WRAŻLIWOŚĆ KLINICZNYCH SZCZEPÓW
KLEBSIELLA PNEUMONIAE
WYWOŁUJĄCYCH ZAKAŻENIA MIEJSCOWE W FORMIE
BIOFILMOWEJ I PLANKTONICZNEJ NA ANTYSEPTYKI
EVALUATION OF EFFICACY OF ANTISEPTICS AGAINST BIOFILMIC AND PLANKTONIC FORMS OF
KLEBSIELLA PNEUMONIAE CAUSING LOCAL INFECTIONS
STRESZCZENIE: Klebsiella pneumoniae stanowi przyczynę zakażeń u pacjentów hospita-lizowanych, może wywoływać infekcje: dróg moczowych, ran skórnych, nosa i gardła, płuc oraz tkanek miękkich. Szereg czynników wirulencji, za pomocą których K. pneumoniae wal-czy o przetrwanie w środowisku, sprawia wiele trudności klinicznych i terapeutycznych. Celem niniejszej pracy była ocena skuteczności przeciwdrobnoustrojowej badanych antysep-tyków (powidon jodu, oktenidyna, etakrydyna, chlorheksydyna, nadtlenek wodoru i poliheksa-nidyna) względem Klebsiella pneumoniae w hodowli planktonicznej oraz biofilmowej. Najteczniejszymi antyseptykami były oktenidyna oraz poliheksanidyna, jednakże OCT była sku-teczniejsza od PHMB.
SŁOWA KLUCZOWE: antyseptyki, biofilm, Klebsiella pneumoniae, oktenidyna, poliheksanidyna
ABSTRACT: Klebsiella pneumoniae is a common cause of urinary tract, skin wounds, nose and throat, lungs, soft tissues, respiratory tract infections and bacteriemia. Virulence factors deter-mines clinical problems. Aim of this work was to evaluate efficacy of antiseptics: iodine povi-done, octenidine, ethacridine, chlorhexidine, peroxide, polyhexanide in eradication of Klebsiel-la pneumoniae in biofilm and pKlebsiel-lanktonic form. Octenidine and polyhexanide were the most ef-ficient antiseptics, but OCT was more efficient than PHMB.
KEY WORDS: antiseptics, biofilm, Klebsiella pneumoniae, octenidine, polyhexanide
1 Tuttomed Farmacja Sp. z o.o.
2 Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej i Parazytologii Wydziału Farmaceutycznego z Oddziałem Analityki Medycznej Uniwersytetu Medycznego im. Piastów Śląskich we Wrocławiu 3 Katedra i Klinika Medycyny Paliatywnej
Hospicjum Stacjonarnego Uniwersytetu Medycznego im. K. Marcinkowskiego w Poznaniu
} MARZENNA BARTOSZEWICZ
Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej i Parazytologii,
Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Analityki Medycznej, Uniwersytet Medyczny
im. Piastów Śląskich we Wrocławiu, ul. Borowska 211a, 50-556 Wrocław, Tel.: 71 784 05 10, e-mail: m.bartoszewicz@umed.wroc.pl Wpłynęło: 13.02.2017 Zaakceptowano: 26.02.2017 DOI: dx.doi.org/10.15374/FZ2017011
WSTĘP
Należąca do rodziny Enterobacteriaceae Klebsiella
pneu-moniae jest oportunistycznym patogenem, który może
wy-woływać zakażenia: dróg moczowych, ran przewlekłych, płuc, tkanek miękkich i krwi oraz zapalenie opon mózgo-wych [1–3].
Za główne czynniki chorobotwórczości K. pneumoniae uważa się:
t grubą śluzową otoczkę umożliwiającą adhezję; t enterotoksyny powodujące biegunki;
t siderofory chelatujące jony żelaza;
t endotoksyny – lipopolisacharyd oraz adhezyny
– odpowiadające za proces przylegania komórki bakteryjnej do powierzchni.
Tworzenie biofilmu przylegającego do biomateriału lub tkanek pacjenta chroni drobnoustroje przed: niekorzystnymi
warunkami środowiskowymi, układem immunologicznym gospodarza, antybiotykami, a nawet antyseptykami [4–8].
Celem niniejszej pracy była ocena wrażliwości klinicz-nych szczepów K. pneumoniae wywołujących zakażenia miejscowe w formie biofilmowej i planktonicznej na anty-septyki: powidon jodu (PVP-jod), dichlorowodorek okteni-dyny (OCT), poliheksanidynę (PHMB), nadtlenek wodoru (H2O2), diglukonian chlorheksydyny (CHG) oraz mleczan etakrydyny.
