Alkaloïdenproduktie door plantecellen

\..

f

.,

0'

.. <t

"

r " , " , .,..'

o

Q '

..

.

o

o

" , "

laboratorium voor Chemische Technologie

Verslag behorende

bij het fabrieksvoorontwerp

van

...

~.:!::.:

..

.

~~

...

'!.~.~~

...

~.~

...

~.~.~.:

....

~!.~~~~.~

... .

onderwerp:

...

p.l.9,D.t~J;:;~l.J.~.n

.

.

.

...

.

...

.

.

t, Nr: 2574 l'\. \

I

.

I

: I

• i

!

1-! : /

o

M.A. de Jong ALKALOIDENPRODUKTIE DOOR PLANTECELLEN Roland Holstlaan 152 2624 GH Delft 015 - 560476 G.C. Stefess Troelstralaan 32 2624 EV Delft

015 -

563816~ Januari 1984

,

v

v

IV

1. Samenvatting.

Dit fabrieksvoorontwerp is algemeen van opzet,omdat de

opdracht niet vasto~lijnd was. Bij het onderzoek naar de

industriële realisatie van de alkaloïdenproduktie door plan-tecellen was onbekend welk alkaloïde door welke plantecel in welke hoeveelheden kan worden geproduceerd.

o~ toch een ontwerp mogelijk te maken is daarom op basis

van verschillende literatuurgegevens een "standaard-plantecel" gekarakteriseerd, die een mengsel van alkaloïden ("totaal-alkaloïde", TA) produceert.

Op grond van deze "standaard-eigenschappen" is na verge-lijking van verschillende reaktoren en systemen, gekozen voor een fed-batch produktiesysteem in een airliftfermentor.

Uitgaand van een jaarproduktie van 47 kg ruw TA is een fermentatietrein van 4 fermentoren gedimensioneerd.

Voor het steriliseren van het gebruikte medium zijn drie alternatieven tegen elkaar afgewogen: een sterilisatie met stoom, zowel batchwise als kontinu, en een kontinue filtratie met bakteriële filters.De batchsterilisatie met stoom bleek het voordeligst.

In dit ontwerp is vanwege de inhoud van de verstrekte opdracht en de beschikbare tijd geen aandacht besteed aan de opwerking en de zuivering van de alkaloïden.

De produktie van 47 kg ruw, onopgewerkt totaalalkalolde per jaar kost, gebruikmakend van het in dit verslag beschreven ontwerp, ca. fl. 4850,- per kg ruw TA (prijspeil '82/'83).

'..J

2. Inhoudsopgave.

3. Irrleiding

4. Karakterisering van de plantecel 5. Medium

6. Reaktorsysteem 7. Produktiesysteem

7.1. Immobilisatie

7.2. Batch (groei en produktie)

7.3. Batchgroei, gevolgd door verdunning 7.4. Fed-batch

7.5. Keuze van het systeem

7.6. Realisatie van het systeem 8. Dimensionering van de apparatuur

8.1. De fermentatietrein 8.2. De fermentoren

8.3. De voorraadvaten 8. 8.4. De bezinktank

8.5. De pompen en compressor

8.5.1. Pomp voor het transport van mediumzouten en sucrose pag. 1 2 6 8 10 11 12 12 13 13 15 16 16 17 20 21 23 23 8.5.2. Pomp voor de produktstroom na de bezinktank 25

8.5.3. De thermostaatpompen 26

8.5.4. De compressor

8.6. De elektrische verwarmingen

8.6.1. De verwarming voor de compressorlucht 8.6.2. De verwarming voor de

verdampings-compensatie stromen

8.6.3. De verwarming voor de extra suikertoevoe-ging aan de 3e en 4e fermentor

8.6.4. De totaaltelling van de warmtestrornen 9. Verdamping tijdens de groei

27 27 28 28 29 30 31

, \ '-' J 10. Warmteoverdracht 10.1. Warmteproduktie 10.1.1. warmteproduktie plantecellen 10.1.2. Roerwarmte

10.1.3. Warmte door expansie van bellen 10.2. Warmteafvoer

10.2.1. Warmteverlies aan omgeving 10.2.2. Warmteverlies door verdamping 10.3. Berekening warmtetoevoer via mantel 11. De kosten van het proces

11.1. De apparatuurkosten 11.1.1. De fermentoren 11.1.2. De voorraadvaten 11.1.3. De bezinktank 11.1.4. De vloeistofpompen 11.1.5. De luchtcornpressor 11.1.6. Het vloeistoffilter 11.2. De investeringskosten per jaar 11.3. De variabele kosten

11.3.1. De elektriciteitskosten 11.3.2. De sterilisatiekosten 11.3.3. De mediurokosten

11.4. De totale kosten per jaar 12. Beschrijving van het proces.

12.1. Het proces 12.2. Het tijdschema

13. Conclusies en aanbevelingen 14. Lijst van tekstsymbolen

14.1. Symbolen 14.2. Griekse symbolen 14.3. Indices 14.4. Afkortingen 15. Literatuur pag. 35 35 35 36 36 37 37 37 37 39 39 39 39 40 40 40 40 42 42 42 44 44 44 46 46 48 51 53 53 54 55 56 57

· ,

~

J

Inhoudsopgave Bijlagen.

I. Sterilisatie

I.~. Sterilisatie van het medium en de fermentoren

pag.

62

62

1.1.1. De batch-sterilisatie met stoom 63

1.1.2. De continue sterilisatie met stoom 77

1.1.3. De continue sterilisatie met microfilters 80

1.2. De sterilisatie van de hulpstromen

11. Mediurnsamenstelling en kosten

111. Specificatie van de apparatuur

IV. Stroom/componentensaten en

Massa & warmte balans

V. Thermodynamische berekeningen 82 84 86 93 101

'"""

, , ' - ' v '"",' '- . /

u

- 1 -3. Inleiding.

Het samenwerkingsverband op b1otechnologisch gebied

tussen de TH Delft en de RU Leiden, BDL, doet o.a. onderzoek aan de plantecelbiotechnolog1e. Vanuit BDL is verzocht om-de industriële realisatie van om-de alkaloïom-denproduktie door plantecellen nader te bestuderen. De resultaten van deze studie zijn vermeld in dit fabrieksvoorontwerp, ..wat als

::;t basis kan dienen voor verder onderzoek.

Onder een alkaloïde wordt verstaan: een gecompliceerde stikstofverbinding met farmocologische eigenschappen, meestal van plantaardige oorsprong. Bekende alkaloïden zijn bv.

cafeïne, kinine en opium (lit 1).

Alkaloïden worden gewonnen uit plantaardig materiaal d.m.v. extractie. Organische synthese is vanwege het

ge-compliceerde karakter van de verbindingen beperkt. De produk-tie van alkaloïden m.b.v. plantecellen biedt verschillende voordelen: (lit 2):

+ De groei kan plaatsvinden onder gecontroleerde omstandig-heden (onafhankelijk van bodemgesteldheid en klinatolo-gische storingen.)

+ Microörganismen en insekten kunnen geen nadelige invloed

..

uitoefenen op de groei.

+ De cellen zijn relatief makkelijk te vermenigvuldigen en mogelijk genetisch te manipuleren, teneinde een specifiek metaboliet te produceren.

Er wordt veel onderzoek verricht aan de alkaloïden-produktie door plantecellen. Met name kunnen hier de alka- -loïden ajmalicine en serp~ptine worden genoemd, vanwege hun

1

1

.-Sl4 :l-·I ry\

eenvoudige detectie (zie bv. l i t 3,4,5,6,7,8).

Voor zover bekend zijn er nog geen industriële proces-sen op grote schaal operationeel.

I

10

',-.. / v , v v - 2

-4. Karakterisering van de plantecel.

Om~te komen tot een weloverwogen keuze van het

produktie-proces~ dienen de eigenschappen van de te gebruiken

plante-cellen bekend te zijn.Tot op heden is nog niet bekend welke soort voor de produktie van de secundaire metabolieten

gebruikt zal gaan worden. In de afgelopen tijd is er relatief veel onderzoek verricht aan de volgende soorten : Catharanthus roseus, Morinda citrifolia en Cinchona spp. ( zie bv. l i t 3,4,

9,10). Enkele resultaten hiervan zullen gebruikt worden om een "standaard plantecel" te karakteriseren.

Plantecellen kunnen worden gekweekt in calluscultuur (weefselkweek op vaste voedingsbodem) of in suspensiecultuur

!

(vloeibaar medium). De beste resultaten m.b.t. groei en

f

produktie worden verkregen in een suspensiecultuur (lit 3,11).

