m p o s i t i o n a f t e r b o t h a c i d i c a n d e n z y m i c o h y d r o l y s i s ( T a b l e 2 . 1 ) . C o n s e q u e n t l y , n o [ a s p a r t o y l ] - s e c r e t i n h a d b e e n f o r m e d . T h i s was c o n f i r m e d b y H P L C a n a l y s i s , a s d e s c r i b e d i n 2 . 2 . 4 . T h e f o r m a t i o n o f o r n i t h i n e - r e s i d u e s h a d a l s o b e e n r e d u c e d , c o m p a r e d w i t h t h e f o r m a t i o n d u r i n g t h e d e p r o t e c t i o n b y c a t a l y t i c h y d r o g e n o l y s i s . 2.2.4 A N A L Y S I S OF S E C R E T I N BY H P L C I t p r o v e d t o be p o s s i b l e t o a n a l y s e n o t o n l y p r o t e c t e d p e p t i d e s , b u t a l s o u n p r o t e c t e d p e p t i d e s b y r e v e r s e - p h a s e H P L C . C h r o m a t o g r a p h y w i t h m e t h a n o l / w a t e r m i x t u r e s , t o w h i c h p e r f l u o r o a l k a n o i c a c i d s h a d b e e n a d d e d ( l y p o p h i l i c i o n -i n t e r a c t -i o n c h r o m a t o g r a p h y ) g a v e e x c e l l e n t r e s u l t s o n o c t a d e c y l s l l y l - s -i l -i c a a s t h e s t a t i o n a r y p h a s e ( 9 5 - 9 7 ) . T a b l e 2.2 s h o w s t h e k ' - v a l u e s o f s e c r e t i n i n t h e s y s t e m s t h a t w e r e r o u t i n e l y u s e d f o r a n a l y s i s . The p r o d u c t s o f a n A s p ( a - * - 8 ) - r e a r r a n g m e n t i n s e c r e t i n , [ B - A s p ] - s e c r e t i n a n d [ a s p a r t o y l ] - s e c r e t i n c o u l d b e s e p a r a t e d i n o n e o f t h e s e s y s t e m s ( 9 6 ) . T h i s w i l l be d i s c u s s e d i n c h a p t e r 5 . C h r o m a t o g r a m s o f 2_ a r e s h o w n i n F i g . 2 . 5 . 2.2.5 P U R I F I C A T I O N OF S E C R E T I N C r u d e s e c r e t i n ( 2 ) was p u r i f i e d b y i o n - e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y o n S P - S e p h a d e x C - 2 5 , a s d e s c r i b e d b y V a n Z o n ( 4 5 ) . T h e c h r o m a t o g r a m o b t a i n e d i s s h o w n i n F i g . 2 . 6 . F r a c t i o n _3_ w a s a n a l y s e d a n d a p p e a r e d t o b e o f g o o d q u a l i t y , a c c o r d i n g t o T L C (> 9 5 % , s y s t e m B ) , HPLC ( F i g . 2 . 5 ) , a n d a m i n o a c i d a n a l y s i s a f t e r A c c o r d i n g t o a s s a y s w i t h t h e a n a e s t h e t i z e d f e r r e t ( e x o c r i n e p a n c r e a t i c r e s p o n s e ) , p e r f o r m e d b y P r o f e s s o r T. S c r a t c h e r d , S h e f f i e l d , E n g l a n d .
0O5 M 250 500 750 1000 , V(ml) F i g . 2.6 T h e p u r i f i c a t i o n o f s e c r e t i n b y i o n - e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y . C o l u m n : S P - S e p h a d e x C-25 ( 5 0 x 0.9 cm I . D . ) ; e l u e n t : N H4H C 03- b u f f e r s ; U V - d e t e c t i o n a t 2 0 6 nm; f l o w r a t e : 15 m l / h . C r u d e s e c r e t i n ( 1 0 0 m g ) , d i s s o l v e d i n 5 m l o f w a t e r w a s p u r i f i e d a t a m b i e n t t e m p e r a t u r e . T h e h a t c h e d a r e a c o r r e s p o n d s t o t h e m a i n f r a c t i o n ( 3 ) , t h e a n a l y s e s o f w h i c h h a v e b e e n g i v e n i n t h e t e x t .