MATERIAŁY I METODY
Badaniem objęto po 20 szczepów Klebsiella
pneumo-niae, izolowanych z zakażeń u pacjentów
hospitalizowa-nych i wchodzących w skład kolekcji szczepów Zakładu Mikrobiologii Farmaceutycznej i Parazytologii Wydziału
Farmaceutycznego z Oddziałem Analityki Medycznej Uni-wersytetu Medycznego im. Piastów Śląskich we Wrocławiu.
POTWIERDZENIE ZDOLNOŚCI SZCZEPÓW
K. PNEUMONIAE DO TWORZENIA BIOFILMU NA
POWIERZCHNI POLISTYRENOWEJ Z UŻYCIEM
MIKROSKOPII ŚWIETLNEJ
W celu potwierdzenia zdolności szczepów K.
pneumo-niae do tworzenia biofilmu na powierzchni polistyrenowej
zastosowano metodę wykorzystującą zdolność odczynnika Congo Red (Sigma-Aldrich) do niespecyficznego wiązania ze związkami posiadającymi wiązania typu beta, wchodzą-cymi w skład śluzu zewnątrzkomórkowego, według Harri-sona-Balestry [9].
OCENA SKUTECZNOŚCI
PRZECIWDROBNOUSTROJOWEJ ANTYSEPTYKÓW
WZGLĘDEM SZCZEPÓW K. PNEUMONIAE
W HODOWLI PLANKTONICZNEJ ORAZ BIOFILMOWEJ
OKREŚLENIE WARTOŚCI MIC I MIC90 W WARUNKACH
BEZ OBCIĄŻENIA WARUNKI CZYSTE
Podczas badań zastosowano stężenia użytkowe dichlo-rowodorku oktenidyny, mleczanu etakrydyny, poliheksani-dyny oraz diglukonianu chlorheksypoliheksani-dyny, wynoszące 0,1%. W przypadku H2O2 oraz PVP-jodu, preparaty antyseptycz-ne doprowadzono do stężenia 0,1% w celu porównania siły bójczej substancji aktywnej każdego preparatu, tak jak zo-stało to zaproponowane przez Bartoszewicz i wsp. [4]. Do określenia wartości MIC (ang. minimal inhibitory concen-tration, minimalne stężenie hamujące) badanych antysepty-ków zastosowano metodę mikrorozcieńczeń na polistyreno-wych płytkach 96-dołkopolistyreno-wych (Sarstedt), zgodnie z wytycz-nymi opracowaz wytycz-nymi przez NCCLS (ang. National Commit-tee for Clinical Laboratory Standards) dla antybiotyków.
Sporządzono zawiesinę o gęstości 1×108 komórek/ml (0,5 MF) z 24-godzinnej hodowli płynnej badanego szczepu. Rozcieńczono ją 100-krotnie za pomocą TSB (ang. tryptic soy broth) w celu uzyskania gęstości 1×106 komórek/ml. 100 μl zawiesiny bakteryjnej o gęstości 1×106 komórek/ml prze-niesiono do odpowiednich dołków (1–10 oraz 12) płytki ti-tracyjnej. Dołek 11. stanowił kontrolę jałowości doświad-czenia (napełniono go jałową pożywką płynną), a dołek 12.
– kontrolę potwierdzającą zdolność szczepu do tworzenia biofilmu na powierzchni polistyrenowej.
Płytkę titracyjną z odpowiednimi zawiesinami komórek bakteryjnych inkubowano w temperaturze 37°C przez 24 go-dziny. Po zakończeniu inkubacji zawiesinę usunięto, a dołki przepłukano 3×0,9% NaCl w celu usunięcia niezadherowa-nych komórek bakteryjniezadherowa-nych w formie planktonicznej i do-dano 100 μl bulionu Mueller-Hintona (MHB). Następnie do dołków płytki wprowadzono rozcieńczenia odpowiednich antyseptyków (Tabela 1) w postępie geometrycznym i pozo-stawiono na 24 godziny w temperaturze 37°C.
