Podstawy genetyki IV

Podstawy genetyki IV

Naprawa DNA, rekombinacja, mutacje

Naprawa DNA

• U E. coli częstość błędów polimerazy 1:10⁷ wstawianych nukleotydów

• Ogólna częstość błędów przy replikacji: 1:10¹⁰ – 1:10¹¹ wstawianych nukleotydów

• genom ~4,6⋅10⁶ bp, czyli błąd raz na ~2000 – 20 000 podziałów

• Za zmniejszenie częstości błędów replikacji o 3-4 rzędy wielkości odpowiadają systemy naprawy DNA

Systemy naprawy DNA

• Naprawa bezpośrednia (DR)

• Naprawa przez wycinanie (ER)

• Naprawa przez wycinanie zasad (BER)

• Naprawa przez wycinanie nukleotydów (NER)

• Naprawa błędnie sparowanych nukleotydów (MMR)

• Naprawa pęknięć dwuniciowych (DSBR)

• system łączenia końców niehomologicznych (NHEJ)

• rekombinacja homologiczna (HR)

Systemy naprawy DNA

Naprawa bezpośrednia

• Naprawa pęknięć jednoniciowych przez ligazę

• Odwrócenie reakcji alkilacji

• np. MGMT (metylotransferaza O6-metyloguanino DNA) – usuwa grupy alkilowe z atomu 6 guaniny

• Fotoreaktywacja dimerów cyklobutylowych

• fotoliaza DNA

• Występuje u mikroorganizmów i wielu zwierząt, ale brak u ssaków łożyskowych, w tym u człowieka (jej rolę przejmuje system NER – tzw. naprawa ciemna)

• Wspólna cecha – bez resyntezy DNA (udziału polimeraz)

Naprawa przez wycinanie zasad (BER)

• Usunięcie uszkodzonej zasady azotowej przez specyficzną glikozydazę DNA

• Powstaje miejsce AP

• Endonukleaza AP oraz fosfodiesteraza usuwają resztkę nukleotydu

• Luka wypełniana jest przez polimerazę

Glikozydazy – przykłady (ssaki)

Tabela jest tylko przykładem – nie uczyć się na pamięć!

Nobel 2015 (chemia)

• Tomas Lindahl, za opisanie mechanizmu BER

Naprawa przez wycinanie nukleotydów

• U bakterii dwa systemy

• krótkich łat (wycinane ~12 nt)

• długich łat (wycinane ~ 2 kb)

• U Eukaryota

• wycinane ~25-30 nt

Xeroderma pigmentosum

• Pol. skóra pergaminowata i barwnikowa

• Choroba genetyczna związana z mutacjami genów kodujących białka systemu NER (7 grup komplementacji)

• U człowieka to NER odpowiada za naprawę fotoproduktów

• Działanie światła słonecznego wywołuje liczne przebarwienia i nowotwory skóry

• Nie ma lekarstwa – pacjenci muszą całkowicie unikać światła słonecznego

Nobel 2015 (chemia)

• Aziz Sancar, za opisanie mechanizmu NER

Naprawa błędnie sparowanych nukleotydów (MMR)

• W odróżnieniu od DR, BER i NER nie dotyczy uszkodzeń w DNA, tylko błędów replikacji – wstawionych niewłaściwych nukleotydów (np. błędy wynikające z tautomerii zasad)

• Rozpoznawane zaburzenie podwójnej helisy, błędny nukleotyd wraz z otoczeniem (nawet do 1 kb) usuwany, po czym polimeraza

uzupełnia lukę

• Problem: jak rozpoznać, która nić jest rodzicielska (i ma właściwy nukleotyd), a która potomna (z błędem)

Naprawa błędnie sparowanych nukleotydów (MMR)

• U bakterii nić rodzicielska jest metylowana

• U Eukaryota metylacja też ma

znaczenie (u ssaków, u drożdży już nie), ale są też inne

mechanizmy (sprzężenie z

replikacją, białka naznaczające nić rodzicielską)

Naprawa błędnie sparowanych

nukleotydów (MMR)

Nobel 2015 (chemia)