L i
10 15 20 25 10 15 20 25 10 15 20 25 tr(min) ymln) t r(min) F i g . 2.7 T h e p u r i f i c a t i o n o f s e c r e t i n b y H P L C . I : c r u d e s e c r e t i n ( 4 ) . I I : c h r o m a t o g r a m o f t h e p u r i f i c a t i o n o f _4_. I l l : p u r i f i e d s e c r e t i n ( J 5 ) . C o l u m n : P o l y g o s i l C 1 8 , 10 i m ( 3 0 x 0.4 cm I.D.) ( I , I I I ) , L i C h r o s o r b R P - 1 8 , 10 um ( 3 0 x 0.4 cm I.D.) ( I I ) ; e l u e n t : m e t h a n o l / w a t e r / T F A 6 4 : 3 6 : 0 . 1 ( I , I I I ) , m e t h a n o l / w a t e r / T F A 6 7 : 3 3 : 0 . 5 ( I I ) ; U V - d e t e c t i o n a t 2 0 5 nm ( I , I I I ) o r 2 3 0 nm ( I I ) .T a b l e 2.1 A m i n o a c i d a n a l y s e s o f s e c r e t i n 2 ? 2s 2.a ^ 2a i f Za T h e o r y b b c b c b b b b A s p 1.69 1.67 1.66 2.03 1.94 1.83 1.98 1.79 1.93 2 T h r 1.15 1.49 1.88 1.48 1.77 1.54 1.76 2 S e r 1.66 3.14 3.49 2.90 3.32 2.99 3.32 4 G l u 2.92 3.00 1.03 3.00 1.03 2.92 3.02 2.99 3.04 3 ( ld) G l y 1.82 1.79 1.82 1.97 1.94 1.74 1.84 1.83 1.97 2 A l a 1.12 1.08 1.13 1.04 1.00 1.07 1.12 1.09 1.10 1 V a l 1.00 0.94 1.08 0.99 1.00 1.03 1.01 1.05 1.00 1 L e u 6.05 6.11 5.81 6.05 6.05 6.00 6.20 5.87 5.98 6 P h e 0.81 0.81 0.78 0.98 0.99 0.82 0.88 0.86 0.98 1 H i s 0.79 0.94 1.03 0.96 0.93 1.72 0.82 0.73 0.89 1 A r g + O r n 3.91 3.87 3.93 3.99 4.05 3.97 3.95 4.00 4.00 4 a S e e t e x t . b A c i d i c h y d r o l y s i s ( 6 M HC1, 24 h , 110 ° C ) . G i n was d e t e r m i n e d a s G l u . c E n z y m i c h y d r o l y s i s ( L A P , 24 h , 37 ° C ) . T h r , S e r , a n d G i n c o u l d n o t be d e t e r m i n e d . d G l u = 1; G i n = 2. T a b l e 2.2 C h r o m a t o g r a p h i c d a t a o f s e c r e t i n3 I o n - i n t e r a c t i o n r e a g e n t E l u e n t k' b m e t h a n o l / w a t e r 0.1% TFA 6 4 : 3 6 3.6 0 . 0 0 5 M p e r f l u o r o o c t a n o i c a c i d 8 2 : 18 3.2 a C o l u m n : P o l y g o s i l C 1 8 , 10 im ( 3 0 X 0.4 cm I . D . ) ; t e m p e r a t u r e : 30 ° C . b k' = <Vp e p t i d e - Vwater) / Vwater.
