BIJDRAGE TOT DE KENNIS DER
BIOSYNTHESE VAN DE ALKALOÏDEN BIJ
ATROPA BELLADONNA L.
PROEFSCHRIFT
TER VERKRIJGING VAN DE GRAAD VAN DOCTOR IN DE TECHNISCHE WETENSCHAP AAN DE TECHNISCHE HOGESCHOOL TE DELFT, OP GEZAG VAN DE RECTOR MAGNIFICUS
DR. O . B O T T E M A , HOOGLERAAR IN DE
AFDELING DER ALGEMENE WETENSCHAPPEN, VOOR EEN COMMISSIE UIT DE SENAAT TE
VERDEDIGEN OP WOENSDAG 4 JULI 1956 DES NAMIDDAGS TE 2 UUR
DOOR
PETRUS REINOUTS VAN HAGA
SCHEIKUNDIG INGENIEUR GEBOREN TE ENSCHEDE
'2
Dit proefschrift is goedgekeurd door de promotor: P R O F . DR P . A . ROELOFSEN
"The study of alkaloid metabolism, may be expected to yield much information valu-able to the wider study of the plant's ni-trogen metabolism in general".
I N H O U D I n l e i d i n g 7 H o o f d s t u k I O v e r z i c h t v a n de m e t h e t o n d e r z o e k v e r b a n d h o u d e n d e l i t e r a t u u r 9 A) P r o e v e n o v e r de l o c a l i s a t i e v a n de b i o s y n t h e s e 9 B) W o r t e l c u l t u r e s v a n S o l a n a c e a e 12 C) O n d e r z o e k i n g e n e n t h e o r i e ë n o v e r h e t m e c h a n i s m e d e r b i o s y n t h e s e 13 H o o f d s t u k II E i g e n o n d e r z o e k i n g e n 22 A) M e t h o d e n 22 B) R e s u l t a t e n 29 H o o f d s t u k III B e s c h o u w i n g e n o v e r d e b i o s y n t h e s e d e r A / r o / > a - a l k a l o i d e n 5 3 S a m e n v a t t i n g 59 S u m m a r y 61 L i t e r a t u u r 63
I N L E I D I N G
De definitie van alkaloïden als „stikstofhoudende, b a -s i -s c h e -stoffen uit het plantenrijk, m e e -s t a l met een vrij ingewikkelde s t r u c t u u r , hoog m o l e c u l a i r gewicht en een s t e r k e physiologische werking", geeft m e t e e n de oorzaak aan van de grote wetenschappelijke belangstelling voor deze p r o d u c t e n .
Het gebruik van deze physiologische werking, ten goe-de of ten kwagoe-de, is eeuwen oud en het aangoe-deel dat goe-deze stoffen hebben in de geneeskunde is nog s t e e d s z e e r b e -langrijk.
Onderzoekingen komen dan ook m e e s t voort uit p h a r m a c e u t i s c h e k r i n g e n . Terwijl het zoeken naar nieuwe a l -kaloïden o n v e r m i n d e r d voortgaat, heeft het onderzoek n a a r de biosynthese zijn intrede gedaan, h i e r m e d e ook het t e r r e i n van de botanische biochemie b e t r e d e n d e .
De belangstelling r i c h t t e zich e n e r z i j d s op de v r a a g in welke weefsels van de plant de alkaloïden g e p r o d u c e e r d worden en op de vraag of deze al dan niet weer in de stofwisseling kunnen worden opgenomen. E e r s t is voor nicotine, l a t e r ook voor de z . g . m y d r i a t i s c h e (pupilver-wijdende) alkaloïden uit Atropa, Hyoscyamus en Datura met vrij grote waarschijnlijkheid gebleken dat de wor-t e l s de hoofdproducenwor-ten zijn en dawor-t de planwor-t zelfs in hongertoestand deze alkaloïden niet of weinig v e r w e r k t .
Anderzijds is ook voor de biosynthese van deze a l k a -loïden veel belangstelling g e r e z e n . Het onderzoek van Robinson (59) over de „in v i t r o " synthese van tropinon heeft in deze z e k e r stimtilerend gewerkt en hierop is dan ook door l a t e r e o n d e r z o e k e r s , z o a l s Cromwell (6), J a m e s (36), Diaper (12) en Leete (40) voortgebouwd.
Hun gevolgtrekkingen, waarop in hoofdstuk I sub c nader z a l worden ingegaan, leken mij evenwel nog g e e n s -zins a a n v a a r d b a a r , zodat ik mij ten doel stelde deze na-der te v e r i f i ë r e n .
Genoemde a u t e u r s werkten met gehele planten of met afgesneden bladeren, m a a r omdat het inmiddels bekend was geworden dat de m y d r i a t i s c h e alkaloïden hoofdzake-lijk in de w o r t e l s worden g e p r o d u c e e r d , lag het voor de hand thans met w o r t e l s te w e r k e n .
Daar mij bij de aanvang van mijn onderzoek nog geen publicaties bekend waren, w a a r i n pogingen v e r m e l d w e r den om s t e r i e l e w o r t e l c u l t u r e s van deze planten te v e r -krijgen, r i c h t t e het onderzoek zich a l l e r e e r s t op deze techniek.
Nadat in 1950 dergelijke cultures ^3.n Atropa
bella-donna L., de Wolfskers, door mij v e r k r e g e n waren, werd
vervolgens nagegaan welke cultuuromstandigheden de beste groei opleverden.
Daarna werden aan het cultuurmedium bepaalde stof-fen, welke voorstadia van de alkaloïden zouden kunnen zijn, toegevoegd en werd nagegaan welke invloed dit op de alkaloidproductie had.
Daarnaast werden eenvoudige enzymatische proeven en een aantal entproeven gedaan.
Veelvuldig gebruik van p a p i e r c h r o m a t o g r a f i s c h e a n a -l y s e s gaf voorts aan-leiding tot het vinden, i s o -l e r e n en indentificeren van een, voor Atropa nieuw, alkaloid.
Op grond van de v e r k r e g e n r e s u l t a t e n en in combinatie met inmiddels bekend geworden feiten van andere au-t e u r s , werd au-tensloau-tau-te een nieuw, hypoau-theau-tisch s c h e m a voor de biosynthese van de m y d r i a t i s c h e alkaloïden op-g e s t e l d .
Enkele r e s u l t a t e n w e r d e n gepubliceerd in een a a n t a l voorlopige mededelingen (55, 56, 57, 58).
H o o f d s t u k I
O V E R Z I C H T V A N D E M E T H E T O N D E R Z O E K V E R B A N D H O U D E N D E
L I T E R A T U UR
Deze l i t e r a t u u r kunnen we verdelen in:
A) proeven over de localisatie van de blosynthese. B) w o r t e l c u l t u r e s van Solanaceae.
C) onderzoekingen en t h e o r i e ë n over het m e c h a n i s m e der b i o s y n t h e s e .
A ) P r o e v e n o v e r d e l o c a l i s a t i e v a n d e b i o -s y n t h e -s e
Volgens de oude opvatting worden de alkaloïden g e v o r m d In de bovengrondse delen van de plant. L a t e r b e sefte men e c h t e r dat het bewijs h i e r v o o r a l l e r m i n s t g e -l e v e r d was en men t r a c h t t e dus het antwoord op deze v r a a g te v e r k r i j g e n door het k r u i s l i n g s op e l k a a r enten van twee planten, waarvan de ene a l k a l o i d - p r o d u c e r e n d w a s . Dus een entloot van A op de o n d e r s t a m van B en o m g e k e e r d .
De oudste proeven op dit gebied d a t e r e n uit 188 5, toen S t r a s z b u r g e r (70) Datura op a a r d a p p e l entte en hierbij mooie a a r d a p p e l s v e r k r e e g , welke s l e c h t s een z e e r k l e i ne hoeveelheid atropine bevatten. Enige conclusie o m -t r e n -t de l o c a l i s a -t i e van de s y n -t h e s e p l a a -t s w e r d hierui-t e c h t e r niet getrokken.
De aandacht w e r d opnieuw op deze methode gevestigd door de r e s u l t a t e n , welke door Dawson (7) v e r k r e g e n werden bij het enten van tomaat op tabak en waarbij de tomaat aanzienlijke hoeveelheden nicotine bleek te b e
-vatten.
De oude opvatting bleek dus niet houdbaar en l a t e r e onderzoekingen van Hieke(28), P e a c o c k ( 5 2 ) , Loftus Hills (42), Mothes (46), Hegnauer (23), W a r r e n Wilson (75) en anderen, toonden onomstotelijk aan dat bij Atropa,
Datura, Duboisia en Nicotiana het o v e r g r o t e deel van het a l
-kaloid in de wortel g e v o r m d w o r d t .
Door de l a a t s t e a u t e u r w e r d de entmethode bovendien gebruikt in een uitgebreid onderzoek (76) n a a r het t r a n s -port van de alkaloïden, waarbij kwam vast te staan dat
het o p w a a r t s e t r a n s p o r t p l a a t s heeft in het xyleem, m a a r dat e r tevens een dalend t r a n s p o r t is in het p h l o e e m . Door dit l a a t s t e kwam de kleine hoeveelheid in de entloot aanwezige alkaloid, ten dele t e r e c h t in het w o r t e l -s t e l -s e l van de, n o r m a l i t e r dit alkaloid niet bevattende o n d e r s t a m , bij voorbeeld nicotine of atropine in de w o r -t e l s van -tomaa-t, a a r d a p p e l of Physalis alkekengi. Tevens bleek dat beworteling boven de entplaats bij een entplant
van Atropa op tomaat, d i r e c t aanleiding gaf tot productie
van alkaloïden.
Uit al deze onderzoekingen is wel afdoende gebleken dat de bovengrondse delen zonder hun eigen w o r t e l s t e l -s e l nauwelijk-s alkaloid vormen, t e r w i j l de w o r t e l -s zon-der hulp van de n o r m a l e bovenstam dit wel kunnen.
Toch blijven e r nog v r a g e n o v e r . Bijv.: vormt het b o -vengrondse deel dat niet zijn n o r m a l e w o r t e l s t e l s e l heeft, in het geheel geen alkaloid, of wel, doch in z e e r b e p e r k -te ma-te ?
Een tweede v r a a g i s : vormt een bovenstam, die niet zijn n o r m a l e w o r t e l s t e l s e l heeft, s o m s een ander a l k a -l o i d ?
