WŁODZIMIERZ PUZYNA
W PŁYW R O ZPU SZC ZA LN IK A NA FLU O R ESC EN C JĘ KW ASÓW HUM INOW YCH
Zakład Fizyki A kadem ii Rolniczej w Szczecinie
WSTĘP
S p ektro sk op ia em isy jn a zy sk u je w o statn im okresie coraz w iększą p opu larn o ść w b ad aniach nad s tru k tu rą , w łaściw ościam i i w zajem n y m oddziaływ aniem obiektów o drobnych rozm iarach od m olekuł począw szy, a n a m ikro org anizam ch kończąc. W łaściw ości flu o rescen cy jn e kw asów próch niczn y ch u m o żliw iają zastosow anie spektroskopii em isy jn ej w b a d aniach ty ch sub stan cji.
Po dejm o w an e dotąd p ró b y b adań flu o rescen cji su b sta n c ji pró ch nicz ny ch [1, 2, 3, 4, 5] nie p rzy n io sły zadow alających rezu ltató w . Ogłaszane w y n ik i często obarczone są błęd am i m etodycznym i i nie rzadko in te r p reta cy jn y m i. D latego to p o d jęliśm y b ad an ia n ad flu o rescen cją ty c h su b stan cji od podstaw .
W pierw szy m etapie b ad ań / nad fluorescenc ją kw asów hum in o w y ch [6, 7] uzyskano rzeczyw iste w idm a w zbudzenia i em isji w ro ztw orach alkalicznych.
Stw ierdzono, że k ró tko falo w a część w idm w zbudzenia jest podobna do w id m absorpcji oraz że m iędzy w idm am i w zbudzenia i em isji nie m a sy m e trii zw ierciad lanej. K sz tałt w idm em isji zależny jest od długości fa li w zbudzającej.
U zyskane dane w sk azu ją n a złożony m echanizm em isji, o b jaw iający się w ystęp o w aniem ró żnorodnych flu oro fo ró w i zjaw isk w ew n ątrzm o le- k u larn eg o tra n s p o rtu energii. Różnice obserw ow ane w w id m ach em isji kw asów próchnicznych różnego ty p u i pochodzenia pozw alają m ieć n a dzieję n a zastosow anie flu o rescen cji jako jednego z k ry te rió w k lasy fik a c y jn y c h ty ch sub stan cji.
P ierw szy m k ro k iem w ty m k ie ru n k u jest w y jaśn ien ie podstaw ow ych pro blem ó w zw iązanych z m echanizm em em isji. B adanie w p ływ u roz puszczaln ik a n a flu o rescen cję może dostarczyć in fo rm acji o c h a ra k te rz e przejść zw iązanych ze św ieceniem , ro d zaju oddziaływ ań fluoroforów ze
strącen ie kw asem . N astępnie osad p rzep łu k iw an o trz y k ro tn ie w odą i su szono w te m p e ra tu rz e 50°C. P r e p a r a t A pochodził z gleby m urszow ej lasu A rk o n ka w Szczecinie, p re p a ra t В — z czarnoziem u n a pyle z oko lic Żabow a koło P y rzy c.
Jak o rozpuszczalników używ ano: m etan o lu i etan o lu 95-procentow e- go do fluorescencji firm y M erck, dioksanu do chrom atografii firm y LO BA oraz w ody d w u k ro tn ie d esty lo w an ej w a p a ra tu rz e szklanej.
R oztw ory do b ad ań sporządzano rozpuszczając w stęp nie 10 mg su ch e go p re p a ra tu w 1 m l 0,1 M NaOH, a n a stęp n ie dodaw ano odpow iednią ilość ta k przygotow anego k o n c e n tra tu do poszczególnych rozpuszczalni ków bądź ich m ieszanin. O stateczne stężenie w ynosiło 0,1 m g p re p a ra tu w 1 m l roztw o ru.