a c i d i c a n d e n z y m i c h y d r o l y s i s ( L A P ) ( T a b l e 2 . 1 ) . T h i s p r o d u c t was h i g h l y p o t e n t i n a b i o a s s a y w i t h t h e r a t ( T a b l e 2 . 3 ) . The o t h e r f r a c t i o n s o b t a i n e d d u r i n g t h e p u r i f i c a t i o n w e r e o f s o m e w h a t l e s s q u a l i t y ( T L C , H P L C , a m i n o a c i d a n a l y s i s ) . One o f t h e s e f r a c t i o n s h a d a v e r y s i m i l a r i m m u n o l o g i c a l b e h a v i o u r a s n a t u r a l s e c r e t i n ( F i g . 2 . 8 ) . C r u d e s e c r e t i n ( 4 ) , o b t a i n e d a f t e r H F / a n i s o l e t r e a t m e n t o f p r o t e c t e d s e c r e t i n , s y n t h e s i z e d a s s h o w n i n F i g . 2 . 1 a , was p u r i f i e d b y HPLC o n m g - s c a l e ( F i g . 2 . 7 ) . The p u r i f i e d s e c r e t i n ( 5 ) was p r a c t i c a l l y p u r e a c c o r d i n g t o TLC ( s y s t e m A, B) a n d HPLC ( F i g . 2 . 7 ) . The a m i n o a c i d c o m p o s i t i o n o f 4_ a n d 5_, a f t e r a c i d i c h y d r o l y s i s , i s g i v e n i n T a b l e 2 . 1 . T h e b i o l o g i c a l p o t e n c y o f _5, d e t e r m i n e d w i t h t h e a n a e s t h e t i z e d f e r r e t , i s s h o w n i n T a b l e 2 . 3 . A s e c r e t i n s a m p l e , o b t a i n e d a f t e r i o n - e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y o f c r u d e s e c r e t i n , was p u r i f i e d a n a l o g o u s l y , w h i c h a l s o y i e l d e d a p r o d u c t ( 7 ) w i t h a h i g h b i o l o g i c a l p o t e n c y ( T a b l e 2 . 3 ) . The a m i n o a c i d c o m p o s i t i o n o f t h e p r o d u c t b e f o r e (6_) a n d a f t e r ( 7 ) t h e HPLC p u r i f i c a t i o n i s g i v e n i n T a b l e 2 . 1 . T a b l e 2.3 R e l a t i v e b i o l o g i c a l p o t e n c y o f s e c r e t i n S e c r e t i n B i o l o g i c a l p o t e n c y ( % )a> A n i m a l nc ra' 2 98 ± 8 5_ 112 ± 10 7 95 ± 8 r a t 6 1 f e r r e t 1 5 f e r r e t 1 5 a S e e t e x t ( c h a p t e r 2.2.6 a n d 2 . 3 . 8 ) . The b i o l o g i c a l p o t e n c y o f p u r e s e c r e t i n was a s s u m e d t o be 1 0 0 % . A f t e r c o r r e c t i o n f o r p e p t i d e c o n t e n t , c N u m b e r o f a n i m a l s u s e d i n a n a s s a y . d N u m b e r o f a s s a y s p e r d o s e i n o n e a n i m a l . O n l y o n e d o s e was a d m i n i s t e r e d . 2.2.6 D E T E R M I N A T I O N OF THE B I O L O G I C A L POTENCY OF S E C R E T I N S e c r e t i n was a s s a y e d i n d e p e n d e n t l y b y two g r o u p s : 1. P r o f e s s o r T. S c r a t c h e r d e t a l . , D e p a r t m e n t o f P h y s i o l o g y , U n i v e r s i t y o f S h e f f i e l d , S h e f f i e l d , E n g l a n d d e t e r m i n e d t h e b i o l o g i c a l p o t e n c y w i t h t h e a n a e s t h e t i z e d f e r r e t . 2. P r o f e s s o r M . I . G r o s s m a n e t a l . , V e t e r a n s A d m i n i s t r a t i o n , C e n t e r f o r U l c e r R e s e a r c h a n d E d u c a t i o n ( C U R E ) , L o s A n g e l e s , CA, USA, d e t e r m i n e d t h e b i o l o g i c a l p o t e n c y w i t h t h e a n a e s t h e t i z e d r a t .
