A C T A U N I V E R S I T A T I S L O D Z I E N S I S
F O L IA B IO C H IM IC A E T B IO P H Y S IC A 14, 1999
M agdalena W ojtysiak-Staniaszczyk, M arzena Przepiórkiew icz, Z o fia W alter
WPŁYW ŁFO NA AKTYWNOŚĆ MIKROSOMALNYCH
I CYTOZOLOWYCH TRANSFERAZ S-G LUTAIIO N O W Y CH (GST) W LIMFOCYTACH KRWI OBWODOWEJ ŚWINI
B a d an o w pływ insektycydów fo sfo ro o rg an iczn y ch (IF O ) n a a k ty w n o ść tra n s fe ra z S-glu tatio n o w y ch w lim focytach krw i obw odow ej świni. M ik ro so m a ln e G S T w y k a zyw ały ak ty w n o ść zaró w n o w sto su n k u d o C D N B , ja k i d o D C N B ja k o su b strató w ; ak ty w n o ść cytozolow ych G S T stw ierd zo n o ty lk o z C D N B .
P o inkubacji lim focytów z IF O (m alatio n em i m ety lo p aratio n em ) z ao b serw o w an o zn am ien n y statystycznie w zrost aktyw ności G S T zaró w n o frakcji m ik ro so m aln ej ja k i cytozolow ej. W zro st ak tyw ności był zależny od ro d zaju in sek ty cy d u , je g o d aw k i ja k i czasu inkubacji.
W S T Ę P
Pow szechnie dziś stosow ane w rolnictw ie insektycydy fo sforo organ iczn e (IF O ) o prócz skutecznego niszczenia ow adów stan o w ią zagrożenie tak że d la człow ieka.
W ykazano ich szkodliwy wpływ n a m ateriał genetyczny ssaków. P ow odują one pow staw anie aberracji chrom osom ow ych, m utacji, działają terato g en n ie o ra z kancerogennie [15].
IF O należą d o grupy zw iązków chem icznych o zdolnościach alkilujących. M echanizm alkilacji polega n a interrakcji pom iędzy elektrofilow ym i centram i IF O a nukleofilow ym i centram i kw asów nukleinow ych i białek co w pływ a n a stru k tu rę i właściwości biologiczne tych cząsteczek. O d wielu lat żywe zainteresow anie b u d zą więc b a d a n ia w pływ u IF O n a m a te ria ł genetyczny [1-5, 11, 16-18, 20, 21]. D uże znaczenie m a ją tak że b a d a n ia procesów m etabolicznych i detoksykacyjnych tych zw iązków zachodzących w o r ganizm ach.
W d etoksykacji IF O isto tn ą rolę odgryw ają tran sferazy S -glutationow e (G S T ), k tó re k a ta liz u ją sprzęganie IF O ze zred u k o w an y m g lu tatio n e m
(G S H ), w w yniku czego po w stają p ro d u k ty lepiej rozpuszczalne w wodzie, co u łatw ia ich w ydalanie 7. organizm u [19].
G S T są g ru p ą w ielofunkcyjnych enzym ów nie tylko ze względu n a katalizow anie reakcji sprzęgania g lu tatio n u z d użą liczbą zw iązków chem icz nych (w tym z w ielom a czynnikam i alkilującym i), co chroni k o m ó rk ę przed ich p o ten cjaln ą toksycznością, ale rów nież z uwagi n a w ykazyw anie innych typów aktyw ności, tak ich jak : aktyw no ść peroksydazy glutation ow ej nieza leżnej od selenu, izom eraz dla 3-ketokw asów . O dgryw ają w ażną rolę w we w n ą trzk o m ó rk o w y m tran sp o rcie różnych organicznych n iesu b strato w y ch , hydrofob ow ych ligandów , takich jak bilirubina, hem , m etab o lity steroid ów , kw asy żółciow e i h o rm o ny tyroidow e. U czestniczą w biosyntezie leuko- trien ó w i odgryw ają rolę w m etabolizm ie kw asu arach idon ow eg o. B iorą udział w syntezie grup pro statyczn ych hem u d la ap o -cy to ch ro m u P-450. U czestniczą w w ytw arzaniu opo rności m ik ro organ izm ów przeciw lekowi a n ty p ro to z o a [19].