W celu dokonania oceny wpływu antyseptyków na bak-terie w formie planktonicznej, 100 μl zawiesiny bakteryjnej naniesiono do dołków płytki wraz z odpowiednimi rozcień-czeniami. Następnie płytkę inkubowano przez 24 godziny w temperaturze 37°C. W celu określenia MIC badanych sub-stancji – zarówno względem bakterii w formie planktonicz-nej, jak i biofilmowej – użyto metody Richardsa, opartej na ocenie redukcji bezbarwnego chlorku 2,3,5-trójfenylotetra-zoliowego (20 μl, 1% TTC) do czerwonego formazanu. Do barwnej redukcji związku dochodziło jedynie w obecności żywych, aktywnych metabolicznie drobnoustrojów. Za mini-malne stężenie hamujące przyjmowano stężenie antyseptyku w pierwszym dołku, w którym po 24 godzinach od inkubacji z 5 μl TTC nie doszło do zmiany zabarwienia. Za MIC90 bra-no to stężenie badanego preparatu, które prowadziło do za-hamowania wzrostu 90% badanych szczepów. Każdy pomiar został przeprowadzony w trzech powtórzeniach.
OCENA SKUTECZNOŚCI BADANYCH ANTYSEPTYKÓW
WZGLĘDEM SZCZEPÓW
K. PNEUMONIAE W HODOWLI PLANKTONICZNEJ
ORAZ BIOFILMOWEJ OKREŚLENIE WARTOŚCI MIC
I MIC
90W WARUNKACH IMITUJĄCYCH ŚRODOWISKO
RANY PRZEWLEKŁEJ WARUNKI Z OBCIĄŻNIKIEM
Sporządzono zawiesinę o gęstości 1×108 komórek/ml (0,5 MF) z 24-godzinnej hodowli płynnej badanego szczepu. Roz-cieńczono ją 100-krotnie za pomocą TSB w celu otrzyma-nia gęstości 1×106 komórek/ml. 100 μl zawiesiny bakteryj-nej o gęstości 1×106 komórek/ml przeniesiono do odpowied-nich dołków (1–10 oraz 12) płytki titracyjnej. Dołek 11. sta-nowił kontrolę jałowości doświadczenia (napełniano go jało-wą pożywką płynną), a dołek 12. – kontrolę potwierdzającą
Numer dołka płytki 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Stężenie antyseptyku (μg/ml) 0,49 0,98 1,96 3,91 7,82 15,63 31,25 62,50 125,0 250,0 KN KP
KP – kontrola pozytywna (zawiesina bakteryjna niepoddana działaniu antyseptyku); KN – kontrola negatywna (kontrola jałowości – pożywka mikrobiologiczna, do któ-rej nie wprowadzono zawiesiny bakteryjnej). Stężenie użytkowe powyższych preparatów wynosi 1000 μg/ml, jednak obecność inoculum bakteryjnego i pożywki pro-wadzi do jego rozcieńczenia do 250 μg/ml.
zdolność szczepu do tworzenia biofilmu na powierzchni poli-styrenowej. Tak przygotowaną płytkę titracyjną inkubowano przez 24 godziny w temperaturze 37°C. Po zakończeniu inku-bacji zawiesinę usunięto, a dołki przepłukano 3×0,9% NaCl w celu usunięcia niezadherowanych komórek bakteryjnych w formie planktonicznej. Następnie do dołków płytki dodano 100 μl MHB, zawierającego 18% krew baranią oraz 18% BSA (ang. bovine serum albumine). Uzyskano stężenia antysepty-ków zawarte w Tabeli 1 i stężenie krwi baraniej oraz białka BSA w zawiesinie wynoszące 4,5%, w oparciu na dane przed-stawione przez Bartoszewicz i wsp. [10]. W przypadku ho-dowli planktonicznych, do dołków płytki titracyjnej wprowa-dzano 100 μl zawiesiny odpowiedniego szczepu bakteryjnego oraz 100 μl bulionu MHB, zawierających 18% krew baranią oraz 18% BSA, kolejno 100 μl antyseptyku i 100 μl 0,9% NaCl. Uzyskano stężenia antyseptyków zawarte w Tabeli 1 i stężenie krwi baraniej oraz białka BSA w zawiesinie wynoszące 4,5%.
