Expression and co-expression of surface
markers of pluripotency on human amniotic cells cultured in different growth media
Ekspresja i koekspresja powierzchniowych markerów pluripotencjalności na komórkach owodni łożyska ludzkiego w warunkach hodowli w różnych podłożach
$OHNVDQGUD%U\]HN
13LRWU&]HNDM
1'DQXWD3OHZND
1+DOLQD.RPDUVND
0DUFLQ7RPVLD
10DUWD/HVLDN
$OHNVDQGHU/6LHURĔ
-HU]\6LNRUD
3.DWDU]\QD.RSDF]ND
4¹ Department of Cytophysiology, Medical University of Silesia, Katowice, Poland
2 Department of Molecular Biology, Medical University of Silesia, Katowice, Poland
3 Department of Perinatology and Gynecology, Central Clinical Hospital, Medical University of Silesia, Katowice, Poland
4 Students Scientific Society, Medical University of Silesia, Katowice, Poland
Abstract
Objectives: Despite constant advances in the field of biology and medical application of human embryonic stem cells, the molecular mechanism of pluripotency remains largely unknown. So far, definitions of pluripotent stem cells (SC) have been based on a limited number of antigenic markers and have not allowed for unambiguous determination of the homogeneity of each subpopulation. Moreover, the use of some crucial pluripotency markers such as SSEA-3 and SSEA-4 has recently been questioned due to the possibility that the pattern of surface glycans may be changed depending on the content of the cell culture medium.
Aim: Quantitative analysis of amniotic SC subpopulations cultured in different media, based on the following pluripotency surface markers: SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 and TRA-1-81 expression and co-expression.
Material and methods: Immunofluorescence and fluorescence microscopy were used to identify and localize SC within a normal human placenta at term. The number of SSEA-4+, SSEA-3+, TRA-1-60+ and TRA-1-81+ cells and cells with co-expression of the above mentioned markers, cultured in media containing different protein supplements of animal origin, was counted by flow cytometry.
Otrzymano: 22.04.2013
Zaakceptowano do druku: 30.09.2013 Adres do korespondencji:
Piotr Czekaj
Department of Cytophysiology, Medical University of Silesia, Medyków 18, 40-752 Katowice, Poland
phone: +48 32 2088374 fax : +48 32 2526574 e-mail: pcz@sum.edu.pl.
Abbreviations:
BSA – bovine serum albumin; ESC – embryonic stem cells; FBS – fetal bovine serum; hESC – human embryonic stem cells; MSC – mesenchymal stem cells; PBS – phosphate buffered saline; SC –stem cells; SSEA-3 and SSEA-4 – Stage-Specific Embryonic Antigen 3 and 4, respectively; TRA- 1-60 and TRA-1-81 – Tumor Rejection Antigen 1-60 and 1-81 respectively.
Skróty:
BSA – albumina surowicy wołowej; ESC – embrionalne komórki macierzyste;
FBS – płodowa surowica bydlęca; hESC – ludzkie embrionalne komórki macierzyste; MSC – mezenchymalne komórki macierzyste; PBS – sól fizjologiczna buforowana fosforanami; SC – komórki macierzyste; SSEA-3 i SSEA-4, ang. – Stage-Specific Embryonic Antigen 3 i 4; TRA-1-60 i TRA- 1-81, ang. – Tumor Rejection Antigen 1-60 i 1-81.
Introduction
5HFHQWO\ SXEOLVKHG VWXGLHV KDYH UHSRUWHG WKH SUHVHQFH RI D SRSXODWLRQ RI VWHP FHOOV 6& ZKLFK H[KLELW FKDUDFWHULVWLFV RI SOXULSRWHQW HPEU\RQLF FHOOV LQ WKH RUJDQV RI DGXOW LQGLYLGXDOV
>1@ ,W LV EHOLHYHG WKDW SOXULSRWHQW FHOOV ZKLFK LQKDELW WKH RUJDQV GXULQJ WKH IHWDO OLIH RI PDPPDOV PD\ EHFRPH GRUPDQW LQ DGXOW WLVVXHV DQG PLJKW EHFRPH D VRXUFH RI WLVVXHVSHFL¿F SUHFXUVRU FHOOV GXULQJ WKH SURFHVV RI RUJDQ UHJHQHUDWLRQ DQG IRU FHOO WKHUDS\
> 3@ 'HPRQVWUDWLQJ WKH SUHVHQFH RI SOXULSRWHQW FHOOV ZLWK VWUXFWXUDO DQG IXQFWLRQDO FDSDELOLWLHV FRPSDUDEOH WR HPEU\RQLF VWHP FHOOV (6& ERWK LQ DGXOW DQG SHULQDWDO WLVVXHV SUHVHQWV D FXUUHQW VFLHQWL¿F DQG PHGLFDO FKDOOHQJH >4@ &RQ¿UPDWLRQ RI VXFK SUHVHQFH ZRXOG EHJLQ D QHZ VFLHQWL¿FDOO\ MXVWL¿HG PRUDOO\ DQG Results and conclusions: Cells with characteristics of embryonic SC were identified in the amniotic epithelium and the chorion, but not in the decidua basalis. Amniotic epithelium contained various types of SC, with SSEA-4+ as the most numerous. Disproportion in the number of SSEA-4+, SSEA-3+, TRA-1-60+ and TRA-1-81+ cells and cells characterized by co-expression of these antigens, as well as lack of quantitative differences between SC subpopulations cultured in different media, was observed. In conclusion, the amniotic epithelium is composed of SC at different stages of the development but human amnion might become an alternative source of SSEA-4+ embryonic-like SC. The composition of the evaluated media, characterized by different content of animal-derived proteins, does not influence the number of cells identified within the SC subpopulations.
Key words: KXPDQSODFHQWD/ amnion / SOXUiSoWHnW VWHm FHOOV /
/ maUNHUV oI SOXUiSoWHnF\ / co-expression / SSEA-3 / SSEA-4 / TRA-1-60 / / TRA-1-81 / cXOWXre meGia /
Streszczenie
Wstęp: Mimo ciągle rosnącej wiedzy o biologii i zastosowaniach medycznych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, molekularny mechanizm utrzymujący ich pluripotencjalność pozostaje nieznany. Dotychczas stosowane definicje komórek pluripotencjalnych opierają się na oznaczeniach ograniczonej liczby markerów antygenowych i nie pozwalają na jednoznaczne określenie homogenności danej subpopulacji. Ponadto, zastosowanie niektórych kluczowych markerów pluripotencji, np. SSEA-3 i SSEA-4, jest obecnie kwestionowane, ponieważ skład powierzchniowych glikanów przypuszczalnie może się zmieniać w zależności od ich zawartości w podłożu hodowlanym.
Cel pracy: Celem pracy była analiza ilościowa owodniowych subpopulacji komórek macierzystych wykazujących ekspresję i koekspresję markerów powierzchniowych pluripotencji SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 i TRA-1-81, w warunkach hodowli w różnych podłożach.
Materiał i metody: Zastosowano techniki immunofluorescencyjne i mikroskopię fluorescencyjną do immunodetekcji i lokalizacji komórek macierzystych w prawidłowym łożysku ludzkim. Liczebność komórek SSEA-4+, SSEA-3+, TRA- 1-60+ i TRA-1-81+ oraz komórek wykazujących koekspresję tych markerów, hodowanych w podłożach różniących się zawartością białek pochodzenia zwierzęcego, oceniano metodą cytometrii przepływowej.
Wyniki i wnioski: Wykazano, że komórki o cechach embrionalnych komórek macierzystych występują w łożysku ludzkim w nabłonku owodni i w kosmówce, natomiast nie są obecne w doczesnej. Nabłonek owodni zawierał różne populacje komórek macierzystych, przy czym najliczniejsze były komórki SSEA-4+. Stwierdzono dysproporcje liczbowe w subpopulacjach komórek SSEA-4+, SSEA-3+, TRA-1-60+ i TRA-1-81+ oraz komórek wykazujących koekspresję tych markerów, a także brak różnic ilościowych pomiędzy subpopulacjami komórek hodowanych w badanych podłożach. Podsumowując, nabłonek owodni zawiera komórki macierzyste reprezentujące różne stadia rozwoju, ale może być atrakcyjnym źródłem komórek macierzystych SSEA-4+. Skład badanych podłoży hodowlanych, charakteryzujący się różną zawartością białek pochodzenia zwierzęcego nie miał wpływu na liczebność subpopulacji komórek macierzystych identyfikowanych w hodowli.