• Paul Modrich, za opisanie mechanizmu MMR

Naprawa pęknięć DNA

• Pęknięcia w jednej nici są łatwe do naprawienia: polimeraza +

ligaza. Białka PARP chronią jednoniciowe fragmenty przed dalszą degradacją

• Pęknięcia dwuniciowe są trudniejsze do naprawienia

• Powstają np. w wyniku działania promieniowania jonizującego

• Blokują replikację, nienaprawione mogą doprowadzić do utraty dużych fragmentów chromosomu podczas podziału

Naprawa pęknięć dwuniciowych

• Łączenie końców

niehomologicznych (NHEJ)

• Występuje u Eukaryota,

uproszczony wariant może też u bakterii

System SOS u bakterii

• Przy rozegłych uszkodzeniach

matrycy (miejsca AP, fotoprodukty, uszkodzone zasady)

• Białko RecA pokrywa matrycę

• Polimeraza V z RecA tworzy mutasom

• Replikacja zachodzi, ale generuje wiele błędów

Rekombinacja

Rekombinacja

• Procesy pękania i ponownego łączenia łańcuchów nukleotydowych

• Opisana w związku z crossing-over

• Pierwotna funkcja – naprawa pęknięć nici po replikacji, odblokowywanie widełek replikacyjnych

• Crossing-over utrzymuje chromosomy homologiczne razem – ułatwia segregację

• Bardzo ważna funkcja dla zapewnienia ewolucyjnej dynamiki genomu (wtórna)

Typy rekombinacji

• Rekombinacja homologiczna (ogólna)

• zachodzi między fragmentami DNA o znacznej homologii

• pomiędzy dwiema cząsteczkami lub w obrębie jednej

• crossing-over, naprawa DNA

Typy rekombinacji

• Rekombinacja umiejscowiona

• Zachodzi między cząsteczkami mającymi jedynie krótki obszar homologii

• Regulowana przez specyficzne enzymy

• Np. integracja genomów fagowych

Typy rekombinacji

• Transpozycja

• Przeniesienie fragmentu DNA z jednej pozycji w genomie w inną

• Replikatywna: przenoszona kopia sekwencji

• Konserwatywna: przenoszona sekwencja oryginalna

• Różne mechanizmy (z udziałem

DNA i odp. białek, retrotranspozycja za pośrednictwem RNA itp.)

Modele rekombinacji homologicznej

• Holliday

• Meselson-Radding

Konwersja genu

Zmiana allelu w trakcie mejozy, zmienia rozkład z 2:2 na 3:1. Nie da się wyjaśnić w modelu Hollidaya.

Model pęknięć dwuniciowych

Model pęknięć dwuniciowych

Konwersja genu przez MMR

Możliwe jest wiele sposobów rozcięcia podwójnej struktury Hollidaya, dających wymianę nici, brak wymiany, konwersję itp

Maszyneria rekombinacyjna

• Wiele różnych wariantów, niektóre enzymy zachowane od bakterii do ssaków, inne specyficzne

• Kompleks RecBCD – tworzy dwuniciową cząsteczkę z wolnym jednoniciowym końcem. Helikaza + nukleaza

• inne warianty: RecF, RecE

• RecA – wiąże koniec jednoniciowy, inwazja nici

• RuvA, RuvB, RuvC – przemieszczanie się rozgałęzienia, rozłączenie struktury Hollidaya

• U eukariontów i niekt. bakterii w rozłączaniu bierze udział topoizomeraza

Rekombinacja i naprawa DNA

• Naprawa pęknięć dwuniciowych

• Gdy maszyneria widełek replikacyjnych napotka miejsca z

uszkodzeniami DNA, w nici potomnej powstaje luka. Replikacja często się zatrzymuje (kolaps widełek replikacyjnych)

• Naprawa polega na wykorzystaniu nieuszkodzonej cząsteczki potomnej do uratowania replikacji

• Mechanizm rekombinacji homologicznej – główna funkcja

Naprawa pęknięć przez rekombinację

• Postreplikacyjna - w fazie stacjonarnej

• Replikacyjna - zapobieganie kolapsowi replikacji przy pęknięciach matrycy

Naprawa pęknięć dwuniciowych przez rekombinację

• Pęknięcia dwuniciowe często powodowane są przez promieniowanie jonizujące, UV.

