Microsatellite instability in lung cancer

(1)

Wst´p

Rak p∏uca jest w skali ca∏ego Êwiata jednym z najcz´st- szych i jednoczeÊnie obarczonych najwi´kszà umieralno- Êcià nowotworów z∏oÊliwych. W Polsce wskaêniki zachoro- waƒ utrzymujà si´ od kilku lat na wy˝szym poziomie w po- równaniu ze Êrednià Êwiatowà – rocznie notuje si´ oko∏o 17.000 nowych zachorowaƒ na raka p∏uca u m´˝czyzn i oko∏o 4.000 u kobiet [1].

Rozwój biologii molekularnej umo˝liwi∏ lepsze po- znanie genetycznych i epigenetycznych zaburzeƒ w przebiegu kancerogenezy. Uwa˝a si´, ˝e zaburzenia te odgry- wajà zasadniczà rol´ w patogenezie nowotworów. Najle-

piej dotychczas poznanymi zmianami sà mutacje genów supresorowych (p53, FHIT, P16INK4/MST1), protoonko- genów (EGFR, HER2/neu) oraz genów regulujàcych pro- cesy apoptozy (Bcl2). W ostatnich latach zwraca si´ uwa- g´ na znaczenie zaburzeƒ naprawy DNA. Skutkiem tych nieprawid∏owoÊci mo˝e byç zaburzenie wiernoÊci odtwa- rzania genomu.

W niniejszej pracy przedstawiono stan wiedzy doty- czàcy tego zagadnienia, ze szczególnym uwzgl´dnieniem klinicznego znaczenia niestabilnoÊci mikrosatelitarnej w raku p∏uca.

Co to jest niestabilnoÊç mikrosatelitarna?

NiestabilnoÊç mikrosatelitarna (microsatellite instability – MSI) odpowiada zmianom d∏ugoÊci krótkich, polimor- ficznych, tandemowo powtarzajàcych si´ sekwencji DNA

Artyku∏y przeglàdowe • Review articles

45–51

NiestabilnoÊç mikrosatelitarna w raku p∏uca

Liliana Krasiƒska

Uwa˝a si´, ˝e zaburzenia molekularne odgrywajà zasadniczà rol´ w patogenezie raka p∏uca. Najlepiej dotychczas poznanymi zmianami sà mutacje w obr´bie genów supresorowych, protoonkogenów oraz zaburzenia dzia∏ania bia∏ek regulujàcych pro- cesy apoptozy i naprawy DNA. Szereg badaƒ przeprowadzonych w ostatniej dekadzie wykaza∏o, ˝e w raku jelita grubego z wy- sokà cz´stoÊcià wyst´pujà zaburzenia w dzia∏aniu produktów genów grupy MMR (mismatch repair genes), w tym hMSH2, hMSH6, hMLH1, hPMS1 i hPMS2, zaanga˝owanych w napraw´ b∏´dów powstajàcych w czasie replikacji DNA. Efektem tych zmian jest wyst´powanie niestabilnoÊci mikrosatelitarnej (MSI). Nieprawid∏owoÊç t´ stwierdzono nast´pnie w innych nowo- tworach, w tym tak˝e w raku p∏uca. Kolejne lata badaƒ pozwoli∏y lepiej poznaç zmiany molekularne wyst´pujàce w obr´bie ge- nów MMR oraz ich ekspresj´ w tym nowotworze. Zwrócono uwag´ na znaczenie kliniczne MSI oraz zwiàzek z patologiczny- mi cechami raka p∏uca. Stwierdzono tak˝e, ˝e MSI wià˝e si´ z podwy˝szonà cz´stoÊcià wyst´powania innych mutacji, charak- terystycznych dla raka p∏uca. W ostatnich latach wykryto wyst´powanie zmian MSI typowych dla komórek nowotworowych w DNA p∏ynów ustrojowych, co stwarza nadziej´ rozwoju nowych metod przesiewowych.

Microsatellite instability in lung cancer

Molecular alterations are considered a key factor in lung cancer pathogenesis. Mutations in supressor genes and protoonco- genes, as well as the malfunction of proteins involved in apoptosis and DNA repair regulation, are among the most widely stu- died. During the recent decades numerous investigations in colorectal cancer have reported a high frequency of defective func- tioning of mismatch repair gene (MMR) products, such as hMSH2, hMSH6, hMLH1, hPMS1 and hPMS2, involved in DNA replication error repair. These alterations result in microsatellite instability (MSI). It has been later reported that MSI occur al- so in other tumors, including lung cancer. Further studies have analysed genetic alterations and expression of MMR genes in this malignancy. The correlation between MSI and clinical and pathologic features of lung cancer has been studied. It was de- monstrated that MSI is associated with a higher rate of other mutations characteristic of lung cancer. Recent studies have de- monstrated that MSI is detectable in soluble DNA derived from body fluids thus creating prospects for its use in the early de- tection of lung cancer.

S∏owa kluczowe: niestabilnoÊç mikrosatelitarna, rak p∏uca Key words: microsatellite instability, lung cancer

Katedra i Klinika Onkologii i Radioterapii Akademii Medycznej w Gdaƒsku

(2)

(mikrosatelitów), losowo rozsianych w ludzkim genomie.

Zaburzenie to zwiàzane jest z mutacjami w okreÊlonych genach naprawczych DNA, a obserwowane jest zarówno w nowotworach wyst´pujàcych rodzinnie, jak i sporadycznie. MSI wynika z inaktywacji obu alleli genu napraw- czego DNA. W nowotworach wyst´pujàcych rodzinnie dziedziczona jest mutacja jednego z alleli genu napraw- czego DNA; do MSI dochodzi po utracie aktywnoÊci dru- giego allelu w tym samym locus. W nowotworach spora- dycznych dochodzi do somatycznego unieczynnienia obu alleli w locus genu odpowiedzialnego za napraw´ DNA.