Tenslotte een derde v r a a g : v o r m t het bovengrondse deel ook geen alkaloid wanneer het wèl kan s a m e n w e r k e n met zijn n o r m a l e w o r t e l s t e l s e l ? Het zou mogelijk zijn, dat de wortel, behalve de typerende alkaloïden, ook voor-stadia d a a r v a n aan de stengel afstaat en dat de eigen bla-d e r e n uit bla-deze voorstabla-dia wèl bla-de typerenbla-de alkaloïbla-den kunnen v o r m e n . Zelfs is het t h e o r e t i s c h mogelijk dat de b l a d e r e n hun eigen w o r t e l s , door middel van bepaalde remstoffen, dwingen geen alkaloid, doch alleen de v o o r -stadia te vormen, zodat in de n o r m a l e plant toch pas in de b l a d e r e n het typerend alkaloid gevormd wordt.
Om deze vragen te beantwoorden moet men beschikken over een z e e r gevoelige en specifieke quantitatieve a n a -l y s e m e t h o d e .
De m y d r i a t i s c h e werking is wel specifiek voor de hoofdalkaloiden en buitengewoon gevoelig: men kan e r 0,01 Hg mee aantonen. Voor quantltatief werk is de m e -thode e c h t e r veel minder geschikt.
Wanneer dus Hieke (28) in enten van Atropa op tom^aat een m y d r i a t i s c h e werking aantoont, kan men daaruit niet b e s l u i t e n dat e r een m y d r i a t i s c h alkaloid gevormd i s , want het kan ook afkomstig zijn van de entloot welke g e -bruikt w a s . Deze entloot behoort afkomstig te zijn van een andere ent van Atropa op t o m a a t .
Hegnauer (22,26) vindt in Datura op t o m a a t s o m s wel, s o m s geen alkaloid. Dit wijst e r m . i . op dat het boven-g r o n d s e deel boven-geen alkaloid v o r m t .
Mothes en Romeike (46) vinden in Datura op tomaat duidelijke hoeveelheden alkaloid, welke zij bij hun analyse r e s u l t a t e n aanduiden als „ a t r o p i n e " . Hun b e p a l i n g s -methode is e c h t e r niet specifiek h i e r v o o r . Bovendien is de m y d r i a t i s c h e werking z e e r g e r i n g en in o v e r e e n s t e m -ming met de oorspronkelijk in de ent aanwezige heid. Bij l a t e r e proeven (47) vinden zij dat de hoeveelheid alkaloid afhankelijk is van de v a r i ë t e i t van de t o m a a t . Op v a r . „Lucullus" ge^nie Atropa l e v e r d e een a l -kaloidgehalte van 0,5 tot 1,5 mg „ a t r o p i n e " p e r 100 g v e r s m a t e r i a a l . Het g e ï s o l e e r d e alkaloid werkte m y d r i a t i s c h en gaf een positieve VitaliMorin r e a c t i e . De grootte o r -de van -de gevon-den hoeveelheid alkaloid maakt het even-wel toch nog moeilijk een veilige conclusie te t r e k k e n ,
Wat betreft de in de w o r t e l g e s y n t h e t i s e e r d e alkaloïden deelt Mothes (49) mede dat, alhoewel hyoscyamine en scopolamine beide zowel in de w o r t e l als de bovengrond-se delen gevonden worden, het bloedingsvocht van een af-gesneden w o r t e l van Atropa s l e c h t s scopolamine bevat.
J a m e s en Thewlis (31) bepaalden de verhouding hyos-c y a m i n e / s hyos-c o p o l a m i n e in Atropa en vonden dat, bij enting van Datura innoxia op Atropa, de bovenstam dezelfde verhouding k r e e g als de oorspronkelijke bovenstam van
Atropa. Omgekeerd k r e e g een Atropa ent op Datura een
alkaloldverhouding zoals deze oorspronkelijk was in de bovenstam van Datura. Dit zou e r dus op wijzen dat de alkaloïden hyoscyamine en scopolamine in beide planten geheel in de w o r t e l s gevormd worden.
Evans en P a r t r i d g e (14) d a a r e n t e g e n vonden dat Datura
tatiüa op eigen en op Datura ferox o n d e r s t a m , de voor Datura tatula k a r a k t e r i s t i e k e alkaloïden hyoscyamine en
scopolamine b e v a t t e .
Het o m g e k e e r d e gaf een analoog v e r s c h i j n s e l : de b o -venstam van Datura ferox bevatte in beide gevallen de alkaloïden scopolamine en meteloidine, welke n o r m a a l in deze plant voorkomen.
Hieruit hebben de a u t e u r s de conclusie getrokken dat, althans bij enten van v e r s c h i l l e n d e Datura s p e c i e s op e l kaar, in de bovengrondse delen, alhoewel hier geen b e langrijke synthese plaats heeft, de alkaloïden wel v e r -v o r m d kunnen worden, of dat de l a a t s t e stappen -van de biosynthese hier plaats hebben, zodat de eindproducten toch kenmerkend zijn voor de b o v e n s t a m .
L a t e r e publicaties (15) tonen e c h t e r dat de s c h e l d l n g s -en id-entificatie-method-en vaak nog niet voldo-ende exact geweest zijn (met name die van J a m e s en Thewlis), w a a r -door een z e k e r e m a t e van onzekerheid in de conclusies o n t s t a a t . Het l a a t s t e woord in deze m a t e r i e is dus z e k e r nog niet g e s p r o k e n .
B) Wo r t e 1 c u It u r e s v a n S o l a n a c e a e
De methodiek der plantaardige weefselcultures is b e -trekkelijk jong. De m e e s t bekende o n d e r z o e k e r s die de methodiek algemeen toegankelijk maakten, zijn White, Gautheret en Nobécourt. De l a a t s t e twee hielden zich voornamelijk bezig met c a l l u s c u l t u r e s . White wierp zich op de kweek van worteltoppen en diens e r v a r i n g e n , n e e r -gelegd in zijn „Handbook of Plant T i s s u e C u l t u r e " , zijn dan ook de b a s i s geweest van de hier gebruikte m e t h o d e . Het object w a a r m e d e het m e e s t gewerkt is, de t o m a a t , is evenals Atropa een Solanacea.
Bij het onderzoek n a a r de alkaloidbiogenese is deze methode nog betrekkelijk weinig gebruikt.
Dawson (8) zag als e e r s t e de mogelijkheden h i e r v a n in en deed onderzoekingen met Nicotiana w o r t e l s . Hij vond hierbij, zoals uit entproeven r e e d s was gebleken, dat de wortels nicotine p r o d u c e e r d e n . Tevens bleek dat een b e -langrijk deel hiervan in het cultuurmedium w e r d uitge-s c h e i d e n .
P e a c o c k c. s. (52) gebruikten w o r t e l c u l t u r e s van Datura en v e r k r e g e n h i e r m e e ook voor deze plant de bevestiging van de conclusie, waartoe ook hier entproeven r e e d s aan-leiding hadden gegeven, nl. dat de w o r t e l s tot alkaloid-productie in staat w a r e n .
Rudorf en Schwarze (64) kweekten w o r t e l s van gewone en t e t r a p l o i d e v o r m e n van Datura tatula. Zij gingen na of arginine de alkaloidproductie b e v o r d e r d e , doch vonden geen duidelijke r e s u l t a t e n bij een gift van 0,01% van dit a m i n o z u u r . Volgens hun e r v a r i n g ging de a l k a l o i d p r o -ductie p a r a l l e l aan de g r o e i .
Moreno (44) onderzocht bij w o r t e l c u l t u r e s van Atropa de Invloed van de a n o r g a n i s c h e bestanddelen van het m e dium. Ook zij vond dat het alkaloidgehalte met de o u d e r dom steeg, al bleven bij haar de hoogst gevonden p e r -centages op droog gewicht belangrijk beneden de in de natuur gevonden waarden (ca 0,1%).
Uffelie(73) werkte met w o r t e l c u l t u r e s van Hyoscyamus
en Datura s p e c i e s . Ook hij wilde nagaan of aminozuren
de alkaloidvorming s t i m u l e e r d e n , doch vond m e r k w a a r digerwijs dat toevoeging van kleine hoeveelheden a m i n o -zuur (0,1 - 0,2 mg per kolf) toxisch w e r k t e n .
De m e e s t r e c e n t e publicaties op dit gebied zijn, voor zover mij bekend, die van S t i e n s t r a (68, 69). Zij kweek-te w o r t e l s van Datura stramonium en v e r k r e e g duidelijke alkaloidproductie. Zij kondigde v e r d e r e onderzoekingen aan o v e r de balans van de, bij de alkaloidvorming b e -trokken producten,
C) O n d e r z o e k i n g e n e n t h e o r i e ë n
m e c h a n i s m e d e r b i o s y n t h e s e o v e r h e t Reeds in 1905 werd door P i c t e t (53) de v e r o n d e r s t e l -ling geuit dat aminozuren een belangrijke r o l zouden spelen bij de biosynthese van alkaloïden. Robinson (59) en Schöpf (65) deden proeven w a a r i n zij een z e k e r e steun zagen voor deze hypothese.
D e z e o n d e r z o e k e r s slaagden e r i n a l l e r l e i alkaloidach-tige stoffen op gewone c h e m i s c h e wijze te s y n t h e t i s e r e n onder zogenaamde „physiologische omstandigheden", d. w . z . omstandigheden zoals deze in de plant zouden voorkomen, dus: lage c o n c e n t r a t i e s , zwak zuur of a l k a -l i s c h mi-lieu en n o r m a -l e t e m p e r a t u u r .
Het k l a s s i e k e voorbeeld hiervan is de synthese van tropinon uit barnsteenzuurdialdehyde, methylamine en acetondicarbonzuur: C H , C H , -H -c. CH^-COOH + H^N-CHg + C=0 C H j C O O H C H , C H , -CH- - C H , N-CHg C=0 -CH- - C H , TROPINON
Na r e d u c t i e en v e r e s t e r i n g met t r o p a z u u r zou dan hier-uit hyoscyamine ontstaan:
CH;: CH; -CH CH_ CH_OH I I 2 O I 2 N-CH^ C H - O - C - C H -CH- -CH.,
S"5
13Het verband met de a m i n o z u r e n wordt nu in dit geval gelegd door aan te nemen dat het b a r n s t e e n z u u r d i a l d e -hyde door oxydatie uit ornithine kan ontstaan:
H^N-CH^CH^CH^CH-COOH — OHC-CH-CH^ CHO NH^
Dit s c h e m a is door l a t e r e o n d e r z o e k e r s vaak als werk-hypothese gebruikt; e c h t e r is e r ook critiek op geleverd, waarop wij terugkomen bij de bespreking van nieuwere s y n t h e s e s c h e m a ' s .
Nemen we in principe aan dat de aminozuren een b e langrijke r o l spelen, dan ligt het voor de hand te v e r o n -d e r s t e l l e n -dat zowel bij verhoog-de eiwitafbraak als bij verhoogde eiwitsynthese het alkaloidgehalte stijgt.