~-De celwand van een plantecel bestaat voornamelijk uit cellulose. Deze is bestand tegen hoge osmotische druk, maar heeft een lage afschuifweerstand (lit 12). Deze weerstand is

t--... ~_ ...

bij oude cellen kleiner dan bij jonge cellen (lit 9). Verder hebben de cellen een relatief groot volume, wat in een hoge

Jtschijnbare viscositeit van de celsuspensie resulteert (lit

_~~\;r

13)

.Met name bij hoge celdichtheden treden grote

afschuif-t.;

l.rf ,

~>'V

.

krachten op, die lysering van de cel tot gevolg hebben (lit

12,

..,J'('

\ '

~y-

_{de celsuspensie gemengd kan worden (lit 12,13,14,15).} Deze eigenschappen hebben konsekwenties voor de wijze waarop

13) •

Plantecellen kunnen groeien als losse cellen, maar ook als aggregaten ten gevolge van het uitblijven van de separatie na de celdeling (lit 12,14,15). Aggregaten bezinken sneller,

zijn gevoeliger voor afschuiving en er kan mogelijk diffusie-limitatie in optreden. Voor de standaardplantecel wordt een

' - - .

groei als losse cel aangenomen.

Volgens Fowler (lit 12) zijn er maar weinig soorten

die zich foto-autotroof kunnen handhaven. Bij foto-autotrofe groei levert licht de energie en is CO

v

v

,

.

v

- 3

-Plantecellen groeien beter op suiker. Dit treedt dan op

koolstof- en energiebron~ waardoor geen licht nodig is

(lit 16r~ De optimale groeiomstandigheden zijn: een

tempe-ratuur van ca. 28 oe (lit 9,12,15,16) en een initiële pH van 5.5 (lit 3). In suspensiecultuur met een 10% ent en

groei op glucose, bereikte Morinda citrifolia na 8 dagen een

maximale celdichtheid (lit 9). Onder de zelfde

omstandig-heden behaalde Catharanthus roseus deze celconcentratie na

20 dagen (lit 3,4). Voor de standaardplantecel is aangenomen dat na 14 dagen de hoogste celdichtheid bereikt wordt.

. - - - -1

Di t komt neer op een gemiddelde groeisnelheid lJ =0.164 dag .

(Door gebruik ~e maken van tumorcellijnen zou deze

groei-snelheid verhoogd kunnen worden (lit 17).)

De yieldfactor (Y b)' die aangeeft hoeveel gram biomassa per

s,

gram substraat gevormd wordt, heeft een waarde van

Y _s,b = 0.5 - 0.6 g biomassa/g suiker (lit 3,4,18). Hierbij

is de onderhoudsenergie (maintenance) verwaarloosd. De

---

-maximale te behalen celdichtheid is bij de meeste soorten

--ongeveer gelijk aan 20 9 drooggewicht(DW)/l (lit 3,4,15). Bij

---deze dichtheid kunnen de cellen nog juist weerstand bieden

aan de optredende .afschuifkrachten (lit 12).

Bij de groei op suiker wordt zuurstof gebruikt. Voor de zuurstofconsumptiesnelheid, r

O

,

zijn de volgende waarden in

de literatuur gevonden: 2

a. ) r 6 cellen.h (lit 12) (plantecellen algemeen)

O

=

1 umol °2/ 10

2 b.

J

r

O ₂ = 2 lJ 1 02/mg DW. h (lit 19) (Tr iptergi um Wildorri

c. ) rO

=

1 _{mg 02/~:min} (lit 9) (Morinda citrifolia

2

~ad a.) Volgens (lit 12) is de gemiddelde diameter van een

u plantecel d 1 = 85

urn.

Bij bolvormige cellen is het volume

ce 3 -13 3

:...'

v

v

--

~

-Lit 20 geeft voor de dichtheid van de cellen Pcel

=

1100 kg/m3•

3

Het aa~tal cellen per m bedraagt dan:

n :: - psusp. = 5.65 10 11 cellen/m. Hieruit volgt: 3

P cel 'if.V cel

r O

=

10-6 mol °2/ 106 2

3 cellen.h 'if. n

=

0.57 mol 02 /m .h

-3 3

ad b.) r

O

=

2 lJ102/mg DW.h

=

2 10 m 02/kg DW.h

2 0 -3 3

Het molaire gasvolume bij 28 C is 24.6 10 m.

Verder is aangenomen dat P _susp.

=

20 kg Dw/m3 , zodat geldt:

=

2 10-3_x20 24.6 10- 3 3

=

1.6 mol 02/m .h ---- ad c.) r O

=

1 mg 02/l.min.

=

60 g 02/m3.h

=

1.88 mol 02/m3.h 2

Voor de maximale ga~iddelde zuurstofconsumptiesnelheid

van de standaard plantecel wordt, op grond van het boven-staande, een waarde aangenomen van:

De groeisnelheid is sterk afhankelijk van het medium.

'f1..-Uë-,--,!!J

Bepaalde componenten, zoals groeihormonen, suiker, een .~.'

-

--

_./'"'

stikstof- , fosfor-, en zwavelbron zijn essentiëel. Indien één van deze componenten ontbreekt of in te lage concentratie aanwezig is, dan wordt de cel gelimiteerd in de groei en zal deze beginnen met de produktie van secun-daire metabolieten (lit 6,9,21).

Bij experimenten in batchcultures is de produktie van o.a.~

alkaloïden tijdens de groeifase gering. Pas tijdens de stationaire fase bereikt de produktie zijn maximum. De

groei- en produktiefase zijn gedeeltelijk ontkoppeld (lit 3,4,9). In het gekozen proces (zie hoofdstuk 7.5.) is het niet

relevant of de geproducee~de alkaloïden door de cellen

worden opgeslagen of worden uitgescheiden.

---'--J I

- 5

-In de meeste gevallen vindt opslag plaats in de vacuolen

van de cel (lit 8,16,22). Het produkt wordt wél

uitgeschei-den bi3 permeabilisatie van de celwand door toediening van

opperv~akte aktieve stoffen (lit 8,16,22), of bij

immobili-satie van de cellen (lit 11,22).

De gemiddelde opbrengst aan alkaloïden is ongeveer 1%

van het drooggewicht (lit 5,15,23). Het is gunstig om een

cellijn te gebruiken die snel groeit en een hoge alkaloiden-produktie heeft. Er bestaan echter tussen de plantecellen van één soort soms grote verschillen in produktiviteit (lit

4,24). Het is mogelijk om door selektie van weefselkultures

(bv. met_de zgn. auto-immunofluorescentie techniek), de meest

produktieve cellijnen in handen te krijgen (lit 4,5) De standaard plantecellen worden tijdens de groei en

produktie genetisch stabiel verondersteld. Voor het opstarten

van een nieuwe produktiecyclus zal waarschijnlijk steeds

opnieuw een cellijn geselekteerd moeten worden. Het kweken van cellijnen die gedurende lange tijd genetisch stabiel

zijn, is namelijk nog niet succesvol geweest (lit 3,13).

Eén van de mogelijkheden die nog onderzocht wordt, is de cryogene opslag van produktieve cellijnen (lit 16).

'-..-' I .

I

V

'...)

I

~

\ .... : I

I

,

v

- 6 -5. Medium.

Een veel gebruikt medium in de plantencelbiologie is

-het medium van Murashige en Skoog, -het MS- medium (lit 25)T Aan dit synthetisch medium dienen nog een koolstofbron en -eventuele groeiregulatoren (hormonen) te worden toegevoegd.

Vergelijkende onderzoeken, verricht aan verschillende media geven aan dat, wat betreft de samenstelling van de minerale bestanddelen, het MS-medium de voorkeur verdient.

(lit 4,10). Als koolstofbron wordt over het algemeen sucrose (3% (w/v) ) gebruikt (lit 3,4,10). De hoeveelheid en de

soort groeiregulator die moet worden toegevoegd,blijkt af-hankelijk te zijn van de onderzochte cel en het te produceren alkaloïde. Veel onderzoek is verricht naar de produktie van de alkaloïden ajmalicine en serpentine door Catharanthus roseus lit(3,4,9).

De hormonen IAA (indool-3-azijnzuur) en kinetine hebben een gunstige invloed op zowel de groei als de produktie. Döller (lit 3) en Zenk et al. (lit 4) gebruiken deze

regula-toren in de zelfde hoeveelheden: 0.2 mg lAA/1 en 2 mg kinetine per liter. 2,4 Dichloorphenoxyazijnzuur (2,4 D) bevordert de

.

groei, maar remt de alkaloïdsynthese. Benzyladenine daaren-tegen bevordert de produktie, heeft geen invloed op de groei en wordt geïnhibiteerd door 2,4 D (lit 4).

Op grond van bovengenoemde argumenten is besloten tot het gebruik van het volgende medium: MS-medium, aangevuld met 30 g sucrose/I, 0.2 mg lAA/I, 2 mg kinetine/l en 0.1 mg 2,4 D

_.---per liter(zie Döller l i t 3). Na verloop van tijd wordt aan

/IV

\

_{. .;- 'f}

\ de volgroeide culture 1 ~g benzyladenine/l toegevoegd om

_-

---\v

l"/

I ~,'de produktie te verhogen.