Słowa kluczowe: áoĪ\sNo OXG]Nie / owodnia / pOXripoWencMaOne NomyrNi macier]\sWe / / marNer\ pOXripoWencMaOnoĞci / koekspresja / SSEA-3 / SSEA-4 / / TRA-1-60 / TRA-1-81 / podáoĪa KodowOane /
HWKLFDOO\ DFFHSWDEOH SRVVLELOLW\ WR REWDLQ WKHVH FHOOV IRU WKHUDSHXWLF SXUSRVHV DQG WUHDWPHQW RI PHWDEROLF DQG JHQHWLF GLVHDVHV > @
3HULQDWDO WLVVXHV VXFK DV WKH FRUG EORRG WKH SODFHQWD DQG WKH DPQLRWLF ÀXLG SOD\ D VSHFLDO UROH DV D VRXUFH RI SOXULSRWHQW FHOOV GXH WR WKH IDFW WKDW E\ QDWXUH WKH\ DUH D UHVHUYRLU RI FHOOV RI IHWDO RULJLQ
7KH SODFHQWD LV DQ RUJDQ IRUPHG LQ ODUJH SDUW IURP IHWDO WLVVXHV
HSLEODVW SRVWHPEU\RQLF PHVRGHUP DQG WURSKREODVW DQG LQ D UHODWLYHO\ VKRUW SHULRG RI WLPH ZKLFK SURYLGHV WKH SRVVLELOLW\ RI SUHVHUYLQJ D VLJQL¿FDQW QXPEHU RI FHOOV ZLWK WKH FKDUDFWHULVWLFV RI SOXULSRWHQW (6& DQG VLPLODU SRWHQWLDO WR GLIIHUHQWLDWLRQ >@
+XPDQ SODFHQWD LV UHODWLYHO\ HDV\ WR REWDLQ ZLWKRXW DGGLWLRQDO ULVN WR KHDOWK DQG OLIH RI WKH GRQRU RU WKH IHWXV DQG LV VXEMHFWHG WR PDQGDWRU\ UHF\FOLQJ ZLWKRXW HWKLFDO FRQFHUQV ,W PD\ EH WDNHQ GXULQJ ODERU LQ D PLQLPDOO\ LQYDVLYH DQG IDVW ZD\
7KH SODFHQWD LV FRPSRVHG RI D ODUJH QXPEHU RI FHOOV SHU XQLW ZHLJKWYROXPH LH IURP 1 WR 1 PLOOLRQ FHOOV1J WLVVXH GHSHQGLQJ RQ WKH SODFHQWDO OD\HU $SSUR[LPDWHO\ 1
PLOOLRQ FHOOV DUH REWDLQHG IURP KXPDQ DPQLRWLF HSLWKHOLDO FHOOV RI D VLQJOH SODFHQWD 7KH PHDQ SODFHQWDO ELUWK ZHLJKW LV DERXW
J 8QGRXEWHGO\ WKH SODFHQWD KDV WKH EHVW SDUDPHWHUV LQ WHUPV RI PDVV YROXPH DQG FHOO QXPEHU DPRQJ DOO RWKHU FXUUHQWO\ XVHG WLVVXH VRXUFHV RI 6& > @ 3ODFHQWDO FHOOV VKRZ D OLPLWHG H[SUHVVLRQ RI WKH PDMRU KLVWRFRPSDWLELOLW\ FRPSOH[
DQWLJHQV FODVV , +/$$ +/$% DQG +/$& DV ZHOO DV ODFN RI 0+& FODVV ,, ZKLFK LQ WKH FDVH RI FHOOV RI IHWDO RULJLQ LV D QDWXUDO LPPXQRVXSSUHVVLRQ PHFKDQLVP DJDLQVW WKH PDWHUQDO GHIHQVH V\VWHP 7KDW PD\ EH DQ LPSRUWDQW IDFWRU IRU WKH VDIH XVH RI WKHVH FHOOV DQG WKHLU SURJHQ\ GXULQJ WUDQVSODQWDWLRQ >1 11@
)LQDOO\ VWXGLHV KDYH VKRZQ WKDW KXPDQ DPQLRWLF HSLWKHOLDO FHOOV KDYH DQWLLQÀDPPDWRU\ SURSHUWLHV >1 13@ DQG SODFHQWDO 6& KDYH ORZ WXPRULJHQLF SURSHUWLHV > 11 14@
7KH GHYHORSPHQW RI HIIHFWLYH PHWKRGV IRU FHOO LVRODWLRQ DQG FXOWXUH DV ZHOO DV FRQWUROOLQJ WKH SURFHVV RI FHOO GLIIHUHQWLDWLRQ
SUHVHQWV DQRWKHU SUREOHP >4@ 6WHP FHOOV DUH FXUUHQWO\ GH¿QHG E\ D FRPELQDWLRQ RI SK\VLFDO JHQHWLF DQG IXQFWLRQDO SURSHUWLHV
8QLYHUVDO PDUNHUV IRU 6& WKDW PLJKW EH XVHG IRU GLUHFW DQG HI¿FLHQW LVRODWLRQ RI VSHFL¿F 6& SRSXODWLRQV KDYH QRW EHHQ GHWHUPLQHG
\HW $PRQJ WKH VSHFL¿F 6& VXUIDFH PDUNHUV DQ LPSRUWDQW UROH KDV EHHQ DVVLJQHG WR JO\FDQ HSLWRSHV WKDW IXQFWLRQ DV UHFHSWRUV DQG DUH LQYROYHG LQ FHOO DGKHVLRQ DQG VLJQDO WUDQVGXFWLRQ &RPPRQO\
XVHG PDUNHUV RI KXPDQ (6& K(6& LQFOXGH 75$1 DQG 75$11 7XPRU 5HMHFWLRQ $QWLJHQ 1 DQG 11 WKDW EHORQJ WR WKH FODVV RI NHUDWDQ VXOIDWH SURWHRJO\FDQV DQG 66($3 DQG 66($4 6WDJH6SHFL¿F (PEU\RQLF $QWLJHQ 3 DQG 4 ZKLFK DUH FDUERK\GUDWH HSLWRSHV RI JO\FRVSKLQJROLSLGV >1 1 1@
75$1 DQG 75$11 DUH H[SUHVVHG RQ WKH VXUIDFH RI KXPDQ WHWUDFDUFLQRPD 6& KXPDQ HPEU\RQLF JHUP FHOOV DQG K(6& >1@ \HW WKHLU PROHFXODU LGHQWLW\ KDV UHPDLQHG HOXVLYH IRU GHFDGHV
5HFHQWO\ WKH DSSOLFDELOLW\ RI 66($3 DQG 66($4 LQ WKH FKDUDFWHUL]DWLRQ RI 6& KDV EHHQ TXHVWLRQHG EHFDXVH RI WKH SUREDEOH LQFRUSRUDWLRQ RI JO\FDQV LQWR WKH F\WRSODVPLF PHPEUDQH DV D FRQVHTXHQFH RI FHOO PHWDEROLVP ,W LV OLNHO\
WKDW VRPH JO\FDQV PD\ DSSHDU RQ WKH FHOO VXUIDFH DV D UHVXOW RI WKHLU PRGL¿HG H[SUHVVLRQ SDWWHUQ GHSHQGLQJ RQ WKH VWDJH RI FHOO GLIIHUHQWLDWLRQ )LQDOO\ LW ZDV VXJJHVWHG WKDW WKH FKDQJHV RI 66($
HSLWRSHV PD\ GHSHQG RQ FHOOFXOWXUH PHGLXP UHODWLRQV ZKDW LV VWULFWO\ FRQQHFWHG ZLWK WKH XVH RI DQLPDOGHULYHG FRPSRQHQWV
>1 1@ ,Q WKH OLJKW RI WKHVH REVHUYDWLRQV YHUL¿FDWLRQ RI PDUNHU VXLWDELOLW\ DQG FRQWLQXRXV VHDUFK IRU VXFK GHWHUPLQDQWV RI SOXULSRWHQF\ ZRXOG DOORZ IRU WKH LVRODWLRQ RI WKH VXI¿FLHQW QXPEHU RI SRVVLEOH KRPRJHQHRXV FHOOV ZLWK FKDUDFWHULVWLFV RI (6&
The aim
7KH DLP RI WKH VWXG\ ZDV D TXDQWLWDWLYH DQDO\VLV RI DPQLRWLF 6& VXESRSXODWLRQV FXOWXUHG LQ WZR GLIIHUHQW PHGLD $OSKD 0(0 FRQWDLQLQJ IHWDO ERYLQH VHUXP )%6 DQG P7H651 FRQWDLQLQJ DQLPDOVRXUFHG ERYLQH DOEXPLQ EXW QR XQGH¿QHG VHUXP DQLPDORULJLQ FRPSRQHQWV 7KH LGHQWL¿FDWLRQ RI 6& ZDV EDVHG RQ WKH LPPXQRGHWHFWLRQ RI VXUIDFH PDUNHUV RI SOXULSRWHQF\
66($3 66($4 75$1 DQG 75$11 H[SUHVVLRQ DQG FR
H[SUHVVLRQ
Materials and Methods +Xman pOacenWas
7HUP SODFHQWDV IURP 3 KHDOWK\ GRQRU PRWKHUV DJHG 1
3 \HDUV ZHUH REWDLQHG IURP WKH 3HULQDWRORJ\ DQG *\QHFRORJ\
:DUG RI WKH &HQWUDO &OLQLFDO +RVSLWDO 0HGLFDO 8QLYHUVLW\ RI 6LOHVLD .DWRZLFH
7KH ZRPHQ JDYH WKHLU LQIRUPHG FRQVHQW 8QFRPSOLFDWHG HOHFWLYH FDHVDUHDQ GHOLYHULHV ZHUH SHUIRUPHG EHWZHHQ 3 DQG 3
ZHHNV JHVWDWLRQ IRU PHGLFDO UHDVRQV ,I QR HYLGHQFH RI SODFHQWDO LQVXI¿FLHQF\ ZDV IRXQG WKH SODFHQWDV ZHUH UDSLGO\ WUDQVIHUUHG WR WKH ODERUDWRU\ LQ SKRVSKDWH EXIIHUHG VDOLQH 3%6 FRQWDLQLQJ DQWLELRWLFDQWLP\FRWLF VROXWLRQ 3HQLFLOOLQ 1 8QLWVPO
6WUHSWRP\FLQ 6XOSKDWH 1 PJPO $PSKRWHULFLQ % JPO
3$$ DQG ('7$ P0 ('7$ ,QYLWURJHQ DQG ULQVHG VHYHUDO WLPHV ZLWK WKLV PL[WXUH WR UHPRYH EORRG
Table I. Efficiency of cell isolation from human placental amnion.
