β-galaktozydaza (GAL) i α-mannozydaza (MAN) są egzoglikozydazami lizosomal- nymi uczestniczącymi w syntezie gliko- koniugatów w siateczce endoplazma- tycznej oraz aparacie Golgiego i ich degradacji w lizosomach. W chorobach nowotworowych stwierdzono wzrost aktywności egzoglikozydaz lizosomal- nych w tkankach i płynach ustrojowych.
Badanie miało na celu ocenę aktywno- ści GAL i MAN w surowicy krwi chorych z gruczolakorakiem jelita grubego.
Materiałem badanym była surowica krwi 14 chorych z potwierdzonym histo- patologicznie gruczolakorakiem jelita grubego oraz 14 osób zdrowych.
GAL i MAN w surowicy krwi oznaczono metodą Zwierza i wsp. w modyfikacji Szajdy i wsp. Do pomiaru aktywności GAL i MAN użyto czytnika płytek ELX800 firmy BIO-TEK. Stężenie aktywności GAL i MAN wyrażono w pKat/ml, a aktyw- ność specyficzną w pKat/mg białka.
Białko całkowite w surowicy krwi ozna- czono metodą Lowry. Stężenie białka wyrażano w mg/ml.
Wykazano istotny wzrost stężenia ak- tywności GAL (p=0,002) i MAN (p=0,02) w surowicy krwi chorych z gruczolako- rakiem jelita grubego w porównaniu do aktywności badanych enzymów w surowicy krwi osób zdrowych. Nie stwierdzono istotnych różnic (p=0,9511) w stężeniu białka całkowitego w suro- wicy krwi chorych z gruczolakorakiem jelita grubego i surowicy krwi osób zdro- wych. Aktywność specyficzna GAL (p=0,003) i MAN (p=0,03) w surowicy krwi pacjentów z gruczolakiem jelita grubego była istotnie wyższa od aktyw- ności specyficznej badanych enzymów w surowicy krwi osób zdrowych.
Oznaczenie aktywności GAL i MAN w surowicy krwi może mieć zastosowa- nie w diagnostyce gruczolakoraka jelita grubego. Podjęte badanie wymaga jed- nak dalszych wnikliwych badań celem potwierdzenia wartości diagnostycznej egzoglikozydaz lizosomalnych w diagno- styce onkologicznej gruczolakoraka jelita grubego.
S
Słłoowwaa kklluucczzoowwee:: gruczolakorak jelita grubego,β-galaktozydaza (GAL), α-man- nozydaza (MAN), surowica krwi.
Współczesna Onkologia (2007) vol. 11; 2 (64–66)
Aktywność ββ-galaktozydazy
i αα-mannozydazy w surowicy krwi chorych z rakiem jelita grubego
Activity of β-galactosidase and α-mannosidase in the serum of patients with colon adenocarcinoma
Sławomir Dariusz Szajda1, Jadwiga Snarska2, Małgorzata Borzym-Kluczyk1, Beata Zalewska3, Napoleon Waszkiewicz4, Marcin Bierć1, Krzysztof Zwierz1
1Zakład Biochemii Farmaceutycznej
2I Klinika Chirurgii Ogólnej i Endokrynologicznej
3Zakład Diagnostyki Obrazowej SPDSK
4Klinika Psychiatrii, Akademia Medyczna w Białymstoku
Wstęp
β-galaktozydaza (GAL) i α-mannozydaza (MAN) to egzoglikozydazy lizoso- malne [1, 2], które uczestniczą w katabolizmie glikokoniugatów. β-galaktozyda- za hydrolizuje reszty galaktozy od nieredukcyjnego końca oligosacharydów glikoprotein i proteoglikanów, natomiast α-mannozydaza odszczepia resztę mannozy od nieredukcyjnego końca N-wiązanych łańcuchów oligosachary- dowych glikoprotein. Działanie MAN jest końcowym etapem katabolizmu glikokoniugatów [1, 3]. W naszych poprzednich publikacjach wykazaliśmy wzrost aktywności egzoglikozydaz lizosomalnych w tkankach i płynach bio- logicznych pacjentów z nowotworami [4–6].