MSI zwiàzana jest z nieprawid∏owà czynnoÊcià genów na- prawy DNA typu mismatch repair (MMR). Produkty ge- nów MMR rozpoznajà i naprawiajà b∏´dy powsta∏e podczas replikacji DNA, zapobiegajàc w ten sposób groma- dzeniu si´ zmian sekwencji w komórkach potomnych.

Dotychczas u ludzi poznano szeÊç genów naprawy DNA typu MMR: 3 homologi bakteryjnego genu MutS (hMSH2, hMSH3 i hMSH6) oraz 3 homologi bakteryjne- go genu MutL (hMLH1, hPMS1 i hPMS2). Inaktywacja systemu naprawy DNA typu mismatch repair mo˝e prowa- dziç do niestabilnoÊci genomu, zwi´kszenia cz´stoÊci wyst´powania przypadkowych mutacji oraz do mutacji w genach bioràcych udzia∏ w karcinogenezie, w obr´bie któ- rych wyst´pujà sekwencje mikrosatelitarne. Obserwowano m.in. somatyczne mutacje w sekwencjach mikrosatelitar- nych w obr´bie IGFIIR (insulin- like growth factor II recep- tor) w guzach trzonu macicy, ˝o∏àdka i jelita grubego MSI+ [2, 3]. W rakach jelita grubego MSI+ stwierdzono mutacje obu alleli genu BAX, bioràcego udzia∏ w apopto- zie oraz w genie TGFβIIR (receptor typu II transforming growth factor, b´dàcego inhibitorem wzrostu komórek na- b∏onkowych) [4, 5]. W raku jelita grubego nie obserwowano zwiàzku MSI z wyst´powaniem mutacji w genie su- presorowym p53, jednak˝e równoczesna obecnoÊç obu tych zmian genetycznych w raku wst´pujàcej cz´Êci okr´˝- nicy zwiàzana by∏a z przerzutami do w´z∏ów ch∏onnych [6]. Istniejà tak˝e przypuszczenia, ˝e system MMR bierze udzia∏ w regulacji cyklu komórkowego, a zwi´kszona ekspresja bia∏ek hMSH2 i hMLH1 prowadzi do apoptozy [7-9].

MSI po raz pierwszy opisano i do tej pory najlepiej zbadano w rodzinnym niepolipowatym raku jelita grube- go (hereditary non-poliposus colorectal cancer – HNPCC).

W nowotworze tym MSI stwierdza si´ u oko∏o 90% chorych [6, 10, 11]. W sporadycznie wyst´pujàcych nowotworach jelita grubego MSI wyst´puje z mniejszà cz´stoÊcià (13-28%) [6, 10]. W przypadku innych nowotworów sko- jarzonych z HNPCC, opisywanych jako zespó∏ Lynch II, stwierdzono wy˝szà cz´stoÊç MSI w rakach trzustki (67- -75%), ˝o∏àdka (17-48%), trzonu macicy (9-23%) i stercza (15-20%). MSI wyst´puje tak˝e w wielu innych nowotworach (nowotworach mózgu, raku ˝o∏àdka, jajnika, trzonu i szyjki macicy, piersi, p∏uca, skóry, stercza, p´cherza moczowego i ch∏oniakach) [10, 12].

Pod koniec 1997 roku z inicjatywy amerykaƒskiego Narodowego Instytutu Onkologii (NCI) ujednolicono no- menklatur´ oraz opracowano kryteria rozpoznawania MSI w raku jelita grubego. Wyniki zosta∏y podsumowane

i opublikowane przez Bolanda i wsp. w 1998 roku [12].

Zalecany przez NCI panel markerów sk∏ada si´ z dwóch mononukleotydowych (BAT26 i BAT25) oraz trzech dwunukleotydowych powtórzeƒ (D5S346, D2S123 i D17S256).

Guzy wykazujàce niestabilnoÊç w dwu lub wi´cej markerach spoÊród tego panelu okreÊla si´ jako nowotwory o wysokiej cz´stoÊci MSI (MSI-H), natomiast te, w któ- rych stwierdza si´ niestabilnoÊç w tylko jednym lub ˝ad- nym z markerów – jako, odpowiednio, guzy z niskà cz´sto- Êcià MSI (MSI-L) lub nie wykazujàce MSI (microsatellite stable – MSS). Ten zestaw markerów referencyjnych po- zwala wykryç nowotwory charakteryzujàce si´ nieprawi- d∏owoÊciami pierwotnie w obr´bie dwóch g∏ównych genów MMR: hMSH2 i hMLH1 [11]. W przypadku, gdy w bada- niu zostaje u˝ytych ponad pi´ç markerów, grup´ MSI-H stanowià nowotwory wykazujàce MSI w ≥ 30% marke- rów, a grup´ MSI-L – gdy MSI stwierdza si´ w <30% badanych markerów.

W licznych badaniach potwierdzono, ˝e wÊród nowo- tworów zlokalizowanych poza jelitem grubym mo˝na wy- odr´bniç dwie grupy ze zwi´kszonà cz´stoÊcià MSI, w któ- rych niektóre loci wykazujà szczególnie wysokà niestabil- noÊç [12]. Grupa pierwsza, dotyczàca g∏ównie raka

˝o∏àdka i trzonu macicy, posiada fenotyp podobny do raka jelita grubego i wykazuje niestabilnoÊç w obr´bie mono- i dinukleotydowych markerów. Druga grupa guzów wykazuje podwy˝szonà cz´stoÊç niestabilnoÊci tylko w wybranych tri- i tetranukleotydowych powtórzeniach.

Pewna grupa spoÊród zmian tetranukleotydowych (AAAG)_nszczególnie cz´sto ulega MSI, m.in. w raku p∏u- ca, p´cherza moczowego oraz g∏owy i szyi.

