R O CZNIK I G L E B O Z N A W C Z E TOM LIV N R 1/2 W A R SZ A W A 2003: 3 5 -4 2
GRZEGORZ GORZAŁA*, DOROTA JABŁOŃSKA-GORZAŁA*, JÓZEF CHOJNICKI**, DARIUSZ GOZDOWSKI***, STEFAN RUSSEL*
WPŁYW MODYFIKACJI pH GLEBY
NA LICZEBNOŚĆ DROŻDŻY OLIGONITROFILNYCH
INFLUENCE OF SOIL pH MODIFICATION
ON THE NUM BER OF OLIGONITROPHILIC YEAST
Zakład Mikrobiologii Rolniczej* i Zakład Gleboznawstwa**,
Katedra Nauk o Środowisku Glebowym; Zakład Szczegółowej Uprawy Roślin***, Katedra Agronomii, SGGW, Warszawa
Abstract: The effect of modified pH on survival of oligonitrophilic yeast in acid forest soils was
studied. In the experiments soil samples collected from humus horizons of six selected soil profiles situated in Puszcza Biała Forest were used. In all soil samples maximum capillary capacity of water and necessary dose o f CaO to rise pH to the level of 7 have been determinated. The experiment was arranged in three replications and consisted of the following treatments: natural soil, limed natural soil, sterile soil and limed sterile soil. The soil samples, 50 g each, taken from particular combina tions were transferred to plastic-pots and inoculated with 1 cm3 suspension of oligonitrophilic yeasts in saline containing 31- 104 cells. Moisture of soil samples was adjusted to 60% of the maximum water capacity and maintained to the end of experiment. Yeast survival was measured after 1, 8, 15, 29, 35, and 49 days using the plate method. In all experimental combinations directly after soil inoculation rapidly decreased the percentage of live yeast cells and after adaptation period it gradually increased. Liming influenced the growth of oligonitrophilic yeast in a greater degree in sterile soil than in natural.
Słowa kluczowe: drożdże oligonitrofilne, Lipomyces, pH gleby, gleby leśne, doświadczenie wazo
nowe.
Key w ords: oligonitrophilic yeast, Lipomyces, pH of soil, forest soils, pot experiment.
WSTĘP
Gleba jest siedliskiem tysięcy zróżnicowanych pod względem jakościowym i ilościowym gatunków mikroorganizmów [Alexander 1977]. Według Jonga [1989] drobnoustroje glebowe stanowią 25% ogólnej biomasy Ziemi. Pomimo wyizolowania i zidentyfikowania ok. 40 tys. gatunków drobnoustrojów występu jących w środowisku glebowym, to tylko nielicznym gatunkom potrafimy przy pisać określone funkcje w procesach metabolizmu gleby [Hawksworth, Mound
Środowisko glebowe jest bogatym źródłem licznych gatunków drożdży, wyko rzystywanych w biotechnologii [De Mot 1990, Hatano i in. 1991, Holder i in.1989, Horn i in. 1992, Imai, Kuwatsuka 1989, Jeffries 1990, Kock i in. 1991, Middelho- ven i in. 1992, Neujahr 1990, Schisler i in. 1995]. Drożdże oligonitrofilne nie stanowią odrębnej jednostki systematycznej, a jedynie grupę fizjologiczną wyod rębnioną ze względu na ich zdolność do życia w środowisku o minimalnej zawartości azotu, określaną jako drożdże z rodzaju Lipomyces. Drożdże z rodzaju
Lipomyces rosną w postaci śluzowatych kolonii na bezazotowych podłożach
stałych wykorzystując jony amonowe dyfundujące do podłoża z atmosfery [Kock i in. 1991]. Drożdże wyizolowane z gleb Puszczy Białej dodatkowo wykazują zdolność rozwoju w warunkach silnego zakwaszenia środowiska.
Celem niniejszej pracy była ocena wpływu modyfikowanego pH na przeży- walność drożdży oligonitrofilnych w warunkach in vitro.
MATERIAŁ I METODY
Do badań stosowano próbki gleb pobrane z poziomów próchnicznych sześciu różniących się profili glebowych położonych na terenie Puszczy Białej (tab. 1).