Celem obecnej pracy jest ocena aktywności GAL i MAN w surowicy krwi chorych z gruczolakorakiem jelita grubego i stwierdzenie zasadności dalszych badań w celu ustalenia czy GAL i MAN mogą być biochemicznymi markera- mi gruczolakoraka tego odcinka przewodu pokarmowego.
Materiał i metody
Krew pobrano od 14 pacjentów (9 kobiet i 5 mężczyzn) w wieku od 39 do 81 lat (średnia 67±12,09 lat) z rozpoznanym histopatologicznie gruczolako- rakiem (adenocarcinoma) jelita grubego, operowanych w I Klinice Chirurgii Ogólnej i Endokrynologicznej AM w Białymstoku. Grupę kontrolną stanowi- ło 14 osób zdrowych (5 kobiet i 9 mężczyzn) w wieku od 22 do 62 lat (śred- nia 35±10,67 lat). Stwierdzono zgodnie z klasyfikacją kliniczno-histopatolo- giczną u chorych z gruczolakorakiem jelita grubego stopień zróżnicowania komórkowego nowotworu G2 i stopnie zaawansowania klinicznego pT1 (n=1), pT2 (n=6), pT3 (n=5) i pT4 (n=2). Badanie wykonano za zgodą Komisji Bioetycznej Akademii Medycznej w Białymstoku (Nr zgody: R-I-003/153/2005).
Surowicę z wykrzepionej krwi otrzymano przez wirowanie przy 4000 x g w ciągu 10 min. Egzoglikozydazy lizosomalne GAL i MAN w surowicy krwi oznaczono metodą Zwierza i wsp. [2] w modyfikacji Szajdy i wsp. [4]. Pomia- ru aktywności GAL i MAN dokonano przy użyciu czytnika płytek EL
X800 i pro-gramu komputerowego KC junior firmy BIO-TEK. Absorbancję powstałego kompleksu o barwie żółtej mierzono przy długości fali 405 nm. Aktywność GAL i MAN została wyrażona w pKat/ml (stężenie aktywności) i pKat/mg biał- ka (aktywność specyficzna).
Białko całkowite w surowicy krwi oznaczano metodą Lowry [7]. Absorban-
cję powstałego kompleksu o barwie niebiesko-purpurowej mierzono przy
użyciu spektrofotometru Specol 11 przy długości fali 750 nm. Stężenie biał-
ka wyrażano w mg/ml.
Exoglycosidasesβ-galactosidase (GAL) andα-mannosidase (MAN) take part in the synthesis of glycoconjugates in the endoplasmatic reticulum and Golgi apparatus, as well as their degradation in the lysosomes. An increase in the activity of exoglycosidases has been reported in the tissues and body fluids of patients with cancer.
The aim of our study was to evaluate the activity of GAL and MAN in the serum of patients with colon adeno- carcinoma.
The serum samples were taken from 14 patients with colon adenocarcinoma (confirmed histopathogically) and from 14 healthy persons.
GAL and MAN were determined in the blood serum by Zwierz et al., method as modified by Szajda et al. on the microplate reader (ELX800 of BIO-TEK).
The concentration of GAL and MAN activity was expressed in pKat/ml and the specific activity in pKat/mg of protein.
The concentration of protein in the blood serum was determined by the method of Lowry et al. and expressed in mg/ml.
We showed significantly increased concentration of GAL (p=0.002) and MAN (p=0.02) activities in the blood serum of patients with colon adenocarcinoma, in comparison to serum GAL and MAN activities of healthy persons. No significant differences (p=0.9511) were found in the concentration of protein in blood serum of patients with colon adenocarcinoma, in comparison to healthy persons. There were significantly higher specific activities of GAL (p=0.003) and MAN (p=0.03) in blood serum of colon adenocarcinoma patients, in comparison to GAL and MAN activities in blood serum of healthy persons.