Dotychczasowe badania wykazujà zale˝noÊç pomi´- dzy MSI a obni˝onà ekspresjà bia∏ek MMR. W badaniach MSI w raku jelita grubego stwierdzono brak ekspre- sji hMSH2 i hMLH1 w guzach, w których wyst´pujà muta- cje w tych genach. ˚aden z guzów bez MSI nie wykazywa∏

obni˝onej ekspresji bia∏ek MMR. Co wi´cej, obni˝onà ekspresj´ MMR stwierdzano tak˝e przy braku mutacji w genach MMR, co sugeruje, ˝e przynajmniej w niektó- rych przypadkach mogà wyst´powaç inne mechanizmy unieczynniajàce [6, 11-15].

W licznych badaniach próbowano okreÊliç zwiàzek pomi´dzy MSI, a cechami klinicznymi i histologicznymi nowotworów. W HNPCC i raku ˝o∏àdka wykazano zwià- zek MSI z lokalizacjà nowotworu, jego typem histologicz- nym oraz innymi cechami morfologicznymi [12, 16, 17].

Nieco zaskakujàco, pomimo ˝e genetyczna niestabilnoÊç powinna prowadziç do przyspieszonego nowotworzenia i z∏ego rokowania, MSI w HNPCC oraz raku ˝o∏àdka zwiàzane jest z lepszym rokowaniem i wyd∏u˝onym prze-

˝yciem. Z kolei w raku piersi stwierdzono znaczàco krót- szy czas prze˝ycia ca∏kowitego wÊród chorych z guzami MSI+. Co wi´cej, guzy MSI+ by∏y rozpoznawane w wy˝- szym stopniu zaawansowania i cz´Êciej tworzy∏y przerzuty [18].

(3)

Cz´stoÊç wyst´powania oraz mechanizmy odpowiedzialne za MSI w raku p∏uca

Doniesienia dotyczàce wyst´powania MSI w raku p∏uca sà nieliczne i niejednokrotnie sprzeczne. W drobnokomórko- wym raku p∏uca (SCLC) w 45-76% guzów pierwotnych stwierdzono MSI w postaci zmniejszenia lub zwi´kszenia liczby powtarzajàcych si´ di- lub tetranukleotydowych sekwencji [19, 20]. W niedrobnokomórkowym raku p∏uca (NSCLC) cz´stoÊç wyst´powania MSI waha si´ w szero- kich granicach (0-69%). Tak du˝e ró˝nice w wynikach ba- daƒ mogà byç uwarunkowane wieloma czynnikami. Suge- rowano na przyk∏ad, ˝e rozbie˝noÊci w cz´stoÊci wyst´- powania MSI w NSCLC mogà byç zwiàzane z ró˝nymi typami histologicznymi i ró˝nym zaawansowaniem choroby w badanych grupach. Byç mo˝e tak˝e na wyst´powanie MSI wp∏ywajà geograficzne i/lub etniczne czynniki. Po- nadto, odmienne wyniki mogà wynikaç z ró˝nic w rodzaju i liczbie analizowanych primerów, jak równie˝ z ró˝nic w definiowaniu MSI w poszczególnych badaniach. Do tej pory bowiem nie ustalono, jakie powinny byç kryteria rozpoznawania MSI w raku p∏uca. Opublikowane w 1998 roku przez Bolanda i wsp. [12] mi´dzynarodowe kryteria dotyczàce nazewnictwa i rozpoznawania MSI dotyczà tylko raka jelita grubego. Dotychczas nie opracowano podobnego referencyjnego panelu markerów, pozwalajà- cych jednoznacznie rozpoznawaç MSI w innych nowotworach, w tym równie˝ w raku p∏uca. W ostatnich pi´ciu latach wiele laboratoriów opracowa∏o w∏asne sposoby okreÊlania MSI w raku p∏uca, co powoduje, ˝e porówna- nie wyników ró˝nych grup badawczych jest niezwykle trudnym zadaniem. Tabela 1. stanowi prób´ przedstawie- nia wyników dotychczasowych badaƒ MSI w raku p∏uca, ze zwróceniem uwagi na zastosowane markery oraz kryteria definiowania MSI.

Ciekawà analiz´ przeprowadzili Ahrendt i wsp. [21, 22]. Zbadali oni wyst´powanie nowych alleli w sekwencjach mikrosatelitarnych w NSCLC przy u˝yciu 73 4-nukleotydowych markerów w celu okreÊlenia loci cz´sto ule- gajàcych niestabilnoÊci w raku p∏uca. Zidentyfikowano panel 12 markerów, przy u˝yciu których mo˝na by∏o wy- kryç niestabilnoÊç mikrosatelitarnà przynajmniej w jednym z badanych loci wÊród 55% pierwotnych guzów. Nast´pnie przeprowadzono analiz´ sekwencji mikrosatelitarnych w 88 guzach p∏uca. W 35% spoÊród nich wykazano nowy allel z przynajmniej jednym spoÊród badanych 13 mar- kerów (do wybranych 12 dodano jeszcze jeden, który w innych badaniach odznacza∏ si´ cz´stà niestabilnoÊcià w raku p∏uca), a 29% z tych nowotworów mia∏o zmiany w dwu i wi´cej loci. Nast´pnie wszystkie te nowotwory by∏y bada- ne przy u˝yciu zdefiniowanego przez Bolanda i wsp. [12]

referencyjnego panelu jedno- i dwunukleotydowych mar- kerów. Tylko jeden spoÊród 31 MSI+ guzów (3%) wykaza∏ niestabilnoÊç z jednym markerem (MSI-L). Ahrendt i wsp. [23] powtórzyli ostatnio analiz´, wybierajàc 12 czte- ronukleotydowych markerów spoÊród 61 badanych; 11 z 12 wybranych zawiera∏o powtarzajàcà si´ sekwencj´

AAAG. Za ich pomocà stwierdzono zmiany w sekwencjach mikrosatelitarnych w 51% guzach NSCLC, 56%

nowotworach regionu g∏owy i szyi oraz tylko w 21% raków p´cherza i 12% raków nerki.