• Mutanty defektywne w rekombinacji – większa wrażliwość na promieniowanie (mutanty rad

drożdży)

http://afmi1.uaa.alaska.edu/research.html

Naprawa przez rekombinację

Próba replikacji pękniętej nici – kolaps widełek

Funkcje rekombinacji

• Naprawa pęknięć i utrzymywanie widełek replikacyjnych – najstarsza i podstawowa funkcja

• Pomaga w parowaniu chromosomów homologicznych – u Eukaryota

• Generuje różnorodność genotypów w rozmnażaniu płciowym (Eukaryota) – funkcja wtórna

Rekombinacja umiejscowiona

• Przykłady

• Integracja faga (np. λ) do genomu

• Wykorzystywana przez ruchome elementy genetyczne (transpozony, wirusy, niektóre introny)

• Specyficzne enzymy – rekombinazy (np. integraza λ)

• Wykorzystywana w inżynierii genetycznej (system rekombinazy Cre)

• Delecje warunkowe

• Usuwanie markerów selekcyjnych

Transpozycja

• Nie jest odrębnym mechanizmem rekombinacji

• Proces wykorzystujący rekombinację do przenoszenia fragmentów DNA

• Transpozycja DNA

• replikatywna

• konserwatywna

• Retrotranspozycja

• Przepisanie RNA na DNA – odwrotna transkryptaza

• Integracja utworzonego DNA do genomu (integrazy)

• Np. retrowirusy, retrotranspozony, niektóre mobilne introny

Mutacje

Ujęcie genetyczne

Powstawanie mutacji - teorie

• Spontaniczne

• powstają przypadkowo, środowisko może wpływać na częstość (np.

mutageny) mutacji, ale nie na to, w którym genie zachodzą

• Indukowane

• powstają w konkretnym genie w odpowiedzi na czynnik selekcyjny

Test fluktuacyjny

• Pojawianie się mutantów E. coli opornych na faga T1

• Jeżeli pojawiają się w odpowiedzi na kontakt z fagiem, to fluktuacje liczby

opornych kolonii z każdej hodowli będą niewielkie

• Jeżeli pojawiają się spontanicznie, to

liczba opornych kolonii będzie zmienna, zależnie od tego, kiedy w hodowli pojawił się mutant

indukowane spontaniczne

Test fluktuacyjny

indukowane spontaniczne Luria & Delbrück, 1943

Poziom molekularny DNA

• Podstawienia (punktowe)

• Tranzycje

• zmiana puryny w purynę, pirymidyny w pirymidynę

• Transwersje

• zmiana puryny w pirymidynę i vice versa

• Tranzycje są częstsze – tautomeria zasad jest najczęstszą przyczyną błędów replikacji, a prowadzi do tranzycji

• Delecje i insercje

• Rearanżacje na dużą skalę

Mutacje – poziom kodu genetycznego

• Podstawienia

• Niesynonimiczne

• Zmiany sensu (missense)

• Nonsens (nonsense)

• Synonimiczne (ciche)

• Mogą niekiedy wpłynąć na fenotyp - efekt częstości wykorzystywania kodonów synonimicznych

Mutacje – poziom kodu genetycznego

• Zmiany fazy odczytu

• zmienia sekwencję i/lub długość kodowanego białka poniżej miejsca wystąpienia

• Delecje lub insercje w białku

• delecje lub insercje wielokrotności 3 nukleotydów

• delecje lub insercje eksonów

• Deficjencja – rozległa delecja, np. obejmująca cały gen

Mutacje – efekty fenotypowe

• Klasyfikacja Müllera

• nullomorfy

• hipomorfy

• hipermorfy

• antymorfy

• neomorfy

Nullomorfy

• Brak jakiejkolwiek funkcji genu

• Tzw. allele null, inna nazwa: amorfy

• Nullomorfy:

• transkrypcyjne (brak transkryptu)

• translacyjne (brak białka wykrywalnego przeciwciałem)

• inaktywacyjne (obecne białko, ale całkowicie nieaktywne)

• najpewniejszy sposób na uzyskanie nullomorfa – deficjencja (pełna delecja)

• Często recesywne

• Dominacja (lub kodominacja) w przypadku efektu ilości białka - haploinsuficjencja

Hipomorfy

• Obniżona aktywność produktu, niewystarczająca do uzyskania dzikiego fenotypu homozygoty

• Obniżenie ilości produktu lub produkt o obniżonej aktywności

• Np.

