Streszczenie pracy doktorskiej

(1)

M Z Kastyak Chemical characterization and imaging of creatine deposits in human CNS tissues

2

Streszczenie pracy doktorskiej

Rozprawa doktorska “Badanie składu chemicznego i obrazowanie złogów kreatyny w tkankach ośrodkowego układu nerwowego człowieka z wykorzystaniem mikrospektroskopii w podczerwieni z transformatą Fouriera oraz rentgenowskiej mikroskopii fluorescencyjnej” jest kontynuacją badań przedstawionych w pracy magisterskiej pod

tytułem: “Analiza biochemiczna tkanek ośrodkowego układu nerwowego człowieka z wykorzystaniem synchrotronowej mikrospektroskopii w podczerwieni” zrealizowanej na Wydziale Fizyki i Informatyki Stosowanej AGH w roku akademickim 2004/2005. Praca

doktorska została zrealizowana w ramach badań nad procesami neuropatologicznymi w Stwardnieniu Zanikowym Bocznym (ang. Amyotrophic Lateral Sclerosis; ALS). Badania te

są prowadzone w ramach współpracy z Instytutem Neurologii Wydziału Lekarskiego Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie oraz Department of Chemistry University of Manitoba, Winnipeg, Kanada (prof. Kathleen Gough ).

Celem pracy była analiza występowania i składu chemicznego złogów kreatyny w tkankach ośrodkowego układu nerwowego człowieka w przypadku Stwardnienia

Zanikowego Bocznego i grupy kontrolnej (bez schorzeń neurodegeneracyjnych).

Stwardnienie Zanikowe Boczne jest schorzeniem zaliczanym do grupy chorób neurodegeneracyjnych, w którym zanik neuronów obserwuje się w rogach przednich rdzenia kręgowego, korze ruchowej mózgu oraz pniu mózgu. Symptomy choroby związane są z postępującym w czasie jej trwania osłabieniem i zanikiem mięśni. W ramach niniejszej pracy doktorskiej analizowano tkanki z wymienionych wyżej obszarów dotkniętych neurodegeneracją oraz tkanki hipokampu i istoty czarnej dla sześciu przypadków Stwardnienia Zanikowego Bocznego oraz trzech przypadków kontrolnych.

W organizmie ludzkim kreatyna bierze udział w utrzymaniu równowagi energetycznej. Widmo kreatyny zostało zarejestrowane uprzednio w próbce rdzenia kręgowego dla przypadku Stwardnienia Zanikowego Bocznego w trakcie badań prowadzonych w ramach ww. pracy magisterskiej. Kreatyna nie tworzy złogów w warunkach fizjologicznych. Ich obecność mogłaby wskazywać na zaburzenia w metabolizmie w wyniku zmian chorobowych w Stwardnieniu Zanikowym Bocznym. Widmo kreatyny w spektroskopii

w podczerwieni (IR) jest bardzo charakterystyczne, dlatego mikrospekroskopia w podczerwieni z transformatą Fouriera została wykorzystana do identyfikacji złogów

(2)

3 z wykorzystaniem synchrotronu jako źródła promieniowanie podczerwonego. Dwuwymiarowe mapy dystrybucji kreatyny zostały utworzone w oparciu o wartości powierzchni pod pikami, charakterystycznymi dla kreatyny, występującymi w widmie absorpcyjnym podczerwieni tj. przy 1304 cm-1, 1400 cm-1 oraz 2800 cm-1. W ten sposób potwierdzono obecność złogów kreatyny w tkankach rdzenia kręgowego oraz kory ruchowej dla jednego z sześciu analizowanych przypadków Stwardnienia Zanikowego Bocznego. Ponieważ złogi okazały się wystarczająco duże, by obrazować je przy większej rozdzielczości przestrzennej, spektrometr podczerwieni z lokalnym źródłem promieniowania, wyposażony

w detektor ogniskowej matrycy (ang. Focal Plane Array; FPA), został wykorzystany do rejestrowania map powierzchniowych dwudziestu sześciu próbek. Tego typu detektor

stanowi układ (matrycę) wielu detektorów promieniowania IR. Próbka jest oświetlana równomiernie. Sygnały z poszczególnych części próbki są rejestrowane w odpowiednich pikselach (przez poszczególne detektory) układu, co wiąże się z istotnym skróceniem czasu potrzebnego na analizę próbki. W przypadku analizowanych próbek, o powierzchni około 1 cm2, przy rozdzielczości przestrzennej 25 µm×25 µm i 4-16 skanach na piksel, czas ten wynosił od trzech do czterech godzin, co odpowiada czasowi potrzebnemu do zarejestrowania mapy o powierzchni 750 µ m x 750 µ m przy użyciu detektora jednopikselowego.