1)"""-" . ~l' De samenstelling en de kosten van dit medium zijn opgenomen

,r

u

'v

'v

- 7

-Dit medium blijkt geschikt voor de batchgroei van Catharanthus

roseus en de produktie van ajmalicine en serpentine. Omdat er geen gebruik wordt gemaakt van precursors, is sprake van een zgn.

de

novo synthese.

Indien i.p.v. een "standaard plantencel" en-"totaal alkalolde" bekend is welke cel gebruikt gaat worden voor de produktie van welk(e) alkalolde(n), zal het genoemde medium mogeli~k aangepast moeten worden aan de specifieke eisen van het dan te gebrUiken systeem.

u

\...)

,..}

- 8

-6. Reaktorsysteem.

Aan de te gebruiken reaktor worden de volgende eisen gesteld: a) een goede menging, ook bij hoge dichtheden.

b) lage afschuifkrachten i.v.m. de kwetsbare celwand. c) een redelijke beluchting.

De mengproblemen vinden hun oorsprong in het niet-Newtonse gedrag van de celsuspensie en de sheargevoelig-heid van de cellen (lit 9). Uit een vergelijking van

ver-. - '

schillende reaktortypes m.b.t. de groei en de

produktie-

'----capaciteit, blijkt de zgn. "airliftfermentor" het meest geschikt (lit 9,12,26) In onderstaande figuur (lit 26) is een principe schets van de airlift fermentor gegeven.

, , I I

,

~ -Ai'

tL_

I I r -Tempered weftr ' ... ~ \ I , J ~ ~Air

Figuur 6-1. Principeschets van de airlift fermentor. (bron: l i t 26).

- 9

-Een voordeel van de airlift fermentor is de relatief lage energie-input (lit 27). Verder levert dit fermentor-type bij het opschalen weinig problemen (lit 28).

Het gebruik van een turbineroerder noodzaakt i.v.m.

de shear-gevoeligheid een laag toerental (lit 9,12,13,14,~5).

Vooral bij het opschalen en bij hoge dichtheden worden

hiermee problemen verwacht. Alleen Kato et al. (lit 29)

hebben op grote schaal acceptabele resultaten verkregen. Op grond van bovenstaande argumenten is besloten tot

het . gebruik van een airlift fermentor.

De maximale celdichtheid in een airlift fermentor is 20 g DW/ 1. Effecten die kunnen optreden bij een hogere dichtheid zijn o.a. :

- lysering van de cellen (lit 3)

- dichtgroei van apparatuur (lit 12)

- slechte menging en toename afschuifkrachten door een

hogere viscositeit (lit 16).

- sterke daling van de k1a (lit 30).

De fermentor moet gedurende lange tijd aseptisch kunnen werken. Hiervoor zijn extra maatregelen vereist, bv. het cqnstante steriliseren met stoom van de afsluiters. Verder dient het kontakt tussen het medium en de

apparatuur minimaal te zijn, in verband met eventuele

dichtgroei. Mede daarom wordt de temperatuur geregeld met

een spiraal (koelen na sterilisatie,

~en mantel i.p.v.

\,,~'

kty-""

verwarmen tijdens

:~'r"

de groei).

De in de literatuur vermelde beluchtingssnelheid

vari-L. eert van 0.33 (lit 9,12,26) tot 0.5 (lit 4) vvm. ( = volume

.

t"',

.

3 3

\~ per volume per m1nuut : Nm lucht per m vloeistof per

v I I

I

1 () - 10

-,("

vl-.... ~ " ~ ),.,....-7. Produktiesysteem.

?