Skorygow ane w idm a w zb udzenia i em isji w ykonano n a sp ek tro fo to - flu o ry m e trz e H itach i M PF 4, w yposażonym w k o re k to ry p o tencjo m e- try czne. D la zm inim alizow ania efektów filtru w ew nętrzn ego stosow ano fro n ta ln ą obserw ację em isji. W celu u zy sk an ia odpow iedniego u staw ien ia k u w e ty z ro ztw o rem w stosun k u do m onochrom atorów zastosow ano zm o dy fikow an y u c h w y t do p ró b ek stałych.
W idm a absorpcji w ykonano na sp ektro fotom etrze Specord UV-Vis. WYNIKI I DYSKUSJA
W i d m a e m i s j i . O bydw a b adane p re p a ra ty w y k a z u ją w śro dow isku w odnym p rz y w zbudzeniu kró tk o falo w y m (A = 320 nm ) flu o - rescencję o b ejm u jącą cały zakres w id zialny (ryc. 1). W w idm ie p re p a ra tu В stw ierdzić m ożna w iększy udział pro m ieniow ania długofalow ego niż w w idm ie p re p a ra tu A. Św iadczy to o w iększym ud ziale rozb udo w a n y ch układów aro m aty czn y ch w em isji p re p a ra tu B. W artości w spółczyn nik a b arw y Q4/6 w ynoszą: 7,1 dla p re p a ra tu A i 4,8 dla p re p a ra tu В, a więc m ożna wnosić, że flu o rescen cja k o relu je z liczbą pierścien i a ro m a tycznych b ad an ych p rep arató w .
W ro ztw o rach m etanolow ych o b serw uje się spadek n a tę ż e n ia flu o re s cencji z rów noczesnym przesun ięciem m ak sim u m św iecenia w k ie ru n k u fal k ró tk ic h (około 10 n m w p rzy p a d k u p re p a ra tu A i 40 n m w p rz y p a d ku p re p a ra tu B). Z m niejszenie polarnośći rozpuszczalnika przez
zastoso-Rye. 1. Widma em isji kw asów hum inow ych w różnych rozpuszczalnikach a — preparat z gleby murszowej XWZb 320 nm, b — preparat z czarnoziemu na pyle „Żabów” XWZb 320 nm, с — preparat z czarnoziemu na pyle „Żabów*’ XWZb 440 nm; 1 — woda, 2 — m e
tanol, 3 — m etanol:etanol 1:4, 4 — m etanol:dioksan 1:4
Fig. 1. Em ission spectra o f humic acids (HA) in different siolvents
a — HA from m uck soil, excitation at 320 n m ,, b — HA from forest chernozem developed
from silt loam (“Żabów”), excitation at 320 nm^ с —ł HA “Żabów”, excitation at 440 nm; 1 — water, 2 — m ethanol, 3 — m ethanol:ethanol 1:4, (v/v), 4 — m ethanol:dioxan 1:4 (v/v)
w an ie m ieszaniny etanolu z m etan o lem prow adzi do dalszego p rze su n ię cia m ak sim u m w id m a w k ie ru n k u fa l k ró tk ich.
P ró b y u zy sk an ia trw a ły c h roztw orów kw asów hum in ow ych w DMSO, acetonie, dioksanie i czystym etan o lu nie pow iodły się ze w zględu n a w ypadanie rozpuszczonej sub stan cji.
zależnych od ty p u przejść elektro n o w y ch zw iązanych z em isją. W idm a zw iązane z p rzejściam i я* я u leg a ją w tak ie j sy tu a c ji nieznacznym przesunięciom krótkofalow ym , p rzejścia я* -> n c h a ra k te ry z u ją się n ie w ielkim i przesu nięciam i długofalow ym i, znaczne przesun ięcia w idm a w k ie ru n k u fal k ró tkich w roztw orach o niskiej polarności przyp isy w an e są kom pleksom charge-transfer.
In te rp re tu ją c obserw ow ane efek ty należy wziąć pod uw agę po lidy - sp ersy jn y c h a ra k te r kw asów hum inow ych. Można sądzić, że w w idm ach uw idacznia się sum a zróżnicow anych rea k c ji odrębnych em iterów n a zm iany środow iska. ,
Znaczne przesunięcia m aksim um em isji w yw ołane zm niejszeniem po larności środow iska mogą być w ynikiem dużych przesunięć w idm em isji fluoroforów długofalow ych przy rów noczesnych nieznacznych p rzesu n ię ciach w idm fluoroforów krótkofalow ych.