Pobrane próbki z poszczególnych typów gleb po przewiezieniu do laborato rium przesiano przez sito o średnicy oczek 1 mm i doprowadzono do stanu powietrznie suchego. W próbkach tych określono na wstępie maksymalną poje mność wodną (PWm) gleb oraz ustalono dawkę CaO potrzebną do podwyższenia pH do 7,0. Następnie próbki gleby podzielono na 2 części. Jedną część pozosta wiono bez zmian (w stanie naturalnym), drugą wyjałowiono w autoklawie. W kolejnym etapie próbki naturalne i wyjałowione ponownie podzielono na dwie grupy. Jedną grupę próbek pozostawiono bez zmian, natomiast drugą grupę potraktowano CaO w celu doprowadzenia pH do 7,0.
Z przygotowanych próbek naważono po 50 g do przepłukanych 75% alkoho lem etylowym i naświetlonych promieniami UV plastikowych wazonów. Nastę pnie do gleb w poszczególnych wazonach wprowadzono po 1 cm3 zawiesiny w roztworze soli fizjologicznej zawierającej 31- 104 komórek drożdży oligonitrofil nych. Zawiesinę komórek uzyskano spłukując roztworem soli fizjologicznej pię ciodniową hodowlę drożdży na podłożu wg Saburouda (glukoza - 40 g, Aminobak - 10 g, agar - 20 g oraz woda wodociągowa - 1000 ml). Liczba komórek drożdży oligonitrofilnych w 1 cm3 określono metodą płytkową na podłożu bezazotowym (K2H P 0 4 - 1 g, M gS 0 4 -7H20 - 0,5 g, C aC 0 3 - 5 g, glukoza - 20 g, mikroelementy - 1 ml, 15 g agaru oraz woda wodociągowa 1000 ml). Odczyn pożywki doprowa dzono do wartości pH 7,0. Do badanych gleb w wazonach dodano określoną objętość jałowej wody destylowanej w celu doprowadzenia wilgotności do 60% PWm. Uzyskaną wilgotność gleby utrzymywano do końca trwania doświadczenia systematycznie uzupełniając ubytki jałową wodą destylowaną. Wazony przykryto jałow ą laboratoryjną folią aluminiową ograniczając parowanie gleby. Hodowle inkubowano w temperaturze pokojowej przez 49 dni. Wszystkie kombinacje doświadczalne przygotowano w trzech powtórzeniach. Przeży walność drożdży w glebie inkubowanej w wazonach określano metodą płytkową po 1, 8, 15, 29, 35 i 49 dniach trwania doświadczenia. Z poszczególnych kombinacji pobierano i odważano określone próbki gleby i zawieszano w jałowej wodzie wodociągowej przygotowując rozcieńczenia zawiesin glebowych w zakresie od 10_l do 10 . Pobierano po 1 cm3 poszczególnych rozcieńczeń gleb i wysiewano wgłębnie do
Wpływ modyfikacji p H gleby na liczebność
_______drożdży oligonitrofilnych_______ 37
TABELA 1. Charakterystyka poziomów próchnicznych badanych profili glebowych wykorzysta nych w doświadczeniu
TABLE 1. Some physico-chemical properties selected humus horizons of investigated soils profile Nr pro filu No. o f soil profile Typ gleby Soil type Poziom gene tyczny Genetic horizon Głębokość Depth [cm] pH [g • kg J ] C:N H20 KC1 С N 14 Opadowo glejowa pseudogley soil A 2-16 4,2 3,7 24,8 1,3 18,51 15 Rdzawa właściwa rusty soil A 5-1 2 3,7 3,0 28,7 1,1 26,82 21a Murszowa muck soil AM 5-1 0 5,1 4,6 365,0 20,9 17,46 33 Glejobielicowa gley-podzol soil A 3,5-13 3,3 2,8 63,2 2,8 22,25 35 Gruntowo-glejowa gley soil A 1-17 4,1 3,4 66,5 6,3 10,44 38 Czarna ziemia black earth A 2,5-18 3,8 3,0 17,1 1,1 15,27
podłoża bezazotowego. W celu ograniczenia wzrostu bakterii i innych grzybów do podłoży dodawano jałowe roztwory cykloheksamidu (50 ppm) i streptomycyny (50 ppm). Hodowle inkubowano przez 15 dni w temperaturze 28°C. Uzyskane wyniki opracowano statystycznie metodą analizy wariancji wykorzystując pro gram komputerowy Statgraphics. Wyznaczono grupy homogeniczne korzystając z testu t-Studenta przy poziomie istotności a = 0,05.