Met Atropa belladonna deed J a m e s (36) bepalingen aan b l a d m a t e r i a a l . Afgeplukte, jonge b l a d e r e n werden in het donker gevoed met een s u i k e r o p l o s s i n g en vervolgens w e r d het verloop bepaald van de, p e r blad gemiddeld aanwezige hoeveelheid totaal stikstof, eiwitstikstof, o p l o s -b a a r - s t i k s t o f en alkaloid-stikstof. Het -bleek nu dat -bij het begin van vergelen van de bladeren, een eiwitafbraak optrad met als gevolg een stijging van oplosbaar stikstof, g e p a a r d gaande met een stijging in de hoeveelheid a l k a -loid-stikstof (g p e r g v e r s uitgangsmateriaal).
Hegnauer (22) b e s t u d e e r d e het verband t u s s e n eiwit-en alkaloidsynthese in gehele planteiwit-en van Datura
stranio-nium. Inderdaad was e r gedurende de ontwikkeling van de
planten een p a r a l l e l i t e i t aanwezig t u s s e n de totale h o e -veelheden d e z e r stoffen per plant, zowel bij n o r m a l e planten, als bij planten waarbij de bloemen v e r w i j d e r d werden (deze Ingreep heeft tot gevolg, dat maxima van eiwit- en alkaloid-hoeveelheid, welke bij n o r m a l e plant e n opplantreden bij de aanvang van de bloeiperiode, nieplant o p -treden; beiden blijven nu dus stijgen). Intussen z a l deze p a r a l l e l i t e i t ook wel b e s t a a n t u s s e n alkaloid en a l l e r l e i stoffen die e r niets mee te maken hebben. Deze feiten zijn dus niet direct aan te voeren als steun voor de hypo-these dat de alkaloidproductie gekoppeld is aan het eiwit-m e t a b o l i s eiwit-m e , eiwit-m a a r in elk geval w e e r s p r e k e n zij deze niet.
Voedingsexperimenten zijn enerzijds gedaan met het oog op een verhoging van de alkaloidproductie, anderzijds met het doel gegevens te v e r k r i j g e n over de b i o s y n t h e s e .
Onder de e e r s t e groep vinden we de b e m e s t i n g s p r o e v e n met a n o r g a n i s c h e stoffen op de akker en in potten. Als voorbeeld hiervan zij verwezen naar het werk van J a m e s W . O . (32) en J a m e s G . M . (30) in het k a d e r van het „Ox-ford Medicinal Plant S c h e m e " . Een dergelijk onderzoek voor Hyoscyamus muticus werd in Egypte v e r r i c h t door Ahmed en F a h m y (2).
De r e s u l t a t e n van vele o n d e r z o e k e r s t e z a m e n genomen, geven a l s uitkomst dat stikstof en fosfor een gunstige i n -vloed hebben op het alkaloidgehalte ên op de g r o e i .
De tweede groep v o e d i n g s e x p e r i m e n t e n zijn een gevolg van het v e r o n d e r s t e l d e verband t u s s e n het e i w i t m e t a b o l i s m e en de a l k a l o i d s y n t h e s e . Wanneer i m m e r s de a m i -nozuren v o o r s t a d i a zijn, r i j s t natuurlijk de v r a a g : welke?
Op het, door Robinson in 1917 op t h e o r e t i s c h e gronden, r e e d s v e r m o e d e verband t u s s e n t r o p i n e en ornithine is r e e d s gewezen. Van de l a t e r e onderzoekingen welke hier-op g e b a s e e r d zijn, mogen die van C r o m w e l l (6) en van J a m e s W . O . (36) tot de b e la ngr i jks t e g e r e k e n d worden. (De negatieve r e s u l t a t e n van Rudorf en Schwarze werden op pag. 12 r e e d s v e r m e l d . )
C r o m w e l l werkte met gehele planten van Atropa
bella-donna en Datura stramcmium. Oplossingen van 0,2 5% van
een of a n d e r e N-houdende stof, met of zonder 2% gluco-s e , werden door de plant opgenomen via de nog aan de plant zittende stomp van een stengel (bij Atropa) of van een tak (bij Datura). De duur van de proef was 7 dagen en m o n s t e r s van blad en wortel werden genomen voor en na de i n j e c t i e .
Op deze wijze w e r d een 18-tal N-bronnen gebezigd: k a l i u m n i t r a a t , a m m o n i u m s ulfaat, a s p a r a g i n e , glycine, a r g i n i n e , lysine, proline, p u t r e s c i n e , cadaverine, choline, betaine, methylamine, dimethylamine, t r i m e t h y l amine, h e x a m e t h y l e e n t e t r a m i n e , f o r m a m o l , b a r n s t e e n -z u u r i m i d e en u r e u m . Alleen de voeding van A^ro/)a met arginine + glucose of met p u t r e s c i n e al dan niet met glu-c o s e , gaf een duidelijke stijging van het alkaloidgehalte van het blad, uitgedrukt op drooggewicht, Het gehalte van de w o r t e l gaf alleen een significante stijging te zien bij voeding met p u t r e s c i n e + g l u c o s e .
De r e s u l t a t e n met Datura waren veel m i n d e r . Hier gaf alleen p u t r e s c i n e + glucose een g e r i n g e stijging van het alkaloidgehalte van de wortel te z i e n . Een mogelijke v e r -k l a r i n g v o o r dit v e r s c h i l is te vinden in het feit dat bij de
Atropa p e r 3 dagen 400 ml oplossing opgenomen werd,
t e g e n o v e r 100 ml bij Datura.
Met conclusies uit dit s o o r t e x p e r i m e n t e n moet men voorzichtig zijn: gelijkluidende " e s u l t a t e n zouden v e r -kreg.en kunnen worden wanneer arginine en p u t r e s c i n e bijv. r e m m e n d werkten op de koolzuur a s s i m i l a t i e of de ademhaling s t i m u l e e r d e n . In beide gevallen zou i m m e r s het drooggewicht beïnvloed worden in zodanige zin dat het alkaloidgehalte zou stijgen.
C r o m w e l l slaagde e r e c h t e r inderdaad in p u t r e s c i n e uit onbehandeld b l a d m a t e r i a a l te i s o l e r e n . Ook toonde hij aan dat in het g e d i a l y s e e r d e p e r s s a p van wortels en g e ë t i o l e e r d e s p r u i t e n van Atropa een enzym voorkomt dat in staat is p u t r e s c i n e oxydatief te d e a m i n e r e n onder v o r m i n g van een aldehyde.
Aan de hand van zijn r e s u l t a t e n stelde hij het volgende s c h e m a op: eiwit arginine b a r n s t e e n z u u r d i a l d e h y d e 5-aminobutyraldehyde •*-' -^ ornithine
i
i p u t r e s c i n eBeide eindproducten zouden bouwsteen kunnen zijn voor t r o p i n e of voor de g e r e d u c e e r d e p y r r o o l b a s e n : CH-CHO CH^CHO + N-CH H CH-CHOH 2 \ CH-CHOH C H , N-CH^ - I - CO C H , CH-CH- - C H , N-CH^ CO CH-CH- -CH„ TROPINON CHzCHO CH-CH^NH^ CH-CHOH CH-CHOH NH / CH^CH^ C H , NH -•- CO — CH-CH- - C H , / CHzCHOH CH2CH NH CO
/ I
C H , NOR-TROPINONEen d e z e r r e a c t i e s is dezelfde als aangegeven door Robinson, de andere bestaat uit een ringsluiting van het
6- amino butyr aldehyde.
De voor het s c h e m a van Robinson noodzakelijke a a n wezigheid van methylamine, acht C r o m w e l l , m . i . t e -r e c h t , hoogst onwaa-rschijnlijk. Als mogelijke ande-re
methyldonors ziet hij choline, w a a r v a n de aanwezigheid aangetoond is (Guggenheim 21), of glyoxylzuur.
J a m e s (36) gebruikte als object afgesneden b l a d e r e n van Atropa belladonna. Deze werden in het donker gevoed met een 1% oplossing van s a c c h a r o s e w a a r a a n 0,01 M van de te p r o b e r e n N-bron werd toegevoegd. De duur der proeven v a r i e e r d e van 3 tot 5 dagen.
Bladeren welke r e e d s geheel volgroeid waren, of welke in de late herfst geplukt waren, vertoonden zelden enige stijging in alkaloidhoeveelheid t . o . v . het u i t h a n g s m a t e -r i a a l . Bij jonge, nog g-roeiende, b l a d e -r e n c o n s t a t e e -r d e hij e c h t e r wel z e e r geringe verhogingen van de gemid-delde hoeveelheid alkaloid per blad. Dit gebeurde alleen bij voeding met arginine of o r n i t h i n e .
Z e e r jonge, nog niet ontvouwde, b l a d e r e n bleken bij deze m a n i e r van voeden niets op te n e m e n . Werd hierbij e c h t e r een vacuuminfiltratie toegepast, dan werden g r o -t e r e s-tijgingen gevonden dan bij a n d e r e b l a d e r e n . Zulks alweer alleen bij a r g i n i n e .
Een l a t e r onderzoek van C h a r l e s (5) toonde aan dat bas i bas c h e bastoffen in het a l g e m e e n door opzuiging baslecht, o p -genomen worden.
De onderzochte N-bronnen waren: ammoniumsulfaat, glycine, dl-alanine, 1-valine, 1-leucine, 1-glutamine-zuur, 1-arginine, 1-ornithine, 1-acetylornithine, 1-his-tidine en 1-proline.
Dat zowel arginine als ornithine hier w e r k z a a m kunnen zijn. wordt mogelijk gemaakt door het enzym a r g i -nase dat arginine splitst in ornithine en u r e u m . J a m e s toonde de aanwezigheid hiervan in Atropa a a n . O p m e r k e -lijk is ook dat F u l l e r en Gibson (17) vonden dat bij Datura
tatula een stijging van het alkaloidgehalte in % op
droog-gewicht tijdens de ontwikkelingvan de plant, gepaard ging met een stijging van de a r g i n a s e a c t i v i t e i t van het p e r s -s a p . Zij menen hieruit de conclu-sie t e mogen t r e k k e n dat t u s s e n beiden een oorzakelijk verband b e s t a a t . De a r g i n a s e - a c t i v i t e i t van de b l a d e r e n is e c h t e r c a . 3 x zo groot a l s van de wortel, t e r w i j l aangenomen m a g worden dat in de l a a t s t e toch de s t e r k s t e synthese plaats heeft.