0orpKoOoJicaO sWXdies
&URVVVHFWLRQV H[FLVHG IURP WKH SHULFHQWUDO DUHD RI WKH SODFHQWD ZHUH ¿[HG LQ 1 IRUPDOGHK\GH GHK\GUDWHG LQ LQFUHDVLQJ FRQFHQWUDWLRQV RI HWKDQRO[\OHQH VHULHV DQG HPEHGGHG LQ SDUDI¿Q 7KH SDUDI¿Q EORFNV ZHUH FXW LQWR 4 ȝP VOLFHV ZKLFK ZHUH WKHQ GHSDUDI¿QL]HG DQG UHK\GUDWHG E\ SDVVLQJ WKURXJK D VHULHV RI [\OHQH DQG DOFRKRO DQG VWDLQHG ZLWK KHPDWR[\OLQ DQG HRVLQ +( E\ VWDQGDUG SURFHGXUH
,QYLYRimmXnodeWecWion oI sWem ceOO markers
)LUVWO\ 1[ PP WLVVXH VDPSOHV FRQWDLQLQJ HQWLUH FURVV
VHFWLRQV RI WKH GLVFRLG SODFHQWD ZHUH ¿[HG LQ 4 EXIIHUHG IRUPDOLQ S+ 4 KU DW URRP WHPSHUDWXUH IROORZHG E\ LQ¿OWUDWLRQ ZLWK 3 VXFURVH LQ 3%6 RYHUQLJKW DW 4& IRU FU\RSURWHFWLRQ 7KHQ
WKH VDPSOHV ZHUH HPEHGGHG LQ WLVVXH IUHH]LQJ PHGLXP 2&7 (PEHGGLQJ 0DWUL[ &HOO3DWK DQG P WKLFN FU\RVHFWLRQV ZHUH SUHSDUHG 7KH VHFWLRQV ZHUH ZDVKHG ZLWK 3%6 EORFNHG ZLWK 1
VROXWLRQ RI ERYLQH VHUXP DOEXPLQ %6$ DQG LQFXEDWHG ZLWK SULPDU\ DQWLERGLHV DQWL66($3 UDW ,J0 0$%433 DQWL
66($4 PRXVH ,J*3 0$%434 DQWL75$1 PRXVH ,J0
0$%43 RU DQWL75$11 PRXVH ,J0 0$%431 DOO IURP
&KHPLNRQ0LOOLSRUH DW D FRQFHQWUDWLRQ RI 1 JPO IRU KU
DW 4&
$IWHU WKH ZDVKLQJ VWHSV ZLWK 3%6 WKH VHFWLRQV ZHUH H[SRVHG WR DSSURSULDWH VHFRQGDU\ ),7&FRQMXJDWHG DQWLERGLHV PRXVH DQWLUDW ,J0 11 H%LRVFLHQFHV JRDW DQWLPRXVH ,J*3 11 $E'6HURWHFK RU JRDW DQWLPRXVH ,J0 SRO\FORQDO DQWLERG\ 1%4 1RYXV %LRORJLFDOV $IWHUZDUGV LQ RUGHU WR YLVXDOL]H WKH FHOO VWUXFWXUH )DFWLQ ZDV FRXQWHUVWDLQHG ZLWK
P0 5KRGDPLQH SKDOORLGLQ ,QYLWURJHQ )RU QXFOHL VWDLQLQJ
VOLFHV ZHUH PRXQWHG ZLWK +DUG 6HW 0RXQWLQJ 0HGLD FRQWDLQLQJ '$3, 9HFWRU /DERUDWRULHV ,Q FRQWURO VSHFLPHQV WKH SULPDU\
DQWLERG\ ZDV VXEVWLWXWHG ZLWK DQ HTXLYDOHQW FRQFHQWUDWLRQ RI LVRW\SHVSHFL¿F LPPXQRJOREXOLQV UDW ,J0 N ,VRW\SH &WUO 41 PRXVH ,J*3 N ,VRW\SH &WUO 4131 RU PRXVH ,J0 N ,VRW\SH &WUO 411 DOO IURP %LR/HJHQG
,soOaWion and cXOWXre oI ceOOs Irom WKe KXman amnioWic membrane
7KH DPQLRWLF PHPEUDQH ZDV PDQXDOO\ VHSDUDWHG IURP WKH FKRULRQ ZDVKHG LQ 3%6 VXSSOHPHQWHG ZLWK DQWLELRWLFV DQG DQWLP\FRWLFV DV GHVFULEHG DERYH DQG FXW LQWR SLHFHV a[
PP 7KH IUDJPHQWV ZHUH WKHQ VXEMHFWHG WR HQ]\PDWLF GLJHVWLRQ
DW 3& PLQXWHV ZLWK 4 8PO GLVSDVH VROXWLRQ 5RFKH WZLFH 4 PLQXWHV ZLWK WU\SVLQ4 P0 ('7$ VROXWLRQ 3$$
DQG PLQXWHV ZLWK PJPO FROODJHQDVH VROXWLRQ 5RFKH
&HOOV ZKLFK ZHUH UHFRYHUHG DIWHU GLJHVWLRQ ZHUH FROOHFWHG E\
FHQWULIXJDWLRQ 3 [ J 4& DQG VXVSHQGHG LQ D FRPSOHWH PHGLXP
)UDFWLRQV FROOHFWHG DIWHU HDFK GLJHVWLRQ VWHS ZHUH FRPELQHG WR FRQVWLWXWH D PL[WXUH RI WKH FHOOV )URP WKLV SURFHVV WKH UHVXOWLQJ FHOO VXVSHQVLRQV ZHUH GHSOHWHG RI UHG EORRG FHOOV E\ LQFXEDWLRQ ZLWK /\VLQJ %XIIHU %' %LRVFLHQFHV $IWHU FHQWULIXJDWLRQ DQG
¿OWUDWLRQ WKURXJK D 1 P FHOO VWUDLQHU WKH FHOOV ZHUH SODFHG LQWR FXOWXUH ÀDVNV 1 [ 15 FHOOVFP (DFK FHOO FXOWXUH ZDV PDLQWDLQHG LQ $OSKD 0(0 $OSKD 0RGL¿FDWLRQ RI 0LQLPXP (VVHQWLDO 0HGLXP 6LJPD$OGULFK VXSSOHPHQWHG E\ 1 )%6
1 DQWLELRWLFDQWLP\FRWLF VROXWLRQ DQG 1 /JOXWDPLQH DOO IURP 3$$ DQG LQ P7H651 PHGLXP 6WHP&HOO 7HFKQRORJLHV LQ ERWK FDVHV DW 3Ƞ& ZLWK ZDWHU VDWXUDWHG DWPRVSKHUH DQG 5
&2 $OSKD 0(0 FRQWDLQV QRQHVVHQWLDO DPLQR DFLGV VRGLXP S\UXYDWH DQG DGGLWLRQDO YLWDPLQV >@ DQG LV RQH RI WKH PRVW ZLGHO\ XVHG V\QWKHWLF FHOO FXOWXUH PHGLXP IRU FXOWLYDWLRQ RI D ZLGH YDULHW\ RI FHOOV JURZQ LQ PRQROD\HU ZKLOH P7H651 LV D VWDQGDUGL]HG PHGLXP IRU IHHGHULQGHSHQGHQW PDLQWHQDQFH RI K(6& LQ FXOWXUH >3 4@ P7H651 FRQWDLQV DQ DQLPDOVRXUFHG SURWHLQ ERYLQH DOEXPLQ EXW LW LV FKDUDFWHUL]HG E\ WKH HOLPLQDWLRQ RI XQGH¿QHG PHGLXP FRPSRQHQWV DQG UHPRYDO RI WKH LQKHUHQW YDULDELOLW\ DVVRFLDWHG ZLWK IHHGHU FHOOV DQG FRQGLWLRQHG PHGLD
K(6& PDLQWDLQHG LQ P7H651 PHGLXP VKRXOG EH SKHQRW\SLFDOO\
KRPRJHQRXV DQG H[SUHVV KLJK OHYHOV RI DQWLJHQV DVVRFLDWHG ZLWK SOXULSRWHQF\ 7KH PHGLD ZHUH FKDQJHG DIWHU 4 KU DQG HYHU\ 3±4 GD\V WKHUHDIWHU 7KH FHOOV ZHUH JURZQ IRU IXUWKHU 14 GD\V XQGHU WKHVH FRQGLWLRQV
,QYLWURimmXnodeWecWion oI sWem ceOO markers
$IWHU 1 KRXUV WKH FHOOV ZHUH FROOHFWHG FHQWULIXJHG
VXVSHQGHG LQ 3%6 VXSSOHPHQWHG ZLWK 1 )%6 DQG 5 P0 ('7$
DQG LQFXEDWHG 3 PLQ 4& LQ WKH GDUN ZLWK DQWLKXPDQ SULPDU\
DQWLERGLHV DQWL66($3 5DW ,J0 DQWL66($4 0RXVH ,J*3 DQWL