/

-I~ een continu-cultuur bevindt de cel ZiC~ een

ge-- \ /

-de~eeLde fase van de groei. De optimale

celsuspensie---

-'---

~~~

-dichtheid is 4~9 OW/I (lit 14). In een batch-cultuur

daar-entegen doorloopt de cel verschillende groeistadia en kan de suspensiedichtheid oplopen tot hoge waarden (20 g OW/l zie hoofdstuk 4). De metabolietproduktie per cel neemt pas

toe, als de cellen volgroeid zijn (lit

3,4,9).

Volgens

Martin (lit 26) is de continu-cultuur dan ook wil geschikt voor de bestudering van de celgroei en het metabolisme,

maar niét geschikt de produktie van (secundaire) metabolieten.

---Daarom is gekozen voor discontinue bedrijfsvoering.

In hoofdstuk 4 is aangegeven dat de gr?ei- en p~~duktie­

omstandigheden van elkaar verschillen. Zenk et al. (lit 4) definiëren een medium met een optimale alkaloïdenopbrengst.

Bij gebruikmaking van een verschillend groei- en produktie-medium, dienen de volgroeide cellen van het groeirnedium te worden gescheiden. Dit levert echter, vanwege de extreme

kwetsbaarheid van de cellen, grote problemen op. Immobilisatie zou hier een mogelijke oplossing kunnen zijn.

Indien de volgroeide cellen in suspensie blijven, dan zijn er nog drie andere mogelijkheden om de produktie van alkaloïden te realiseren, namelijk:

a.) Een batchproces, waarbij het produktiemedium gelijk is

aan het groeimedium. -'

-b.) Een batchproces, waarbij het groeimediurn verdund wordt met een 8% suikeroplossing ( l : 10 , v/v) (li t 6).

o c.) Een fed-batch proces, waarbij bepaalde nutriënten pas

~I.i;,-~",.,..r ~ na een z~e tijd worden toegevoegd (lit 3) •

-

' V

Van de hier geschetste mogelijkheden zullen in het

onder-, onder-

,;v-G\~'

staande de voor en tegens worden afgewogen, waarna, op grond

~) van deze afweging, een keuze zal worden gemaakt.

j

u

----)

. ~

- 11

-7.1. Immobilisatie.

Cellen kunnen worden geïmmobiliseerd op een drager of

-in een. matrix. Een beschrijving van de eerste mogelijkheid_

is niet gevonden in de literatuur. Een overzicht van matrix-immobilisaties is gegeven in (lit 7,31). Brodelius en Mosbach

(lit 11) prefereren Ca-alginaat als matrix, want het is mild, eenvoudig te verwerken (ook in grote hoeveelheden) en het geeft een hoge yield aan aktieve biomassa.

De voordelen van immobilisatie zijn:

+ Minstens drie weken behoud van aktiviteit (lit 11).

+ Hogere produktiesnelheid dan in suspensiecultuur (bij

ge-n

bruik van een alginaatmatrix en de novo produktie : tot

een factor 1.4 ; l i t 7) (lit 11).

+ Mogelijkheid tot recirculatie van de biomassa (lit 7) .

+ Geconcentreerde produktstroom

+ Hoge mechanische stabiliteit.

+ Uitscheiding, indien produktopslag in een vacuole zou

plaatsvinden.

Het grootste nadeel is de realiseerbaarheid op grote schaal. Lit(7,8 en 11) geven weer hoe de alginaatimmobilisatie in zijn werk gaat: ./ ~lNvl\\...

1'-

V-z

$ :""'-~" '''" - t.'.

ft·

Cel suspensie (max. 50% (w/v) FW/I) en alginaatoplossing (2-5%

(w/v» worden gemengd in een verhouding van 1:1 (w/w).

Deze cel-alginaatsuspensie wordt toegedruppeld aan een CaCI 2

-oplossing (min. 50 ~M), waarin de zo gevormde bolletjes

ca. 45 minuten moeten stabliseren •

Uitgaand van 200 g FW/I is dus per liter celsuspensie 200 g alginaat nodig. Alginaat is duur (ca. fl 60,- Ikg) en is in een 2% (w/v) oplossing al viskeus (lit 32). Het voor de menging noodzakelijke harde roeren, zou fataal zijn voor de cellen. Zelfs als van 5% alginaat oplossing wordt

uitge-v 10 v v

I

v - 12 -3 I . d d 40 3 I ' t I '

Per 10 m ce suspens~e wor t an m a g~naa op oss~ng

ge-bruikt. Evenals de caCl

2-oplossing brengt deze

alginaatoplos-sing hoge aanschaf- en sterilisatie kosten met zich mee.

Verder-zal de tijdsduur voor het maken van 50 m3

bolletjes-te lang zijn. Het concentreren van de celsuspensie is niet~

mogelijk vanwege de grote kwetsbaarheid van de cel. Een bijkomend nadeel is het benodigde reactorvolume: voor een ca. 2 maal grotere produktie (t.o.v. suspensie)

is een meer dan 5 maal grotere reactor nodig.

7.2. Batch (groei en produktie)

Bij het bereiken van de stationaire groeifase in de batchcultuur, is de mediumsarnenstelling veranderd door het

opraken van de voedingsstoffen. De cellen worden door deze

nutriëntlimitatie geremd in metabolische aktiviteit en komen

in de endogene fase, zodat de produktie van secundaire meta.

-bolieten laag blijft. De produktie is een funktie van de initiële suikerconcentratie (lit 3,4).

De voordelen van de eenvoudige batchgroei zijn de

goede realiseerbaarheid, en het niet optreden van extra kos-ten (extra sterilisatie van toe te voegen stoffen, investe-ringen e.d.) Het nadeel is de relatief lage produktie.

"7.3. Batchgroei, gevolgd door verdunning.

Knobloch en Berlin (lit 6) verdunnen de volgroeide culture

met negen maal het cultuurvolume aan 8% (w/v) glucoseoplos~

sing. Zo wordt bereikt dat de groeibevorderende stoffen (hormonen, fosfaat, nitraat e.d.) worden verdund en de

glu-cose kan wor~en gebruikt voor alkaloïde produktie. Op grote

schaal kent deze methode vele nadelen:

- hoog suikerverbruik (mogelijk te recirculeren ?~.

- hoge sterilisatiekosten.

,

,

'-" j 'v - 13 -7.4. red-batch.

Oöller (lit 3) kweekt de cellen met een lage

groei-snelh~id en een initi~le glucoseconcentratie van 2%(w/v). -In de loop van de tijd wordt 2 maal 0.5% (w/v) glucose toegevoegd, zodat totaal 3% glucose is gebruikt. Na ca. vier weken wordt zo een maximale produktie bereikt. De voor-delen van dit proces zijn:

+

effici~nt gebruik van suiker.

+ lage sterilisatiekosten.

+ relatief hoge produktie (doordat de cellen lang in de

stationaire fase verkeren) .

+ eenvoudig te realiseren.

Als nadeel van het batchproces in het algemeen, is de discontinue produktie aan te voeren. Hiervoor is te com-penseren door gebruik te maken van twee parallel gescha-kelde fermentoren, die uit fase bedreven worden.

7.5. Keuze van het systeem.

In onderstaande tabel zijn de produkties van de ver-schillende methoden gekwantificeerd.

Tabel 7-1. Overzicht van de produktietechnieken.1

methode lito alkaloïde(n) suiker totaal opbrengst

beschikb. suiker

-(% (w/v) (mg- alk. /1)

immobilisatie 7 ajmalicine sucrose 1.4 x susp.Q)

batch 4 serr:>entine glucose 2 ₅₀

a-IJ

'

--,. v

r V \.J v

u

2 3

..

- 14

-In alle gevallen is gekeken naar de hoeveelheid alkaloïde die in twee weken de novo is geprodu-ceerd door een volgroeide culture van

. Catharanthus roseus.

zie tekst.

in een relatief

la

maal groter volume .

i.v.m. analyse is glucose i.p.v. sucrose gebruikt.

Vergelijking van deze cijfers wordt bemoeilijkt,

doordat niet in alle systemen met de zelfde parameters is gewerkt.

• Bij de opbrengst van het immobilisatiesysteem, noet nog worden opgemerkt dat de produktie langer kan duren dan de genoemde twee weken (lit 11). De moeilijke realisatie op grote schaal is echter een groot nadeel.

~ Het batchsysteem heeft geen gescheiden groei en produktie en is dientengevolge niet optimaal.

~ Het voordeel van de relatief hoge produktie van het

verdunningssysteem, wordt te niet gedaan door het extreem grote werkvolume.

Op grond van de in dit hoofdstuk aangevoerde argumenten

is besloten tot toepassing van het fedbatch produktiesysteem. Naar analogie van Döller (lit 3) wordt de initiële

suikerconcentratie in het medium 2% (w/v) genomen. Na verloop van 14 en 21 dagen wordt dan 0.5%(w/v) suiker toegevoegd.

Aangezien het mediumvolume

la

m3 is,betekent dit een toevoeging van 50 kg suiker per keer. Indien een 25%(w/v) suikeroplossing wordt gebruikt, leidt dit tot een totale

1 t 2 0 2 0 4 3 . d ·

-vo urne oename van ~ •

= •

m. De ger~nge ver unn~ng

die hierdoor optreedt, kan een mogelijk gunstige invloed hebben op de produktie (zie 7.3.)

I I I v , , ~. ' 0 - 15