POTWIERDZENIE ZDOLNOŚCI SZCZEPÓW
K. PNEUMONIAE DO TWORZENIA BIOFILMU NA
POWIERZCHNI PROFILÓW POLISTYRENOWYCH
ZA POMOCĄ METODY RICHARDSA I MIKROSKOPII
ELEKTRONOWEJ
Zawiesinę bakteryjną po 24-godzinach hodowli doprowa-dzono do gęstości 0,5 MF i inkubowano w obecności profi-lu polistyrenowego (Model Ad) i 1% TTC przez 24 godziny w temperaturze 37°C. Po upływie czasu inkubacji profil prze-płukiwano 3×0,9% NaCl w celu usunięcia niezadherowanych bakterii z jego powierzchni. Czerwone zabarwienie, będące wynikiem redukcji TTC do czerwonego formazanu, służy-ło wstępnemu potwierdzeniu zdolności szczepów do tworze-nia biofilmu na powierzchni polistyrenowej. Następnie profi-le poddawano suszeniu w temperaturze 37°C przez 4 godziny. Na wysuszone profile napylano mieszaninę Au/Pd za pomocą napylarki Quorum-Q150R ES. W celu uzyskania obrazu bio-filmu posłużono się mikroskopem elektronowym ZEISS-32.
OCENA ZDOLNOŚCI BADANYCH ANTYSEPTYKÓW
DO ERADYKACJI BIOFILMU Z POWIERZCHNI
PROFILÓW POLISTYRENOWYCH
Badane szczepy K. pneumoniae rosnące na podłożach stałych przeniesiono do odpowiednich podłoży płynnych i inkubowano przez 24 godziny w temperaturze 37°C w wa-runkach tlenowych, bez wytrząsania. Po upływie czasu in-kubacji gęstość zawiesiny bakteryjnej ustalono densytome-trycznie na 3×108 komórek/ml. Do tak przygotowanych za-wiesin wprowadzono profil polistyrenowy w kształcie walca o średnicy 0,5 cm i długości 1 cm i poddano kolejnej inku-bacji w 37°C. Po 24 godzinach przepłukano go intensywnie 0,9% NaCl w celu pozbycia się z jego powierzchni niezwią-zanych lub luźno zadherowanych bakterii. Następnie profile
z utworzonym biofilmem wprowadzono na czas kontakto-wy jednej minuty do 1 ml badanego antyseptyku w stęże-niu użytkowym. Profile przeniesiono na 5 minut do neu-tralizatora niwelującego działanie substancji przeciwdrob-noustrojowej. Po upływie czasu neutralizacji profil przenie-siono do 1 ml łagodnego detergentu, 0,5% saponiny i pod-dano mechanicznemu wytrząsaniu (jedna minuta) w celu uwolnienia komórek bakteryjnych z warstw śluzu tworzą-cego biofilm. 100 μl uzyskanego lizatu posiano ilościowo na odpowiednie podłoże, stale wykorzystując technikę se-ryjnych rozcieńczeń. Po 24-godzinnej inkubacji w 37°C zli-czono liczbę kolonii bakteryjnych na płytce. Wynik poda-no jako CFU (ang. colony forming unit) całkowite, obliczo-ne według wzoru:
CFU całkowite = liczba kolonii × 10 N+1
gdzie: N = numer rozcieńczenia, w którym wyrosły szcze-py bakteryjne; +1 = rozcieńczenie 10-krotne (0,1 ml z 1 ml saponiny).
WYNIKI
POTWIERDZENIE ZDOLNOŚCI SZCZEPÓW
K. PNEUMONIAE DO TWORZENIA BIOFILMU NA
POWIERZCHNI POLISTYRENOWEJ Z UŻYCIEM
MIKROSKOPII ŚWIETLNEJ
Za tworzące biofilm na powierzchni polistyrenowej przy-jęto szczepy Klebsiella pneumoniae posiadające zdolność trwałej adhezji i produkcji zewnątrzkomórkowego śluzu w ciągu 1–24 godzin inkubacji. Trwałą adhezję badanych szczepów zaobserwowano po 2–4 godzinach od naniesienia na powierzchnię szkiełka polistyrenowego. Najwcześniej po upływie 4 godzin, a najpóźniej po 8 godzinach od naniesie-nia na szkiełko szczepy poddane testom rozpoczynały pro-dukcję zewnątrzkomórkowego śluzu (Ryc. 1).