75$1 0RXVH %$/%F ,J0 53 DQG DQWL75$11 0RXVH %$/%F ,J0 51 4 RU ZLWK 5DW ,J0 553 4 0RXVH ,J*3 55 DQG 0RXVH ,J0 55344 DOO IURP %' 3KDUPLQJHQ LVRW\SH FRQWUROV $OO DQWLERGLHV ZHUH FRQMXJDWHG ZLWK ),7& DQG XVHG LQ DFFRUGDQFH ZLWK WKH PDQXIDFWXUHUV SURWRFRO O VROXWLRQ SHU 1 O FHOO VXVSHQVLRQ FRQWDLQLQJ 1 [ 1 FHOOV )LQDOO\ WKH FHOOV ZHUH ¿[HG LQ SDUDIRUPDOGHK\GH
DQG PRXQWHG LQ 9HFWDVKLHOG +DUG6HW 0RXQWLQJ 0HGLXP ± ZLWK '$3, 9HFWRU LQ RUGHU WR SUHYHQW SKRWREOHDFKLQJ
%RWK LPPXQRKLVWRFKHPLFDO DQG LPPXQRF\WRFKHPLFDO UHDFWLRQV ZHUH DQDO\]HG LQ ÀXRUHVFHQFH PLFURVFRSH 1LNRQ (FOLSVH 7L8 HTXLSSHG ZLWK D FDPHUD 1LNRQ 'LJLWDO 6LJKW '6
60& UXQQLQJ RQ WKH 1,6(OHPHQWV $5 3 VRIWZDUH 1LNRQ ,QVWUXPHQWV ,QF
Flow cytometry
,Q RUGHU WR FRPSOHWH ÀRZ F\WRPHWULF DQDO\VLV WKH FHOOV REWDLQHG IURP WKH DPQLRWLF PHPEUDQH ZHUH KDUYHVWHG VHTXHQWLDOO\
DIWHU 1 KRXUV DQG RQ GD\V DQG 14 RI FXOWXUH PDQDJHPHQW LQ WZR GLIIHUHQW PHGLD ,PPXQRVWDLQLQJ ZDV SHUIRUPHG IRU 3
PLQXWHV DW 4& LQ WKH GDUN XVLQJ 3( DQWL66($3 UDW ,J0 $OH[D )OXRU 4 DQWL+XPDQ 75$11 PRXVH ,J0 541 +XPDQ 3OXULSRWHQW 6WHP &HOO 6RUWLQJ DQG $QDO\VLV .LW %' 3KDUPLQJHQ 3( DQWLKXPDQ 75$1 PRXVH ,J0 51 3 %' 3KDUPLQJHQ
$OH[D )OXRU 4 DQWLKXPDQ 75$15 PRXVH ,J0 33
%LR/HJHQG DQG 3HU&3 DQWLKXPDQPRXVH 66($4 PRXVH ,J*3 )$%1435& 5 ' 6\VWHPV LQ FRPELQDWLRQV ,Q DGGLWLRQ
PDWFKHG LVRW\SH FRQWUROV ZHUH XVHG QDPHO\ ),7& 0RXVH ,J0
3( 5DW ,J0 $OH[D )OXRU 4 0RXVH ,J0 541 +XPDQ 3OXULSRWHQW 6WHP &HOO 6RUWLQJ DQG $QDO\VLV .LW %' 3KDUPLQJHQ 3( 0RXVH ,J0 4111 %LR/HJHQG $OH[D )OXRU 4 0RXVH ,J0 411 %LR/HJHQG DQG 3HU&3 0RXVH ,J*3 ,&&
5 ' 6\VWHPV (DFK WLPH DW OHDVW 1 HYHQWV ZHUH DQDO\]HG E\ ÀRZ F\WRPHWU\ )$&6 $ULD %HFWRQ 'LFNLQVRQ ZLWK WKH %' )$&6'L9D VRIWZDUH
Statistical analysis
6WDWLVWLFDO DQDO\VLV ZDV SHUIRUPHG XVLQJ 0DQQ:KLWQH\ 8 WHVW 7KH OHYHO RI VLJQL¿FDQFH ZDV VHW DW S 5
Results
,Q WKH ¿UVW VWDJH RI WKH H[SHULPHQW ZH SHUIRUPHG LQ YLYR LPPXQRORFDOL]DWLRQ IROORZHG E\ LQ YLWUR LPPXQRGHWHFWLRQ DQG ÀRZ F\WRPHWULF TXDQWL¿FDWLRQ RI DPQLRWLF FHOOV H[SUHVVLQJ PDUNHUV RI SOXULSRWHQF\ LVRODWHG IURP QRUPDO WHUP KXPDQ SODFHQWD )LJXUH 1
,mmXnolocali]ation oI SSEA-3+, SSEA-4+, TRA-1-60+ and TRA-1-81+ cells in KXman placenta
,W ZDV VKRZQ WKDW WKH FHOOV FKDUDFWHUL]HG E\ 66($4 )LJXUH
66($3 )LJXUH 3 75$1 )LJXUH 4 DQG 75$11 )LJXUH 5 PDUNHU H[SUHVVLRQV ZHUH SUHVHQW PRVWO\ LQ WKH DPQLRWLF HSLWKHOLXP DQG LQ D VPDOOHU QXPEHU 66($4 DQG 66($3 LQ WKH VWHP DQG WHUWLDU\ YLOOL 1R LPPXQRUHDFWLYLW\ LQ WKH GHFLGXDO FHOOV ZDV REVHUYHG 'DWD JDWKHUHG IURP WKH LPPXQRKLVWRFKHPLFDO UHDFWLRQ XQGHU WKH ÀXRUHVFHQFH PLFURVFRSH VKRZHG WKDW 66($
4+ FHOOV ZHUH WKH PRVW QXPHURXV LQ WKH DPQLRQ &HOOV H[SUHVVLQJ 66($3 75$1 DQG 75$11 PDUNHUV ZHUH VSUHDG EHWZHHQ WKH FHOOV RI WKH DPQLRWLF HSLWKHOLXP VRPHWLPHV JURXSHG LQ VPDOO FOXVWHUV
Isolation of the amniotic cells and LQYLWUR TXali¿cation and TXanti¿cation of SSEA-3+, SSEA-4+, TRA-1-60+ and TRA-1- 81+ cells
7KH REWDLQHG PHDQ HI¿FDF\ RI FHOO LVRODWLRQ ZDV PLOOLRQ FHOOV IURP 1J RI KXPDQ DPQLRWLF WLVVXH 7DEOH , 7KH LVRODWLRQ RI WKH FHOOV IURP WKH DPQLRWLF PHPEUDQH ZDV IROORZHG E\ WKH LPPXQRGHWHFWLRQ RI 6& PDUNHUV LQ WKH SULPDU\ FXOWXUH )LJXUH
DQG ÀRZ F\WRPHWULF TXDOLWDWLYH DQG TXDQWLWDWLYH DQDO\VLV RI 66($3+ 66($4+ 75$1+ DQG 75$11+ VXESRSXODWLRQV RI KXPDQ DPQLRWLF FHOOV )LJXUH
2XU DQDO\VLV VKRZHG WKDW LVRODWHG DPQLRWLF FHOOV H[SUHVVHG DOO IRXU PDUNHUV 66($4+ FHOOV ZHUH WKH PRVW QXPHURXV ±
5 IROORZHG E\ FHOOV ZLWK 66($3 PDUNHU 4 ±3 75$
11 5± DQG ¿QDOO\ FHOOV PDUNHG ZLWK 75$1 34 RI WKH HQWLUH SRSXODWLRQ )LJXUH
,QYLWUR SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 and TRA-1-81 co-expression
,Q WKH QH[W VWHS RI WKH H[SHULPHQW ZH LQYHVWLJDWHG WKH SUHVHQFH RI D SRSXODWLRQ RI FHOOV H[SUHVVLQJ WKH IRXU HYDOXDWHG (6& PDUNHUV WRJHWKHU LQ WKH DPQLRQ )LJXUH DQG )LJXUH
7KH PXOWLSDUDPHWHU ÀRZ F\WRPHWU\ DQDO\VLV UHYHDOHG D YHU\ VPDOO QXPEHU RI FHOOV 3 H[SUHVVLQJ 66($3 WRJHWKHU ZLWK 66($4 75$1 DQG 75$11 'LIIHUHQW FRPELQDWLRQV RI 66($4 PDUNHU ZLWK 66($3 75$1 DQG 75$11 DQWLJHQV FRPSULVLQJ IURP 35 WR 5 RI WKH SULPDU\ FXOWXUH
ZHUH IRXQG
&ell cXltXre in Alpha 0E0/F%S and mTeSR1 mediXm )LQDOO\ ZH H[HFXWHG D TXDQWLWDWLYH DQDO\VLV RI 66($3+ 66($4+ 75$1+ DQG 75$11+ VXESRSXODWLRQV GXULQJ D 14GD\ LQFXEDWLRQ SHULRG RI WKH DPQLRWLF FHOOV LQ WZR GLIIHUHQW PHGLD $OSKD 0(0)%6 DQG P7H651 7KH TXDQWLWDWLYH GDWD RI WKH VWXGLHG VXESRSXODWLRQV REWDLQHG IURP WKH ÀRZ F\WRPHWU\