P rzesunięcie sum arycznego w idm a może być rów nież sk utkiem znacz niejszego spadku n atężen ia św iecenia fluoroforów długofalow ych niż k ró t kofalow ych p rzy niew ielkich przesunięciach w idm cząstkow ych.
Stosując w zbudzenie falam i dłuższym i m ożna z sum arycznego w idm a w yelim inow ać em isję krótkofalow ą i obserw ow ać bezpośrednio w zbudzo ną em isję długofalow ą. A naliza w idm fluorescencji p re p a ra tu B, uzyska n y ch przy w zbudzeniu 440 nm (ryc. lc), skłania raczej do p rzy jęcia d ru giej z w ym ienianych hipotez m echanizm u przesunięć m aksim um w idm a em isji w zbudzanej nadfioletem . Stosunkow o nieduże przesunięcia w idm długofalow ych, tow arzyszące zm ianie polarności rozpuszczalnika, w skazu ją na m ałe praw dopodobieństw o udziału kom pleksów charge-transfer w e fluorescen cji kw asów hum inow ych.
W yjaśnienia w ym aga przyczyna w zro stu natężenia św iecenia p re p a r a tu A w m ieszànym rozpuszczalniku dioksan-m etanol, m im o częściowe go w y trąc e n ia su b stan cji rozpuszczonej. M ożna przypuszczać, że fra k c ja pozostająca w roztw orze w chodzi w w iązania w odorow e z dioksanem , k tó r y w y k azu je silne właściwości akceptorow e. W p rzy p a d k u w iązania w o dorowego flu o ry zu jącej m o lekuły z u k ładem n iearo m aty cznym w y stę p u je często) w zro st w ydajności k w an to w ej św iecenia [8].
W i d m a w z b u d^z e n i a. W idm a w zbudzenia odw ierciedlają ab sorpcję ty ch chrom oforów układu, k tó re m ogą fluoryzow ać bezpośrednio
bądź sensybilizow ać św iecenie fluoroforów leżących w pąsiedztw ie. E fek ty oddziaływ ania rozpuszczalnika widoczne są rów nież w w idm ach w zbu dzenia.
C h a rak tery sty czn ą cechą typow ego w idm a w zbudzenia kw asów h u m i now ych (p re p a ra t B) w środow isku w odnym je s t w ystępow anie m onoto- nicznej części krótko falow ej p rzyp o m in ającej k ształtem w idm o absorpcji i pasm a części długofalow ej (ryc. 2a). M onofoniczna część w idm a w zbu dzenia wiąże się praw dopodobnie z em isją sensybilizow aną, n ato m iast pasm o długofalow e z em isją w zbudzaną bezpośrednio. N achylenie części krótkofalow ej, m ierzone stosunkiem natężen ia przy 270 nm do natężenia p rz y 320 nm , jest w środow isku w odnym stałe (tab. 1).