22 B o t h g r o u p s d e t e r m i n e d t h e p o t e n c y o f t h e s e c r e t i n s a m p l e t o s t i m u l a t e e x o c r i n e p a n c r e a t i c s e c r e t i o n . P o t e n c y o f t h e u n k n o w n s a m p l e was a l w a y s c o m p a r e d w i t h t h a t o f a k n o w n s a m p l e . T h e t w o g r o u p s w o r k e d d i f f e r e n t l y : 1. S c r a t c h e r d a n d H u t s o n g e n e r a l l y u s e d o n e a n i m a l ; o c c a s i o n a l l y t w o f e r r e t s w e r e u s e d . I n t h i s a n i m a l a q u a n t i t y o f t h e u n k n o w n s a m p l e a n d a k n o w n s a m p l e w e r e i n j e c t e d a l t e r n a t e l y . A f t e r e a c h i n j e c t i o n t h e p a n c r e a t i c s e c r e t i o n w a s c o l l e c t e d f o r 10 m i n u t e s a n d w e i g h e d . E q u i v a l e n c e b e t w e e n u n k n o w n a n d s t a n d a r d was e s t a b l i s h e d w h e n i n t r a v e n o u s i n j e c t i o n o f b o t h g a v e i d e n t i c a l o r n e a r l y i d e n t i c a l r e s p o n s e s . 2 . G r o s s m a n a n d S o l o m o n u s e d a l a r g e r n u m b e r o f a n i m a l s ( g e n e r a l l y 6 r a t s ) . I n e a c h a n i m a l t h e p a n c r e a t i c s e c r e t i o n was c o l l e c t e d a n d m e a s u r e d ( 1 5 m i n p e r i o d s ) a f t e r i n j e c t i o n o f t h e u n k n o w n s a m p l e a n d a k n o w n s a m p l e .
2.2.7 D E T E R M I N A T I O N OF THE IMMUNOLOGICAL POTENCY OF S E C R E T I N
T h e i m m u n o l o g i c a l p o t e n c y o f s e c r e t i n was d e t e r m i n e d b y P r o f e s s o r W.Y. C h e y a n d D r . T.M. C h a n g , T h e G e n e s e e H o s p i t a l , T h e I s a a c G o r d o n C e n t e r f o r D i g e s t i v e D i s e a s e s a n d N u t r i t i o n , R o c h e s t e r , NY, U S A . T h e p o t e n c y o f t h e s e c r e t i n s a m p l e t o d i s p l a c e r a d i o a c t i v e l y l a b e l e d s e c r e t i n , [ l ^ I H i s ^ ] -s e c r e t i n , f r o m -s e c r e t i n a n t i b o d y , o b t a i n e d f r o m r a b b i t -s , wa-s d e t e r m i n e d ( 5 7 ) . T h e p o t e n c y o f t h e u n k n o w n s a m p l e was c o m p a r e d w i t h t h a t o f p u r e n a t u r a l s e c r e t i n . F i g . 2.8 s h o w s a d i s p l a c e m e n t c u r v e o f a f r a c t i o n o b t a i n e d a f t e r i o n - e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y o f 2_. r e l a t i v e ° ° I - S b i n d i n g b | 9 n a t u r a l s e c r e t i n ™o e s y n t h e t i c s e c r e t i n c ( p g / t u b e ) F i g . 2.8 T h e d i s p l a c e m e n t o f [ ^ ^ I - H i s1 ] - s e c r e t i n f r o m s e c r e t i n a n t i b o d y b y n a t u r a l a n d s y n t h e t i c s e c r e t i n
2.3 E X P E R I M E N T A L PART R e a g e n t s , s o l v e n t s , a n d a m i n o a c i d d e r i v a t i v e s w e r e p u r c h a s e d a n d u s e d w i t h o u t f u r t h e r p u r i f i c a t i o n , u n l e s s o t h e r w i s e m e n t i o n e d . The a c i d o l y s i s w i t h HF w a s p e r f o r m e d i n a n a p p a r a t u s t h a t w a s d e v e l o p e d p a r t l y i n t h i s l a b o r a t o r y . T h e HF w a s d i s t i l l e d o v e r C o F j b e f o r e u s e . F o r t h e a n a l y t i c a l a n d p r e p a r a t i v e HPLC a W a t e r s M o d e l 6 0 0 0 A pump w i t h a M o d e l U6K i n j e c t o r w a s u s e d i n c o m b i n a t i o n w i t h a S c h o e f f e l S p e c t r o f l o w M o n i t o r SF 7 7 0 o r a P y e U n l e a r n L C 3 f o r v a r i a b l e w a v e l e n g t h d e t e c t i o n .