RQ GD\V 1 DQG 14 RI WKH LQFXEDWLRQ )LJXUH GLG QRW UHYHDO WKH SUHVHQFH RI VLJQL¿FDQWO\ GLIIHUHQW QXPEHUV RI 66($3+ 66($4+ 75$1+ DQG 75$11+ FHOOV ,Q WKH SULPDU\
FXOWXUH DQG GXULQJ WKH 14GD\ FXOWXUH ERWK LQ P7H651 PHGLXP FRQWDLQLQJ VLJQL¿FDQWO\ UHGXFHG DPRXQW RI SURWHLQV RI DQLPDO RULJLQ DQG LQ $OSKD 0(0 PHGLXP FRQWDLQLQJ 1 )%6 ZH GLG QRW REVHUYH VLJQL¿FDQW IDOVL¿HG SRVLWLYH FKDQJHV LQ WKH QXPEHU RI FHOOV H[SUHVVLQJ ERWK 66($ DQG 75$ PDUNHUV
Discussion
7KH DSSOLFDELOLW\ RI 66($3 DQG 66($4 LQ WKH FKDUDFWHULVWLFV RI 6& KDV UHFHQWO\ EHHQ TXHVWLRQHG GXH WR WKH IDFW WKDW VRPH JO\FDQV DUH OLNHO\ WR DSSHDU RQ WKH FHOO VXUIDFH DV WKH UHVXOW RI PHWDEROLF LQFRUSRUDWLRQ ,W ZDV DOVR IRXQG WKDW
D FOHDUFXW VZLWFK LQ WKH FRUH VWUXFWXUHV RI JO\FRVSKLQJROLSLGV RFFXUV GXULQJ K(6& GLIIHUHQWLDWLRQ LQWR HPEU\RLG ERGLHV FDXVLQJ FURVVUHDFWLYLW\ RI DQWLERGLHV DJDLQVW 66($3 DQG 66($4 ZLWK
Figure 1. Topography of the human placenta at term. The tissues in which stem cell markers were identified are shown (H-E staining). Human amnion contains mesenchymal sparse stromal cells and it is lined by closely packed ectodermal epithelial cells.
WKHVH PROHFXOHV >5@ ,Q DGGLWLRQ WKH SUHVHQFH RI 66($ DQWLJHQV RQ WKH VXUIDFH RI FHOOV LQ FXOWXUH FRQGLWLRQV KDV EHHQ VXJJHVWHG WR EH WKH FRQVHTXHQFH RI FKDQJHV LQ WKHLU QDWXUH GHSHQGLQJ RQ WKH FHOOPHGLXP LQWHUDFWLRQV LQYROYLQJ WKH LQFRUSRUDWLRQ RI JO\FRVSKLQJROLSLGV RI )%6 LQGXFWLRQ RI JHQH H[SUHVVLRQ RI JO\FRV\OWUDQVIHUDVHV RU )%6LQGXFHG DFWLYLW\ RI HQ]\PHV LQYROYHG LQ WKH ELRV\QWKHVLV RI 66($3 >1@
)%6 LWVHOI FRQWDLQV D GHWHFWDEOH DPRXQW RI JORERVHULHV JO\FRVSKLQJROLSLGV DQG D PROHFXOH FRUUHVSRQGLQJ WR WKH VL]H RI 66($4 FRXOG EH GHWHFWHG >1 @ 5HFHQWO\ D QXPEHU RI FHOO
FXOWXUH PHGLD IRUPXODWLRQV IRU PDLQWDLQLQJ K(6& DQG UHWDLQLQJ WKH DGYDQWDJHV RI EHLQJ IXOO\GH¿QHG DQG VHUXPIUHH KDYH EHHQ GHVFULEHG :H ZHUH DEOH WR YHULI\ WKH K\SRWKHVLV WKDW D FXOWXUH HQYLURQPHQW FDQ FKDQJH WKH H[SUHVVLRQ SDWWHUQ RI PDUNHUV RI SOXULSRWHQF\ GXULQJ D 14 GD\ DPQLRQGHULYHG 6& FXOWXUH LQ WZR GLIIHUHQW PHGLD
$W WKH ¿UVW VWDJH RI WKH H[SHULPHQW ZH FKRVH DQG TXDQWL¿HG WKH FHOOV H[SUHVVLQJ 66($3 DQG 66($4 DV ZHOO DV XQFRQWHVWHG PDUNHUV RI SOXULSRWHQF\ QDPHO\ 75$1 DQG 75$11
ZKLFK DUH VSHFL¿F LQGLFDWRUV IRU (6& >1 1 1 @
Figure 2. Immunolocalization of SSEA-4+ cells in human placenta at term. FITC (green) - anti-SSEA-4 antibody (left columns) and adequate isotypic controls (right columns) conjugated with FITC; TRITC (red-orange) - F-actin stained with Rhodamine phalloidin; DAPI (blue)- cell nuclei stained with DAPI. Specific staining for SSEA-4 is shown separately in the left column FITC. Scale = 10 μm.
,W LV NQRZQ WKDW WKH FRPSRVLWLRQV RI 6& RI WKH DPQLRWLF PHPEUDQH FRPSDULQJ ZLWK RWKHU SODFHQWDO WLVVXHV DUH TXLWH GLIIHUHQW DQG LW VHHPV WKDW WKH DPQLRWLF PHPEUDQH UHWDLQV SOXULSRWHQW 6& FKDUDFWHULVWLFV ,W PD\ UHÀHFW WKH GLIIHUHQW RULJLQ RI WKH DPQLRQ IURP SOXULSRWHQW HSLEODVW DQG WKH FKRULRQ IURP WURSKHFWRGHUP DV ZHOO DV WKH GLVWDQFH EHWZHHQ WKH DPQLRWLF FHOOV DQG WKH FHQWHUV RI RUJDQRJHQHVLV ZKHUH WKH\ GHYHORS WKH H[WUDFHOOXODU PDWUL[ LV SURGXFHG DQG JURZWK IDFWRUV DUH VHFUHWHG
,W ZDV DOVR FRQ¿UPHG LQ YLYR E\ ,]XPL HW DO >@ WKDW PRVW HSLEODVWGHULYHG IHWDO DPQLRWLF HSLWKHOLDO FHOOV DUH SRVLWLYH IRU 6&
PDUNHUV LQ WKH HDUO\ VHFRQG WULPHVWHU RI WKH SUHJQDQF\ 11
ZHHNV DQG VRPH RI WKHP UHPDLQ LQ WKH WHUP DPQLRQ 7KH DXWKRUV REVHUYHG WKDW WKH SHUFHQWDJH RI 75$1+ DQG 75$11+ FHOOV GHFUHDVHG RYHU WKH FRXUVH RI SUHJQDQF\ IURP DERXW 34 WR DERXW IHZ SHUFHQW
7KH DERYH PHQWLRQHG UHVXOWV DV ZHOO DV RXU UHVXOWV ZKLFK LGHQWL¿HG WKH H[SUHVVLRQ RI 66($3 66($4 75$1 DQG 75$11 LQ IHWDO WLVVXHV RI KXPDQ WHUP SODFHQWD HVSHFLDOO\
LQ WKH DPQLRWLF HSLWKHOLXP LQGLFDWH WKDW HYHQ DW WHUP WKH UDWLRV RI WKH FHOOV H[SUHVVLQJ DOO IRXU PDUNHUV LQ WKH KXPDQ DPQLRQ IURP IHZ WR PRUH WKDQ 5 DUH FRQVLGHUDEO\ KLJKHU WKDQ LQ RWKHU SODFHQWDO WLVVXHV DV ZHOO DV LQ DGXOW 6& 11 IRU
Figure 3. Immunolocalization of SSEA-3+ cells in human placenta at term. FITC (green) - anti-SSEA-3 antibody (left columns) and adequate isotypic controls (right columns) conjugated with FITC; TRITC (red-orange) - F-actin stained with Rhodamine phalloidin; DAPI (blue) - cell nuclei stained with DAPI Specific staining for SSEA-3 is shown separately in the left column FITC. Scale = 10 μm.