-Knobloch en Berlin (lit 6) vinden dat de alkaloïdepro-duktie op sucrose even hoog is als op glucose. Omdat glu-cose duurder is, wordt gekozen voor sucrose.

Het produktiebevorderende phytohormoon 6N-benzyladenine (hfdstk 5) wordt apart toegedient tijdens de eerste suiker-toevoeging, in een concentratie van 1 mg per liter medium.

7.6. Realisatie van het systeem.

De toe te voegen sucroseoplossing dient een tempera-tuur van 28 oe te hebben en moet uiteraard steriel zijn. Een 2s%(w/v) sucroseoplossing heeft bij 20 oe een kine-matische viscositeit van 2 cS, d.w.z. twee maal de vis-cositeit van water (lit 33). Bij deze visvis-cositeit worden bij het verpompen van de oplossing geen problemen ver-wacht. Bij 28 oe zal de viscositeit iets lager zijn.

Daarom wordt aangenomen dat de 2s%(w/v) sucrose oplossing bij 28 oe gesteriliseerd kan worden d.m.v. microfiltratie. Dit heeft tot voordeel dat slechts één suikervoorraadvat en één pomp noodzakelijk zijn. In deze configuratie (zie flowsheet) wordt tijdens het suikertoevoegen niet gecorri-geerd voor de ten gevolge van de beluchting optredende verdamping. Aan het eind van de produktiefase zal het

mediumvolume dus iets minder dan 10.4 m3 zijn. Dit verschil wordt echter verwaarloosd.

1 (

u

u

- 16

-B.

Dimensionering van de apparatuur 8.1. De fermentatietrein

Voor een goede dimensionering van de apparatuur dient de gewenste jaarproductie van het alkaloïdenmengsel (TA) bekend te zijn.De totale vraag in de wereld is sterk afhankelijk van het soort alkaloïde.Deze vraag kan variëren van minder dan één kilogram (bijv.vinblastine) tot enkele tonnen

(bijv.ajmalicine) per jaar (lit 17) .Uit economisch oogpunt mag de productie de wereldvraag niet overschrijden. Verder dient rekening gehouden te worden met de grootte van het productievolume in verband met de menging en het aseptisch houden hiervan.Op grond van deze twee randvoorwaarden is gekozen voor een jaarproductie van ongeveer 40 kg alkaloïden. Indien voor de opwerking een rendement van 80% aangenomen wordt (dit is een grove aanname omdat de opwerkingsmethode nog niet bekend is),dan is de benodigde ruwe alkaloïden-productie gelijk aan 47 kg TA per jaar.

In het gekozen fed-batch systeem kunnen 12 cycli per jaar uitgevoerd worden met een celopbrengst van 20 kg Dw.m-3

en een alkaloidengehalte van 1% (wjw) .Het volume van het productiemedium wordt dan :

v

_prod.med.

=

47

=

ca.20 m jcyclus 3 12 x 0.01 x 20

De voor de productie benodigde hoeveelheid cellen dient eerst opgekweekt te worden in een systeem van fermentoren met een oplopend volume,de zogenaamde ferrnentatietrein.

In hoofdstuk 4 is aangenonen dat een maximale celdichtheid wordt bereikt na twee weken groei.Uitgaande van een

"laboratorium-ent kan in de eerste fermentor elke twee

,

'J

- 17

-Evenzo kan in de tweede fermentor elke twee weken een ent worden geproduceerd voor de groei/productie fermentor. De grQei/productie-tijd bedraagt vier weken.Indien één

grote' fermentor gebruikt wordt betekent dit twee weken

I

stilstand per cyclus voor de kleinere fermentoren.Als echter twee grote groei/productie-fermentoren parallel uit fase bedreven worden,dan kan de elke twee weken geproduceerde ent uit de tweede fermentor alternerend aan de grote fermentoren worden toegevoerd.Zo kan een optimaal gebruik van alle fermentoren gerealiseerd worden. Op grond van het bovenstaande wordt gekozen voor een

systeem van vier fermentoren met oplopend volume.De fermen-toren bevatten dan de volgende hoeveelheden medium

fermentor-nr. 8.2. De fermentoren (RB) (R14) (R19,R26) De ~!~~!!~g~~ y~~

9§

!§E~§~!2E§~ V _{me .} d in m3 0.1 1

la

Voor de 3e fermentor (R19) zal berekend worden welke

afmetingen gewenst zijn.De volgende standaardverhoudingen gelden (lit 9)

H/D

=

2 (B.I)

en

Dd.t./D = 0.44

waarin H en 0 respectievelijk de hoogte en de diameter

van de fermentor zijn.D_d._t . is de diameter van de

draft-tube.Er wordt verder aangenomen dat:

o

(.) I ~) , )

u

- 18

-Dit is de verhouding van de hoogtes van de draft-tube en het beluchte medium.Het volume van het beënte medium is

10

m3.~ij

het doorleiden van lucht treedt volumevergroting

op vanwege de hold-up van lucht.Voor de hold-up wordt aangenomen t

=

0.15 . Dan geldt:

v

_med+lucht

=

V med.

1-[:

=

11. 76 m 3

Het is gebruikelijk om een fernentor te bedrijven met 80% werkvolume,zodat :

v

=

ferm. Voor het volume geldt

vmed+lucht 0.80

V _ferm.

=

~

₄ x D2 x H

=

14.7 m 3

Uit verg. 8.1,8.2,8.4 en de waarde voor V

f erm. volgt

D

=

2.1 m H

=

4.2 m _{Dd.t.= 0.9 m}

Martin (lit 26} vermeldt in zijn review dat anti-schuim niet giftig is,maar wel invloed heeft op de groei.

Daarom wordt besloten om geen anti-schuim toe te voegen,

\

\ maar om 15% extra reactorhoogte te nemen.De hoogte van de

I

fermentor wordt dan :

Hl

=

H

x

1.15

=

4.9

m

Het totale reactorvolume VI _bedraagt

De hoogte van het beluchte medium

'J - 19 -V 11 .76 Hit ₌₌ med+lucht

₌

_{== 3.4 m} 'IT D2 3.46

'4

x

en met verg. 8.3

,

de hoogte van de draft-tube

H_d.

t . == 3.4

x

0.75

=

2.5

m.

De karakteristieke afmetingen van de andere fermentoren zijn op een analoge wijze berekend. De resultaten hiervan zijn vermeld in tabel 8-1

Een deel van het totale fermentoroppervlak wordt afgeschermd door een mantel.Voor de hoogte hiervan wordt die van het medium in beluchte toestand genomen :

Hit

=

3.4 m

Het uitwisselingsoppervlak van de fermentor met de mantel is dan :

A =

~

x D x Hit =22.4 m2

Het totale fermentoroppervlak bestaat uit :

2

het oppervlak van de cylinder: 'IT D Hl

=

32.3 m h _{et opperv a} 1 k _{van on er- en} d b _{oven an} k t _: -'lT2 D2 -- 7.0 ,waarbij als benadering een tank met vlakke fronten is

2 m

2

aangenomen.Het totale oppervlak, A_tot ' bedraagt 39.3 m Het oppervlak dat niet afgeschermd wordt door de mantel,A I , is dan :

AI

=

A - A

=

tot 39.3 - 22.4

=

16.9

2 m •

Bovenstaande berekening kan ook uitgevoerd worden voor de andere fermentoren.De resultaten hiervan zijn vermeld in tabel 8-1 .

U v

v

,0

v

v

-

20

-Tabel 8-1 Overzicht van de karakteristieke afmetingen

van de gebruikte fermentoren.

fermen- V VI D Hl H" D H A AI r.\ed ferm d.t. d.t. tor (m3 ) (m 3) (m) (m) (m) (m) (m) (m2 ) (m2 ) R8 0.1 0.17 0.45 1.04 0.74 0.20 0.56 1.05 0.74 R14 1 ~.7 0.98 2.25 1.56 0.43 1.17 4.80 3.64 R19/R26 10

17

2.1 4.9 3.4 0.9 2.5 22.4 16.9 8.3. De voorraadvaten

De voorraadvaten dienen voldoende stof te bevatten voor één cyclus.Om infectiegevaar te verkleinen worden de mediumzouten en de suikerbron apart opgeslagen.Verder zijn de voorraden geconcentreerd,waardoor relatief kleine vaten nodig zijn.Hoge concentraties en kleinere vaten leiden tot respectievelijk verdere verkleining van het infectiegevaar (grotere osmotische druk in de oplossing) en aanzienlijke besparingen op de investeringskosten.

Indien wordt aangenomen dat een Ënt geen sucrose meer bevat,dan is per cyclus nodig (zie bijlage 11)

666 kg sucrose .Het volume van een sucrose-oplossing 3

r.\et een concentratie van 250 gil bedraagt dan ca. 2.7 m .

Er wordt een vat genomen van 3 m3 dat éénmaal per cyclus

gevuld wordt.

Het medium-voorraadvat bevat de zouten van het MS-medium en plantecelhormonen (behalve benzyladenine) in de juiste verhoudingen.Als wordt gesteld dat een ent nog vrijwel alle mediumzouten bevat,dan is per cyclus nodig (zie bijlage 11) : ca. 92.7 kg mediumcomponenten.

Indien het volume van het voorraadvat 3 m3bedraagt

(; 1 v

u

, '-' ...,' - 21

-ca. 3.5 % (w/v) .Bij deze concentratie wordt aangenomen dat alle zouten goed oplossen.Gedemineraliseerd water

(Demi-water) hoeft niet te worden opgeslagen,omdat dit per leiding aangevoerd kan worden.Er zijn dus twee voor-raadvaten nodig,beide met een volume van 3 m3.Er kan worden volstaan met twee atmosferische opslagtanks