WYNIKI I DYSKUSJA
Rozwój drobnoustrojów w środowisku glebowym i ich bioróżnorodność są warunkowane przez wiele czynników środowiska. Te same gatunki drobnoustro jów mogą występować często w drastycznie różniących się warunkach środowi skowych [Alexander 1977]. Duży wpływ na liczebność drobnoustrojów w glebie wywiera zakwaszenie [Widmer i in. 1989, Amato i Ladd 1994]. Badane gleby leśne charakteryzowały się niskimi wartościami pH (od 3,3 do 5,1). W pracy przedstawiono badania dotyczące wpływu zmian pH z kwaśnego na obojętne na przeżywalność w glebach leśnych drożdży oligonitrofilnych.
Analizy wykazały znaczne zmiany w liczebności wprowadzonych do gleby drożdży oligonitrofilnych w badanych kombinacjach doświadczalnych. Bez względu na wartość pH po żaszczepieniu gleby drożdżami nastąpił gwałtowny spadek liczby żywych komórek, a po okresie przystosowania liczba ta stopniowo wzrastała. Reakcja ta może wynikać z potrzeby adaptacji tych organizmów do nowych warunków środowiska. W przypadku gleb niejałowionych na zachowanie drożdży może również mieć wpływ wzajemna konkurencja pomiędzy drobnou strojami [Kottler, Alexander 1995, Vishniack 1995]. W dostępnej literaturze nie
□ niewapnowana, no limed | wapnowana, limed
о
Czas inkubacji (dni) Time of incubation (days)
RYSUNEK 1. Wpływ wapnowania na występowanie drożdży oligonitrofilnych w poziomie pró chniczym gleby opadowo-glejowej (*różnymi literami oznaczono różniące się średnie)
FIGURE 1. Influence of liming on occurrence oligonitrophilic yeast in humus horizons of pseudo- gley soil (*mean significant differences are marked with different letters)
znaleziono danych dotyczących wpływu wapnowania gleb na występowanie drożdży oligonitrofilnych. Wydaje się jednak, że obojętne pH jest czynnikiem sprzyjającym ich rozwojowi.
W przypadku gleby naturalnej opadowo glejowej (rys. 1) początkowo stwier dzono w glebie wapnowanej istotnie wyższą ilość żywych komórek. Następnie począwszy od 8 dnia do 35 dnia od analizy stwierdzono istotnie niższą liczbę jednostek tworzących kolonie (jtk) w glebie wapnowanej. W ostatniej analizie (po 49 dniach) nie stwierdzono istotnych różnic w ilości drożdży oligonitrofilnych w glebach kontrolnych i wapnowanych. W przypadku gleby jalowionej z tego samego profilu nie stwierdzono istotnych różnic pomiędzy liczebnością w dniu
□ niewapnowana, no limed щwapnowana, limed
Czas inkubacji (dni) Time of incubation (days)
RYSUNEK 2. Wpływ wapnowania na występowanie drożdży oligonitrofilnych w poziomie pró chniczym gleby rdzawej (*różnymi literami oznaczono różniące się średnie)
FIGURE 2. Influence of liming on occurrence oligonitrophilic yeast in humus horizons of rusty soil (*mean significant differences are marked with different letters)
Wpływ modyfikacji p H gleby na liczebność _______drożdży oligonitrofilnych_______
39
□ niewapnowana, no limed naturalna, natural Iwapnowana, limed jalowiona. sterileCzas inkubacji (dni) Time of incubation (days)
RYSUNEK 3. Wpływ wapnowania na występowanie drożdży oligonitrofilnych w poziomie pró chniczym gleby murszowej (*różnymi literami oznaczono różniące się średnie)
FIGURE 3. Influence of liming on occurrence oligonitrophilic yeast in humus horizons o f muck soil (*mean significant differences are marked with different letters)
1 i 15 analiz. W pozostałych terminach analizy liczba żywych komórek drożdży w glebie wapnowanej była istotnie wyższa niż w glebie niewapnowanej.