H[DPSOH LQ ERQH PDUURZ >@ 7KH SURSRUWLRQ RI DPQLRWLF FHOOV ZKLFK UHDFW ZLWK WKH 66($4 75$1 75$11 DQG 66($
3 DQWLERGLHV WRJHWKHU ZLWK WKH IDFW WKDW DQWL66($3 DQG DQWL
66($4 DQWLERG\ UHFRJQL]HV GLIIHUHQW SDUWV RI WKH JDQJOLRVLGH DQG WKDW DQWL75$1 DQG DQWL75$11 DQWLERG\ UHFRJQL]HV GLIIHUHQW HSLWRSHV VXJJHVW WKDW DPQLRWLF 6& DUH DW YDULRXV VWDJHV RI GLIIHUHQWLDWLRQ ,W LQGLFDWHV WKDW WKH DPQLRWLF FHOO SRSXODWLRQ FRQVLVWV RI GLIIHUHQW VXEVHWV 6LPLODUO\ DV LQ WKH VWXG\ E\ 0LNL HW DO > @ QR VSHFL¿F SDWWHUQ RI WKH 6& PDUNHUSRVLWLYH FHOOV GLVWULEXWLRQ ZDV REVHUYHG LQ GLIIHUHQW SDUWV RI WKH DPQLRQ 7KH DXWKRUV VXJJHVWHG WKDW DPQLRWLF 6& DUH QRW RUJDQL]HG E\ H[WHUQDO
UHJXODWRU\ VLJQDOV 7KH\ VKRZHG DOVR WKDW DOPRVW DOO DPQLRWLF HSLWKHOLDO FHOOV UHDFW ZLWK DQWLERGLHV VSHFL¿F IRU 66($4 DQG 1 ZLWK DQWLERGLHV WR 75$1 DQG 75$11 $PQLRWLF PHVHQFK\PDO FHOOV DQG FHOOV REVHUYHG LQ DQ\ RWKHU SDUW RI WKH KXPDQ SODFHQWD FKRULRQ DQG GHFLGXD EDVDOLV ZHUH QHJDWLYH IRU 66($4 75$1 DQG 75$11 ,Q KLVWRORJLFDO VHFWLRQV WDNHQ IURP WKH KXPDQ SODFHQWD 66($3+ FHOOV ZHUH QRW REVHUYHG LQ DQ\ OD\HU RI WKH SODFHQWD LQ YLYR 7KDW ¿QGLQJ LV LQ FRQWUDVW WR RXU REVHUYDWLRQV WKDW ERWK 66($4+ DQG 66($3+ FHOOV DUH SUHVHQW LQ WKH DPQLRWLF HSLWKHOLXP DQG WKDW VPDOO VXESRSXODWLRQV RI WKHVH FHOOV DUH SUHVHQW LQ VWHP DQG WHUWLDU\ YLOOL ,W VKRXOG EH DOVR QRWHG
Figure 4. Immunolocalization of TRA-1-60+ cells in human placenta at term. FITC (green)- anti-TRA-1-60 antibody (left columns) and adequate isotypic controls (right columns) conjugated with FITC; TRITC (red-orange)- F-actin stained with Rhodamine phalloidin; DAPI (blue)- cell nuclei stained with DAPI. Specific staining for TRA-1-60 is shown separately in the left column FITC. Scale = 10 μm.
WKDW +XDQJ HW DO IRXQG WKDW DOO DERYH PHQWLRQHG DQWLJHQV DV ZHOO DV 2FW4 FDQ EH GHWHFWHG LQ 06& GHULYHG IURP WKH GHFLGXD EDVDOLV UDQJLQJ IURP 335 WR 44 >3@
,Q HDUOLHU VWXGLHV 0LNL HW DO IRXQG DQG TXDQWL¿HG in YiWUR DPQLRWLF 66($4+ 43 75$11+ 75$
1+ DQG 66($3+ FHOOV GHVSLWH WKH IDFW WKDW WKH ODWWHU ZHUH QRW LGHQWL¿HG in YiYR >31@ 7KH GLIIHUHQFH LQ DPQLRWLF 66($3+ in YiYR DQG in YiWUR LGHQWL¿FDWLRQ PD\ UHVXOW IURP D WHPSRUDU\ DSSHDUDQFH RI WKLV DQWLJHQ RQ WKH FHOOV ,W ZDV SUREDEO\ QRW LQÀXHQFHG E\ FRPSRQHQWV RI WKH FXOWXUH PHGLD LQFOXGLQJ 1 )%6 EHFDXVH LQ RXU VWXG\ ZH LGHQWL¿HG 66($
3+ FHOOV ERWK in YiYR DQG in YiWUR 2XU UHVXOWV EDVHG RQ RQH
PDUNHU LGHQWL¿FDWLRQ in YiWUR VKRZHG DPQLRQGHULYHG 6& WR EH SKHQRW\SLFDOO\ KHWHURJHQHRXV ZLWK WKH GRPLQDQFH RI WKH 66($
4+ FHOOV ± 5 6XESRSXODWLRQV RI FHOOV ZLWK 66($3 75$
11 DQG 75$1 PDUNHUV ZHUH VLJQL¿FDQWO\ OHVV QXPHURXV 4 ±3 5± DQG 34 UHVSHFWLYHO\ 7KHVH REVHUYDWLRQV FRQ¿UP WKDW DPQLRWLF HSLWKHOLXP RIIHUV WKH ODUJHVW SRWHQWLDO UHVHUYRLU RI FHOOV H[SUHVVLQJ PDUNHUV RI SOXULSRWHQF\ HVSHFLDOO\
66($4 DPRQJ RWKHU WLVVXHV RI WKH KXPDQ SODFHQWD
'DWD DQDO\]LQJ WKH FRH[SUHVVLRQ RI DQWLJHQV WKDW DUH SOXULSRWHQF\ PDUNHUV RQ DPQLRWLF 6& DUH VFDUFH
Figure 5. Immunolocalization of TRA-1-81+ cells in human placenta at term. FITC (green)- anti-TRA-1-81 antibody (left columns) and adequate isotypic controls (right columns) conjugated with FITC; TRITC (red-orange) - F-actin stained with Rhodamine phalloidin; DAPI (blue) - cell nuclei stained with DAPI. Specific staining for TRA-1-81 is shown separately in the left column FITC. Scale = 10 μm.
,Q RXU VWXG\ WKH PXOWLSDUDPHWHU ÀRZ F\WRPHWU\ DQDO\VLV UHYHDOHG D YHU\ VPDOO QXPEHU RI FHOOV 3 H[SUHVVLQJ 66($
3 WRJHWKHU ZLWK 66($4 75$1 DQG 75$11 LQ WKH KXPDQ DPQLRQ 'LIIHUHQW FRPELQDWLRQV RI WKH 66($4 PDUNHU ZLWK 66($3 75$1 DQG 75$11 DQWLJHQV FRPSULVLQJ IURP 35 WR 5 RI WKH SULPDU\ FXOWXUH ZHUH IRXQG ,W VHHPV WKDW 66($4+ VXESRSXODWLRQ LV KHWHURJHQHRXV DQG RQO\ DERXW 5
RI WKH DPQLRWLF FHOOV FRQWDLQ ERWK 66($4 DQG 66($3DQWLJHQ
7KH SRVVLELOLW\ WKDW 66($3 75$1 DQG 75$11 DUH QRW WKH PDLQ 66($4 SDUWQHUV LQ WKH FRH[SUHVVLRQ RQ WKH DPQLRWLF FHOOV FDQQRW EH UXOHG RXW 2WKHU DXWKRUV IRXQG WKDW 66($4 VWDLQLQJ
ZDV QRW FRQ¿QHG WR WKH 75$1+ FHOOV LQ FRORQLHV RI YDULRXV SOXULSRWHQW K(6& OLQHV VWDLQHG ZLWK YDULRXV PDUNHUV DW GLIIHUHQW WLPH SRLQWV 75$1+ FHOOV H[KLELWHG RYHUODSSLQJ VSHFL¿F 2FW4 DQGRU 1DQRJ VWDLQLQJ &RH[SUHVVLRQ RI DOO PDUNHUV ZDV GHWHFWHG RQO\ LQ VPDOO DUHDV >3@
$V D FRQVHTXHQFH DPQLRWLF 6& OLNH K(6& PD\ EH GLYLGHG LQWR PDQ\ GLIIHUHQW FHOO VXESRSXODWLRQV DQG GLYHUVL¿HG LQ WKHLU FORQRJHQLF VHOIUHQHZDO DQG SOXULSRWHQW SURSHUWLHV >33@ ,W VHHPV DOVR WKDW KXPDQ DPQLRQ FHOOV GLVSOD\ VRPH FKDUDFWHULVWLF SURSHUWLHV RI 6& UHJDUGOHVV ZKHWKHU WKH\ DUH ORFDWHG LQ WKH DPQLRWLF VWURPD RU WKH HSLWKHOLXP DQG GLIIHUHQW HPEU\RORJLFDO RULJLQ RI
Figure 6. Immunodetection of SSEA-4+, SSEA-3+, TRA-1-60+ and TRA-1-81+ cells in primary culture of amniotic cells. FITC (green) - specific antibodies (left columns) and adequate isotypic controls (right columns) conjugated with FITC; TRITC (red-orange) - F-actin stained with Rhodamine phalloidin; DAPI (blue) - cell nuclei stained with DAPI.