Prace Ahrendt i wsp. [21, 22, 23] skupiajà si´ na opi- sanej klinicznie i genetycznie, a wyst´pujàcej w raku p∏u- ca i innych nowotworach (rakach g∏owy i szyi oraz p´- cherza moczowego) swoistej formie MSI, w której zmiany mikrosatelitarne zlokalizowane sà w wybranych 3- i 4-nukleotydowych powtórzeniach. W tych nowotworach po- wtórzenia d∏u˝sze wykazujà zmiany cz´Êciej ni˝ 1- i 2-nu- kleotydowe, które sà charakterystyczne dla nowotworów jelita grubego i rodziny nowotworów zwiàzanych z HNPCC. T´ swoistà odmian´ MSI nazwano EMAST (elevated microsatellite alterations at selected tetranucleoti- de repeats). Badania wskazujà, ˝e w pierwotnym raku p∏u- ca wyst´puje binominalny rozk∏ad niestabilnoÊci w 3- i 4- -nukletydowych powtórzeniach. Ma∏y szczyt guzów wykazuje ca∏kowità cz´stoÊç tego zaburzenia rz´du >10%

w pewnych, najbardziej wra˝liwych markerach, podczas gdy dla wi´kszoÊci guzów p∏uca istnieje du˝y szczyt w ob- r´bie 0-2% wra˝liwych powtórzeƒ [12].

Mimo, ˝e zaburzenia genetyczne, le˝àce u podstaw MSI, zwiàzane z nieprawid∏owà naprawà DNA typu mi- smatch repair sà coraz lepiej poznane, mechanizm po- wstawania niestabilnoÊci mikrosatelitarnej typu EMAST pozostaje nadal niewyjaÊniony. Niepokrywanie si´ rozle- g∏ych zmian MSI z EMAST sugeruje udzia∏ innej drogi ni˝

zaburzenia w systemie MMR. Uwa˝a si´, ˝e zmiany EMAST mogà byç zwiàzane z uszkodzeniem szlaków na- prawy zale˝nych od p53. Bia∏ko p53 odgrywa wa˝nà rol´

w odpowiedzi komórki na uszkodzenie DNA. Jego na- gromadzenie w komórce prowadzi do zatrzymania cyklu komórkowego w celu zapobie˝enia replikacji uszkodzonego DNA, a kiedy DNA nie ulega naprawie, mo˝e pro- wadziç do apoptozy takiej komórki. Gen p53 cz´sto ulega mutacjom w raku p∏uca. Podobnie do guzów EMAST, mutacje genu p53 cz´Êciej wyst´pujà w p∏askonab∏onko- wym ni˝ gruczo∏owym raku p∏uca. Wykazano cz´stsze wyst´powanie EMAST w guzach zawierajàcych nieprawi- d∏owy gen p53 [22].

RównoczeÊnie, wyniki ostatnich badaƒ zmieni∏y tak˝e wczeÊniejsze poglàdy na temat roli genów MMR.

Wykazano bowiem, ˝e nadekspresja hMSH2 i hMLH1 prowadzi do apoptozy, zarówno w komórkach zdolnych do naprawy DNA, jak i z uszkodzonymi mechanizmami naprawczymi [9]. Mierzàc ekspresj´ bia∏ek hMSH2 i hMLH1, nie stwierdzono istotnych zmian w ich po- ziomach w przebiegu cyklu komórkowego [7]. Sugero- wa∏oby to, ˝e bia∏ka MMR odgrywajà wa˝nà rol´

w ochronie komórki przed skutkami b∏´dów w replikacji oraz prawdopodobnie uszkodzeniem DNA. Równo- czeÊnie, wywo∏ywanie apoptozy w wyniku nadekspre- sji hMSH2 i hMLH1 wskazuje na ich podobieƒstwo ra- czej do genów supresorowych, takich jak APC czy p53, ni˝ genów naprawy DNA. Wyniki tych badaƒ pokrywa-

∏yby si´ z wczeÊniej stwierdzonà wzgl´dnà opornoÊcià niedrobnokomórkowych raków p∏uca na napromienia- nie oraz na niektóre cytostatyki (cisplatyn´, doksorubicy- n´ i etopozyd), co sugerowa∏oby udzia∏ genów MMR w aktywacji Êcie˝ek, przekazujàcych sygna∏ do apoptozy

(4)

Tab. I. Charakterystyka dotychczas przeprowadzonych badaƒ MSI w raku p∏uca Autor nStopieƒ No badanych Markery% guzów MSI+Najcz´stsze Zwiàzek z innymi mutacjami/ cechami [piÊmiennictwo]zaawansowanialoci1-n*2-n3-n4-nw ≥1 lociw ≥2 lociloci MSI+klinicznymi Shridhar [37]38np**16np34%np Fong [30]108I-III614-165%1%Zwiàzek MSI z mutacjami K-rasi p53 Adachi [29]57pI-IV11np29%npD3S1284MSI cz´Êciej w III i IV st. zaawansowania 35m#55%D14S78Zwiàzek MSI z LOH w 3p i 18q D9S162 D8S167 Ryberg [32]137np5-41-21%5%AR (Xq12) Miozzo [31]53I-III4-21132%8%AR(Xq11)Bez zwiàzku z mutacjami p53 D3S1351 Rosell [28]35I8np69%npZwiàzek MSI ze z∏ym rokowaniem Pifarre [38]64I-IIInp-wszystkie--66%npZwiàzek MSI ze z∏ym rokowaniem Bez zwiàzku z mutacjami p53i K-ras Pylkkanen [39]93np16-16--0%0%LOH w 28%, najcz´Êciej w 3p Sozzi [26]87I-III4-3-156%npFHIT (3p)MSI cz´Êciej u m´˝czyzn i SQC D21S1245 Ahrendt [21]50I-III15---1546%npL17686 D20S82 Caligo [40]52np6np35%npBez zwiàzku z mutacjami p53 Brak MSI w TGFbetaRII, BAX, IGFIIR Chang [25]68I-IV8-8--np41%χD13S170Zwiàzek MSI z ma∏ymi delecjami w p53 D9S162 D17S786 Zhou [27]91I6np3p-14%npD10S198MSI w 10p24- niezale˝ny niekorzystny 9p-25%D10S192czynnik rokowniczy 10p-35%MSI cz´Êciej w SQC Ahrendt [22]88I-III13---1335%10%L17686Zwiàzek EMAST z mutacjami p53 D20S82EMAST cz´Êciej w SQC Xu [23]47np12---1251%np *x - liczba nukleotydów w sekwencji markera **np - nie podano # p - nowotwory pierwotne, m- guzy przerzutowe χ41% w > 3 markerach

(5)

po rozpoznaniu uszkodzenia DNA lub adduktów DNA [9].