T a b e l a 1 Maksima fluorescencji kwasów huminowych w różnych rozpuszczalnikach
Fluorescence maxima of humic acids in different solvents 1
Rozpuszczalnik — Solvent
Preparat A — Preparation A Preparat В — Preparation В ^•wzb 3 2 0 nm j exc j^wzb exc 4 4 0 nm Avzb 320 nm 1 exc Awzb4 4 0 nm exc Woda — Water 5 2 0 (4 7 0 ) j 5 3 0 5 6 0 5 4 0 Metanol — Methanol 5 1 0 (4 7 0 ) 5 2 5 i 5 2 0 52 5 Metanol : etanol 1: 4 4 4 0 5 1 5 4 5 5 5 1 5 Methanol-ethanol 1:4 ; Metanol : dioksan 1 : 4 I 4 2 0 (5 0 0 - 5 1 0 ) ; 5 1 0 ! 11 Methanol-dioxan 11 ! : ! II
Położenie maksimów podano w nanometrach ; w nawiasach położenie zarysowujących się ramion widma
Position of the maxima is quoted in nanometers; in brackets — position of outlining spectre arms
T a b e l a 2 Współczynniki nachylenia I2 70/I320 widma wzbudzenia w różnych rozpuszczalnikach
Coefficients I270/I320 for excitation spectra in different solvents
Preparat A — Preparation A Preparat В — Preparation В Rozpuszczalnik --- j---
;---Solvent A0 bs 4 8 0 nm| Я0ь8 5 2 0 nm! A0 bs 5 6 0 nm, Л0 ь5 4 8 0 nni; A0bs 5 2 0 nmj Л0 ь5 6 5 0 nm
Woda — Water 2,09 i 2,09 1,98 1,62 1,65 1,68 Metanol Methanol Metanol: etanol 1 2,09 j 1 j 2,11 1 1,96 i 1 1,77 'j 1,82 1,80 1:4 Methanol-ethanol 1:4 2,40 1 j ! 2,56 1 1 2,37 ! i ! ! 2,02 2,21 i 2,21
^obs — długość fali, przy której obserwowano fluorescencję / cbs — wavelength at which the fluorescence was observed
Ryc. 2. Widma wzbudzenia kwasów hum inowych w różnych rozpuszczalnikach. KH „Żabów”
W m iarę obniżania polarności rozpuszczalnika w w idm ach w zbudze nia, od pow iadających em isji 560 i 520 nm , obserw u je się zanik c h a ra k te ry stycznego pasm a z rów noczesnym w zrostem n ach y len ia części n iesp e cyficznej (ryc. 3, tab. 2). W w idm ie w zbudzenia em isji 400 i 440 nm .nie
i
Fig. 3. Comparison of excitation niia w różnych rozpuszczalnikach.
Preparat „Żabów”, tabs 560 nm 1 — woda, 2 — m etanol, 3 — m eta
nol: etanol 1:4
Fig. 3. Comparison of excitation spectra in different solvents. HA
“Żabów”; observation at 560 nm 1 — water, 2 — m ethanol, 3 — m e
thanol: ethanol 1:4
zachodzą istotn e zm iany. W idm a w zbudzenia św iadczą o d egradacji fluo- roforów długofalow ych w środow isku niep o larnym . G dyby jed y n y m s k u t k iem w p ły w u rozpuszczalnika było obniżenie w ydajności kw antow ej, k sz ta łt w idm w zbudzenia nie pow inien ulegać zm ianie, ta k jak to m a m iejsce w p rz y p a d k u em isji 400 nm . Z m iany w w idm ach w zbudzenia em isji 480, 520 i 560 nm św iadczą o w yelim inow aniu pew nej liczby fluo- ro fo rów długofalow ych w roztw o rach alkoholow ych. W zrost n ach y len ia części niespecyficznej su geru je, iż elim inacji u legają flu o ro fo ry zw iązane z fra k c ją „bardziej aro m aty czn ą” . D egradacja tego ty p u może być w y n i kiem agregacji lub zm ian s tr u k tu ry poziom ów energetycznych su b stan cji rozpuszczonej.
P orów n u jąc oba badane p re p a ra ty stw ierdzić m ożna, że zm iany w w idm ach w zbudzenia w yraziściej w y stę p u ją w p rep aracie B, w k tó ry m w zrost w spółczynnika I270/320 uw idacznia się już w m etanolu, gd y ty m czasem w p rep aracie A analogiczny efek t p ojaw ia się dopiero w etanolu.
a — woda, b — m etanol, с — m etanol:etanol 1:4; Х0ь3: 1 — 400 nm, 2 — 440 nm, 3 — 480 nm,
4 — 520 nm, 5 — 560 nm. Widma znorm alizowano do I (270 nm). Widma 2, 3, 4, 5 są przesunięte
w stosunku do widm a 1 odpowiednio o 20, 40, 60 i 80 nm
Fig. 2. Excitation spectra of HA in different solvents. HA „Żabów”
а — water, ъ — m ethanol, с — m ethanol:ethanol 1:4 (v/v); observation: 1 — at 400 nm, 2 — at 440 nm, 3 — at 480 nm, 4 — at 520 nm, 5 — at 560 nm. Spectra are norm alized to l m.