( H/D=2 ; H=2.48 m ) ,die ieder uitgerust zijn met een roerder.

8.4. De bezinktank

Na 28.5 dagen groei en productie in één van de grote fermentoren bestaat de ferrnentorinhoud uit plantecellen en medium.De alkaloïden kunnen aanwezig zijn in de cellen, in het medium,of in beide.Dit is afhankelijk van de mate van uitscheiding door de cellen.In alle gevallen moet een scheiding plaatsvinden tussen cellen en medium,omdat de alkaloïden op verschillende wijzen geïsoleerd kunnen worden.

Bij de scheiding van medium en cellen is het van belang dat de celinhoud niet in het medium terechtkomt.Hiervoor zijn drie redenen aan te voeren :

Het levert extra problemen bij de opwerking van de alka-loïden.

Eventuele recirculatie van het mediure wordt bemoeilijkt, omdat de celbestanddelen verwijderd moeten worden.

Indien de alkaloïden uitgescheiden worden,dan kunnen de nog intakte cellen mogelijk gerecirculeerd worden .

Uit het bovenstaande volgt dat filtratie niet toegepast

kan worden,omdat de cellen te gevoelig zijn voor de afschuif-krachten die daarbij optreden.Er is daarom gekozen voor

het laten bezinken van cellen in een bezinktank.

Het medium is nog rijk aan voedingsstoffen;Om de kans op infectie te verkleinen wordt de bezinking niet continu maar ladingsgewijs (batch) uitgevoerd.Na de verwerking van

v

, I 1 - ' v

u

- 22

-één fermentorinhoud (10 m3) kan de bezinktank steeds gesteriliseerd worden.Het benodigde volume van een tank is ongeveer 11 m3 (V d + 11 = 10.4 m3) .De

neergesla-me ce en

gen ëellen moeten gemakkelijk afgevoerd kunnen worden. Dit is mogelijk door een tank met een conisch bodem-oppervlak te nemen.Er wordt gekozen voor een bezinktank met de volgende afmetingen

Db.t.= 2 m _{Hb . t}

.=

4 m m 3 Cl

=

bodem Indien de cellen bolvormig verondersteld worden,dan

o

90

geldt voor de bezinksnelheid van de cellen de wet van Stokes

u _s

=

g

d~el

(Pcel-Pmed-cellen)

18 'lmed

(8.5)

In hoofdstuk 4 werd aangenomen dat

d 1= 85

~m

en P 1= 1100 kg

m-

3

~

J

0/(

~!vJi;,-ifC

ce ce

---

-

---_.

Verdere aannames zijn

10- 3 Ns -2 n_med= _{nH 0} = m 2 1000 kg -3 Pmed-celle~ PH 0= m 2

Vergelijking 8.5 levert dan: u = 3.94 x 10-4 m s-l s

De bezinktijd wordt gegeven door vergelijking 8.6 :

t _s

=

H vat u s 4

=

3.94.10- 4

=

ca. 2.8 uur

Na ongeveer 3 uur kunnen de cellen worden afgevoerd.

Het resterende medium wordt daarna door een filter geleid om de achtergebleven cellen te verwijderen.Er wordt

aangenomen dat een filter met een poriediameter van 10 ~m

---

--voldoende is om de cellen tegen te houden. Vanwege de druk-val over het filter (M30) is hier een pomp nodig (P31). De oplossing en de cellen kunnen vervolgens ieder apart

'...J

.

_~ '

- 23

-verwerkt worden.De geleegde bezinktank wordt schoongeblazen met stoom en is daarna gereed voor een volgende fermentor-lading.De totale verwerkingstijd wordt geschat op maxi-maal ·O.S dag.Dit valt ruim binnen de termijn van 14 dagen, waarna weer een volgende fermentorinhoud ter verwerking . aangeboden wordt.

8.5. De pompen en compressoren

Voor alle pompen en compressoren wordt een gemiddeld totaal rendement aangenomen van n

tot= 0.5 (lit 36)

8.5.1. Pomp voor het transport van mediumzouten en sucrose (P21)

De oplossingen van MS-zouten en sucrose kunnen na elkaar met dezelfde pomp in een fermentor overgebracht worden.Deze pomp zal gedimensioneerd worden op het vullen van één van de grote fermentoren.Er is als eis gesteld dat de fermentor binnen 1 uur gevuld moet worden.

Het mediumvolume bedraagt 10 m3,waarin 20 kg sucrose/m3 aanwezig is.Er moet dus 200 kg suiker verpompt worden.

Omdat de suikerconcentratie in het voorraadvat 250 kg/m3 is, bedraagt het volume van de te verpompen sucrose-oplossing :

3 0.8 m •

Per cyclus wordt totaal ca. 20 m3 medium aangemaakt,

waarvoor 92.7 kg mediumcomponenten nodig zijn (zie bijlage 11). In een grote fermentor wordt 9 m3 steriel medium gebruikt.

De hoeveelheid mediumcomponenten hiervoor is gelijk aan :

9

MMS-zouten+hormonen= 2O~ 92.7 = 41.7 kg-In het voorraadvat bevindt zich een 3.5 % (w/v)-oplossing van mediumzouten (zie hfdstk. 8.3) ,zodat het toe te voeren volume gelijk is aan :

u

'..../ 24

-v

=

1.2 MS-zouten+hormonen 3 m

De totale hoeveelheid te verpompen oplossingen van

medium-. 3

componenten en sucrose is dan 2.0 m .

Indien voor de dichtheid van het niet-steriele medi~

1000 kg/m3 wordt genomen,dan volgt uit bijlage I dat het volume van het niet-steriele medium in een grote ferrnentor 7.63 m3 is.Hieruit is af te leiden voor de hoeveelheid toe te voeren demi-water :

3

V demi

=

5. 6 m

Er wordt aangenomen dat het demi-water,dat geleverd wordt op een druk van 7 bar ,in ca. 0.5 uur toegevoerd kan worden, zodat

~d

.= 3.1 x 10-3 m3/s bedraagt.Er blijft dan ca. 0.5

eml 3

uur over voor de te verpompen vloeistof (V

=

2.0 m ) .Dit resulteert in een debiet

Voor het effectief pompvermogen geldt (lit 36)

P

_e

=

~

_v

·lIP

Met een gemiddelde waarde van liP

=

3 bar,volgt uit verg. 8.7

P

=

300 W .Het asvermogen bedraagt dan : e P

=

as Pe 300 l1tot 0.51

=

600 W

Er is dus een pomp nodig met een asvermogen van 600 W .

u

I

v ~I . .) - 25

-8.5.2. Pomp voor de productstroom na de bezinktank (P31)

De hoeveelheid vloeistof die de bezinktank verlaat, V _pro d· ,is gelijk aan :

Vprod

=

Vrned+cellen-Vcellen waarin V d+ 11

=

~0.4

m3 (zie hfdstk. 8.4).

me ce en

Het volume van de cellen kan als volgt bepaald worden Na de groeiperiode is er een celsuspensie aanwezig van

(8.8)

ca. 10 m3 met een celdichtheid van 200 kg FW plantecellen/m3. De totale massa aan cellen is :

M 11 _{ce en}

=

200 x 10

=

2000 kg FW cellen Voor de dichtheid van de cellen geeft Kossen (lit 20) de volgende schatting: p _ce 11 _en

=

1~00

kg/m3.

Dan geldt voor het volume van de cellen

=

1.8 m3.Uit verg. 8.8 wordt gevonden:

V _prod

=

8.6 m 3

V _cellen

=

Mcellen

Pcell en

In hoofdstuk 8.4 is gesteld dat de verwerkingstijd maximaal 12 uur bedraagt.De bezinktijd is ca. 3 uur iVoor de vultijd

-3 3

wordt 1 uur aangenomen ( ~ _v

=

3'10 m

Is )

en voor het schoonmaken en doorblazen met stoom nog eens 2 uur.Er

blijft dan ca. 6 uur over voor het leegpompen van de tank. De vloeistofpomp (P31) moet dan een debiet kunnen leveren

-4

3

van 4.0'10 m Is.Het door de pomp te overwinnen druk-verschil is gelijk aan de opvoerhoogte + het drukverlies over het filter.Een pomp die een drukverschil van P

=

3 bar kan overwinnen is hier voldoende.Voor het asvermogen van de pomp geldt volgens l i t 36 :

P as

=

~ • f:.p v

=

240 W

=

(8.9)

...J

v

- 26

-8.5.3. De thermostaatpompen (PIO,P15,P20,P27)

Vpor de berekening is gesteld dat het water in de man-tel ideaal gemengd is. In hoofdstuk 10 wordt berekend dat bij een grote fermentor (R19 of R26) de benodigde warmtetoevoer

1.7 KJls is.De temperatuur van het verwarmingswater in de mantel moet dan ca. 28.1°C zijn.Voor het

temperatuur-r verschil tussen de in- en uitgaande stroom,6T,wordt hier

() 0 11 •

. ,~ ,0.5 ~genomen;Dus T_in= 28.6 C en T_uit

=

28.1 C.Het benod~gde

\~~

'debiet van het water is dan te berekenen uit verg. 8.10 :

qmantel=

=

1.7 KJ Is

Hieruit volgt : ~ = 8.1 x

V

Het drukverschil over de pomp moet groter zijn dan de opvoerhoogte van het water.Bij een drukverschil van 3 bar wordt daar zeker aan voldaan.Met verg. 8.9 is dan een

(8.10)

schatting te maken van het benodigde pompvermogen : P _as = 500 W

Dezelfde berekeningen kunnen uitgevoerd worden voor de thermostaatpornpen van de Ie en 2e fermentor.De resultaten zijn weergegeven in tabel 8-2 .