W glebie naturalnej rdzawej (rys. 2) stwierdzono istotne różnice w liczebności drożdży oligonitrofilnych w zależności od wapnowania w dwóch ostatnich term i nach analiz. W glebie jałowionej natomiast nie stwierdzono istotnego wpływu wapnowania na liczebność drożdży tylko w pierwszym terminie.
W glebie naturalnej murszowej (rys. 3) istotny wpływ wapnowania stwierdzo no we wszystkich terminach analiz z wyjątkiem drugiej analizy. Natomiast w glebie jałowionej podczas dwóch pierwszych analiz nie stwierdzono istotnych różnic w liczbie drożdży pod wpływem wapnowania.
C zat Inkubacji (dni) Tim» of incubation (days)
RYSUNEK 4. Wpływ wapnowania na występowanie drożdży oligonitrofilnych w poziomie pró chniczym gleby glejobielicowej (*różnymi literami oznaczono różniące się średnie)
FIGURE 4. Influence of liming on occurrence oligonitrophilic yeast in humus horizons of gley-po- dzol soil (*mean significant differences are marked with different letters)
□ niewapnowana, no limed щwapnowana, limed naturalna, natural ja ło w io n a , sterile
Czas inkubacji i (dni) Time of incubation (days)
RYSUNEK 5. Wpływ wapnowania na występowanie drożdży oligonitrofilnych w poziomie próchniczym gleby gruntowo-glejowej (*różnymi literami oznaczono różniące się średnie) FIGURE 5. Influence of liming on occurrence oligonitrophilic yeast in humus horizons of gley soil (*mean significant differences are marked with different letters)
W przypadku gleby naturalnej glejobielicowej (rys. 4) nie stwierdzono istot nego wpływu wapnowania na liczebność drożdży oligonitrofilnych we wszystkich terminach analiz. W glebie jałowionej glejobielicowej wapnowanie zwiększyło liczebność drożdży począwszy od 3 analizy.
W przypadku gleb naturalnych gruntowo-glejowych (rys. 5) istotnie większą liczbę drożdży stwierdzono w dwóch pierwszych terminach analiz w glebie niewapnowanej. W pozostałych terminach nie stwierdzono istotnego wpływu wapnowania na liczebność drożdży oligonitrofilnych. W glebach jałowionych z tego samego profilu glebowego istotnego wpływu wapnowania nie stwierdzono na liczbę drożdży w 8 dniu doświadczenia.
□ niewapnowana, no limed щwapnowana, limed naturalna, natural jałow iona. ste r ile
Czas inkubacji (dni) Time of incubation (days)
RYSUNEK 6. Wpływ wapnowania na występowanie drożdży oligonitrofilnych w poziomie pró chniczym gleby typu czarna ziemia (*różnymi literami oznaczono różniące się średnie)
FIGURE 6. Influence of liming on occurrence oligonitrophilic yeast in humus horizons of black earth (*mean significant differences are marked with different letters)
Wpływ modyfikacji pH gleby na liczebność
_______drożdży oligonitrofilnych_______ 41
W czarnej ziemi (rys. 6) nie stwierdzono istotnego wpływu wapnowania na jtk drożdży w terminach pierwszym i drugim analizy w glebie naturalnej oraz drugim i trzecim w glebie sterylizowanej. W pozostałych terminach zaobserwowano istotny wpływ wapnowania na jtk drożdży oligonitrofilnych.
Przeżywalność mikroorganizmów introdukowanych do gleby ma związek z różnymi czynnikami środowiskowymi, takimi jak: zasobność gleby w składniki pokarmowe, temperatura, odczyn, zasolenie oraz różne biologiczne interreakcje. Może również zależeć w znacznym stopniu od właściwości fizjologicznych mikroorganizmów wprowadzonych do gleb [Kottier, Alexander 1995, Vishniack
1995].
Z dostępnej literatury wynika, że drożdże oligonitrofilne wykazują znaczne możliwości adaptacyjne do zmieniających się warunków środowiska. Z niniejszej pracy wynika, że również stosunkowo łatwo adaptują się do różnych wartości pH.
Wydaje się jednak, że nasza wiedza o zachowaniu się tych samych drobnou strojów w różnych warunkach środowiskowych jest wciąż ograniczona i wyma gane są do zrozumienia tego zjawiska dalsze badania naukowe.