Significantly increased activities of GAL and MAN in blood serum of patients with colon adenocarcinoma suggest the possibility of determination of GAL and MAN serum activity as markers of colon adenocarcinoma. However, further studies are necessary to confirm the diagnostic value for the determination of serum activity of GAL and MAN in oncological diagnostics of colon adenocarcinoma.
K
Keeyy wwoorrddss:: colon adenocarcinoma, β-galactosidase (GAL), α-mannosidase (MAN), blood serum.
Współczesna Onkologia (2007) vol. 11; 2 (64–66)
200
100
0
ppKKaatt//mmll
p
p==00,,000022 pp==00,,0022
o ossoobbyy zzddrroowwee
rraakk jjeelliittaa g grruubbeeggoo
o ossoobbyy zzddrroowwee
rraakk jjeelliittaa g grruubbeeggoo G
GAALL MMAANN
RRyycc.. 11.. Stężenie aktywności GAL i MAN (pKat/ml) w surowicy krwi chorych z gruczo- lakorakiem jelita grubego
FFiigg.. 11.. Concentration of GAL and MAN activity (pKat/ml) in serum of patients with colon adenocarcinoma
Do analizy statystycznej testem Manna-Whitneya wykorzystano pakiet statystyczny SPSS® 8.0 for Windows PL (SPSS, Chicago, IL, USA). Za poziom istotności statystycznej przyjęto p <0,05.
Wyniki
Stężenie aktywności GAL i MAN w surowicy krwi chorych z gruczolakorakiem jelita grubego odpowiednio wynosiło 114,51±32,05 pKat/ml i 130,61±32,05 pKat/ml, a u osób zdrowych 80,86±17,98 pKat/ml i 102,87±23,72 pKat/ml (ryc. 1.).
Stężenie aktywności GAL (p=0,002) i MAN (p=0,02) w surowicy krwi cho- rych z gruczolakorakiem jelita grubego było istotnie wyższe w porównaniu do aktywności badanych enzymów w surowicy krwi osób zdrowych.
Brak było istotnych statystycznie różnic (p=0,9511) w stężeniu białka cał- kowitego w surowicy krwi chorych z gruczolakorakiem jelita grubego i suro- wicy krwi osób zdrowych (ryc. 2.).
Aktywność specyficzna GAL i MAN w surowicy krwi chorych z gruczolako- rakiem jelita grubego wynosiła odpowiednio 2,46±0,69 pKat/mg białka i 2,80±0,74 pKat/mg białka, a w surowicy krwi osób zdrowych 1,73±0,41 pKat/mg białka i 2,19±0,53 pKat/mg białka. Jak wynika z ryc. 3., aktywność specyficzna GAL (p=0,003) i MAN (p=0,03) w surowicy krwi pacjentów z gru- czolakiem jelita grubego jest istotnie wyższa od aktywności specyficznej ba- danych enzymów w surowicy krwi osób zdrowych.
60
30
0
mmgg//mmll
o
ossoobbyy zzddrroowwee rraakk jjeelliittaa ggrruubbeeggoo
R
Ryycc.. 22.. Stężenie białka (mg/ml) w surowicy krwi chorych z gruczolakorakiem jelita grubego
FFiigg.. 22.. Concentration of protein (mg/ml) in serum of patients with colon adenocarcinoma
Omówienie wyników
Glikokoniugaty podlegają ciągłym przemianom związa- nym z rozkładem starych i syntezą nowych cząsteczek.
Degradacja glikokoniugatów zachodzi głównie w lizosomach przy udziale lizosomalnych enzymów hydrolitycznych, do któ- rych należą GAL i MAN [1, 3]. Genetycznie uwarunkowany brak GAL jest przyczyną spichrzania siarczanu keratanu, fragmentów glikoprotein i gangliozydów. W przypadku wro- dzonego braku GAL dochodzić może do rozwoju choroby Krabbego, charakteryzującej się tendencją do odkładania się galaktozyloceramidu [8]. Wadliwa struktura MAN jest przy- czyną mannozydozy, lizosomalnej choroby spichrzeniowej [9]. Bez prawidłowej aktywności MAN rozkład N – wiązanych oligosacharydów – zatrzymuje się na mannozie. Prowadzone przez nasz zespół badania wskazują na istotny wzrost stęże- nia aktywności i aktywności specyficznej GAL i MAN w suro- wicy krwi chorych z gruczolakorakiem jelita grubego (ryc. 1. i 3.).