OCENA SKUTECZNOŚCI
PRZECIWDROBNOUSTROJOWEJ BADANYCH
ANTYSEPTYKÓW WZGLĘDEM BADANYCH
SZCZEPÓW K. PNEUMONIAE W HODOWLI
PLANKTONICZNEJ ORAZ BIOFILMOWEJ
OKREŚLENIE WARTOŚCI MIC I MIC90
W WARUNKACH BEZ OBCIĄŻENIA WARUNKI CZYSTE
Na Ryc. 2A i 2B przedstawiono wartości MIC90 badanych antyseptyków względem szczepów K. pneumoniae w formie planktonicznej i biofilmowej.
Najwyższą aktywność względem badanych szczepów
Klebsiella pneumoniae w formie planktonicznej oraz
bio-filmowej wykazywał dichlorowodorek oktenidyny, a naj-mniejszą – mleczan etakrydyny.
cy biofilm na powierzchni polistyrenowej. A. Ko-mórki bakteryjne przylegające do powierzchni polistyrenowej po dwóch godzinach od rozpo-częcia inkubacji i tworzące równomiernie roz-łożoną warstwę. Brak jest widocznego śluzu ze-wnątrzkomórkowego. B. Po 8 godzinach od roz-poczęcia inkubacji, warstwa komórek bakteryj-nych (1) pokryta jest gęstym, zewnątrzkomórko-wym śluzem (2).
Ryc. 2. Minimalne stężenia hamujące wzrost 90% badanych szczepów K. pneumoniae w formie planktonicznej (A) oraz biofilmowej (B). Wartości MIC90 dla etakrydyny oraz H2O2 przyjmujące na wykresie B wartości wynoszące 250 μg/ml oznaczają, że antyseptyki te nie są skuteczne względem badanych szczepów bakterii w testowanym przedziale stężeń.
Ryc. 3. Minimalne stężenia hamujące wzrost 90% badanych szczepów K. pneumoniae w formie planktonicznej (A) oraz biofilmowej (B). Wartości MIC90 przyjmujące na wykresie B wartości 250 μg/ml oznaczają, że antyseptyki nie są skuteczne względem badanych szczepów bakterii w testowanym przedziale stężeń. 0 5 10 15 20 25 30 35 MIC₉₀ (μg/mL) H₂O₂ PVP -jod Okt enidyna Etakry dyna Chlorhek sydyna Poliheksani dyna 0 50 100 150 200 250 300 MIC₉₀ (μg/mL) H₂O₂ PVP -jod Okt enidyna Etakry dyna Chlorhek sydyna Poliheksani dyna A B 0 50 100 150 200 250 300 PVP -jod Okt enidyna Etakry dyna Chlorhek sydyna Polihek sanidyna MIC₉₀ (μg/mL ) 0 50 100 150 200 250 300 MIC₉₀ (μg/mL) PVP -jod Okt enidyna Etakry dyna Chlorhek sydyna Polihek sanidyna A B
OCENA SKUTECZNOŚCI BADANYCH ANTYSEPTYKÓW
WZGLĘDEM BADANYCH SZCZEPÓW W HODOWLI
PLANKTONICZNEJ ORAZ BIOFILMOWEJ
K. PNEUMONIAE OKREŚLENIE WARTOŚCI MIC
I MIC
90W WARUNKACH IMITUJĄCYCH ŚRODOWISKO
RANY PRZEWLEKŁEJ WARUNKI Z OBCIĄŻNIKIEM
Na Ryc. 3 przedstawiono wartości MIC badanych antysep-tyków, które uzyskano w warunkach symulujących środowisko rany przewlekłej. W testach nie uwzględniono H2O2, ponieważ po wprowadzeniu do zawiesiny zawierającej krew baranią ule-gał on intensywnemu pienieniu. Uniemożliwiało to prowadze-nie następnych etapów procedury określenia wartości MIC. Zaobserwowano podwyższoną oporność mikroorganizmów w formie biofilmowej na stosowane antyseptyki w porównaniu z formą planktoniczną.
Jak przedstawiono na Ryc. 3A, skuteczność badanych an-tyseptyków względem szczepów Klebsiella pneumoniae w for-mie planktonicznej była następująca: oktenidyna > PVP-jod, chlorheksydyna, poliheksanidyna > mleczan etakrydyny. Na Ryc. 3B przedstawiono skuteczność testowanych sub-stancji względem szczepów K. pneumoniae w formie biofil-mowej (w kolejności od największej do najmniejszej: okte-nidyna > chlorheksydyna > poliheksaokte-nidyna > PVP-jod, etakrydyna).