Zmiany molekularne w genach MMR

Molekularne zmiany w jednym lub obu genach (hMSH2 i hMLH1) stwierdza si´ w znacznej cz´Êci HNPCC oraz, nieco rzadziej, w sporadycznie wyst´pujàcych rakach jelita grubego. Obserwuje si´ m.in. utrat´ heterozygotycz- noÊci (LOH) w obr´bie loci genów MMR, metylacj´ re- gionu promotorowego hMLH1 i punktowe mutacje w ob- r´bie sekwencji kodujàcych [10-12, 14, 24]. Analiza mutacji w obr´bie genów hMSH2 i hMLH1 w przypadku raka p∏uca nie wykaza∏a ˝adnych mutacji ani polimorfi- zmu w obszarze promotora i egzonów tych genów. Nie stwierdzono tak˝e zwiàzku pomi´dzy ekspresjà genów MMR, a utratà heterozygotycznoÊci (LOH) na ramio- nach 3p i 2p chromosomów, w których zlokalizowane sà te geny. Wykazano ponadto zwiàzek obni˝onej ekspresji ge- nu hMLH1 i LOH w locus 3p21. Sugeruje to, ˝e utrata jednego z alleli mo˝e byç jednà z g∏ównych przyczyn inaktywacji tego genu. Podobnego zwiàzku nie stwierdzono dla genu hMSH2. Wykazano natomiast ujemny zwiàzek ekspresji hMSH2 z LOH w locus 3p, co mog∏oby wskazy- waç na obecnoÊç genu regulatorowego dla hMSH2 oraz na istnienie ujemnego sprz´˝enia zwrotnego [15].

Ekspresja genów MMR

Istniejà liczne badania potwierdzajàce zwiàzek wyst´powania MSI w raku jelita grubego z obni˝onà ekspresjà bia∏ek hMSH2 i hMLH1, odpowiadajàcà mutacjom stwierdzanym w genach MMR [6, 11, 12, 14-16, 24]. Mniej jest natomiast danych dotyczàcych tego zagadnienia w od- niesieniu do raka p∏uca. W jednym z badaƒ wykazano obni˝onà ekspresj´ przynajmniej jednego z badanych bia-

∏ek w 82% guzów, w tym w 59% hMLH1, 58% hMSH2 i w 34% przypadków obu bia∏ek [15]. Chang i wsp. [25]

wykazali bliski zwiàzek pomi´dzy ekspresjà hMLH1, a wy- st´powaniem MSI. U 77% chorych z MSI nie stwierdzono ekspresji bia∏ka hMLH1.

Zwiàzek pomi´dzy MSI, a patologicznymi i klinicz- nymi cechami raka p∏uca

W niektórych pracach stwierdzono cz´stsze wyst´powanie MSI w raku p∏askonab∏onkowym, w porównaniu z rakiem gruczo∏owym. Wskazywa∏o by to na istnienie ró˝nic w rodzaju zmian genetycznych, prowadzàcych do rozwoju obu wymienionych typów histologicznych [22, 26, 27].

Rozbie˝ne sà wyniki badaƒ dotyczàcych zwiàzku pomi´dzy cz´stoÊcià wyst´powania MSI, a klinicznym stop- niem zaawansowania raka p∏uca. W niektórych badaniach nie stwierdzono ˝adnej zale˝noÊci pomi´dzy wymienio- nymi cechami, co mog∏oby sugerowaç wczesne pojawienie si´ MSI w procesie karcinogenezy [21, 28]. Niektórzy autorzy wykazali jednak znamiennie cz´stsze wyst´powanie tej zmiany genetycznej w guzach w III i IV stopniu zaawansowania [29]. Co wi´cej, zmiany te wyst´powa∏y cz´-

Êciej w guzach przerzutowych, w porównaniu z guzami pierwotnymi. W badaniu Adachi i wsp. [29] poddano ana- lizie 10 par guza pierwotnego i odpowiadajàcego mu prze- rzutu. W 4 z par zarówno guz pierwotny, jak i przerzut, wykazywa∏y MSI w tych samych loci, co wskazywa∏oby,

˝e MSI pojawi∏a si´ wczeÊnie w procesie wzrostu guza pierwotnego i ˝e komórki nowotworowe z MSI by∏y tymi, które da∏y przerzuty. W 2 przypadkach w przerzutach stwierdzono MSI, której nie obserwowano w guzach pierwotnych. Wskazywa∏o by to, ˝e MSI musia∏a pojawiç si´

póêno w przebiegu progresji guza pierwotnego lub ju˝

w komórkach przerzutowych. Z badania tego wynika, ˝e zmiany typu MSI gromadzà si´ w trakcie progresji NSCLC oraz ˝e fenotyp MSI jest potencjalnym markerem z∏oÊliwoÊci klinicznej NSCLC.