C r o m w e l l , zowel als J a m e s , t r e k k e n uit hun proeven de conclusie dat arginine en ornithine werkelijk v o o r s t a -dia van t r o p i n e zijn. De r o l van p u t r e s c i n e is nog ondui-delijk: J a m e s (35) was niet in staat enige decarboxylatie van ornithine te ontdekken door e x t r a c t e n of weefsel-schijfjes van Atropa. Onder dezelfde omstandigheden
werd glutaminezuur wel vlot gedecarboxyleerd, alanine en glycine d a a r e n t e g e n w e e r niet. Wel c o n s t a t e e r d e J a m e s dat ornithine in Atropa p e r s s a p geoxydeerd kan worden door chinonen, ontstaan onder invloed van poly-phenoloxydase. Het r e a c t i e p r o d u c t h i e r v a n is aketo6a m i n o v aketo6a l e r i aketo6a aketo6a n z u u r , daketo6at door ringsluiting een p y r r o l i -dinekern kan geven. Op grond h i e r v a n neemt J a m e s aan dat het Natoom in tropine afkomstig is van de 6 a m i n o -groep van o r n i t h i n e . Het moet e c h t e r opgemerkt worden dat deze oxydatie niet e n z y m a t i s c h i s .
T r a u t n e r (71) vindt in het s c h e m a van C r o m w e l l te veel ongefundeerde hypothesen. Hij v e r m o e d t dat de invloed van de genoemde a m i n o z u r e n niet het gevolg is van een inbouwen in het t r o p i n e m o l e c u u l , doch dat hun aanwezigh e i d ' b e s t a a n d e evenwicaanwezighten doet v e r s c aanwezigh u i v e n met tot g e -volg een g r o t e r e alkaloidproductie,
Uit de p r o e v e n van C r o m w e l l blijkt een duidelijk s t i -m u l e r e n d effect van de toegevoegde g l u c o s e . C r o -m w e l l wijt dit aan de hieruit vrijkomende energie en aan m o g e -lijke producten hiervan, die bij de synthese van tropine gebruikt worden, In dit v e r b a n d is het te b e t r e u r e n dat C r o m w e l l de invloed van glucose alléén niet nagegaan heeft. J a m e s deed dit wel, doch ontkent een significante invloed h i e r v a n . (Bij de helft van deze gevallen t r a d een stijging op welke ca 2 X zo groot was als de daling welke bij de a n d e r e helft o p t r a d ) .
Deze invloed van glucose v e r k l a a r t T r a u t n e r met een geheel nieuw schema, dat aansluit op de n o r m a l e glycolyse en de c i t r o e n z u u r c y c l u s . Dpor oxydatieve d e c a r -boxylering van c i t r o e n z u u r zou acetondicarbonzuur ont-s t a a n en uit p y r o d r u i v e n z u u r diketoadipinezuur (zie ont- sche-m a b l z . 19).
Het komt e r hier dus op n e e r , dat niet tropinon uit o r -nithine ontstaat, m a a r dat beide uit diketoadipinezuur o n t s t a a n .
Deze gang van zaken wijkt e c h t e r s t e r k af van de a l g e mene opvatting volgens welke glutaminezuur als v o o r s t a -dium van ornithine beschouwd w o r d t ,
Een poging tot exacte bewijslevering werd gedaan door Diaper, Kirkwood en Marion (12).
Zij voedden Datura stramonium planten via de w o r t e l s ( w a t e r c u l t u r e s ) of via de s t o m p welke aan de plant bleef zitten na afsnijden van een der s t e n g e l s , met radioactief putrescine-1-40-'^'*.
C O O H I C O
I
C H , C H C O O H I CH NH_ I ^ C H , I ^ CH NH_ I ^ C O O H PUTRESCINE COOH C H r — C - O H 2 1 NH2 NH2 CH.r—C-OH "^ COOH C H - C O O H + CO CHr-COOH CH-CH C H .^ \ I '
NH CO/ I
C H - C H CH^ NOR-TROPINON ORNITHINE / \ PROLINE ARGININEverloop van tijd (variei'end van 24 uur tot 9 dagen), g e -i s o l e e r d e alkaloïden waren n-iet rad-ioact-ief. B-ij Datura zou dus p u t r e s c i n e geen voorstadium vnov de alkaloïden ' zijn.
Toch m a g deze conclusie niet bewezen geacht worden. Hoewel de atropine synthese in Datura en Airopa wel niet zal v e r s c h i l l e n , ware het toch beter geweest als p r o e f m a t e r i a a l nie\ Datura n^aar Atropa te kiezen omdat C r o m w e l l ook Atropa had gebruikt en met Datura weinig effect had g e k r e g e n .
De proef w e r d bovendien uitgevoerd in het donker, z o -dat e r een koolhydraatgebrek kon optreden, te m e e r , daar de voedingsoplossing geen glucose b e v a t t e . De
held is h i e r d o o r niet uitgesloten dat het p u t r e s c i n e niet op de n o r m a l e wijze werd v e r w e r k t .
Zien we e c h t e r af van deze critiek, dan zou het r e s u l -t a a -t in o v e r e e n s -t e m m i n g kunnen zijn me-t de -t h e o r i e van T r a u t n e r .
Ook door M o r t i m e r (45) is een biosynthese s c h e m a op-gesteld; het doel hiervan is een gemeenschappelijke basis te vinden voor de nicotine-, t r o p i n e - en hygrinealkaloiden om het s a m e n voorkomen h i e r v a n in bepaalde Duboisia s p e c , te kunnen v e r k l a r e n .
Het uitgangspunt zou tryptophaan zijn. Via kynurenine en 3hydroxyanthranilzuur zou, door ringopening en s l u i -t i n g van deze l a a -t s -t e s-tof, he-t -t r o p i n e s k e l e -t g e v o r m d
kunnen worden: CH=CH-COOH 2 \ NH
r>'
\ / ^ N H , C-CHxCH-COOH 2 \ NH^ _ T R Y P T O P H A A N KYNURENINE COOH N H , OH 3-HYDROXY-ANTHRANILZUUR CH-CH.; - C H , N H , COi / 2 I
CH-CH COOH C H - C H — C H ^ NH C O/ I
CH-CH CH^ NOR-TROPINONDoor Robinson (60) wordt o . a . h i e r t e g e n aangevoerd dat het doorbreken van het 3-hydroxyanthranilzuur t u s s e n de C - a t o m e n 1 en 2 z e e r onwaarschijnlijk i s , terwijl het s c h e m a geen oplossing geeft voor de ringhomologe alka-loïden als coniine, p e l l e t i e r i n e , lobelanine e n z . Deze zijn volgens Robinson duidelijk verwant aan lysine, op
dezelf-de m a n i e r als dezelf-de p y r r o l i d i n e - a l k a l o ï d e n verwant zijn aan ornithine (proline).
De b e l a n g r i j k s t e bijdragen tot het vraagstuk zijn onge-twijfeld de r e c e n t e onderzoekingen van Leete, Marion en Spencer (40).
Zij voedden r a d i o a c t i e v e o r n i t h i n e - 2 - C ^ ^ aan Datura
stratnonium planten. Gedurende één week verbleven de
planten met hun w o r t e l s in een voedingsoplossing, t e r -wijl alleen het bovenste deel van de plant licht k r e e g . De alkaloïden werden d a a r n a g e ï s o l e e r d , waarbij blee.k dat hyoscyamine een s t e r k e radioactiviteit vertoonde, in t e -genstelling tot scopolamine, dat totaal geen activiteit be-z a t . Een onderbe-zoek van de afbraakproducten van hyoscya-mine bewees dat inderdaad alle activiteit g e l o c a l i s e e r d was op de, volgens het s c h e m a van Robinson te v e r w a c h -ten p l a a t s .
Ornithine blijkt dus inderdaad een voorstadium te zijn voor hyoscyamine; z e e r opmerkelijk is é c h t e r dat o r n i -thine geen voorstadium zou zijn voor s c o p o l a m i n e ! De a u t e u r s v e r o n d e r s t e l l e n dat scopine ontstaat uit een hy-pothetisch hydroxy-ornithine, wat van hydroxy-proline afgeleid zou zijn:
C H ^ — C H - C O O H C H r — C H - C O O H NH / HO-CH C H , HO-CH-N H , 2 - ^ 2 2 - C H - N H C H C H -\ ^N-CH3 C H - C H -CH^ CHOH I - C H , SCOPINE
Ondanks het feit dat een dergelijke „gescheiden syn-t h e s e " - syn-t h e o r i e r e e d s door T r a u syn-t n e r (71), op geheel and e r e gronanden, ontworpen is en welke andus andoor het r e s u l -taat van Leete c.s. ondersteund wordt, lijkt het mij toch in hoge m a t e onwaarschijnlijk dat twee d e r m a t e verwante stoffen als tropine en scopine langs v e r s c h i l l e n d e wegen g e v o r m d zouden worden. Ik kom hier l a t e r op t e r u g .
H o o f d s t u k I I
E I G E N O N D E R Z O E K I N G E N
A) M e t h o d e n
A-1) W o r t e l c u l t u r e s
Het opzetten van een wortelcultuur v e r e i s t het v e r -krijgen van minstens één s t e r i e l e , gezonde worteltop.
De beste m a n i e r hiervoor is uit te gaan van s t e r i e l zaad. Voor deze s t e r i l i s a t i e zijn d i v e r s e methoden g e -bruikelijk, zoals behandelen met 1% oplossingen van b r o o m , sublimaat of calciumhypochloriet. Deze m i d d e -len werden al-len toegepast op zaad van Atropa, doch zonder s u c c e s : zelfs na een wekelijks herhaalde behan-deling gedurende 20 minuten met b r o o m w a t e r , bleef het zaad hardnekkig geïnfecteerd met s c h i m m e l s zowel als b a c t e r i ë n . Ondanks deze r i g o u r e u z e behandeling bleek het p e r c e n t a g e zaden, dat uiteindelijk kiemde, niet veel l a g e r dan n o r m a a l .
In een dergelijk geval is de j u i s t e m a n i e r ongetwijfeld om uit te gaan van gave vruchten en hieruit het zaad a s e p t i s c h te verwijderen; deze w a r e n e c h t e r bij de a a n -vang van het onderzoek niet b e s c h i k b a a r ,
Een m i c r o s c o p i s c h e beschouwing van het zaad deed v e r m o e d e n dat de zaadhuid caviteiten bezat, mogelijk af-gesloten door plantenwassen en h i e r d o o r ontoegankelijk geworden voor vloeibare en g a s v o r m i g e desinfectiemid-delen.
Na spoelen met, aether gedurende 3 m i n . , een etsing met g e c o n c e n t r e e r d zwavelzuur gedurende 2 m i n . en een verblijf van 1 uur in 1 % b r o o m w a t e r , welke l a a t s t e b e -handeling zo nodig na een paar dagen herhaald werd, bleef ca 80% van het zaad, uitgelegd op vochtig f i l t r e e r -p a -p i e r in P e t r i s c h a l e n , s t e r i e l .