• obniżona transkrypcja, splicing, stabilność, translacja

• obniżona aktywność katalityczna

• Często recesywne

Hipomorfy vs. nullomorfy

• Df – deficjencja, czyli całkowita delecja, m – badana mutacja

• Deficjencja jest zawsze nullomorfem

• Jeżeli genotyp m/Df daje cięższy fenotyp niż m/m, to m jest hipomorfem, jeżeli taki sam, to nullomorfem

• Wprowadzenie kolejnych kopii allelu m daje fenotyp coraz lżejszy, przy nullomorfach – bez różnicy

Hipomorfy vs. nullomorfy

• Uzyskanie hipomorfa zamiast nullomorfa może utrudnić analizę fenotypu, ale...

• Hipomorfy mogą być jedynym sposobem na badanie ważnych genów

Hipermorfy

• Fenotyp wynika z:

• nadmiaru produktu genu (np. nadekspresja)

• nadmiernie wysokiej aktywności produktu

• Df – deficjencja, czyli całkowita delecja, m – badana mutacja

• Fenotyp m/+ cięższy niż m/Df; zwykle też m/m cięższy od m/+

Antymorfy

• Zmutowany produkt ma działanie antagonistyczne wobec dzikiego

• Fenotyp podobny do fenotypu nullomorfa lub hipomorfa, ale z definicji dominujący

• Zwiększenie dawki allelu dzikiego może osłabić (odwrócić) fenotyp

• Możliwe odwrócenie (pseudorewersja) przez kolejną mutację znoszącą ekspresję zmutowanego allelu

• Inny termin – mutacje dominujące negatywne (dominant negative)

Antymorfy

“Advanced Genetic Analysis: Finding Meaning In A Genome” RS Hawley, MY Walker, Blackwell 2003

Mutacje w genach podjednostek tubuliny blokujące polimeryzację

Antymorf – zespół Marfana

• Dominująca mutacja w genie FBN1 kodującym fibrylinę – białko tkanki łącznej

• Zmutowane białko blokuje polimeryzację białka prawidłowego

• Defekty tkanki łącznej, aorty i zastawek serca, wysoki wzrost, arachnodaktylia

• Ok. 1:5 000 osób

Neomorfy

• Aktywność genu w niewłaściwym miejscu lub czasie

• np. mutacje heterochroniczne (ekspresja w niewłaściwym czasie)

• przykład: chłoniak Burkitta: translokacja fragmentu chromosomu 8 na 14 przenosi gen c-myc pod kontrolę silnego promotora IGHα

aktywnego w limfocytach

• Niewłaściwa aktywność, ale nie toksyczna dla produktu dzikiego

• Wiele mutantów regulatorowych

• Np. białko pozbawione domeny odpowiadającej za regulację aktywności, konstytutywnie aktywne

Neomorf

• Antennapedia (Antp73b)

• Sekwencja genu Antp przeniesiona w pobliże promotora genu ulegającego ekspresji w głowie

• Rozwój odnóży na segmencie głowowym

Inne terminologie

• Mutacje utraty funkcji (loss-of-function)

• nullomorfy i hipomorfy w klasyfikacji Mullera

• Mutacje nabycia funkcji (gain-of-function)

• neomorfy i hipermorfy w klasyfikacji Mullera

• Mutacje dominujące negatywne

• antymorfy

• niekiedy zaliczane do “nabycia funkcji” albo “utraty funkcji” – częste niejednoznaczności

Mutacje utraty funkcji

• Null – całkowita utrata funkcji. Np. deficjencja.

• Częściowa utrata funkcji (hipomorf). Dotyczy poziomu produktu lub jego aktywności.

• Warunkowe

• np. temperaturo-wrażliwe – utrata aktywności tylko w warunkach

restrykcyjnych - np. podwyższona (ts) lub obniżona (cs) temperatura.

