H YDROLIZA LIPIDÓW MLEKA ZA POMOCĄ LIPAZY TRZUSTKOWEJ

(1)

WYDZIAŁ CHEMICZNY POLITECHNIKI ŚLĄSKIEJ W GLIWICACH

K ATEDRA C HEMII O RGANICZNEJ , B IOORGANICZNEJ I B IOTECHNOLOGII

H YDROLIZA LIPIDÓW MLEKA ZA POMOCĄ LIPAZY TRZUSTKOWEJ

Prowadzący: mgr inż. Katarzyna Ludwik

(2)

WSTĘP TEORETYCZNY

Enzymy lipolityczne na przykładzie Lipazy

Lipaza należy do grupy enzymów lipolitycznych (klasa:hydrolazy, podgrupa:esterazy), hydrolizuje ona wiązanie estrowe występujące pomiędzy glicerolem i kwasami tłuszczowymi w obrębie różnorodnej grupy lipidów. Lipazy są szeroko rozpowszechnione w przyrodzie, występują w nasionach i organach wegetatywnych wielu roślin, w niektórych mikroorganizmach oraz w organizmach ludzi i zwierząt (trzustka, wątroba, ściana żołądka i jelit). Lipazy katalizują hydrolizę nierozpuszczalnych w wodzie triacylogliceroli (TAG). Reakcja ta zachodzi na granicy faz a produktami są kwasy tłuszczowe, diacyloglicerole (DAG), monoacyloglicerole (MAG) oraz glicerol. Lipazy katalizują również hydrolizę rozpuszczalnych w wodzie, krótkołańcuchowych estrów kwasów karboksylowych (reakcja zachodzi bardzo powoli).

TRIACETYLOGLICEROL (TAG) DIACETYLOGLICEROL (DAG) WOLNY KWAS

T£USZCZOWY H₂O

LIPAZA H₂O

DIACETYLOGLICEROL (DAG) WOLNY KWAS

T£USZCZOWY H₂O

LIPAZA H₂O

MONOACETYLOGLICEROL (MAG)

WOLNY KWAS T£USZCZOWY H₂O

LIPAZA H₂O

MONOACETYLOGLICEROL (MAG) GLICEROL

Hydroliza triacylogliceroli jest reakcją odwracalną, kierunek reakcji jest zależny od środowiska, przy czym nadmiar wody wywołuje hydrolizę, natomiast niska zawartość wody wywołuje estryfikacje glicerolu-reakcja odwrotna. Szybkość hydrolizy triacylogliceroli wzrasta z liczbą reszt kwasów tłuszczowych, długością łańcucha oraz stopniem nienasycenia kwasów tłuszczowych. Reakcje katalizowane przez lipazy można prowadzić w rozpuszczalnikach organicznych oraz roztworach buforowych możliwa jest wtedy kontrola zawartości wody (współczynnik aktywności wodnej).

Lipazy katalizują następujące typy reakcji:

1. hydrolizę (środowisko wodne, z nadmiarem wody),

2. estryfikację (środowisko z małym udziałem wody lub środowisko bezwodne), 3. transestryfikacja (wymiana kwasów tłuszczowych w TAG),

 acydoliza (grupy acylowe pochodzą od wolnych kwasów),

 interestryfikacja (wymiana grup arylowych pomiedzy estrami),

 alkoholiza (reakcja pomiedzy alkoholem i estrem w wyniku której powstaje nowy alkohol i ester).

Optymalne pH reakcji dla lipaz pochodzenia zwierzęcego wynosi 7.0-8.0, a dla lipaz roślinnych w granicach pH 4.7-5.0, natomiast temperatura efektywnego działania mieści się między 35 a 37˚C.

(3)

Aktywność lipaz można sprawdzić poprzez określenie ilości uwolnionych kwasów tłuszczowych w wyniku działania enzymu w reakcji prowadzonej w optymalnych warunkach doświadczalnych. Ilość uwolnionych kwasów tłuszczowych w próbkach badanego substratu, pobieranych w równych odstępach czasu, oznacza się przez miareczkowanie mianowanym roztworem wodorotlenku potasu.

Utlenianie lipidów zachodzi pod wpływem dwóch enzymów : lipazy i lipooksygenazy (schemat poniżej).

T£USZCZOWCE

lipaza

KWASY T£USZCZOWE GLICEROL

lipooksygenaza

WODORONADTLENKI KWASÓW T£USZCZOWYCH

ALDEHYDY I KETONY

Reakcja zaczyna się od działania lipazy uwalniającej z cząsteczek triacylogliceroli kwasy tłuszczowe, z których następnie powstają produkty utleniania. Rozkład tłuszczów zachodzi szybko, np. podczas przemiału pszenicy wtedy mąka posiada gorzki smak. Wysoką aktywność lipolityczną mają zarodki pszenne a przede wszystkim otręby pszenne.