De v e r k r e g e n worteltopjes werden d a a r n a afgesneden en geënt in een vloeibaar m e d i u m . E e r s t werd hiervoor genomen het medium dat White (80) gebruikte voor t o m a -t e n w o r -t e l s . L a -t e r werd di-t vervangen door een a n d e r , ook van White (81), w a a r i n door mij enkele wijzigingen m o e s t e n worden aangebracht, alvorens een maximale g r o e i v e r k r e g e n w e r d ,
De techniek voor het v e r k r i j g e n van grote hoeveelheden v e r g e l i j k b a a r e n t m a t e r i a a l , zoals deze bij t o m a t e n w o r -t e l s -toegepas-t kan worden, bleek bij A-tropa w o r -t e l s nie-t mogelijk.
Deze methode bestaat uit het v e r d e l e n van een goed gegroeide wortel in een aantal segmenten, welke elk in een a p a r t e kolf overgeënt worden, t e r w i j l de top niet gebruikt w o r d t . Deze segmenten gaan dan zi jw o r te l s vormen, w a a r v a n de toppen gebruikt worden als e n t m a -t e r i a a l in v e r g e l i j k i n g s p r o e v e n .
Bij Atropa v o r m e n w o r t e l s e g m e n t e n zonder top e c h t e r geen zi j w or te ls en vertonen zelfs geheel geen groei m e e r . De m i c r o s c o p i s c h z i c h t b a r e p r i m o r d i a groeien niet uit en e r worden ook geen nieuwe g e v o r m d .
Voor e n t m a t e r i a a l was ik dus aangewezen op de toppen van zijwortels ener hoofdwortel, t e r w i j l m e e r d e r e hoofd-w o r t e l s voor één p r o e f s e r i e benodigd hoofd-w a r e n . Het hoofd-wachten tot een wortel voldoende zijwortels g e v o r m d h a d w a s z e e r tijdrovend. Bovendien heeft de methode het nadeel dat de ouderdom van de v e r s c h i l l e n d e zijwortels van een hoofd-w o r t e l niet gelijk i s . De invloed hiervan is enigszins te ondervangen door de wortels van gelijke ouderdom en af-komstig van verschillende hoofdwortels te verdelen over de c u l t u u r s e r i e s , welke met e l k a a r vergeleken moeten worden. Veiligheidshalve werd e r tevens z o r g voor g e -d r a g e n -dat -de zijwortels van één cultuur over alle, met e l k a a r te vergelijken, p r o e f s e r i e s v e r d e e l d w e r d e n . Af-wijkingen t . g . v , v e r s c h i l l e n in het e n t m a t e r i a a l werden h i e r d o o r zoveel mogelijk b e p e r k t .
Overigens is uit de v e r k r e g e n r e s u l t a t e n l a t e r g e b l e ken dat deze v o o r z o r g niet s t r i k t noodzakelijk was, a a n -gezien o v e r e e n k o m s t i g e c u l t u r e s uit v e r s c h i l l e n d e proef-s e r i e proef-s proef-s t e e d proef-s dezelfde r e proef-s u l t a t e n gaven.
Over de p r a c t i s c h e uitvoering behoeft weinig te worden v e r m e l d ; de techniek wordt in de handboeken nauwkeurig b e s c h r e v e n .
Nadat 50 m l van het complete medium in 250 ml wijd-monds P y r e x E r l e n m e y e r s afgemeten was, werden deze voorzien van een, met hydrophielgaas omgeven prop van ontvette watten, w a a r n a , bij wijze van kap, over het g e -heel een dubbel vel stanniol werd gevouwen. De kolven werden d a a r n a 20 min bij 1 20"C g e s t e r i l i s e e r d ,
Het enten vond plaats in een speciale entkast, onder een Philips UV b u i s l a m p .
De kweekkamer werd automatisch gecondltionneerd op 23
27 C en 85% r e l . vochtigheid; verdamping uit de kolfjes w e r d h i e r d o o r tot een minimum b e p e r k t .
A-2) D e b e p a l i n g v a n h e t a l k a l o i d g e h a l t e
Atropa belladonna bevat als hoofdalkaloiden h y o s c y a
mine en s c o p o l a m i n e . D a a r n a a s t komen een aantal n e venalkaloiden voor in veel l a g e r e c o n c e n t r a t i e s . De b e -paling van deze l a a t s t e is in het onderhavige onderzoek niet direct van b e l a n g .
In de n o r m a l e plant bedraagt de concentratie van de hoofdalkaloiden t e z a m e n ongeveer 0,5%van de droge stof. De concentratie in de gecultiveerde w o r t e l s is van d e zelfde orde van grootte, m a a r aangezien de voor de a n a -lyse b e s c h i k b a r e hoeveelheid m a t e r i a a l gemiddeld s l e c h t s ca 2 5 mg b e d r a a g t , is het duidelijk dat de b e p a l i n g s m e -thode een bijzondere gevoeligheid moet bezitten.
Als eisen werden gesteld:
aantoonbare hoeveelheid: 0,00 5 mg goede r e p r o d u c e e r b a a r h e i d ,
redelijk snel en
grote specificiteit t . o . v . de hoofdalkaloiden.
De l i t e r a t u u r op dit gebied is z e e r uitgebreid. Het g e b r u i k van atropine in de p h a r m a c i e heeft aanleiding g e -geven tot een groot aantal methoden, welke ongetwijfeld allen hun m e r i t e s hebben; velen gaan e c h t e r voor het g e -stelde doel mank aan specificiteit en gevoeligheid.
De methoden uit de toxicologie zijn vaak b e t e r wat het l a a t s t e betreft, specifiek zijn e c h t e r s l e c h t s enkelen.
T i t r i m e t r i s c h e methoden, bijv. volgens Dijkstra (13), komen voor deze kleine hoeveelheden niet in aannaerking. De tot nu toe bekende c o l o r i m e t r i s c h e bepalingen met gekleurde n e e r s l a g e n welke weer opgelost worden, zoals volgens Bandelin (4), zijn wel nauwkeurig, m a a r niet specifiek. Evenmin is dit het geval met de methode van Romeike (62), volgens welke een n e e r s l a g met s i l i c o m o lybdeenzuur g e r e d u c e e r d w o r d t . Op p a g . 1 1 is r e e d s a a n -geduid dat dit tot v e r k e e r d e c o n c l u s i e s kan leiden.
Pulewka(54) maakte gebruik van de m y d r i a t i s c h e w e r -king. Een voordeel hiervan is dat de e x t r a c t e n bijna geen zuivering v e r e i s e n . De gevoeligheid is buitengewoon groot, evenals de specificiteit. Voor quantltatief werk v e r e i s t de methode e c h t e r een groot aantal proefdieren, t e r w i j l de nauwgezetheid te wensen over l a a t .
-tie van Waszicky met p-dimethylaminobenzaldehyde, bleek bij onderzoek niet gevoelig genoeg.
A d d i t i e r e a c t i e s van alkaloïden met kleurstoffen (Gettl e r en Sunshine, 18) zijn ook gebruikt voor c o (Gettl o r i m e t r i -sche bepalingen. De methode werd onderzocht en bleek aan vele eisen te voldoen. De specificiteit liet e c h t e r te wensen o v e r . Misschien zou door v e r d e r e zuivering van de e x t r a c t e n de bepaling b r u i k b a a r worden, de snelheid zou e r e c h t e r belangrijk door inboeten. C h r o m a t o g r a f i e over alumlniumoxyde en vacuumsublimatie waren niet voldoende.
Getracht werd een methode uit te werken welke b e r u s t t e op de absorptie van atropine in het UV deel van s p e c t r u m . Het bleek e c h t e r dat de voedingsbodem stoffen b e -vatte, welke in hetzelfde gebied een s t e r k e a b s o r p t i e ver-toonden en waarvan de verwijdering op moeilijkheden s t u i t t e .
De uiteindelijke keuze viel op de methode van Allport en Wilson (3) welke b e r u s t op de V i t a l i - M o r i n r e a c t i e : wanneer atropine met rokend s a l p e t e r z u u r wordt behan-deld en het r e s i d u wordt overgoten met alcoholische loog, dan ontstaat een p a a r s rode kleurstof, welke e c h t e r spoe-dig weer verdwijnt.
Volgens J a m e s en Roberts (33) is de specificiteit van de r e a c t i e uitstekend: s l e c h t s een z e e r beperkte groep alkaloïden geeft de k a r a k t e r i s t i e k e k l e u r . Aangenomen m a g worden dat hiervan in Atropa alleen de alkaloïden hyoscyamine en scopolamine voorkomen.
Bij de quantitatieve methode wordt het n i t r a t i e r e s i d u g e ë x t r a h e e r d met een bepaald volume aceton, waarin dan de kleurstofvorming plaats heeft door toevoeging van me-thylalcoholische KOH. De a a r d van de gebruikte aceton i s z e e r b e l a n g r i j k . E r worden hoge e i s e n gesteld aan de zuiverheid en het moet een kleine hoeveelheid water b e -vatten.
De gevormde kleurstof is z e e r gevoelig voor koolzuur; het e x t r a h e r e n met aceton moet d a a r o m snel geschieden, t e r w i j l de kleur gevormd moet worden in een gesloten cuvet, dat bijna geheel gevuld i s .
De methode v e r e i s t wel een grote m a t e van standaardi-s a t i e , m a a r wanneer deze standaardi-s t r e n g aangehouden wordt, zijn de r e s u l t a t e n z e e r goed b r u i k b a a r .
De enigszins door mij gewijzigde uitvoering van de b e -paling was als volgt:
Het natte w o r t e l m a t e r i a a l w e r d t u s s e n f i l t r e e r p a p i e r 25
v o o r z i c h t i g bevrijd van aanhangende vloeistof en d a a r n a gedurende 30 min. gedroogd bij 105°C. Nadroging g e -schiedde gedurende 24 u. in een v a c u u m e x s i c c a t o r boven c a l c i u m c h l o r i d e . Bij deze methode t r a d geen alkaloid-v e r l i e s op.
Na weging w e r d het droge m a t e r i a a l gemalen in een m o r t i e r onder toevoeging van enkele druppels 1% Na2C03 oplossing en deze pasta werd 10 X g e ë x t r a h e e r d met k l e i -ne p o r t i e s c h l o r o f o r m .
De chloroformoplossing werd 5 X uitgeschud met 1 N azijnzuur (met 5% alcohol, om schuimen tegen te gaan), tot totaal 5 ml, of bij veel u i t g a n g s m a t e r i a a l 10 ml, v e r
-k r e g e n w a s .