WNIOSKI
1. Bezpośrednio po wprowadzeniu do gleby drożdży oligonitrofilnych ich liczebność spadała gwałtownie, a następnie obserwowano wzrost liczby komórek.
2. Wapnowanie wpłynęło w większym stopniu na liczebność drożdży oligonitrofil nych w glebach jałowych niż naturalnych.
LITERATURA
ALEXANDER M. 1977: Introduction to soil microbiology. Wiley J., New York.
AMATO M. , LADD J. N. 1994: Application of the ninhydrin-reactive N assay for microbial biomass in acid soils. Soil Biol. Biochem. 26: 1109-1115.
DE MOT R. 1990: Conversion of starch by yeasts. [W] Yeast. Biotechnology and biocatalysis, Verachtert H., De Mot R. (red.), Marcel Dekker, Inc., New York and Basel: 163-196. HATANO T., KOSAKA M., CUI Z., KAWAGUCHI M., MIYAKAWA T., FUKAI S. 1991:
Purification and characterization of carboxymethylcellulose-degrading enzyme secreted by yeasts strain newly isolated from soil. J. Fermentation and Bioengineering 71: 313-317. HAWKSWORTH D. L., MOUND L. A. 1991: Biodiversity of microorganisms and invertebrates:
Its Role in sustainable agriculture. Hawksworth D. L.(red.) CAB Int., Wallingford, UK: 14-29. HOLDER N. H. M., KILIAN S. G., DU PREEZ J. С. 1989: Yeast biomass from bagasse
hydrolysates. Biol. Wastes. 28: 239-246.
HORN C. H., DU PREEZ J. C., KILIAN S. G. 1992: Protein enrichment of gmin sorgum by submerged culture o f the amylolytic yeast Schwanniomyces occidentalis and Lipomyces
kononenkoae. World J. Microbiol. Biotechnol. 8: 416-422.
IM AI Y., KUWATSUKA S. 1989: Characteristics of paraquat-degrading microbes. J. Pesticide
Sei., 14: 475-480.
JEFFRIES T. W. 1990: Fermentation of D-xylose and cellobiose. [W] Yeast. Biotechnology and biocatalysis. Verachtert H., De Mot R. (red.), Marcel Dekker, Inc, New York and Basel: 349-381.
JONES D., GRIFFITHS E. 1967: Microbial aspects of soil structure. Plant and Soil 27: 187-200. JONG S. C. 1989: Microbial germplasm. [W] Biotic diversity and germplasm preservation, global imperatives. Knutson 1., Stone A. K. (red.), Kluwler Academic Publications, Derdrecht: 241-273.
KOCK J. L. F., COETZEE D. J., VAN DYK M. S., TRUSCOTT M., CLOETE F. G., VAN WYK V., AUGUSTYN О. P. H. 1991: Evidence for pharmacologically active prostaglandins in yeasts. S. Afr. J. Sei. 87: 73-76.
KOTTLER B. D., ALEXANDER M. 1995: Survival as a ciriterion for autochthony. Soil Biol.
Biochem. 28: 633-638.
MIDDELHOVEN W., J., KOOREVAAR M., SCHUUR G. W. 1992: Degradation of benzene compounds by yeasts in acidic soil. Plant and Soil 145: 37-43.
NEUJAHR H. Y. 1990: Yeasts in biodégradation and biodeterioration processes. [W] Yeast biotechnology and biocatalysis. Verachtert H., De Mot R. (red.): 321-341.
SCHISLER D. A., KURTZMAN C. P., BOTHAST R. J., SLININGER P. J. 1995: Evalution of yeasts for biological control of Fusarium dry rot potatoes. Am. Potato J. 72: 339-353. VISHNIACK H. S. 1995: Simulated in situ competitive ability and survival of representative soil
yeast, Cryptococcus albidus. Microbial Ecology 30: 309-320.
WIDMER P., BROOKES P. C., PARRY L. C. 1989: Microbial biomass nitrogen measurements in soils containing large amounts of inorganic nitrogen. Soil Biol. Biochem. 21: 865-867.
M gr ini. G rzegorz G orzała Z akład M ikrobiologii R olniczej, K atedra Nauk o Środowisku G lebow ym , Szkoła G łówna G ospodarstw a W iejskiego, ul. R akow iecka 26/30, 0 2-528 W arszawa.