Złogi kreatyny nie były wcześniej obserwowane w rutynowych badaniach histopatologicznych. Może się to wiązać ze sposobem przygotowania próbek. Dla większości metod histopatologicznych, a zwłaszcza przy wybarwianiu charakterystycznych struktur tkanek, wymagane jest eksponowanie materiału na działanie substancji organicznych, które mogą łatwo wymywać niewielkie cząsteczki kreatyny. Tkanki przeznaczone do analizy z wykorzystaniem mikrospektroskopii w podczerwieni oraz rentgenowskiej mikroskopii fluorescencyjnej nie wymagają tego typu procedury. Tkanki pobrane w czasie autopsji, były cięte na kriostacie mrożeniowym bez utrwalania i umieszczane bezpośrednio na foli polimerowej zamocowanej na uchwycie próbki. Zastosowana metoda preparatyki próbek pozwoliła na zachowanie złogów kreatyny w analizowanych tkankach.

Należy znaczyć, że kreatyna jest substancją bezbarwną, jednak niektóre złogi obserwowane w badanych tkankach przy użyciu mikroskopu posiadały zabarwienie brunatno-brązowe. Analiza obrazów mikroskopowych tkanek oraz około siedemdziesięciu map pojedynczych złogów, zarejestrowanych z wykorzystaniem mikrospektroskopii FTIR pozwoliły na stwierdzenie, że ok. jedna czwarta złogów wykazywała pigmentację. Fakt ten nasuwał przypuszczenie, że naturalne barwniki, na przykład neuromelanina, mogą być obecne

(3)

4 w strukturze złogów. Neuromelanina wykazuje silne właściwości chelatujące w stosunku

do metali, zatem ich obecność mogłaby potwierdzać stawianą hipotezę. Badania z wykorzystaniem synchrotronowej rentgenowskiej mikroskopii fluorescencyjnej nie

wykazały jednak zwiększonej zawartości metali (potasu, wapnia, miedzi, cynku, żelaza) w złogach kreatyny w stosunku do tkanki otaczającej. Stwierdzono jedynie obecność

niewielkich struktur (rzędu pojedynczych pikseli) o podwyższonych poziomach ww. pierwiastków. Należy wspomnieć, że ich lokalizacja i kształt nie korespondowały z obserwowanymi złogami kreatyny. Brak istotnych różnic pomiędzy poziomem Fe w tkance

i obserwowanych złogach kreatyny pozwolił też wykluczyć hipotezę o ich związku z naczyniami krwionośnymi.

Zaobserwowano ponadto wpływ polaryzacji promieniowanie podczerwonego wykorzystywanego w badaniach na kształt widm rejestrowanych w dużych złogach kreatyny, wykazujących krystalizację. Intensywność charakterystycznych pików kreatyny zmieniała się w wyniku zmiany kąta polaryzacji. W przypadku każdej orientacji, krystaliczne złogi były obserwowane, ale ich kształt i intensywność w poszczególnych pikselach nieznacznie się różniły, w zależności od polaryzacji i rodzaju wybranego do analizy piku.

Złogi kreatyny zostały zidentyfikowane w dwóch spośród sześciu przypadków Stwardnienia Zanikowego Bocznego w rejonach ośrodkowego układu nerwowego dotkniętych zanikiem neuronów. Duże, często pigmentowane złogi nie występowały w żadnej z kontrolnych tkanek. Niektóre próbki kontrolne zawierały liczne lecz stosunkowo niewielkie

złogi, przypominające złogi powstające w procesie starzenia. Należy wspomnieć,

że Stwardnienie Zanikowe Boczne jest schorzeniem zróżnicowanym w swych formach. Nie

jest wiec zaskakujące, że złogi kreatyny nie zostały zidentyfikowane w każdej z badanych próbek.

Kreatyna pełni ważną funkcję w procesach związanych z metabolizmem. Odkrycie jej złogów może okazać się istotne dla zrozumienia procesów prowadzących do degeneracji i zaniku neuronów. W celu ustalenia związku pomiędzy występowaniem złogów kreatyny i metabolizmem niezbędne będzie zbadanie większej ilości próbek oraz uzyskanie dodatkowych informacji o ich budowie biochemicznej z wykorzystaniem innych technik badawczych.