• Ważne narzędzie do badania genów, w których mutacje null są letalne

Mutacje letalne

• Badane za pomocą alleli warunkowych

• uzyskiwanych naturalnie (poszukiwanie mutantów np. ts)

• konstruowanych, przykłady dla drożdży:

• reprymowalne promotory (np. tet-off)

• fuzje z sekwencją peptydową powodującą degradację białka w podwyższonej temperaturze (degron)

• uszkodzenia w sekwencji 3’ UTR mRNA: DAmP (decreased abundance by mRNA perturbation)

Dominacja i recesywność

• Dominację i recesywność należy rozpatrywać pod kątem

• konkretnego fenotypu

• poziomu organizacji (komórka vs. organizm)

Dominacja i recesywność

• Dominację i recesywność należy rozpatrywać pod kątem

• konkretnego fenotypu

• np. u myszy allel A^Y – dominujący pod względem koloru, recesywny letalny

wt (agouti) mutant yellow

agouti × agouti ➔ same agouti

agouti × yellow ➔ ½ yellow i ½ agouti yellow × yellow ➔ 2/3 yellow i 1/3 agouti

AA × AA ➔ AA

AA × AA^Y ➔ A A^Y; AA

AA^Y × AA^Y ➔ 1 AX^YA^Y; 2 A A^Y; 1 AA

Dominacja i recesywność

• Poziomu organizacji (komórka vs. organizm)

• np. supresory nowotworów (p53, Rb)

• Na poziomie komórkowym recesywne – komórka z jednym allelem dzikim funkcjonuje prawidłowo

• Na poziomie organizmu (rodowody) dominujące – u heterozygot rozwija się zespół chorobowy częstego występowania rzadkich nowotworów

(zespół Li-Fraumeni, retinoblastoma)

• u heterozygot prawdopodobieństwo zmutowania jedynej pozostającej kopii w jednej z bardzo wielu komórek i rozwinięcia się nowotworu jest wysokie

Dominacja i recesywność

• Mutacje nullomorficzne i hipomorficzne (utraty funkcji) z reguły są recesywne

• Jeden allel pozostaje aktywny i wytwarza produkt. Ilość produktu (enzymu) nie jest limitująca (limituje zwykle substrat)

• Ponieważ są to najczęstsze mutacje, to większość izolowanych mutacji jest recesywna

Haploinsuficjencja

• Wyjątek: haploinsuficjencja

• Jedna kopia (allel) nie wystarcza do zapewnienia odpowiedniej ilości produktu

• Np. białka rybosomalne

• Mutant Minute u Drosophila: heterozygota – opóźniony rozwój, anomalie rozwojowe; homozygota – letalna

• U drożdży stwierdzono dla około 3% (~200) genów

• Zdarza się haploinsuficjencja warunkowa – heterozygota objawia fenotyp tylko w konkretnych warunkach środowiska

Haploinsuficjencja

• Rodzinna hipercholesterolemia

• Mutacje w genach LDLR (receptor LDL – low density lipoprotein) i

ApoB (apolipoproteina B – część kompleksu LDL odpowiedzialna za oddziaływanie z receptorem)

• Heterozygoty: podwyższony poziom LDL we krwi, miażdżyca, choroby serca ok. 40 r. życia

• leczenie: statyny, dieta

• Homozygoty: ciężkie schorzenia serca i naczyń już w dzieciństwie

• leczenie: trudne, wysokie dawki statyn, przeszczep wątroby

Haploinsuficjencja warunkowa

• Anemia sierpowata

• Mutacje w genie β-globiny

• Choroba recesywna, ale w warunkach niskiego ciśnienia (wysoko w górach) heterozygoty chorują – warunkowa haploinsuficjencja

• Dodatkowy fenotyp – odporność na malarię, fenotyp dominujący

Anemia sierpowata

Częstość allelu HbS Występowanie malarii (historyczne)

Znani nosiciele allelu HbS

Lassana Diarra

(ex. Real Madryt, ex. rep. Francji)

Ryan Clark

(Pittsburgh Steelers)

HbS i sport

• W latach 2004 - 2008 5 przypadków śmierci u zawodników akademickiej ligi futbolu amerykańskiego powiązanych z

nosicielstwem anemii sierpowatej

• ~2% wszystkich (reszta to inne choroby, urazy i przyczyny niezwiązane z uprawianym sportem)

• ryzyko u nosicieli 37 x wyższe, niż u homozygot dominujących

Źródło: Br J Sports Med. 2012 Apr;46(5):325-30.