Zwiàzek zmian w systemie MMR z bardziej agre- sywnym fenotypem p∏askonab∏onkowego raka p∏uca wykazali Xinarianos i wsp. [15]. Obni˝ona ekspresja genu hMLH1 (ale nie hMSH2) zwiàzana by∏a z przerzutami do w´z∏ów ch∏onnych. W badaniu tym obni˝ona ekspresja hMLH1 mia∏a tak˝e zwiàzek zarówno z liczbà papierosów wypalanych dziennie, jak i w ciàgu ca∏ego ˝ycia. Sugerowa-

∏o by to wp∏yw karcynogenów dymu tytoniowego na unie- czynnienie hMLH1 oraz mo˝liwoÊç addytywnego dzia∏ania obu tych czynników. Wynik ten wydaje si´ potwierdzaç wysuni´te poprzednio przypuszczenia, ˝e czynniki Êrodo- wiskowe biorà udzia∏ w powstawaniu niektórych zmian mikrosatelitarnych. Zwrócono zw∏aszcza uwag´ na prowa- dzàce do MSI uszkodzenia DNA przez wolne rodniki tle- nowe i addukty lipidowe. Sugeruje si´ udzia∏ palenia i die- ty w tym procesie. Nara˝enie na te czynniki mo˝e samo- dzielnie lub ∏àcznie ze zmianami w Êcie˝kach naprawy DNA prowadziç do swoistych fenotypów w ró˝nych rodza- jach nowotworów [12].

Zwiàzek MSI z innymi mutacjami

W badaniach nad zmianami genetycznymi typu MSI w raku p∏uca próbowano okreÊliç ich zwiàzek z mutacjami genu p53, cz´stymi w tym nowotworze. Podobnie do MSI, mutacje genu p53 wyst´pujà cz´Êciej w p∏askonab∏onko- wym raku p∏uca, w porównaniu z rakiem gruczo∏owym.

W badaniu Ahrendt i wsp. [22] mutacje genu p53 wyst´- powa∏y w 81% guzów MSI+ i tylko w 44% guzów MSI-.

Wy˝szà cz´stoÊç mutacji genu p53 w guzach MSI+ wyka- zali tak˝e inni autorzy [25, 30]. Z kolei Miozzo i wsp. [31]

w swoim badaniu nie zaobserwowali zale˝noÊci pomi´- dzy MSI, a nadmiernà ekspresjà bia∏ka p53. Wspó∏wy- st´powanie MSI i mutacji genu p53 mo˝e sk∏aniaç do wy- suni´cia dwóch ró˝nych wniosków. Z jednej strony brak mo˝liwoÊci odroczenia podzia∏u komórki i naprawy DNA, na skutek utraty funkcji supresorowego bia∏ka p53, zwi´k- sza prawdopodobieƒstwo, ˝e nie dojdzie do naprawy DNA uszkodzonego podczas replikacji. Mo˝e to prowa- dziç do proliferacji genetycznie zmienionych komórek.

Alternatywna hipoteza zak∏ada, ˝e zwi´kszona cz´stoÊç zmian w sekwencjach mikrosatelitarnych, wyst´pujàcych w obr´bie genów kontrolujàcych cykl komórkowy, mo˝e u∏atwiaç wzrost komórek ze zmutowanym genem p53.

(6)

Badano tak˝e zwiàzek MSI z innymi mutacjami. Wy- kazano m.in. zwi´kszonà cz´stoÊç mutacji genu K-ras, utrat´ alleli na chromosomach 3p i 18q (do akumulacji tych zaburzeƒ dochodzi wraz z progresjà NSCLC) i obec- noÊç rzadkich alleli w locus H-ras1 VNTR (variable num- ber of tandem repeats) [29, 30, 32].

Wykorzystanie MSI w rozpoznawaniu raka p∏uca

Chirurgiczne leczenie wczesnego raka p∏uca pozwala uzy- skaç 60-80% 5-letnich prze˝yç [33]. Na ogó∏ jednak chorzy zg∏aszajà si´ w zaawansowanych, nieoperacyjnych sta- diach choroby. Pomimo znacznej cz´stoÊci zachorowaƒ i zgonów z powodu raka p∏uca, nie istniejà skuteczne testy przesiewowe wÊród grup wysokiego ryzyka. Tradycyjne metody, oparte na konwencjonalnej cytologii plwociny i zdj´ciach radiologicznych klatki piersiowej, okaza∏y si´

nieskuteczne w obni˝eniu umieralnoÊci z powodu raka p∏uca. Wi´ksze mo˝liwoÊci w tej dziedzinie stwarza spiral- na tomografia komputerowa, ale z uwagi na wysoki koszt tej metody, mo˝liwoÊci jej zastosowania w badaniach ma- sowych sà ograniczone.

Analiza mikrosatelitarna mo˝e si´ okazaç wa˝nà i wzgl´dnie ∏atwà alternatywà w wykrywaniu nowotwo- rów. W przeciwieƒstwie do koniecznoÊci zastosowania specyficznych wskaêników dla okreÊlenia mutacji w obr´- bie onkogenów (np. genu p53 czy ras), ta zmiana moleku- larna jest ∏atwo rozpoznawana przy u˝yciu jednego ze- stawu primerów dla wszystkich próbek. Analiza sekwencji mikrosatelitarnych od kilku lat s∏u˝y wykrywaniu zmian genetycznych w ró˝nych nowotworach. Opisuje si´ dwa rodzaje zmian mikrosatelitarnych: utrat´ heterozygotycz- noÊci (LOH) oraz niestabilnoÊç, przy czym MSI jest ∏a- twiejsza do wykrycia w materiale biologicznym ni˝ subtel- ne ró˝nice, na podstawie których stwierdza si´ LOH [22].

MSI jest obecna tylko w komórkach nowotworowych.

Swoiste dla guza zmiany mikrosatelitarne zosta∏y u˝yte do identyfikacji komórek nowotworowych w moczu chorych na raka p´cherza moczowego oraz w surowicy chorych na nowotwory g∏owy i szyi [34, 35].