Hiervan werd 1 m l afgepipetteerd in een p o r c e l e i n e n schaaltje en op een kokend waterbad drooggedampt. Di-r e c t na het dDi-roogvallen weDi-rden 5 dDi-ruppels s a l p e t e Di-r z u u Di-r p . a . , s . g . 1,4, toegevoegd, zodanig omgezwenkt dat het gehele r e s i d u goed bevochtigd w e r d en op het waterbad gelaten tot 3 m i n . , gerekend vanaf het toevoegen van het s a l p e t e r z u u r . Daarna w e r d afgekoeld, 5 x g e ë x t r a h e e r d met aceton, nauwkeurig tot 10 m l aangevuld (in een g e -ijkte c o l o r i m e t e r cuvet), 3 druppels 3% methylalcoholi-sche KOH (niet ouder dan 1 week) toegevoegd, e e n m a a l o m g e k e e r d en de k l e u r i n t e n s i t e i t gemeten na 1 min. bij
530 mu (bandbreedte ca 20 mu^.
De gebruikte colorinaeter was een enigszins gewijzigde colorinneter volgens D r . L a n g e . In de oorspronkelijke t o e s t a n d was de gevoeligheid h i e r v a n niet voldoende. De o o r z a a k hiervan lag in een te grote bandbreedte van de bijbehorende f i l t e r s . Nadat een s t r e n g e r e f i l t e r c o m b i n a -tie uitgezocht was, bleek het noodzakelijk de galvanomet e r ook galvanomete vervangen door een z e e r gevoelige. In de g e -wijzigde vorm bleek het apparaat een s t e r k verhoogde gevoeligheid te bezitten met een z e e r behoorlijke r e p r o -d u c e e r b a a r h e i -d .
Bij de oorspronkelijke bepaling volgens Allport en Wilson wordt de kleur gemeten na 5 m i n . Bij het meten van de snelheid van de intensiteitsdaling van de kleur bleek mij dat deze snelheid verhoogd wordt door de a a n -wezigheid van onbekende stoffen in de e x t r a c t e n . Deze daling was e c h t e r voor z u i v e r e oplossingen en e x t r a c t e n in de e e r s t e twee minuten p r a c t i s c h gelijk, t e r w i j l een optredende t r o e b e l i n g binnen 1 min. verdwenen w a s . Het beste was dus om na 1 minuut t e m e t e n .
c o n c e n t r a t i e s iets s n e l l e r w a s . Dit kan de r e d e n zijn dat de i j k k r o m m e in dit gebied de wet van L a m b e r t - B e e r niet volgde.
De nauwkeurigheid werd g e c o n t r o l e e r d door toevoegen van een hoeveelheid zuivere atropine aan een w o r t e l e x -t r a c -t en na -te gaan hoeveel hiervan -teruggevonden werd:
bepaling in e x t r a c t 0,110 mg toegevoegd 0,020 mg
bepaling totaal (duplo) 0,129 en 0,128 mg
Bij toevoeging van g r o t e r e hoeveelheden werd het v e r -lies in p r o c e n t e n van de toegevoegde hoeveelheid kleiner (ca 3%),
Hieruit blijkt een grote gevoeligheid, terwijl de nauwkeurigheid o m s t r e e k s 5% geacht m a g w o r d e n . De r e p r o -d u c e e r b a a r h e i -d bleek ook z e e r behoorlijk, gezien het feit dat duplo-bepalingen in de r e g e l niet m e e r dan 5% uit e l k a a r liepen.
In a a n m e r k i n g nemende dat de e x p e r i m e n t e n s t e e d s vergelijkend uitgevoerd werden en dat t u s s e n identieke c u l t u r e s s t e e d s aanmerkelijke v e r s c h i l l e n zijn door and e r e omstanandigheanden, m a g ande nauwkeurigheiand van ande b e -paling voldoende geacht worden.
A-3) D e p a p i e r c h r o m a t o g r a f i s c h e a n a l y s e v a n Atropa-aIkaloiden e n v a n a m i n o z u r e n Bij de alkaloïden wordt de p a p i e r c h r o m a t o g r a f i e voornamelijk gebruikt voor het onderzoek van p h a r m a c e u t i -sche p r a e p a r a t e n , a l s m e d e in de toxicologie.
Door mij werd deze methode toegepast met het doel aanwijzingen te verkrijgen over het m e c h a n i s m e van de b i o s y n t h e s e .
Van een aantal methoden bleek die van Munier en Macheboeuf (50), met als loopvloeistof b u t a n o l a z i j n z u u r w a t e r , voor/4^ro/)aalkaloiden de beste r e s u l t a t e n te g e -ven. Na een opstijging van de loopvloeistof over 20 cm zijn de 7 alkaloïden, voorkomende in gecultiveerde wor-t e l s van Awor-tropa, uiwor-tswor-tekend gescheiden.
De looptijd is ca 1 5 uur, hetgeen het voordeel heeft dat men ' s avonds de c h r o m a t o g r a m m e n kan inzetten en de volgende m o r g e n over de r e s u l t a t e n kan beschikken.
De methode is z e e r soepel, zij leent zich ook u i t s t e -kend voor m i c r o c h r o m a t o g r a f i e in r e a g e e r b u i z e n volgens Rockland (61), waarbij dan m e e s t a l binnen enkele uren voldoende scheiding is o p g e t r e d e n .
De loopvloeistof is eenvoudig te b e r e i d e n en v e r e i s t weinig tijd. Het gebruikte p a p i e r (Whatman no 1) v e r e i s t geen voorbehandeling. De loopsnelheid laat zich goed r e -gelen door de t e m p e r a t u u r , zonder dat het scheidend vermogen e r door beïnvloed w o r d t . T e m p e r a t u u r s c h o m m e -lingen van 4°C s t o r e n weinig.
Voor nauwkeurig werk, waarbij de scheiding belang-r i j k i s , moet gewebelang-rkt wobelang-rden met v e belang-r s e loopvloeistof, Soms e c h t e r laten de omstandigheden het toe dat gewerkt wordt met oude loopvloeistof, welke zo nodig enigszins g e r e g e n e r e e r d kan worden door toevoeging van een wei-nig ijsazijn. Voor identificatie van stoffen met een s t e r k uiteenlopende R^-waarde, is de v e r m i n d e r d e scheiding geen b e z w a a r .
De alkaloïden werden uit het natte of droge m a t e r i a a l g e ë x t r a h e e r d zoals b e s c h r e v e n op pag. 26. De oplossing v e r e i s t p r a c t i s c h geen zuivering: zelfs g e c o n c e n t r e e r d p e r s s a p van w o r t e l s of b l a d e r e n geeft een uitstekend c h r o m a t o g r a m . Ook de hoeveelheid alkaloid welke opge-b r a c h t kan worden, laat r u i m e v a r i a t i e toe: van 0,005 tot 0,3 m g . Bij de kleine vlekken is het oppervlak onge-v e e r p r o p o r t i o n e e l aan de hoeonge-veelheid alkaloid, bij de g r o t e vlekken neemt het oppervlak m i n d e r toe dan te ver-wachten i s . Dit heeft het voordeel dat de scheiding goed blijft. Toch is deze bij de hoge c o n c e n t r a t i e s i e t s g e r i n g e r omdat bij toenemende dosis alkaloid, niet het m i d -den van de vlek op constante hoogte blijft (constante Rf), doch de bovenrand van de vlek. Aangezien deze in dia-m e t e r toeneedia-mt, is het duidelijk dat de Rf, wanneer deze g e m e t e n wordt naar het midden van de vlek, bij grote hoeveelheden i e t s daalt.
Het z i c h t b a a r m a k e n van de vlekken met Dragendorff's r e a g e n s kan geschieden door onderdompeling of door b e spuiten. De e e r s t e m a n i e r l e v e r t r e g e l m a t i g e r r e s u l t a t e n . Bij grote hoeveelheden alkaloid kan e c h t e r het g e -vormde p r a e c i p i t a a t loslaten van het papier en zich hierover v e r s p r e i d e n , waardoor het c h r o m a t o g r a m w a a r d e -loos wordt. Spuiten verdient d a a r o m m , i . de v o o r k e u r . De specificiteit van het D r a g e n d o r f f - r e a g e n s is gering: het is een algemeen a l k a l o i d r e a g e n s . Toch laat het enige differentiëring toe door de kleur der gevormde v e r b i n dingen. De m e e s t e alkaloïden geven een oranje vlek, e n -kele e c h t e r (tropine, p y r r o l i d i n e ) een p a a r s e .
De chromatografie van a m i n o z u r e n werd gedaan vol-gens Dent (10): 2-dimensionaal met phenol-water en met c o l l i d i n e - l u t i d i n e - w a t e r .
B. R e s u l t a t e n
B-1) W a a r n e m i n g e n b i j w o r t e l c u l t u r e s a) Het gunstigste medium
Voor de e e r s t e w o r t e l c u l t u r e s werd het medium g e bruikt, w a a r m e e White goede groei v e r k r e e g met t o m a -t e n w o r -t e l s (80). De s a m e n s t e l l i n g hiervan was: Ca(N03)2 MgS04 KNO3 KCl KH2PO4 ZnS04 Na2Si03 Al2(S04)3 KJ H3BO3 NaCl MnS04 NiCl LiCl C0CI2 CUSO4 Fe2(S04)3 s a c c h a r o s e g i s t e x t r a c t (I ppm) 140 I 37 81 67 12,25 0,3 0,27 1,07 0,15 0,32 0,56 0,44 0,04 0,039 0,04 0,01 2,5 20 g 10 m
Hierin groeiden de worteltjes e c h t e r t r a a g in v e r h o u -ding tot t o m a t e n w o r t e l s . Zij vertoonden een a b n o r m a l e , kronkelende g r o e i , met een o n r e g e l m a t i g e inplanting van de z i j w o r t e l s .