Specific staining for SSEA-4, SSEA-3, TRA-1-60 and TRA-1-81 is shown separately in the left column FITC. Scale = 10 μm.
WKHVH OD\HUV %RWK SRSXODWLRQV KDG D VLPLODU LPPXQRSKHQRW\SH DQG SRWHQWLDO IRU in YiWUR GLIIHUHQWLDWLRQ LQWR PDMRU PHVRGHUPDO OLQHDJHV >34@ /DFN RI VLJQL¿FDQW TXDQWLWDWLYH GLIIHUHQFHV LQ WKH QXPEHU RI 6& EDVHG RQ WKH H[SUHVVLRQ DQG FRH[SUHVVLRQ RI 66($3 66($4 75$1 DQG 75$11 PDUNHUV REVHUYHG LQ RXU VWXG\ PD\ LQGLFDWH WKDW WKH H[SUHVVLRQ RI WKHVH PDUNHUV in YiWUR ZDV QRW LQÀXHQFHG E\ WKH FRPSRQHQWV RI WKH $OSKD 0(0
)%6 DQG P7H651 FXOWXUH PHGLD
%DVHG RQ GLIIHUHQW QXPEHU RI DPQLRWLF 66($4+ DQG 66($3+ FHOOV LGHQWL¿HG LQ SUHVHQWHG VWXGLHV WKH TXHVWLRQ DULVHV ZKHWKHU WKHVH FHOOV H[KLELW PRUH RU OHVV SURQRXQFHG SOXULSRWHQF\
'XULQJ K(6& GLIIHUHQWLDWLRQ 66($3 DQG 66($4 VXFFHVVLYHO\
GLVDSSHDUHG IURP WKH VXUIDFH RI WKH FHOOV DQG 66($4 EXW QRW 66($3 ZDV IRXQG RQ 06& >1 @ 7KDW DEVHQFH GLG QRW VHHP WR H[HUW D VLJQL¿FDQW LQÀXHQFH RQ FHOO SOXULSRWHQF\ >@ +XPDQ SULPRUGLDO JHUP FHOOV ZHUH SRVLWLYH IRU ERWK 66($3 DQG 66($
4 EXW KXPDQ DPQLRWLF VWHP FHOOV &'11+ DEOH WR JHQHUDWH FHOO OLQHDJHV RI GLIIHUHQW JHUP OD\HUV ZHUH SRVLWLYH IRU 66($4 DQG QHJDWLYH IRU 66($3 >1@
Figure 7. Flow cytometric analysis of amnion-derived cells exhibiting co-expression of SSEA-4, SSEA-3, TRA-1-60 and TRA-1-81. Arrows show the consecutive steps of the analysis starting from the primary culture (P1 population).
Figure 8. Quantitative data of the co-expression analysis of stem cell markers on amnion-derived cells. The results show a number of positive-staining cells as a percent of primary population. Amniotic cells taken from the placenta were cultured in both mTeSR1 and Alpha MEM/FBS. The values are means of measurements from two placentas. The differences between the cultures in two different media were not significant.
0RUHRYHU K(6& JHQHUDWHG IURP ERWK 66($3+ DQG 66($
3 FHOOV UHWDLQHG WKHLU SOXULSRWHQW SRWHQWLDO DQG FKURPRVRPDO VWDELOLW\ DQG ZHUH DEOH WR JHQHUDWH WHUDWRPDV FRQWDLQLQJ DOO WKUHH JHUP OD\HUV XSRQ LQMHFWLRQ LQWR LPPXQRGH¿FLHQW PLFH >33@
2Q WKH RWKHU KDQG ERWK 66($3 DQG 66($4 DQWLJHQV DV ZHOO DV 75$1 DQG 75$1 ZHUH DOVR IRXQG RQ KXPDQ ¿UVW
WULPHVWHU IHWDO EORRG WKH OLYHU DQG ERQH PDUURZ PHVHQFK\PDO VWHP FHOOV 06& 7KH GDWD RQ WKHLU SUHVHQFH RQ DGXOW 06& DUH LQFRQFOXVLYH >1 35 3@
Conclusion
7R VXP XS WKLV SUHOLPLQDU\ VWXG\ VKRZV WKDW WKH HYDOXDWLRQ RI 66($3 H[SUHVVLRQ DQG LWV VLDO\ODWHG GHULYDWLYH 66($
4 DV ZHOO DV WKH UHFRJQL]HG 6& PDUNHUV 75$1 DQG 75$
11 ZKLFK FDQ EH DXWKRULWDWLYH LQGLFDWRUV RI SOXULSRWHQW FHOOV LQ WKH SULPDU\ FXOWXUH KDV QRW EHHQ LQÀXHQFHG E\ PHGLD FRPSRQHQWV $PQLRWLF 6& H[SUHVVLQJ 66($ HSLWRSHV FDQ EH LGHQWL¿HG LQGHSHQGHQWO\ RI WKH )%6 SUHVHQFH LQ WKH FRQWHQW RI WKH FXOWXUH PHGLD
:H KDYH UHFHQWO\ UHSRUWHG WKDW KXPDQ DPQLRQ PLJKW KDYH DWWUDFWHG DWWHQWLRQ DV DQ DOWHUQDWLYH VRXUFH RI 66($4+ 6& EXW WR D OHVVHU GHJUHH RI 66($4+ FHOOV H[KLELWLQJ FRH[SUHVVLRQ RI WKH NQRZQ PDUNHUV RI SOXULSRWHQF\ 66($3+ 75$1+ DQG 75$
11+ 7KH FHOOV ZLWK FKDUDFWHULVWLFV RI (6& ± 66($4+ 75$
1+ 75$11+ DV ZHOO DV WKH FHOOV H[SUHVVLQJ WKH 66($3 PDUNHU FRXOG EH LGHQWL¿HG LQ WKH IHWDO SDUW RI WKH KXPDQ SODFHQWD
QRW RQO\ LQ WKH DPQLRQ EXW DOVR WKH FKRULRQ
Acknowledgments
This work was supported by the institutional grants from the Medical University of Silesia: grant no KNW-1-027/10, KNW-1-007/P/1/0, KNW-1- 036/P/2/0 and KNW-1-051/N/3/0.
Oświadczenie autorów:
1. Aleksandra Bryzek – autor koncepcji i założeń pracy, korekta i aktualizacja literatury, zebranie materiału, wykonanie badań laboratoryjnych, opracowanie wyników badań, współautor protokołu, analiza i interpretacja wyników, przygotowanie manuskryptu i piśmiennictwa, współautor tekstu pracy, korekta i akceptacja ostatecznego kształtu manuskryptu.
2. Piotr Czekaj – autor koncepcji i założeń pracy, współautor protokołu, opracowanie wyników badań, analiza statystyczna wyników, analiza i interpretacja wyników, przygotowanie manuskryptu i piśmiennictwa, współautor tekstu pracy, korekta i aktualizacja piśmiennictwa, uzyskanie funduszy na realizację badań laboratoryjnych, przygotowanie, korekta i akceptacja ostatecznego kształtu manuskryptu – autor zgłaszający i odpowiedzialny za manuskrypt.
3. Danuta Plewka – wykonanie badań laboratoryjnych, opracowanie wyników badań, analiza i interpretacja wyników.
4. Halina Komarska – wykonanie badań laboratoryjnych, opracowanie wyników badań.
5. Marcin Tomsia – zebranie materiału, wykonanie badań laboratoryjnych, opracowanie wyników badań, korekta i aktualizacja literatury.
6. Marta Lesiak – wykonanie badań laboratoryjnych, opracowanie wyników badań.
7. Aleksander L. Sieroń – współautor założeń pracy, współautor protokołu, korekta i aktualizacja literatury, korekta i akceptacja ostatecznego kształtu manuskryptu.
8. Jerzy Sikora – współautor założeń pracy, zebranie materiału, współautor tekstu pracy, współautor protokołu, korekta i akceptacja ostatecznego kształtu manuskryptu, uzyskanie funduszy na realizację badań laboratoryjnych.
9. Katarzyna Kopaczka – aktualizacja literatury, zebranie materiału, wykonanie badań laboratoryjnych.
Źródło finansowania:
badania statutowe SUM nr KNW-I-027/10, KNW-1-007/P/10, KNW-1- 036/P/2-0 i KNW-1-51/N/3/0.