2.3.1 S Y N T H E S I S OF PROTECTED S E C R E T I N BY THE REMA METHOD
P r o t e c t e d s e c r e t i n (J_) w a s s y n t h e s i z e d a s s h o w n i n F i g . 2 . 1 b . T h e s y n t h e s i s u p t o t h e 2 5 - p e p t i d e w a s p e r f o r m e d w i t h 1.4 e q u i v a l e n t s o f t h e m i x e d a n h y d r i d e . T h e s y n t h e s i s o f t h e 2 5 - , 2 6 - , a n d 2 7 - p e p t i d e w a s p e r f o r m e d w i t h 2 e q . o f t h e m i x e d a n h y d r i d e . A 1 . 4 - f o l d e x c e s s o f t h e m i x e d a n h y d r i d e w a s o b t a i n e d b y a d d i n g 1.4 e q . o f i s o b u t y l c h l o r o f o r m a t e t o a s o l u t i o n o f 1.5 e q . o f N - p r o t e c t e d a m i n o a c i d d e r i v a t i v e a n d 1.5 e q . o f N - m e t h y l f o r m a l i n e (NMM) i n d i m e t h y l f o r m a m i d e ( D M F ) a t - 1 5 ° C . A f t e r 1-2 m i n , 1 e q . o f t h e n e u t r a l i z e d ( b y NMM) a m i n o c o m p o n e n t , i n DMF, w a s a d d e d t o t h e a c t i v a t e d a m i n o a c i d d e r i v a t i v e . T h e c o u p l i n g w a s p e r f o r m e d a t - 1 5 ° C . T h e pH o f t h e r e a c t i o n m i x t u r e was m a i n t a i n e d a t p H 7 . 5 - 8 . 0 . T h e p r o g r e s s o f t h e r e a c t i o n w a s f o l l o w e d b y a s p o t t e s t o n s l l l c a g e l w i t h f l u o r e s c a m i n e . A f t e r d i s a p p e a r a n c e o f 9 9 . 9 % o f t h e a m i n o c o m p o n e n t , w h i c h was g e n e r a l l y t h e c a s e w i t h i n a f e w m i n u t e s , t h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s s t o r e d f o r 1 h . T h e n , a b o u t 4 e q . o f 2 M KHCO3 w e r e a d d e d a n d t h e s o l u t i o n w a s s t i r r e d f o r 15 m i n , w h i l e w a r m i n g t o 0 ° C . T h e p e p t i d e w a s i s o l a t e d b y p r e c i p i t a t i o n w i t h w a t e r o r s a l i n e , f i l t r a t i o n , w a s h i n g , a n d d r y i n g i n v a c u o . T h e N - p r o t e c t i n g g r o u p s w e r e r e m o v e d b y a c i d o l y s i s . T h e b e n z y l o x y c a r b o n y l ( Z ) - g r o u p w a s r e m o v e d b y t r e a t m e n t o f t h e p e p t i d e w i t h 2 M H B r i n a c e t i c a c i d f o r 90 m i n a t a m b i e n t t e m p e r a t u r e . T h e B o c - g r o u p w a s r e m o v e d b y t r e a t m e n t w i t h TFA o r T F A / C H2C 12 ( 1 : 1 ) d u r i n g 3 0 m i n a t a m b i e n t t e m p e r a t u r e . T h e N - p r o t e c t e d p e p t i d e s w e r e i s o l a t e d b y e v a p o r a t i o n o f t h e s o l v e n t u n d e r r e d u c e d p r e s s u r e , f o l l o w e d b y t r i t u r a t i o n w i t h e t h e r , f i l t r a t i o n , w a s h i n g w i t h e t h e r , a n d d r y i n g i n v a c u o . The y i e l d s o f t h e c o u p l i n g s t e p s a r e s h o w n i n F i g . 2 . 1 b . T h e o v e r a l l y i e l d o f t h e s y n t h e s i s , c a l c u l a t e d o n t h e a s s u m p t i o n t h a t a l l p r o d u c t s w e r e p u r e , was 1 3 % , b a s e d o n Z - V a l .