LITERATURA
[1] S e a l B. K., R o y K. В., M u k h e r j e e S. K.: Fluorescence emission spectra and structure of humic and fulvic acids. J. Indian Chem., Soc. 41, 1964, 212. [2] D a t t a C., G h o s h K., M u k h e r j e e S. K.: Fluoroscence excitation spectra
of different fractions of humus. J. Indian Chem. Soc. 48, 1971, 279.
[3] M ü l l e r - W e g e n e r U.: Fluoreszenzspektroskopische Untersuchungen in H u minsäuren. Z. Pflanzenernähr. Bodenkd. 140, 1977, 563.
[4] G h o s h K., S c h n i t z e r M.: Fluorescence « excitation spectra of humic sub stances. Can. J. Soil Sei. 60, 1980, 373.
[5] B a c h e l i e r G.: Etude spectrographique de la fluorescence des acides hum i-ques et des acides fulviaues de divers sols. Cah. ORSTOM, Sér. Pédol., 18, 1980/81, 129.
[6] P u z y n a W.: Corrected fluorescence spectra of humic substances. Transaction of the International Symposium Humus et Planta VIII, Prague, 1983, s. 145. [7] P u z y n a W.: Badanie struktury substancji humusowych metodą spektroskopii
fluorescencyjnej. M ateriały V Zjazdu B iofizyków Polskich, Wrocław — Książ 1983, s. 37.
[8] P a r k e r C. A.: .Photolum inescence of solutions. Elsevier 1968.
в . П У ЗЫ Н А ВЛИЯНИЕ РАСТВОРИТЕЛЯ НА ФЛУОРЕСЦЕНЦИЮ ГУМИНОВЫХ КИСЛОТ Кафедра физики Сельскохозяйственной академии в Щецине Р езю м е В труде предпринимается попытка определения влияния растворителя на спектры воз буждения и эмиссии гуминовых кислот. Установлены значительные коротковые передви жения спектров возбуждаемой ультафиолетом эмиссии (320 п т) в ряде растворителей с уменьшающейся полярностью (метанол, метанол-этанол 1: 4, метанол-диоксан 1:4). В спек трах флуоресценции возбуждаемой радиацией 440 п т влияние растворителя менее заметное. Спектры возбуждения при долговолновом наблюдении (560 п т ) показывают в не полярных растворителях частичное замирание характерной полосы 480 п т , с одновремен ным повышением Наклона монотоничной коротковолновой части.
Наблюдаемые эффекты можно разъяснить различным реагированием долго- и коротко волновых флуорофоров на изменения полярности среды. Деградация долговолновых флуо- рофоров в среде с пониженной полярностью происходит по всей вероятности под влиянием агрегации молекул гуминовых кислот или конформационных изменений вызванных вли янием растворителя на внутримолекулярное равновесие. W. PUZYNA
SOLVENT EFFECT ON THE FLUORESCENCE OF HUMIC ACIDS / Department of Physics,
Agricultural U niversity of Szczecin S u m m a r y
An attempt of determination of the solvent effect on excitation and emission spectra of humic acids has been undertaken in the work. Considerable short-w a- velen gth shifts of the spectra of U V -excited em ission (320 mm) in a number of solvents of decreasing polarity (methanol, m ethanol : ethanol 1:4, m ethanol : dioxane 1:4) have been found. In spectra of the fluorescence excited by radiation of 440 nm the solvent effect is less distinct.
Excitation spectra at a long-w avelength observations (560 nm) exhibited in non- -polar solvents a partial disappearance of the characteristic 480 nm band, and si m ultaneous increase of the slope of monotonic short-w avelength part.
The effects observed can be explained byy a different response of long- and short-w avelength fluorophores to the m edium polarity changes. A degradation of long-w avelength fluorophores in the medium of a lowered polarity occurs most pro bably in consequence of aggregation of m olecules of humic acids or of conformation changes under the solvent effect on the interm olecular equilibrium.
Dr W łodzim ierz P uzyna
Zakład F izyk i AR Szczecin, ul. Janosika 8