W badanym przedziale stężeń mleczan etakrydyny oka-zał się nieskuteczny zarówno względem bakterii w formie planktonicznej, jak i biofilmowej. Charakteryzował się niż-szą skutecznością od pozostałych antyseptyków w warun-kach tzw. czystych oraz brudnych.
POTWIERDZENIE ZDOLNOŚCI SZCZEPÓW
K. PNEUMONIAE DO TWORZENIA BIOFILMU NA
POWIERZCHNI PROFILÓW POLISTYRENOWYCH ZA
POMOCĄ MIKROSKOPII ELEKTRONOWEJ
Na Ryc. 4 i 5 przedstawiono biofilm tworzony przez ba-dane szczepy na powierzchniach polistyrenowych.
OCENA ZDOLNOŚCI BADANYCH ANTYSEPTYKÓW
DO ERADYKACJI BIOFILMU Z POWIERZCHNI
PROFILÓW POLISTYRENOWYCH
Liczba komórek badanych szczepów K. pneumoniae two-rzących biofilm na powierzchni profilu polistyrenowego (CFU/profil) wynosiła od 105 do 107.
Oktenidyna charakteryzowała się najwyższą zdolnością do całkowitej eradykacji biofilmu (18 przypadków). PVP- -jod był najskuteczniejszy w 17 przypadkach, chlorheksy-dyna – w 15, poliheksanichlorheksy-dyna – w 14, a nadtlenek wodo-ru – w 12. Z kolei mleczan etakrydyny tylko w 6 przypad-kach wykazał zdolność całkowitej eradykacji biofilmu z pro-filu polistyrenowego.
OMÓWIENIE I WNIOSKI
Celem pracy była ocena wrażliwości klinicznych szcze-pów Klebsiella pneumoniae w formach biofilmowych i plank-tonicznych na wybrane antyseptyki. Forma biofilmowa K.
pneumoniae wykazuje podwyższoną oporność wobec
środ-ków przeciwdrobnoustrojowych, co ma istotne znaczenie kliniczne i terapeutyczne.
Ocena i kontrola wzrostu oporności szczepów wobec sto-sowanych antyseptyków poprzez oznaczenie wartości mi-nimalnego stężenia hamującego powinna być stosowana Ryc. 4. Biofilm tworzony przez szczep Klebsiella pneumoniae 8M na
po-wierzchni profilu polistyrenowego. Biofilm uwidoczniony został na ko-lor czerwony za pomocą metody Richardsa wykorzystującej zdolność ży-wych, aktywnych metabolicznie bakterii do redukcji bezbarwnego TTC (chlorku 2,3,5-trifenylotetrazoliowego) do czerwonego formazanu.
Ryc. 5. Biofilm tworzony przez szczep Klebsiella pneumoniae 8M na po-wierzchni profilu polistyrenowego. Na zdjęciu widoczne komórki bakte-ryjne przylegające grubą warstwą do powierzchni profilu polistyrenowe-go (1) oraz śluz zewnątrzkomórkowy (2), częściowo pokrywający war-stwę komórek bakteryjnych. Skaningowy mikroskop elektronowy ZEISS, powiększenie ×6600.
w diagnostyce mikrobiologicznej. Metoda mikrorozcień-czeń służy do określenia wartości MIC testowanych substan-cji na 96-dołkowych płytkach polistyrenowych. Jest to zgod-ne z wytycznymi opracowanymi przez NCCLS dla antybio-tyków. Metoda ta jest wysoce powtarzalna i daje możliwość określenia najniższego stężenia hamującego rozwój drob-noustrojów w czasie kontaktowym 24 godzin. Jak wykaza-no w badaniach Bartoszewicz i wsp., technika ta może także zostać zaadaptowana do oznaczania MIC badanych związ-ków przeciwdrobnoustrojowych względem bakterii w for-mie biofilmowej [10]. Wymaga zastosowania stężeń antysep-tyków niższych niż stężenia użytkowe (obecność inoculum bakteryjnego), jednak wszystkie metody testowania skutecz-ności antyseptyków posiadają tą cechę. Jest to również za-warte w normie EN 1041.
W celu zbadania zdolności antyseptyków do eradykacji biofilmu, profile opłaszczone biofilmem wprowadzono do 1 ml antyseptyku o stężeniu użytkowym na czas jednej mi-nuty. Czas ten jest podany w rekomendacjach producentów środków przeciwdrobnoustrojowych, w których substancja-mi aktywnysubstancja-mi są: oktenidyna, poliheksanidyna, powidon jodu oraz chlorheksydyna. W przypadku zastosowania mle-czanu etakrydyny oraz nadtlenku wodoru brak jest takich danych.