Takie stwierdzenie może być podstawą do rozważań, czy róż- nice w aktywności badanych egzoglikozydaz lizosomalnych mogą być wykorzystane w rozpoznaniu i monitorowaniu przebiegu gruczolakoraka jelita grubego. Prowadzone przez nasz zespół badania aktywności egzoglikozydaz lizosomal- nych w raku nerki [5], trzustki [4] czy mózgu [6] sugerują moż- liwość wykorzystania badania tych enzymów w diagnostyce onkologicznej.
Wnioski
1. Oznaczenie aktywności GAL i MAN w surowicy krwi mo- że mieć zastosowanie w diagnostyce gruczolakoraka je- lita grubego. Wymaga jednak dalszych wnikliwych badań celem potwierdzenia wartości diagnostycznej egzogliko- zydaz lizosomalnych.
Piśmiennictwo
1. Czartoryska B. Glikozydazy lizosomalne w katabolizmie heteropoli- sacharydów. Postępy Biochem 1977; 23: 229-66.
2. Zwierz K, Gindzieński A, Głowacka D, Porowski T. The degradation of glycoconjugates in the human gastric mucous membrane. Acta Med Acad Hung 1981; 38: 145-52.
3. Zwierz K, Gindzieński A, Ostrowska L, Stankiewicz-Choroszucha B.
Metabolism of glycoconjugates in human gastric mucosa a review.
Acta Med Hung 1989: 46; 275-88.
4. Szajda SD, Snarska J, Kamiński F, Siedlecka K, Waszkiewicz N, Knaś M, Zwierz K. The activity of N-acetyl-beta-D-hexosaminidase in serum and urine of patients with pancreatic cancer. Współcz Onkol 2006;
10: 92-5.
5. Borzym-Kluczyk M, Darewicz B, Knaś M, Szajda SD, Sulik M, Olszewska E, Zwierz K. The activity of N-acetyl-β-glucosaminidase and its isoenzymes in the renal tissue, serum and urine of patients with renal cancer. Współcz Onkol 2005; 9: 287-90.
6. Wielgat P, Walczuk U, Szajda S, Bien M, Zimnoch L, Mariak Z, Zwierz K.
Activity of lysosomal exoglycosidases in human gliomas. J Neurooncol 2006; 80: 243-9.
7. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall R. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem 1951; 193: 265-75.
8. Murray RK, Granner DK, Mayes PA. Biochemia Harpera. Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 1994.
9. Beccari T, Stinchi S, Orlacchio A. Lysosomal alpha-D-mannosidase.
Biosci Rep 1999; 19: 157-62.
Adres do korespondencji dr med. SSłłaawwoommiirr DD.. SSzzaajjddaa Zakład Biochemii Farmaceutycznej Akademia Medyczna
ul. Mickiewicza 2A 15-230 Białystok
tel. +48 85 748 56 90, +48 85 748 56 91 e-mail: spoak@amb.edu.pl
4
2
0
ppKKaatt//mmgg bbiiaałłkkaa
R
Ryycc.. 33.. Aktywność specyficzna GAL i MAN (pKat/mg białka) w surowicy krwi chorych z gruczolakorakiem jelita grubego FFiigg.. 33.. Specific activity of GAL and MAN activity (pKat/mg of protein) in serum of patients with colon adenocarcinoma
o ossoobbyy zzddrroowwee
rraakk jjeelliittaa g grruubbeeggoo
o ossoobbyy zzddrroowwee
rraakk jjeelliittaa g grruubbeeggoo G
GAALL MMAANN
p p==00,,0033 p
p==00,,000033