Tabel 8-2 Overzicht van de berekening van het benodigde asvermogen van de thermostaatpompen voor de verschillende fermentoren. fermentor-nummer R8 R14 R19 of R26 x) Zie tabel 10-1 q x) mantel ( KW ) 0.074 0.40 1.7 ~v 3 (m Is) 3.10- 5 2'10- 4 8'10- 4 p as (W) 20 125 500

ü I'~

lu

I

Iv

I

--..1

u

v - 27 -8.5.4. De compressor (Cl)

B~j de groei is een totaalluchtdebiet nodig van

0.116 m3/s (zie tabel 10-1) ,bij een maximale drukval van

~P = 1.5 bar.Volgens l i t 37 is voor dit debiet en deze

drukval alleen een Sliding Vane Rotary geschikt.Het as-vermogen van een omkeerbaar isothermische compressor kan berekend worden met verg. 8.11 (li t 36)

V

~lucht·PO P₂

'N

.

\

L-.--· P ln / "'-J'-I.1~ ... '\1..

=

x as n_{tot PI} Hierin is Po de luchtdruk.Pl en P 2 zijn respectievelijk

de aanzuigdruk en de persdruk van de compressor.Als voor de verhouding P

2/P1 een waarde van 2.5 wordt aangenomen

dan volgt uit verg. 8.11 :

P

=

21 KW

as

8.6. De electrische verwarmingen

Alle stromen die de fermentoren tijdens de groei binnentreden dienen opgewarmd te worden,van de

omgevings-o 0

temperatuur {ca. 20 Cl tot de fermentortemperatuur (28 C). Vanwege het geringe te overbruggen temperatuurverschil en de lage investeringskosten is hier gekozen voor electrische verwarming in plaats van warmtewisselaars met stoom.De ver-warming vindt plaats in de toevoerleidingen,die plaatselijk omwikkeld zijn met verwarmingslint.Er wordt voor elke

stroom een berekening uitgevoerd van de benodigde hoeveel~

heid warmte per jaar en een schatting gemaakt van het totale aantal meters te omwikkelen leiding.

'..J

,..)

u

u

- 28

-8.6.1. De verwarming voor de compressorlucht (H4)

3 Het totale luchtdebiet bedraagt : ~lucht= 0.116 m

Is

(zie tabel 10-1) .De algemene vergelijking voor de benodig-de warmtestroom luidt : q

=

4>·p·c

·(T . -T. ) P Ul.t l.n

•

Met en de aanname T.

=

20 C l.n -3 PI _uc h = 1.2 kg·m _t volgt uit verg. 8.12 :

qlucht= ~.~~ KW

De geleverde warmte per jaar is dan (12 cycli van 28.5 dag) 3

Qlucht,tot=1.11·24.28.5·12 = 9.11·10 KWh_t

8.6.2. De verwarmingen voor de verdampings-compensatie stromen (H3,H12,H17,H24)

De totale hoeveelheid water die tijdens de groei in alle fermentoren verdampt is gelijk aan (zie hfdstk. 9)

~. = aantal cycli ~ aantal fermentoren ~ verdamping

·~20 __ 4

12 ~ 2 ~ (2214 + 217.7 + 21.8) = 5.89'10 kg H20/jaar

De hoeveelheid warmte die nodig is om de compensatiestroom

o •

op te warmen van omgevingstemperatuur (20 C) tot 28 C wordt gegeven door vergelijking 8.13 :

(8.12)

(J ,-' I '-..' . j , \ ' J - 29 --1 -1

Uit verg. 8.13 volgt,met c = 4.2 KJ·kg ·K

PH ₂

°

,

.

q

=

1.98.106 KJ

H

20,comp.tot

Dit komt overeen met een hoeveelheid overgedragen energie

-van

q

=

550 K\'1h

t

H

20,comp.tot

8.6.3. De verwarmingen voor de extra suikertoevoegingen in de

3e en 4e fermentor (H17,H24)

Per keer (0.5 % toevoeging) wordt 50 kg sucrose toegevoegd

(zie hfdstk. 7.4) .Dit impliceert een volume van 0.2 m3 per

puls.Aan de fermentoren wordt per jaar van 12 cycli en

2 toevoegingen per fermentor per cyclus het volgende

volume extra suikeroplossing toegevoerd

Vsuiker= 12·2·2·0.2 = 9.6 m3

De hoeveelheid warmte die per jaar nodig is om dit volume

o

op 28 C te brengen wordt gevonden uit vergelijking 8.14 :

Lit 33 geeft

kg/m3 .Indien

voor de dichtheid van

-1 -1 c op 4.2 KJ·kg ·K de oplossing ca. 1090 wordt gesteld,volgt P • uit verg. 8.14 (~T = 8 C) 3.5.105 KJ qsuikeropl.=

Dit komt overeen met 98 KWh

t per jaar.

I ' J I 'J 'J '.J - 30

-8.6.4. De totaaltelling van de warmtestromen

In hoofdstuk 10 is berekend dat de totaal toegevoerde warmtestroom via de mantels gelijk is aan 2.2 KW gedurende ca. 28.5 dag per cyclus.Op jaarbasis is dan de volgende

hoeveelheid war~te nodig :

~antel,tot.=

12·2.2·28.5·24 = 1.81.104 _{KWh t}

Met de berekeningen uit hoofdstuk 8.6 kan bepaald worden hoeveel warmte per jaar geleverd wordt door de electrische verwarmingen :

qtot= qlucht,tot+ qH 0 t t+ qsuikeropl.+ qmantel

2 ,comp. 0

Uit verg. 8.15 volgt

De warmtefactor - d.i. het rendement van de omzetting van

electriciteit in warmte - wordt gesteld op E = 0.8 .

De electrische verwarmingen verbruiken dan

q

=

el.verw.

4

=

3.49·10 KWh

e

De vloeistofstromen onder 8.6.2,3 en 4 hebben een klein debiet, zodat maar een geringe lengte verwarmingsbuis nodig is.Voor de opwarming van de compressorlucht is een grotere lengte nodig,omdat het debiet groter is dan bij de vloei-stofstromen.Tevens is de warmtecapaciteit van de lucht klein ten opzichte van die van water.

(8.15)

De totale lengte aan verwarmingsbuis kan niet berekend worden,omdat het Webci-prijzenboekje (lit 38) alleen de prijs

I

geeft en niet de warmteoverdrachtscapaciteit van de verwar- \~.

*'"

mingsbuis .De totaal benodigde lengte wordt daarom geschat: '\ ~~-tJ'

ca. 15 In.

o

u

I I ' V U I û

I

u

I I

u

'.J '-..) -0 - 31

-9. Verdamping tijdens de groei

Tjjdens de groei (en productie) wordt belucht met 0.33 vvm.Voor de grote fermentoren betekent dit een gas-debiet van 0.055 m3/s.

De lucht wordt geleverd door compressor Cl en op een "\ druk gebracht van 2.2 bar. Om condensatie in het systeem ~<...'_.

te voorkomen,moet de aanqezogen lucht zover gedroogd '

... . - -

---worden dat het maximum verzadigingspercentage (bij 2.2 bar) ca. 70% bedraagt.Dit komt overeen met ca. 30% verzadiging bij 1 bar.Er wordt aangenomen dat bij deze vochtigheden geen condensatie van water optreedt.

De druk van 2.2 bar,na de compressor,is nodig om de drukval over het sterilisatiefilter (0.8 bar) en de fermentor-vloeistofhoogte (ca. 3 m water

=

0.3 bar) te overwinnen én een lichte overdruk in de fermentor te handhaven.Deze overdruk dient om in geval van lekkage de kans op infectie te verkleinen.

Omdat de waterconcentraties bij verschillende drukken worden berekend,zullen deze worden uitgedrukt in

kg H₂0/Nm3 lucht, (Nm3

=

Normaal m3 ) .Indien de waterdamp beschouwd wordt als een ideaal gas,dan wordt de

waterdamp-3 concentratie, p , (in kg H

20/Nm lucht) beschreven door :

met x

₌

P

₌

n P 1

=

p%

₌

x p

=

100 verzadigingspercentage genormaliseerde druk heersende druk temperatuur-afhankelijke verzadigde waterdampspanning (-) (Pa) (Pa) (Pa) ( 9 .1) MH

°

=

molecuulmassa H20 -1 (kg 'mol )

R 2

₌

_{gasconstante (J ·mol} -1 _{. K} -1 ₎ T

=

temperatuur (K)

-~--- -I ü

IU

I I

u

u - 32 -o

Er is aangenomen dat de lucht na de compressor (2.2 bar,20 C)

70% verzadigd is.Onder die omstandigheden

(P~=

2.43 kPa

-3 3

(lit J9)) is de waterconcentratie 5.72·10 kg H

20/Nm .

o

Na de compressor wordt de lucht opgewarmd tot 28 C

(P~=

3.85 kPa ;(lit 39)) .Daarna vindt een drukval plaats

over het filter (~P = 0.8 bar) .Dit resulteert in een druk

van 1.4 bar voor de ingaande fermentorluchtstroom.De

o

waterdampconcentratie van deze stroom bij 1.4 bar en 28 C wordt berekend met vergelijking 9.2 en de concentratie bij 2.2 bar en 20 C.Er behoeft alleen een temperatuur-correctie te worden toegepast,omdat de concentraties zijn

, "

uitgedrukt in kg/Nm3 : '

~ ,

5.72.10- 3 . ~." P (28)./ =

Pferm,in=

P

~

O

~

301

Als de lucht de fermentor verlaat is de druk afgenomen

ti

tot 1.1 bar en het is dan 100% verzadigd bij 28

c.

De hoeveelheid water,die uit het medium verdampt is,wordt gevonden door het concentratieverschil voor en na de

fermentor te vermenigvuldigen net de gasstroom

Uit verg. fermentor Gedurende

9.3 volgt dat de verdamping uit de 3e of 4e

3 -1 - 4 - 1

(~lucht= 0.055 Nm·s ) 9.0·10 kg·s bedraagt.

één cyclus verdampt er dan 2214 kg H₂0.

(9 .2)

(9 .3)

Een analoge berekening is uit te voeren voor de kleinere fer-mentoren.Het resultaat hiervan is vermeld in tabel 9-1