Konflikt interesów:
Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów oraz nie otrzymali żadnego wynagrodzenia związanego z powstawaniem pracy.
Piśmiennictwo
1. Ratajczak MZ, Zuba-Surma E, Kucia M, [et al.]. Pluripotent and multipotent stem cells in adult tissues. Adv Med Sci. 2012, 57 (1), 1-17.
2. Ratajczak M, Machliński B, Czajka R, [et al.]. Physiological and pathological consequences of a presence of germ line stem cells in adult tissues. Ginekol Pol. 2009, 80 (12), 935-941.
3. Stangel-Wójcikiewicz K, Majka M, Basta A, [et al.]. Adult stem cells therapy for urine incontinence in women. Ginekol Pol. 2010, 81 (5), 378-381.
4. Zuba-Surma EK, Kucia M, Abdel-Latif A, [et al.]. Morphological characterization of very small embryonic-like stem cells (VSELs) by ImageStream system analysis. J Cell Mol Med. 2008, 12 (1), 292-303.
5. Kao CF, Chuang CY, Chen CH, Kuo HC. Human pluripotent stem cells: current status and future perspectives. Chin J Physiol. 2008, 51 (4), 214-225.
6. Ratajczak MZ, Zuba-Surma E, Ratajczak J. Komórki macierzyste – blaski i cienie. Acta Haematol Polon, 2009, 40 (6), 289-303.
Figure 9. The percent of SSEA-4+, SSEA-3+, TRA-1-60+ and TRA-1-81+ cells during 14 days of amnion-derived cells culture in two different media. The flow cytometric analysis was performed on day 1, 7 and 14 of the culture; n=7 for SSEA-4+ cells and n=5 for SSEA-3+ cells (mTeSR1, day 1st), and n=2 for all other measurements in mTeSR1 and Alpha MEM/FBS.
7. Parolini O, Soncini M. Human placenta: a source of progenitor/Stem Cells? J. Reprod. Med Endocrinol. 2006, 3 (7), 117-126.
8. Parolini O, Alviano F, Bagnara GP, [et al.]. Concise review: isolation and characterization of cells from human term placenta: outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells. Stem Cells. 2008, 26 (2), 300-311.
9. Murphy S, Rosli S, Acharya R, [et al.]. Amnion Epithelial Cell Isolation and Characterization for Clinical Use. Curr Protoc Stem Cell Biol. 2010, Chapter 1, Unit 1E.6. DOI:
10.1002/9780470151808.sc01e06s13.
10. Portmann-Lanz CB, Schoeberlein A, Huber A, [et al.]. Placental mesenchymal stem cells as potential autologous graft for pre- and perinatal neuroregeneration. Am J Obstet Gynecol. 2006, 194 (3), 664–673.
11. Ilancheran S, Michalska A, Peh G, [et al.]. Stem cells derived from human fetal membranes display multilineage differentiation potential. Biol Reprod. 2007, 77 (3), 577–588.
12. Solomon A, Rosenblatt M, Monroy D, [et al.]. Suppression of interleukin 1alpha and interleukin 1beta in human limbal epithelial cells cultured on the amniotic membrane stromal matrix. Br J Ophthalmol. 2001, 85 (4), 444–449.
13. Li H, Niederkorn JY, Neelam S, [et al.]. Immunosuppressive factors secreted by human amniotic epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005, 46 (3), 900–907.
14. Niknejad H, Peirovi H, Jorjani M. [et al.]. Properties of the amniotic membrane for potential use in tissue engineering. Eur. Cell. Mater. 2008, 15, 88-99.
15. Nagano K, Yoshida Y, Isobe T. Cell surface biomarkers of embryonic stem cells. Proteomics.
2008, 8 (19), 4025–35.
16. Wright AJ, Andrews PW. Surface marker antigens in the characterization of human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 2009, 3 (1), 3-11.
17. Yanagisawa M. Stem cell glycolipids. Neurochem Res. 2011, 36 (9), 1623-1635.
18. Adewumi O, Aflatoonian B, Ahrlund-Richter L, [et al.]. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nat Biotechnol. 2007, 25 (7), 803-816.
19. Draper JS, Pigott C, Thomson JA, Andrews PW. Surface antigens of human embryonic stem cells: changes upon differentiation in culture. J Anat. 2002, 200 (Pt 5), 249-258.
20. Brimble SN, Sherrer ES, Uhl EW, [et al.]. The cell surface glycosphingolipids SSEA-3 and SSEA- 4 are not essential for human ESC pluripotency. Stem Cells. 2007, 25 (4), 54-62.
21. Suila H, Pitkänen V, Hirvonen T, [et al.]. Are globoseries glycosphingolipids SSEA-3 and -4 markers for stem cells derived from human umbilical cord blood? J Mol Cell Biol. 2011, 3 (2), 99-107.
22. Stanners CP, Eliceiri GL, Green H. Two types of ribosomes in mouse-hamster hybrid cells. Nat New Biol. 1971, 230 (10), 52-54.
23. Ludwig TE, Bergendahl V, Levenstein ME, [et al.]. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 2006, 3 (8), 637-646. Erratum in: Nat Methods. 2006, 3 (4), 867.
24. Ludwig TE, Levenstein ME, Jones JM, [et al.]. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 2006, 24 (2), 185-187.
25. Liang YJ, Kuo HH, Lin CH, [et al.]. Switching of the core structures of glycosphingolipids from globo- and lacto- to ganglio-series upon human embryonic stem cell differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010, 107 (52), 22564-9.
26. Henderson JK, Draper JS, Baillie HS, [et al.]. Preimplantation human embryos and embryonic stem cells show comparable expression of stage-specific embryonic antigens. Stem Cells.
2002, 20 (4), 329-37.
27. Izumi M, Pazin BJ, Minervini CF, [et al.]. Quantitative comparison of stem cell marker-positive cells in fetal and term human amnion. J Reprod Immunol. 2009, 81 (1), 39-43.
28. Miki T. Amnion-derived stem cells: in quest of clinical applications. Stem Cell Res Ther. 2011, 2 (3):25. doi: 10.1186/scrt66.
29. Miki T, Mitamura K, Ross MA, [et al.]. Identification of stem cell marker-positive cells by immunofluorescence in term human amnion. J Reprod Immunol. 2007, 75 (2), 91-96.
30. Huang YC, Yang ZM, Chen XH, [et al.]. Isolation of mesenchymal stem cells from human placental decidua basalis and resistance to hypoxia and serum deprivation. Stem Cell Rev.
2009, 5 (3), 247-55.
31. Miki T, Lehmann T, Cai H, [et al.]. Stem cell characteristics of amniotic epithelial cells. Stem Cells. 2005, 23 (10), 1549-1559.
32. Laursen SB, Mřllgĺrd K, Olesen C, Moolgard K. Regional differences in expression of specific markers for human embryonic stem cells. Reprod Biomed Online. 2007, 15 (1), 89–98.
33. Stewart MH, Bossé M, Chadwick K, [et al.]. Clonal isolation of hESCs reveals heterogeneity within the pluripotent stem cell compartment. Nat. Methods. 2006, 3, 807–815.
34. Díaz-Prado S, Muiños-López E, Hermida-Gómez T, [et al.]. Human amniotic membrane as an alternative source of stem cells for regenerative medicine. Differentiation. 2011, 81 (3), 162-171 35. Gang EJ, Bosnakovski D, Figueiredo CA, [et al.]. SSEA-4 identifies mesenchymal stem cells
from bone marrow. Blood. 2007, 109 (4), 1743-1751.
36. Guillot PV, Gotherstrom C, Chan J, [et al.]. Human first-trimester fetal MSC express pluripotency markers and grow faster and have longer telomeres than adult MSC. Stem Cells. 2007, 25 (3), 646-654.
Szanowni Państwo,
Z przyjemnością przedstawiamy nowy podręcznik, napisany przez klinicystów-praktyków, którzy w sposób jasny i zwięzły omawiają najważniejsze zagadnienia z zakresu ginekologii onkologicznej.
Zgodnie z intencją Autorów, nie jest to szeroka analiza naukowa, lecz zbiór praktycznych wskazówek jak skutecznie rozpoznawać i leczyć nowotwory w oparciu o nowoczesną wiedzę.
Mamy nadzieję, że zaproponowana formuła spotka się z dobrym przyjęciem i okaże przydatna w kształceniu podyplomowym lekarzy.
Zamówienia:
Prosimy przesyłać na niżej podany adres e-mail:
wtog@tlen.pl
więcej informacji oraz zamówienia na stronie:
http://www.praktycznaultrasonografia.pl/inne-publikacje/
W zamówieniu prosimy podać dokładny adres do wysyłki oraz dane do wystawienia faktury.
Prosimy o dokonanie wpłaty na konto:
Wielkopolskie Towarzystwo Onkologii Ginekologicznej 60-535 Poznań ul. Polna 33
Bank PKO S.A. 83124017471111000018496622
K O M U N I K A T