Met het doel hierin v e r b e t e r i n g te b r e n g e n en mede met het oog op de moeilijkheden bij het v e r k r i j g e n van grote hoeveelheden e n t m a t e r i a a l (zie p a g . 2 3), werden wijzigingen in de voedingsoplossing a a n g e b r a c h t . Weglating van b a k k e r s g i s t e x t r a c t of vervanging door b i e r g i s t e x t r a c t , toevoeging van pindolazijnzuur of 2 , 4 d i chloorphenoxyazijnzuur in d i v e r s e c o n c e n t r a t i e s , b r a c h -ten e c h t e r niet de gewenste v e r a n d e r i n g . Gebruik van een ander medium (White, 81) gaf direct een v e r b e t e r i n g , a l -hoewel ook hier het aantal zijwortels g e r i n g bleef en on-r e g e l m a t i g h e d e n o p t on-r a d e n ,
De s a m e n s t e l l i n g h i e r v a n w a s : Ca(NC^)2 M g S 0 4 N a 2 S 0 4 KNO 3 K C L N a H 2 P 0 4 . H 2 0 F e 2 ( S 0 4 ) 3 M n S 0 4 Z n S 0 4 H 3 B O 3 K J s a c c h a r o s e g l y c i n e n i c o t i n e z u u r p y r i d o x i n e t h i a m i n e p e r L 200 360 200 80 6 5 1 6 , 5 2,5 4,5 1,5 1,5 0 , 7 5 20 3,0 0 , 5 0,1 0,1 mg g mg m e r k B . D . H , C , P , h a n d e l s p r o d u c t L i g h t J J t 3 J »
Het gebruik van h a n d e l s s u i k e r in dit medium geeft h i e r a a n een enigszins ongedefinieerd k a r a k t e r . White (79) is van mening, dat de zuiverheid voldoende i s en het gebruik hiervan geen nadeel oplevert, behoudens het feit dat g r o e i v e r s c h i l l e n kunnen optreden doordat de quar liteit niet constant i s . Om dit te ontgaan w e r d een h o e -veelheid aangeschaft, welke voor ettelijke j a r e n voldoen-de w a s .
De opmerkingen van White over handelssuiker zijn e c h t e r enigszins misleidend omdat e r vele s o o r t e n han-d e l s s u i k e r zijn; White noemt als verontreinigingen Ca^ Mg, Cu en Zn, terwijl eventueel aanwezige hoeveelheden vitaminen welke voor planten belangrijk zijn, v e r w a a r -loosd mogen worden. Hierbij moet men bedenken dat White h i e r m e d e een A m e r i k a a n s handelsproduct op het oog heeft. Z e e r waarschijnlijk dus r/efeuiker. De door mij gebruikte handelssuiker was daarentegen öze/suiker. Dat t u s s e n deze beide producten een belangrijk v e r s c h i l b e s t a a t , was mij bij de aanvang van dit onderzoek niet bekend. Uit een publicatie van Wilcox CS. (82) bleek l a t e r dat b i e t s u i k e r , in t e g e n s t e l l i n g tot r i e t s u i k e r , niet te v e r w a a r l o z e n hoeveelheden g r o e i b e v o r d e r e n d e stoffen bevatte, w a a r o n d e r thiamine, nicotinezuuramide, p y r i -doxine, panthoteenzuur en biotine.
b) De invloed van glycine, nicotinezuur, pyridoxine en thiamine op de g r o e i .
Nagegaan werd in h o e v e r r e bij het tweede White m e -dium, afgezien van wat r e e d s met de b i e t s u i k e r gegeven werd, het gebruik van deze stoffen gewenst i s ,
De r e s u l t a t e n zijn h i e r o n d e r weergegeven: zonder toevoeging geen g r o e i alleen thiamine redelijke g r o e i alleen pyridoxine matige groei alleen nicotinezuur slechte groei alleen glycine slechte groei
Het blijkt dus dat in b i e t s u i k e r te weinig vitaminen aanwezig zijn en dat alle vier een z e k e r e groei mogelijk maken, thiamine nog het b e s t e . Bij de combinaties bleek vooral de invloed op de z i j w o r t e l v o r m i n g :
zonder toevoeging alleen thiamine
alleen thiamine, pyridoxine alleen thiam ., pyr., glycine t h i a m . , pyr., g l y c , n i c . z u u r
Hieruit volgt dat, in de gebezigde hoeveelheden, gly-cine de, door pyridoxine en thiamine mogelijk gemaakte goede g r o e i , r e m t , t e r w i j l nicotinezuur de vorming van zijwortels r e m t . Deze e r v a r i n g e n zijn volkomen gelijk aan die, welke Skinner en Street (67) ondervonden bij w o r t e l c u l t u r e s van Senecio vulgaris.
Bij het g r o o t s t e gedeelte van de e x p e r i m e n t e n is dan ook het tweede Whitemedium (Standaardmedium) g e -bruikt, doch zonder nicotinezuur en glycine (S-G-N); s l e c h t s in de aanvang is gewerkt met het volledige m e -dium (S).
Door wijzigingen in het milieu is het dus wel gelukt de z i j w o r t e l v o r m i n g te v e r b e t e r e n , dit bleef e c h t e r beperkt tot de gehele wortel: w o r t e l s e g m e n t e n v e r k r e g e n ook in het v e r b e t e r d e medium geen z i j w o r t e l s .
c) De invloed van g i s t e x t r a c t
Het toevoegen hiervan had, zowel in het e e r s t e als het tweede White-medium geen gunstig effect.
31 g r o e i geen redelijk z e e r goed goed goed z i j w o r t e l -vorming slecht z e e r goed m a t i g slecht
Er moet e c h t e r gewezen worden op een eigenaardig v e r s c h i j n s e l dat optrad bij het vergelijken van media met en zonder g i s t e x t r a c t , nl. het naar de bodem zinken van s o m m i g e worteltjes direct na het o v e r e n t e n . White nam het zinken ook wel eens waar bij tomatenwortels en s c h r e e f dit toe aan een afwijking in de algemene gezondheidstoestand van de m o e d e r c u l t u u r . Het bleek mij e c h -t e r da-t zijwor-tels van één cul-tuur, willekeurig afgeknip-t en gelijk verdeeld over een medium mét en een zonder g i s t e x t r a c t , in het e e r s t g e n o e m d e allen zonken en dan niet m e e r groeiden, doch in het medium zonder g i s t e x -t r a c -t allen -tegen he-t vloeis-tofoppervlak bleven drijven en goed g r o e i d e n .
Naast de mogelijkheid dat de gezondheidstoestand een r o l kan spelen, moet dus ook nog een in de cultuurvloei-stof aanwezige factor van invloed zijn. Gedacht wordt bijv. aan oppervlakactieve stoffen die oorzaak kunnen zijn van een snel ontwijken van gasbelletjes uit de i n t e r -c e l l u l a i r e r u i m t e n bij het sneevlak, waardoor het s . g . van de worteltjes zou stijgen. Nader onderzocht is dit e c h t e r niet.
d) Uitscheiding van alkaloid in het medium
Bij de e e r s t e e x p e r i m e n t e n over de alkaloidvorming in w o r t e l c u l t u r e s , werd ook het gehalte aan alkaloid van de cultuurvloeistof bepaald Dit gehalte bleek vrij constant en z e e r laag te zijn: ca 0,01 m g / 5 0 m l .
Dit is geheel in tegenstelling met het gedrag van w o r -t e l c u l -t u r e s van Nico-tiana . Dawson (8) vond in he-t voe-dingsmedium nl. 2 a. 3 X zoveel nicotine als in de w o r t e l .
Om na te gaan of het alkaloid m i s s c h i e n wel uitgeschei-den, doch in het medium afgebroken werd, voegde ik aan een s e r i e cultures 0,09 mg hyoscyamine of scopolamine p e r cultuurkolf t o e .
P e r i o d i e k e bepalingen vertoonden geen belangrijke da-ling: na 3 maanden was de hoeveelheid bij de cultures s l e c h t s gedaald van 0,09 mg tot gemiddeld 0,07 m g . Bij controlekolfjes zonder w o r t e l s , daalde het in dezelfde tijd tot gemiddeld 0,08 m g .
De groei van de worteltjes vertoonde een geringe r e m -ming t . o . v . c o n t r o l e c u l t u r e s zonder alkaloidtoevoeging, de gehalten w a r e n e c h t e r volkomen n o r m a a l .
e) De invloed van licht
De invloed van continue belichting op de groei en de alkaloidproductie werd nagegaan door een helft van een p r o e f s e r i e te b e s t r a l e n met een Philips T L - b u i s van 25 watt op een afstand van 50 c m . Deze belichting vond plaats in een, van binnen wit g e s c h i l d e r d e kist, welke in de k w ee k k a me r was opgesteld en voorzien van een ven ti l a -t o r , zoda-t de v e r d e r e oms-tandigheden binnen en bui-ten de kist p r a c t i s c h gelijk w a r e n .
De andere helft van de c u l t u r e s verbleef in het donker, behoudens een korte dagelijkse belichtingsperiode van ongeveer 15 minuten, noodzakelijk voor controle der cul-t u r e s .
De invloed blijkt uit de volgende analyse r e s u l t a t e n : Tabel 1
Kweekduur 50 dagen; medium S Donker C u l t . n r , 631 632 633 637 638 g e m . Drooggew. 27,1 25,0 29,0 23,5 24,9 26 mg mg a l k . 0,165 0,182 0,183 0,135 0,152 0,163 % a l k . 0,61 0,73 0,63 0,57 0,61 0,63% Licht C u l t . n r . 630 634 635 636 639 g e m . Drooggew. 18,8 20,2 17,0 15,3 18,8 18 mg mg alk. 0,071 0,081 0,073 0,055 0,073 0,071 % alk. 0,38 0,40 0,43 0,36 0,39 0,39%
Door de belichting zijn dus zowel de g r o e i als de a l k a -loidproductie l a g e r dan n o r m a a l .
Het oudere deel van de hoofdwortel van de belichte e x e m p l a r e n vertoonde een duidelijke c h l o r o p h y l v o r m i n g .
De z i j w o r t e l v o r m i n g w a s m i n d e r , w a a r a a n h o o f d z a k e l i j k h e t l a g e r e d r o o g g e w i c h t t e w i j t e n i s . O v e r i g e n s m a a k t e n de w o r t e l s e e n goed g e z o n d e i n d r u k e n w a r e n i e t s s t e v i -g e r e n e l a s t i s c h e r . C h r o m a t o -g r a f i s c h w a s -g e e n v e r s c h i l t e c o n s t a t e r e n in de a a n w e z i g e a l k a l o ï d e n of in hun o n -d e r l i n g e v e r h o u -d i n g . f) De i n v l o e d v a n K e n NO3 O m de i n v l o e d n a t e g a a n v a n K e n NO3 w e r d e n p r o e f -s e r i e -s i n g e z e t m e t v e r -s c h i l l e n d e c o n c e n t r a t i e -s v a n K N O -s i n het s t a n d a a r d m e d i u m S. De e e r s t e r e s u l t a t e n d e d e n i n z i e n dat d e i n v l o e d b e t r e k k e l i j k g e r i n g w a s e n dat s i g -n i f i c a -n t e v e r s c h i l l e -n a l l e e -n o p t r a d e -n bij h o g e d o s e r i -n g e -n e n l a n g e k w e e k d u u r . De r e s u l t a t e n v a n e e n l a t e r e p r o e f z i j n v e r m e l d i n t a b e l 2 , T a b e l 2 K w e e k d u u r 100 d a g e n , n a 50 d a g e n o v e r g e ë n t i n v e r s m e d i u m (S) 80 m g K N O 3 / L C u l t . n r . 455 461 462 46 3 46 4
1 gem.