Uit de tabelwaarden blijkt dat in alle fermentoren ca. 20% van het mediumvolume water verdampt.Vooral omdat aan de samenstelling van het medium hoge eisen gesteld worden, dient voor de verdamping gecorrigeerd te worden.

u

\.J

u

- 33

-Tabel 9-1 Overzicht van de verdamping uit de fermentoren

fermentor 4> lucht ( - ) ( 1 0 -

~

Nm 3 / s ) verdamping x) tijdsduur per cyclus (dagen) ve-rdamp'ing per cyclus (kg H 20) R8 0.55 28 21.77

Rl4

5.5 28 217.7 R19 of R26 55 28.5 2214

Voor de verdampingscompensatie zijn drie alternatieven tegen elkaar afgewogen :

a) condensatie van het verdampte water en terugvoering b) 100% verzadiging van de ingaande fermentorluchtstroom cl toevoeging van de verdampte hoeveelheid

De temperatuur van de in- en uitgaande luchtstroom is 28 °e.Het drukverschil tussen beide is ca. 0.3 bar

(P, = 1.4 bar,P 't= 1.1 bar) .Indien de in- en uitgaande stroom

~n U~

100% verzadigd zijn,dan zal ten gevolge van dit drukverschil toch nog verdamping optreden.Deze bedraagt dan voor een

3 grote fermentor (V

med=10 rn ) met verg. 9.1 en 9.3 :

Per cyclus betekent dit een verlies van 730 kg H

20 , een onaanvaardbare hoeveelheid.

\.J

. ...}

u

- 34

-ad b) Er is aangenomen dat de lucht gekoeld wordt met koelwater. Een voordeel van deze methode is dat geen extra

sterilisatie behoeft te worden uitgevoerd.

Een 100% verzadigde luchtstroom bij 1.1 bar en 20·C

-2 3

bevat volgens vergelijking 9.1 : 1.63 ·10 kg H₂0/Nm .

De lucht stroom die de fermentor verlaat (1.1 bar,100%

o -2 . 3

verzadigd,28 C) bevat (verg. 6.1) 2.52·10 kg H₂0/Nm .

Dus met koelwater is dan maximaal te condenseren :

=

0.055-(2.52-1.63)-10-2

=

=

4.9.10- 4 kg/s

-4

De verdamping bedraagt 9·10 kg/s (zie tabel 9-1),

zodat het waterverlies gelijk is -4

~ H 0=(9.0 - 4.9) ·10

m, 2

aan :

Per cyclus wordt dan ca. 1000 kg H

20 verloren.Dit is

10% van het mediumvolume,hetgeen onaanvaardbaar is.

ad c) Omdat slechts een kleine volurnestroom behoeft te

-4 -3 3

worden toegevoegd (9·10 kg H

20/S

=

3.24·10 m luur)

kan de noodzakelijke sterilisatie hiervan gemakkelijk gebeuren met een microfilter.De aanschaf van een extra voorraadvat met steriel water,dat gepaard gaat met hoge investerings- en sterilisatiekosten,is dan overbodig.

Uit het bovenstaande blijkt dat methode c) de voorkeur verdient.Een combinatie van mogelijkheden resulteert in hoge investeringen.In de onder c) vermelde methode zijn slechts nodig : gedemineraliseerd water onder druk en een micro-filter (d = 0.22 pm).

I....)

\....)

'..J

- 35

-10. Warmteoverdracht

De warmtebalans over één fermentorsysteem in groei of productie luidt :

warmtetoevoer + warmteproduct.= warmteafvoer + warmteophoping(lO.l

warmtetoevoer via mantel

+

+ warmteverlies omg~ving + warmteverlies verdamping

+

warmteproductie cellen roerwarmte + warmte t.g.v. expansie

=

(10.2 warmteverlies decompressie

+

warmte ophoping

Als de warmte ophoping nul wordt verondersteld,dan geldt voor verg. 10.2 in formulevorm

Doordat de in- en uitgaande lucht beide een temperatuur

van 28 ~ hebben,is er geen warmteverlies door de opwarming

van lucht.

Uit verg. 10.3 wordt berekend hoeveel warmte moet worden toegevoerd via de mantel.Daartoe zullen de termen

in de balans apart behandeld worden.Alle berekeningen worden uitgevoerd voor één van de grote fermentoren.

10.1. Warmteproductie

10.1.1. Warmteproductie plantecellen

In hoofdstuk 4 is afgeleid dat de gemiddelde zuurstof-consumptiesnelheid van een culture in groei,bij een

-3 -1

celdichtheid van 20 g DW/l ca. 1.0 mol 02·m ·h bedraagt.

Roels (lit 40) geeft dat de warmteproductie van systemen

u

u

- 36

-Direct na de ent is de celdichtheid 2 g/l.De minimale

warmteproductie is dientengevolge: q d

=

455 KJ/uur

=

0.13KW

pro

Er wordt aangenomen dat er in de productiefase geen warmteproductie t.g.v. metabolische activiteit optreedt. Ter bepaling van de maximaal toe te voeren warmtestroom wordt dan ook de warmteproductie van de cellen tijdens de

groei verwaarloosd.Dus q _{prod -}- 0 KW .

10.1.2. Roerwarmte

Het toegevoerd vermogen bij beluchting wordt gegeven door verg. 10.4 :

Het luc~tdebiet '~lucht' bedraagt bij de grote fermentoren

0.055 m /s.P_O

=

~.l bar en de vloeistofhoogte ,H

med, bedraagt

2.9 m. Indien wordt aangenomen dat al het toegevoerde vermogen wordt gedissipeerd als warmte,dan wordt uit verg. 10.4 gevonden voor de roerwarmte :

q

=

P

=

1.39 KW

roer

(10.4)

u

10.1.3. Warmte door expansie van bellen

u

De hoeveelheid energie die vrijkomt door de expansie van de opstijgende luchtbellen is volgens Roels en Heijnen

(lit 40) even groot als de energie die wordt opgenomen door de isothermische decompressie van de lucht.De beide termen vallen dus tegen elkaar weg in de warmtebalans.

. ...;

u

u

- 37

-10.2. Warmte afvoer

10.2.1. Warmteverlies aan omgeving

Het warmteverlies aan de omgeving vindt plaats via

het gedeelte van het fermentoroppervlak dat niet afgeschermd is door de mantel.De warmtestroom wordt gegeven door:

In

bijla~e

1.1.1 is berekend: UI

=

_0.01

KW'm-2~C-l

Het oppervlak AI

=

16.9 m2 (zie hfdstk 8.2.2)

Indien de buitenlucht temperatuur op 20 ~ wordt gesteld,

dan volgt uit vergelijking 10.5 voor het warmteverlies:

q

=

1.35 KW

omg

10.2.2. Warmteverlies door verdamping

-4

In hoofdstuk 6 is berekend dat er per seconde 9·10 kg

H₂0 verdampt.Omdat de verdampingswarmte voor water bij

1.1 bar en 28°C een waarde heeft van 1936 KJ/kg (zie

bijlage V.4) is de warmtestroom t.g.v. verdamping:

10.3. Berekening warmtetoevoer via de mantel

Uit de warmtebalans (verg. 10.3) kan qmantel worden berekend :

Invullen van de gevonden waarden geeft: q t 1= 1.70 KW

man e

In bijlage 1.1.1 werd berekend voor de

warmteoverdrachts-"ff' ." -2 • -1 -1

coe 1C1ent van de mantel: U

=

1.175 KJ·m

.e

.s

00.5)

u

v

- 38

-Het warmtewisselingsoppervlak van de mantel,A, werd

bepaald in hoofdstuk 8.2.2 : A

=

22.4 m2 .

Gezien de grote warmteoverdrachtscapaciteit van de • -1

mantel, (U'A = 26.3 KW·C ) ,is een temperatuurverschil

tussen mantel en medium van 0.07 ~ al voldoende om de

benodigde warmtestroom te realiseren.

Op analoge wijze kunnen de warmtestromen in de kleinere fermentoren berekend worden.De resultaten hiervan zijn vermeld in tabel 10-1.

Tabel ~O-~ Overzicht van de benodigde warmtestromen

V med

o

.1 1 10 A' 0.55 0.74 5.5 3.64 55 16.9 (KW) (KW) (KW) 0.06 0.017 0.003 0.291 0.174 0.067 1. 35 1.74 1. 39 qmantel (KW) 0.074 0.398 1. 70

u

- 39

-11. De kosten van het proces

De totale kosten van het proces kunnen onderverdeeld worden in variabele kosten en investeringskosten.De vari-abele kosten bestaan uit de kosten van electriciteit, medium en de sterilisatie.De investeringskosten omvatten de aanschaf van de apparatuur.De daarbij optredende kosten voor montage,pijpleidingen,hulpdiensten,e.d. worden

verdisconteerd in de zogenaamde Lang-factor.Deze heeft voor gas/vloeistof-processen een waarde van 4.74 (zie l i t 42).

De afmetingen van de apparatuur zijn bepaald in hoofdstuk B.De aanschafprijzen van de apparatuur worden geschatmet behulp van het webci-prijzenboekje (lit 38), tenzij anders vermeld.Op grond van deze prijzen kan met de Lang-factor een schatting gemaakt worden van de inves-teringen.Alle berekende apparatuurkosten zijn vermeld in tabel 11-1 (behalve de microfilters) .

11.1. De apparatuurkosten

11.1.1. De fermentoren

Er is gekozen voor drukvaten in verband met druk van 2 bar die optreedt tijdens de sterilisatie.In Webci worden de prijzen gegeven van cylindrische drukvaten met bolle fronten zonder mantel,draft-tube en luchtverdeler (sparger). Voor deze uitbreiding wordt een extra investering van ca. 15 % aangenomen.

11.1.2. De voorraadvaten

Er z~Jn twee vaten nodig,die elk een volume hebben van 3 m3.Webci vermeldt de prijzen van atmosferische