W NSCLC swoiste zmiany mikrosatelitarne wykryto w plwocinie, pop∏uczynach z drzewa oskrzelowego (BAL – bronchoalveolar lavage) oraz w osoczu. Ciekawe wyniki uzyskali Miozzo i wsp. [31], którzy u 29% chorych, których nowotwór nie wykazywa∏ MSI, stwierdzili wyst´powanie zmian mikrosatelitarnych w nab∏onku oskrzelowym, odle- g∏ym od nowotworu i prawid∏owym w badaniu histopato- logicznym. Wskazywa∏o by to na rozrost bezimiennych klonów komórkowych, ró˝nych od wyst´pujàcych w obr´- bie nowotworu. Mo˝na sàdziç, ˝e rozszerzenie tego rodzaju analizy na inne oskrzela pozwoli na wykrycie klonów komórkowych, charakteryzujàcych si´ potencja∏em trans- formacji. W badaniu przeprowadzonym przez Ahrendt i wsp. [21], zmiany mikrosatelitarne okaza∏y si´ najmniej czu∏e spoÊród 4 markerów molekularnych (p53, K-ras, p16 i MSI), analizowanych w pop∏uczynach z drzewa oskrzelowego. Powodem by∏o prawdopodobnie zbyt du˝e zanieczyszczenie badanego p∏ynu komórkami nienowo- tworowymi. Stwierdzono bowiem, ˝e progiem dla wykry-

cia MSI jest obecnoÊç 5-7% komórek nowotworowych w p∏ynie BAL. Co wi´cej, badanie to okaza∏o si´ najmniej pomocne w sytuacjach, w których ulepszone metody dia- gnostyczne sà najbardziej przydatne – u chorych z ma∏ymi, obwodowo po∏o˝onymi guzami.

Ostatnie badania wykaza∏y, ˝e zmiany genetyczne mogà byç wykrywane w DNA, krà˝àcym w osoczu lub surowicy chorych z ró˝nymi nowotworami (m.in. SCLC, jelita grubego, trzustki, g∏owy i szyi) [34, 35]. Sozzi i wsp.

[26] przeprowadzili badanie cz´stoÊci i rozleg∏oÊci zmian mikrosatelitarnych w DNA osocza chorych, z ograniczonà postacià NSCLC. U 61% chorych zmianom MSI w ko- mórkach nowotworowych towarzyszy∏y zmiany w DNA osocza i w wi´kszoÊci przypadków by∏y one takie same.

Ponadto u pi´ciu chorych wykazano MSI w DNA osocza, podczas gdy zmian tych nie by∏o w guzie. Wyniki te stwarzajà perspektywy wykorzystania analizy MSI w prak- tyce klinicznej. JeÊli rzeczywiÊcie zmiany w DNA osocza wyst´pujà cz´sto w I i II stopniu zaawansowania NSCLC (kiedy choroba jest potencjalnie uleczalna), a równocze- Ênie iloÊç DNA, uwalnianego z nowotworu, jest w osoczu wybiórczo zwi´kszona, analiza genetyczna takiego DNA mog∏aby byç u˝yta w celach diagnostycznych i przesiewowych.

Podsumowanie

NiestabilnoÊç mikrosatelitarna jest cz´stym zjawiskiem w raku p∏uca, jednak rola biologiczna tego zaburzenia, jak równie˝ jej zwiàzek z cechami klinicznymi oraz innymi nieprawid∏owoÊciami genetycznymi wymaga dalszych ba- daƒ. Obiecujàca wydaje si´ mo˝liwoÊç zastosowania te- stów wykrywajàcych MSI w badaniach przesiewowych i w rozpoznawaniu raka p∏uca.

Lek. med. Liliana Krasiƒska Klinika Onkologii i Radioterapii Akademii Medycznej

ul. D´binki 7, 80-211 Gdaƒsk

PiÊmiennictwo

1.Zatoƒski W, Tyczyƒski J. Nowotwory z∏oÊliwe w Polsce w 1996 roku. Warsza- wa: Centrum Onkologii – Instytut im. M.Sk∏odowskiej-Curie, Zak∏ad Epidemiologii i Prewencji Nowotworów. Krajowy Rejestr Nowotworów;

1999.

2.Ouyang H, Shiwaku H, Hagiwara H et al. The Insulin-like Growth Factor II receptor gene is mutated in genetically unstable cancers of the endome- trium, stomach and colorectum. Cancer Res 1997; 57: 1851-1854.

3.Caligo M, Ghimenti C, Marchetti A et al. Microsatellite alterations and p53, TGFbetaRII, IGFIIR and BAX mutations in sporadic non-small-cell lung cancer. Int J Cancer 1998; 78: 606-609.

4.Rampino N, Yamamoto H, Ionov Y et al. Somatic Frameshift mutations in the BAX gene in colon cancers of the microsatellite mutator phenoty- pe. Science 1997; 275: 967-969.

5.Markowitz S, Wang J, Myeroff L et al. Inactivation of the type II TGF-(re- ceptor in colon cancer cells with microsatellite instability. Science 1995;

268: 1336-1338

6.Lleonart M, Garcia-Foncillas J, Sanchez-Prieto R et al. and Ramon y Ca- jal S. Microsatellite instability and mutations in sporadic right and left co- lon carcinoma. Cancer 1998; 83: 889-895.

(7)

7.Mayers M, Theodosiou M, Acharya et al. Cell cycle regulation of the human DNA mismatch repair genes hMSH2, hMLH1 and hPMS2. Can- cer Res 1997; 57: 206-208.

8.Gradia S, Acharya S, Fishel R. The human mismatch recognition complex hMSH2-hMSH6 functions as a novel molecular switch. Cell 1997; 91:

995-1005.

9.Zhang H, Richards B, Wilson T et al. Apoptosis induced by overexpres- sion of hMSH2 and Hmlh1. Cancer Res 1999; 59: 3021-3027

10.Arzimanoglou I, Gilbert F, Barber H. Microsatellite instability in human solid tumors. Cancer 1998; 82: 1808-1819.

11.Dietmaier W, Wallinger S, Bocker T et al. Diagnostic microsatellite instability: definition and correlation with mismatch repair protein expres- sion. Cancer Res 1997; 57: 4749-4756.