D r o o g g e w . 32,2 m g 33,6 29,6 36,7 2 9 , 5 32 m g % a l k . 0,94 0,82 1,10 0 , 8 5 0,99 0 , 9 4 %240 mg KNO3/L 1
C u l t . n r , 456 458 459 46 5 466 467 468 g e m . D r o o g g e w , 45,2 m g 39,6 4 4 , 8 43,1 4 8 , 5 37,4 45,0 43 m g% alk. 1
1,32 1.47 1,30 1,36 1,19 1,30 1,29 1,32% H i e r u i t b l i j k t d u s dat e x t r a k a l i u m n i t r a a t s t i m u l e r e n d w e r k t op de g r o e i e n op de a l k a l o i d p r o d u c t i e . Z u l k s n i e t -t e g e n s -t a a n d e de w o r -t e l s d a n e e n o n g e z o n d v o o r k o m e n h a d d e n ( b o c h t i g e n o n r e g e l m a t i g ) . Bij d e z e p r o e f k a n z o w e l d e v e r h o o g d e [ K ' ] e e n r o l s p e l e n a l s de v e r h o o g d e [ N O 3 ' ] , O m na t e g a a n w e l k e v a n d e z e t w e e de g r o o t s t e i n v l o e d u i t o e f e n t , w e r d e e n s e r i e i n g e z e t , w a a r b i j de v e r h o u d i n g N a / K g e v a r i e e r d w e r d , t e r w i j l de [ N O 3 ' ] c o n s t a n t g e h o u d e n w e r d ( g e l i j k a a n het s t a n d a a r d m e d i u m ) . E v e n e e n s w e r d e e n p r o e f g e -d a a n m e t v e r v a n g i n g v a n KNO3 -d o o r K C l .Tabe medium met NaN03
Na/K=7/§ .. 4/6 ., 1/9 ,, 3-voudig KNO3 „ NaNOg KCl 1 3 slechte g r o e i redelijk redelijk n o r m a a l goed slecht geen groei 0,29% alk, 0,41 0,43 0,43 0,55 0,32
-Het blijkt dus dat Na schadelijk is en dat K zowel als NO3 nodig zijn, m a a r of de m e e r p r o d u c t i e bij een d r i e -voudige dosis KNO3 aan de K- of aan de NOg-toename te wijten i s , kan uit deze proeven niet worden afgeleid.
V e r d e r onderzoek van de invloed van anorganische zouten w e r d achterwege gelaten, aangezien op dat tijdstip de uitgebreide r e s u l t a t e n van Moreno (44) o v e r dit on-d e r w e r p weron-den g e p u b l i c e e r on-d . Hieruit bleek on-dat het on-door mij gebruikte voedingsmedium geen v e r b e t e r i n g behoef-de en t e v e n s dat behoef-de r e s u l t a t e n voor het v r a a g s t u k van behoef-de biosynthese van alkaloïden van s e c u n d a i r belang zijn. g) De invloed van aminozuren en enkele a m i n e n .
De r e s u l t a t e n van het werk van v r o e g e r e o n d e r z o e k e r s wijzen s t e r k in de r i c h t i n g van arginine, ornithine en p u t r e s c i n e a l s mogelijke voorstadia voor t r o p i n e .
De invloed van deze stoffen op de alkaloidproductie en de g r o e i blijkt uit de volgende tabellen.
Tabel 4 Medium S-G-N. kweekduur: 30 dagen Cult. 943 944 945 946 947 g e m . D r . g e w . 24,2 20,7 26,2 27,9 27,5 25 mg % a l k . 0,28 0,35 0,31 0,30 0,32 0,31% 40 dagen Cult. 1004 1005 1006 1009 1010 D r . gew. 29,8 27,8 25,7 28,6 29,0 28 mg % alk. 0,49 0,46 0,52 0,50 0,51 0,50% 35
52 d a g e n C u l t . 830 831 832 833 834 835 D r . g e w . 29,6 28,0 2 7 , 5 26,2 30,8 26,9 28 m g % alk 1 0,63 0,58 0 , 5 5 0 , 6 5 0,62 0,67 0,6 2% 1 T a b e l 5 1 M e d i u m S - G - N -1-0,0002 M a r g i n i n e - H C l , k w e e k d u u r : | 30 d a g e n
1 Cult.
1011 1012 1013 1014 1015 g e m , D r . g e w . 3 0 , 4 36,2 33,8 36,8 34,2 34 m g % a l k . 0,52 0,60 0,57 0,60 0 , 5 5 0,57% 3 5 d a g e n | C u l t 1049 10 50 1051 1052 1053 1054 g e m . D r . g e w . 37,2 36,2 37,4 34,0 39,1 36,0 35 m g%alk. j
0,72 0,73 0,78 0,77 0,77 0,74 0,7 5% 37 d a g e n C u l t . 1136 1137 1138 1139 1140 g e m , D r . g e w . 38,6 3 4 , 4 37,8 39,2 35,2 37 m g % a l k 0 , 8 3 0,79 0,87 0 , 8 4 0 , 7 7 0 , 8 2 %40 d a g e n C u l t . 1 1 1 8 1119 1120 1121 1122 1123 g e m . D r , g e w . 3 8 , 5 38,2 37,8 36,8 3 9 , 5 37,8 38 m g % a l k , 0 , 8 3 0 , 8 5 0,88 0,84 0,80 0,87 0,8 5% C u l t . 1093 1094 1095 1096 1097 g e m . D r . g e w , 3 5 , 5 40,2 38,6 39,2 3 7 , 8 38 m g % a l k . 0,86 0,82 0,88 0,87 0,83 0 , 8 5 % T a b e l 6 M e d i u m S - G - N -1-0,0002 M o r n i t h i n e - H C l , k w e e k d u u r : 30 d a g e n C u l t . 1171 1172 1173 1174 1175 g e m . D r . g e w , 32,6 35,2 30,2 37,8 31,0 33 m g % a l k , 0,53 0,56 0 , 5 5 0 , 5 5 0 , 5 5 0 , 5 5 % 40 d a g e n C u l t . 1196 1197 1198 1199 1200 g e m . D r , g e w . 36,0 41,2 3 8 , 4 3 5 , 4 39,7 38 m g % a l k , 0,79 0,84 0,80 0,82 0,86 0 , 8 2 % T a b e l 7 M e d i u m S - G - N + 0,0002 M p u t r e s c i n e - H C l , k w e e k d u u r : 30 d a g e n C u l t . 1176 1177 1178 1179 1180 g e m . D r . g e w . 30,0 28,2 28,8 2 9 , 6 34,8 30 m g % a l k . • 0,42 0,39 0,36 0 , 3 9 0,38 0,3 9% 35 d a g e n C u l t . 1056 1057 1058 1059 1060 g e m . D r . g e w . 30,8 34,8 31,3 3 2 , 6 2 9 , 7 32 m g % a l k . 0,56 0,58 0,52 0,54 0,50 0,54%
40 d a g e n | C u l t . 1100 1101 1102 1103 1104 D r . g e w 34,2 3 6 , 4 32,5 33,6 34,9 34 m g % a l k . 0,65 0,62 0,69 0,63 0,68
0,65%
1E e n overzicht van de gemiddelde r e s u l t a t e n wordt g e -geven in de figuren 1 en 2.
"iO 20 iö 4 0 DAGEN lO 2 0 30 4 0 DAGEN Drooggewicht - tijd in Alkaloidgehalte - tijd in d i v e r s e media: d i v e r s e media:
1 S-G-N
2 ,, -1- 0,0002 M arg. 3 ,, -1- 0,0002 M orn. 4 ,, -I- 0,0002 M putr.
H i e r u i t blijkt duidelijk het gunstige effect dat door a r -ginine en ornithine op de groei en alkaloidproductie wordt uitgeoefend. P u t r e s c i n e vertoont een analoge werking, e c h t e r minder uitgesproken,
Van glycine, het aminozuur dat in het oorspronkelijke s t a n d a a r d m e d i u m (S) gebruikt wordt, werd de invloed bij v e r s c h i l l e n d e c o n c e n t r a t i e s nagegaan; uit de in tabel 8 v e r m e l d e r e s u l t a t e n blijkt dat het alkaloidgehalte iets stijgt, doch dat het drooggewicht daalt ten gevolge van de v e r m i n d e r d e g r o e i .
T a b e l 8 M e d i u m S, k w e e k d u u r 70 d a g e n ; z o n d e r g l y c i n e C u l t . 68 5 686 687 688 690 g e m . D r . g e w . 34,5 30,2 3 2 , 1 29,2 2 6 , 8 31 m g % a l k . 0,61 0,60 0,59 0,68 0,67 0,63% I m g / L ( c a 10" C u l t . 692 693 695 698 699 g e m . D r . g e w . 2 6 , 4 30,7 2 5 , 0 3 3 , 0 27,2 28 m g " ^ M ) % a l k . 0,65 0,68 0,65 0,67 0,64 0,66% 3 m g / L ( n o r m a a l ) C u l t . 700 701 702 703 705 g e m . D r , g e w . 32,9 32,5 2 8 , 7 2 1 , 5 2 4 , 8 28 m g % a l k . 0,68 0,81 0,79 0,74 0,73 0 , 7 5 % M e t m é é r g l y c i n e e n m e t e n k e l e a n d e r e a m i n o z u r e n w e r d of g e e n , of e e n z e e r g e r i n g e g r o e i v e r k r e g e n : g l y c i n e p r o l i n e l y s i n e n o r v a l i n e c a d a v e r i n e g e e n g r o e i g e e n g r o e i n a 40 d a g e n 17 m g , a l k . g e h . 0,2% z w a k k e g r o e i z w a k k e g r o e i . Bij d e z e e x p e r i m e n t e n w a s d e c o n c e n t r a t i e v a n d e t e o n d e r z o e k e n s t o f 0,0002 M i n h e t m e d i u m S - G - N . A l h o e w e l u i t d e r e s u l t a t e n v a n d e p r o e v e n m e t a m i n o -z u r e n e n e n k e l e a m i n e n n i e t d i r e c t d e c o n c l u s i e m a g w o r d e n g e t r o k k e n d a t o r n i t h i n e e e n v o o r s t a d i u m i s v o o r d e a l k a l o ï d e n , m o g e n z i j w e l g e z i e n w o r d e n a l s e e n s t e u n v o o r d e z e h y p o t h e s e . h) D e i n v l o e d v a n e x t r a s a c c h a r o s e Bij d e z e p r o e v e n w e r d de s a c c h a r o s e c o n c e n t r a t i e v e r h o o g d d o o r a a n h e t n o r m a l e m e d i u m e e n g e l i j k e h o e v e e l -39