Jak wykazano w przeprowadzonych testach, wrażliwość na antyseptyki badanych szczepów bakteryjnych jest niejed-norodna, a same różnice minimalnych stężeń hamujących są w przypadku omawianych substancji przeciwdrobno-ustrojowych wyższe niż w przypadku antybiotyków.
Planktoniczna oraz biofilomowa forma szczepów była oporna na mleczan etakrydyny. Najprawdopodobniej przy-czyną tego zjawiska było nabycie przez badane szczepy genu kodującego oporność na ten antyseptyk.
Badane szczepy K. pneumoniae w formie planktonicznej były wyjątkowo wrażliwe na PVP-jod – zarówno w warun-kach tzw. czystych, jak i imitujących środowisko rany prze-wlekłej (MIC90 wynosił 15 μg/ml). Należy to dokładnie zba-dać, z uwzględnieniem zależności pomiędzy środowiskiem reakcji, szczepem bakteryjnym a środowiskiem bytowania drobnoustroju.
Wyniki badań wskazują, że oktenidyna i poliheksani-dyna są antyseptykami, które powinno się stosować w za-każeniach szczepami Klebsiella pneumoniae. Wrażliwość
K. pneumoniae na OCT i PHMB jest związana ze specyfiką
działania tych związków – wpływają one na błonę komór-kową drobnoustrojów oraz hamują enzymatyczne mechani-zmy oporności.
Wyniki badań dotyczące stopnia eradykacji biofilmu bakteryjnego mają istotne znaczenie kliniczne, ponieważ – w przeciwieństwie do antybiotyków – antyseptyki mogą być stosowane wielokrotnie w ciągu doby.
KONFLIKT INTERESÓW: nie zgłoszono.
PIŚMIENNICTWO
1. Brisse S, Grimont F, Grimont P. The genus Klebsiella. In: Dworkin M, Falkow S, Rosenberg E, Schleifer KH, Stackebrandt E (eds). The Prokaryotes. A Handbook on the Biology of Bacteria. Vol. 6. Springer, New York, 2006.
2. Holt KE, Wertheim H, Zadoks RN et al. Genomic analysis of diversity, population structure, virulence, and antimicrobial resistance in Klebsiella pneumoniae, an urgent threat to public health. Proc Natl Acad Sci U S A 2015;112(27):E3574–E3581. 3. Ito R, Shindo Y, Kobayashi D et al. Molecular epidemiological characteristics
of Klebsiella pneumoniae associated with bacteremia among patients with pneumonia. J Clin Microbiol 2015;53(3):879–886.
4. Bartoszewicz M, Junka A, Smutnicka D. Wrażliwość klinicznych szczepów
Klebsiella pneumoniae na aseptyki stosowane w leczeniu ran. Forum Zakażeń
2011;2(4):121–127.
5. Melot B, Colot J, Guerrier G. Bacteremic community-acquired infections due to Klebsiella pneumoniae: clinical and microbiological presentation in New Caledonia, 2008–2013. Int J Infect Dis 2015;41:29–31.
6. Kollef MH, Shorr A, Tabak YP, Gupta V, Liu LZ, Johannes RS. Epidemiology and outcomes of health-care-associated pneumonia: results from a large US database of culture-positive pneumonia. Chest 2005;128(6):3854–3862. 7. Shon AS, Russo TA. Hypervirulent Klebsiella pneumoniae: the next superbug?
Future Microbiol 2012;7(6):669–671.
8. Siu LK, Yeh KM, Lin JC, Fung CP, Chang FY. Klebsiella pneumoniae liver abscess: a new invasive syndrome. Lancet Infect Dis 2012;12(11):881–887.
9. Harrison-Balestra C, Cazzaniga AL, Davis SC, Mertz PM. A wound-isolated
Pseudomonas aeruginosa grows a biofilm in vitro within 10 hours and is
visu-alized by light microscopy. Dermatol Surg 2003;29(6):631–635.
10. Bartoszewicz M, Junka A, Smutnicka D et al. Skuteczność wybranych antysep-tyków badana in vitro oraz w warunkach imitujących środowisko rany w sto-sunku do szczepów CNS izolowanych z zakażeń ran przewlekłych. Leczenie Ran 2011;8(1):21–27.