12.Boland C, Thibodeau S, Hamilton S et al. A National Cancer Institute workshop on microsatellite instability for cancer detection and familial predisposition: Development of international criteria for the determina- tion of microsatellite instability in colorectal cancer. Cancer Res 1998;

58: 5248-5257.

13.Curia M, Palmirotta R, Aceto G et al. Unbalanced germ-line expression of hMLH1 and hMSH2 alleles in hereditary nonpolyposis colorectal can- cer. Cancer Res 1991; 39: 3570-3575.

14.Thibodeau S, French A, Roche P et al. Altered expression of hMSH2 and hMLH1 in tumors with microsatellite instability and genetic altera- tions in mismatch repair genes. Cacer Res 1996; 56: 4836-4840.

15.Xinarianos G, Liloglou T, Prime W et al. hMLH1 and hMSH2 expression correlates with allelic imbalance on chromosome 3p in non-small cell lung cancer. Cancer Res 2000; 60: 4216-4221.

16.Dos Santos NR, Seruca R, Constancia M et al. Microsatellite Instability at Multiple Loci in Gastric Carcinoma: Clinicopathologic implications and prognosis. Gastroenterology 1996; 110: 38-44.

17.Ottini L, Palli D, Falchetti M et al. Microsatellite instability in gastric cancer is associated with tumor location and family history in a high-risk population from Tuscany. Cancer Res 1997; 57: 4523-4529.

18.Paulson T, Wright F, Parker B et al. Microsatellite instability correlates with reduced survival and poor disease prognosis in breast cancer. Cancer Res 1996; 56: 4021-4026.

19.Merlo A, Mabry M, Gabrielson E et al. Frequent microsatellite instabili- ty in primary small cell lung cancer. Cancer Res 1994; 54: 2098-2101.

20.Chen X, Stroun M, Magnenat J et al. Microsatellite alterations in plasma DNA of small cell lung cancer patients. Nat Genet 1996; 2: 1033-1037.

21.Ahrendt S, Chow J, Yang S et al. Molecular detection of tumor cells in bronchoalveolar lavage fluid from patints with early stage lung cancer.

J Natl Cancer Inst 1999; 91: 332-339.

22.Ahrendt S, Decker P, Doffek K et al. Microsatellite instability at selected tetranucleotide repeats is associated with p53 mutations in non-small cell lung cancer. Cancer Res 2000; 60: 2488-2491.

23. Xu L, Chow J, Bonacum J. et al. Microsatellite instability at AAAG repe- at sequences in respiratory tract cancers. Int J Cancer 2001; 91: 200-204.

24.Leach F, Polyak K, Burrell M et al. Expression of the human mismatch re- pair gene hMSH2 in normal and neoplastic tissues. Cancer Res 1996; 56:

235-240.

25.Chang J, Chen Y, Chen C et al. Correlation of genetic instability with mismatch repair protein expression and p53 mutations in non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res 2000; 6: 1639-1646

26.Sozzi G, Musso K, Ratcliffe C et al. Detection of microsatellite alterations in plasma DNA of non-small cell lung cancer patients: a prospect for early diagnosis. Clin Cancer Res 1999; 5: 2689-2692.

27.Zhou X, Kemp BL, Khuri FR et al. Prognostic implication of microsatel- lite alteration profiles in early stage non-small cell lung cancer. Clin Can- cer Res 2000; 6: 559-565

28.Rosell R, Pifarre A, Monzo M et al. Reduced survival in patients with sta- ge I non-small cell lung cancer associated with DNA-replication errors. Int J Cancer 1997; 74: 330-334.

29.Adachi J, Shiseki M, Okazaki T et al. Microsatellite instability in primary and metastatic lung carcinomas. Genes Chromosom. Cancer 1995; 14:

301-306.

30.Fong K, Zimmerman P, Smith P. Microsatellite instability and other mole- cular abnormalities in non-small cell lung cancer. Cancer Res 1995; 55: 28- -30.

31.Miozzo M, Sozzi G, Musso K et al. Microsatellite alterations in bron- chial and sputum specimens of lung cancer patients. Cancer Res 1996;

56: 2285-2288.

32.Ryberg D, Lindstedt B, Zienolddiny S et al. A hereditary genetic marker closely associated with microsatellite instability in lung cancer. Cancer Res 1995; 55: 3996-3999.

33.Pazdur R, Coia L, Hoskins W, Wagman L. Cancer Management: A Mul- tidisciplinary Approach. Medical, surgical and radiation oncology. Inc.

Melville, NY PRR; 1999.

34.Nawroz H, Koch W, Anker P, Stroun M et al. Microsatellite alterations in serum DNA of head and neck cancer patients. Nat Med 1996; 2: 1035- -1037.

35.Mao L, Schoenberg M, Scicchitano M et al. Molecular detection of prima- ry bladder cancer by microsatellite analysis. Science 1996; 271: 659-662.

36.Sidransky D. Nucleic acid- based methods for the detection of cancer.

Science 1997; 278: 1054-1058.

37.Shridhar V, Siegfried J, Hunt J et al. Genetic instability of microsatellite sequences in non-small cell lung carcinomas. Cancer Res 1994; 54: 2084- -2087.

38.Pifarre A, Rosell R, Monzo M et al. Prognostic value of replication errors on chromosomes 2p and 3p in non-small-cell lung cancer. Br J Cancer 1997; 75: 184-189.

39.Pulkkaenen L, Karjalainen A, Anttila S et al. No evidence of microsatellite instability but frequent loss of heterozygosity in primary resected lung cancer. Environ. Mol Mutagen 1997; 30: 217-223.

40.Caligo MA, Ghimenti C, Marchetti A et al. Microsatellite alterations and p53, TGFbetaRII, IGFIIR and BAX mutations in sporadic non- -small-cell lung cancer. Int J Cancer 1998; 78: 606-609

Otrzymano: 23 lipca 2001 r.

Przyj´to do druku: 2 stycznia 2002 r.