Lipazy wykorzystywane aktualnie w procesach przetwórczych są pochodzenia głównie mikrobiologicznego. Znaczne ich ilości syntezowane są przez różne szczepy drożdży, pleśni czy bakterii (Candida rugosa, Candida cylindracea, Candida antarctica, Aspergillus niger, Bacillus piocyaneum). Wykorzystane są w przemyśle spożywczym do otrzymywania komercyjnie ważnych niskocząsteczkowych estrów o określonych walorach smakowo-zapachowych, stosowane są najczęściej do napojów, soków, nektarów, a także do takich produktów jak budynie, kisiele, dżemy, ciastka i wiele innych. Niektóre z nich posiadają charakterystyczny smak np.:

 octan izoamylu-bananowy,

 maślan metylu-ananasowy,

 propionian metylu-owocowy,

(4)

 octan cytronellylu-aromat różany,

 octan terpinylu-aromat owocowy.

Niektóre lipazy pochodzenia mikrobiologicznego hydrolizują tłuszcz mleka krowiego i uwalnianą są wtedy głównie lotne kwasy tłuszczowe (krótkołańcuchowe), których zawartość wynosi 8-10%

ogólnej ilości związanych w tłuszczu kwasów, inne lipazy odszczepiają przede wszystkim kwasy o długich łańcuchach, w przemyśle mleczarskim odpowiedzialne są za intensyfikację cech organoleptycznych, w tym głównie serów twardych, którym uwolnione kwasy krótkołańcuchowe nadają pikantny smak. W ostatnim czasie lipazy wykorzystywane są do syntezy estrów kwasów tłuszczowych np. z kwasem askorbinowym oraz witaminą A. Przeciwutleniacze te posiadają zmienione właściwości hydrofobowo-hydrofilowe (kwas askorbinowy w postaci estru kwasu tłuszczowego rozpuszcza się w olejach) i mogą mieć szerokie zastosowanie w przemysle tłuszczowym lub kosmetycznym.

W procesach trawiennych mających miejsce w organizmach ludzi i zwierząt największe znaczenie mają lipazy: trzustkowa, wątrobowa i jelitowa. W produktach enzymatycznego rozkładu tłuszczu występują obok uwolnionych kwasów tłuszczowych i glicerolu, także mono- i diacyloglicerole. Lipaza trzustkowa odszczepia wyłącznie kwasy tłuszczowe w pozycjach α i α’ w cząsteczce triacylogliceroli (wiązania estrowe utworzone w reakcji kwasów karboksylowych z pierwszorzędowymi grupami hydroksylowymi). Natomiast lipaza jelitowa działa na wiązania estrowe w położeniu β, powstające w reakcji kwasów tłuszczowych z drugorzędową grupą hydroksylową glicerolu. W warunkach fizjologicznych równowaga reakcji jest przesunięta na korzyść produktów rozkładu dlatego biosynteza estrów praktycznie nie zachodzi.

Przemysłowe zastosowanie lipaz zarówno pochodzenia zwierzęcego jak i mikrobiologicznego:

 przemysł mleczarski-produkcja serów typu roquefort, cheddar, oraz serów włoskich, częściowa hydroliza tłuszczu (poprawa aromatu, smaku), skrót czasu dojrzewania,

 przemysł cukierniczy-hydroliza pozostałości tłuszczu w suchej albuminie jaj, ponieważ obecność tłuszczu obniża zdolność białka do tworzenia piany (traktuje się lipazą masę jajeczną przed suszeniem przez co wzrasta organoleptyczna jakość gotowego produktu), w produkcji czekolady mlecznej lipaza powoduje powstawanie kwasów tłuszczowych, które poprawiają jej smak i aromat,

 przemysł tłuszczowy-modyfikacja tłuszczów, niekorzystna w przypadku transportu i przechowywania nasion oleistych, przy zbyt wysokiej zawartości wody wzrasta kwasowość nasion co niekorzystnie wpływa z uwagi na zachodzącą pod wpływem lipazy hydrolizę acylogliceroli i uwalnianie kwasów tłuszczowych,

 przemysł skórzany-odtłuszczanie skór, wełny, szczeciny,

 przemysł tekstylny-produkcja jedwabiu, odtłuszczanie włókien,

 przemysł chemiczny-składnik detergentów, bioemulgatorów do produkcji środków piorących, preparatów usuwających tłuste plamy z tekstyliów,

 przemysł farmaceutyczny-otrzymywanie preparatów leczniczych, leków wspomagających działanie trzustki i wątroby.