Mutacje dominujące

• Haploinsuficjencja nullomorfów i hipomorfów

• Hipermorfy

• Antymorfy – więcej kopii allelu dzikiego może odwrócić fenotyp

• Neomorfy

Podstawy genetyki V

Interakcje genetyczne. Genetyczne podstawy biologii systemów - interaktomika. Genetyczne podstawy

rozwoju.

W obrębie jednego genu

Rewersja i pseudorewersja

• Rewersja: mutacja powrotna, w tej samej pozycji przywraca dziki allel

• Pseudorewersja: mutacja w innej pozycji tego samego genu przywraca dziki fenotyp

• Np. mutacja blokująca (całkowicie lub częściowo) ekspresję

dominującego allelu antymorficznego lub neomorficznego może przywrócić dziki fenotyp heterozgoty

Rewersja

UAU -> UAA -> UAC tyr stop tyr

UGG -> UGA -> CGA trp stop arg

• Dotyczy tego samego kodonu, ale nie musi przywracać tego samego aminokwasu, może dotyczyć tego samego lub innego nukleotydu

• Podstawienia często rewertują, ale rozległe delecje – nigdy (albo bardzo rzadko)

Pseudorewersja

• “Supresja wewnątrzgenowa”

• Specyficzna względem allelu

• Narzędzie do badania oddziaływań między aminokwasami wewnątrz białka

Pseudorewersja – badanie struktury białka

Sommers & Dumont,1997, J Mol Biol 266:559-575

Komplementacja

m1 +m2

+m1 m2

m1 +m2

+m1 m2

Jest funkcjonalny allel jednego i drugiego

genu

Oba allele

niefunkcjonalne

Komplementacja wewnątrzgenowa

• Dwie mutacje w tym samym genie w układzie trans komplementują

• Mutacje w dwóch niezależnych domenach białka

domena 1 domena I1

domena 1 domena I1

Komplementacja wewnątrzgenowa

• Dwie mutacje w tym samym genie w układzie trans komplementują

• Transwekcja – jedna z mutacji w elemencie regulatorowym, który może działać w układzie cis (np. enhancer)

• Wymaga parowania chromosomów homologicznych w komórkach somatycznych w interfazie – nie u wszystkich organizmów.

Obserwowane głównie u Drosophila

“Advanced Genetic Analysis: Finding Meaning In A Genome” RS Hawley, MY Walker, Blackwell 2003

Pomiędzy genami

Interakcja genetyczna

• Fenotyp podwójnego mutanta AB nie jest sumą fenotypów mutacji A i B

• Dla ujęcia ilościowego wymagana jest liczbowa miara fenotypu

• Np. czas podziału (czas generacji) – czas wymagany do podwojenia liczby komórek w hodowli

• Ujęcie jakościowe wymaga dobrze zdefinowanych, dyskretnych (0,1) fenotypów – np. letalność

Problem terminu “epistaza”

• Epistaza (“epistasis”), Bateson 1909 – jeden z rodzajów interakcji

• w tym znaczeniu stosowane w genetyce klasycznej

• Epistaza (“epistacy”), Fisher 1918 - wszelkie interakcje genetyczne

• w tym znaczeniu używane w genetyce populacji i genetyce ewolucyjnej

Interakcje

• Łagodzące, pozytywne (alleviating interactions)

• Fenotyp podwójnego mutanta lżejszy, niż przewidywany dla sumowania fenotypów mutantów pojedynczych

• Syntetyczne, pogarszające, negatywne (synthetic, aggravating interactions)

• Fenotyp podwójnego mutanta cięższy, niż przewidywany dla sumowania fenotypów pojedynczych mutantów

Ujęcie ilościowe

Dixon et al. 2009, Annu Rev Genet 43:601-25

• U mikroorganizmów typową miarą dostosowania (fenotypu) jest tempo podziałów

• Przy braku interakcji oczekiwane tempo podziałów podwójnego mutanta to iloczyn wartości mutantów pojedynczych

Ujęcie ilościowe - interakcje syntetyczne

Dixon et al. 2009, Annu Rev Genet 43:601-25

Ujęcie ilościowe – interakcje łagodzące

Dixon et al. 2009, Annu Rev Genet 43:601-25