(5)

WYKONANIE ĆWICZENIA

Aktywność lipazy określa się na podstawie ilości uwolnionych kwasów tłuszczowych, w czasie działania enzymu w optymalnych warunkach w substracie zawierającym tłuszcz. Ilość uwolnionych kwasów tłuszczowych w próbkach badanego substratu, pobieranych w kolejnych odstępach czasu, oznacza się przez miareczkowanie mianowanym roztworem wodorotlenku potasowego wobec fenoloftaleiny jako wskaźnika.

Cześć analityczna Materiały i odczynniki:

 Kolba (250-500cm³) – 1szt

 Kolba stożkowa (100cm³) – 7szt

 Kolba stożkowa (300-400 cm³) – 2szt

 Cylinder (100cm³)

 Pipety (5cm³; 2x10cm³; 25cm³)

 Lejek

 Łaźnia wodna (38°C)

 Zestaw do miareczkowania

 Homogenizator

 0,05 M roztwór KOH

 1% roztwór fenoloftaleiny

 Metanol

 Badany produkt

 Trzustka wieprzowa

 Uniwersalne papierki wskaźnikowe

 Sączki

 Gaza

Postępowanie

Otrzymanie wyciagu lipazy z trzustki

Zhomogenizować 200g świeżej, pokrojonej trzustki wieprzowej z 300cm³ wody destylowanej.

Zawiesinę przesączyć przez gazę. Otrzymany przesącz, stanowiący roztwór enzymu, zobojętnić do pH 7 przy użyciu 0,1M roztworu KOH wobec papierka wskaźnikowego.

(6)

Oznaczenie

Do kolby stożkowej o pojemności 250cm³ odmierzyć 100cm³ mleka lub śmietanki, a następnie kolbę umieścić w łaźni wodnej w temperaturze 38°C. Przygotować sześć ponumerowanych kolb stożkowych o pojemności 100cm³ i do każdej z nich odmierzyć po 25cm³ metanolu. Po upływie 10 minut od momentu wstawienia kolby z mlekiem do łaźni, dodać do mleka 30cm³ przygotowanego wstępnie wyciągu enzymatycznego z trzustki i dokładnie wymieszać. Kolbe pozostawić w łaźni wodnej i co kilka minut powtarzać mieszanie. Po upływie 15 minut od dodania wyciągu enzymatycznego pobrać z mieszaniny reakcyjnej 10cm³ roztworu do kolby stożkowej o pojemności 100cm³ (próba nr 1). W analogiczny sposób pobrać kolejne próby w ciągu 90min., w odstępach 15-minutowych (łącznie sześć prób). Poszczególne próbki miareczkować 0,05 M roztworem KOH wobec fenoloftaleiny, do pojawienia się lekko różowego zabarwienia.

Próba zerowa

Przenieść 50cm³ uzyskanego na wstępie wyciągu enzymatycznego do kolby stożkowej o pojemności 100cm³ i ogrzewać do wrzenia w celu inaktywacji enzymu. Po oziębieniu gotowanego roztworu ewentualny wytracony osad odsączyć. Następnie do kolby stożkowej o pojemności 100cm³ (nr 0) odpipetować 10cm³ mleka lub śmietanki, 3cm³ przesączu z ogrzewanego wyciągu enzymatycznego oraz 25cm³ metanolu. Próbę miareczkować analogicznie jak próby badane 0,05 M roztworem KOH wobec fenoloftaleiny. Wyniki zebrać i przedstawić w postaci tabel i wykresów w sprawozdaniu z ćwiczeń.

• Uzyskane wyniki z miareczkowania zestawić w tabeli.

Nr próby

Czas (min.)

Ilość cm³ 0.05M KOH zużytego do miareczkowania próby:

0 0

1 15

2 30

3 45

4 60

5 75

6 90

(7)

• Obliczyć mikroekwiwalenty uwolnionych kwasów tłuszczowych z równania:

mikroekw.=

(A-B) x C x 1000 D

Gdzie:

A – ilość cm³ 0,05 M KOH zużyta do miareczkowania próby właściwej B – ilość cm³ 0,05 M KOH zużyta do miareczkowania próby zerowej C – molowość użytego do miareczkowania KOH

D – ilość cm³ wyciągu enzymatycznego w próbie poddanej miareczkowaniu

• Sporządzić wykres zależności ilości hydrolizowanych kwasów tłuszczowych (mikroekwiwalenty) w czasie (min.)

15 30 45 60 75 90

0

Czas [min.]

Mikroek wiw

alen

ty kwasów tluszczowych