J a k d o tą d b ra k jest danych dotyczących w pływu insektycydów fo sfo ro organicznych n a aktyw ność tran sfera z S -glutationow ych w lim focytach, k tó re są szczególnie dobrym m ateriałem badawczym ze względu n a m ożliw ość śledzenia procesów m etabolicznych w przyżyciow o izolow anych k o m ó rk a c h z pełnym ap a ratem genetycznym .
M A T E R IA Ł i M E T O D Y
M ateriałem d o b a d a ń były lim focyty krw i obw odow ej świni izolow ane m eto d ą C z e r s k i e g o i wsp. n a szalkach Petriego [6]. Żyw otność lim focytów oceniano testem z błękitem try p a n u i azydkiem b uforow an ym PBS [8]. Lim focyty zaw ieszano w płynie P a rk e ra z m alatio nem w daw k ach: 10, 50, 100 /iM i m a ty lo p ara tio n e m w daw kach 10, 50, 120 /¿M i p o d d aw an o inku bacji w różnej długości czasu 1, 2, 6, 18 h. Po in kub acji lim focyty ho m o genizow ano i rozw irow yw ano zm odyfikow aną m e to d ą J a c o b y ’ e g o [9] w celu u zy sk an ia frakcji m ik ro so m aln ej i cytozo lo w ej. A k ty w n o ść en z y m a ty czn ą w w ym ienionych frak cjac h o zn a cza n o m e to d ą II a b i g a i wsp. [7] z dw om a różnym i substratam i: C D N B (l-chloro-4-dinitrobenzenem ) i D C N B (l,2 -dichloro-4-nitrob enzenem ). D o b a d a ń sto so w an o odczyn nik i o w ysokim sto p n iu czystości (98% ). W yniki p rezentow ane ja k o w artości średnie analizow ane były testem t-S tu d e n ta a odchylenie sta n d a rd o w e nie przek raczało 5% .
O M Ó W IE N IE W Y N IK Ó W
N a podstaw ie przeprow adzonych b ad ań w ykazano aktyw ność tra n sie ra z S -glutationow ych w lim focytach nie po dd an y ch działan iu IF O w sto su n k u d o dw óch substratów : C D N B i D C N B . Z aobserw ow ano różnice w aktywności G S I w zależności od badanej frakcji i stosow anego su b stratu .
W p rzy p ad k u m ikrosom alnych G ST aktyw ność w obec C D N B w y no siła 22 + 1 (/¿m ol/m g b ia łk a /m in ), n a to m ia s t w s to s u n k u d o D C N B 17 + 0.5 (/¿m ol/m g b iałk a/m in ). A ktyw ność G S T we frakcji cytozolow ej o trzy m an o tylko w stosunku do C D N B , w ynosiła o n a 35 ± 0 .5 (/¿m ol/m g białk a /m in).
U zyskane wyniki są porów nyw alne z doniesieniam i literatu ro w y m i d o tyczącym i aktyw ności G S T we frakcji cytozolow ej ko m ó rek lim foidalnych człow ieka, k tó ra w obec C D N B w ynosiła 43 + 4 (¿umol/mg b iałk a/m in ) [10], ja k rów nież z oznaczeniam i aktyw ności G S T różnych tk a n e k człow ieka
w sto su n k u do tych su b strató w [13].
Z aobserw ow any b ra k aktyw ności cytozolow ych G S T w obec D C N B jest n a jp ra w d o p o d o b n ie j sp o w o d o w an y b rakiem izonezym ów w ykazujących ak tyw ność w sto su n k u do tego su b stratu . T o spostrzeżenie p o tw ierd zają rów nież d an e literaturow e [14], poniew aż nie stw ierdzono dotych czas a k tyw ności cytozolow ych G ST wobec D C N B . W yższa aktyw n ość G S T frakcji cytozolow ej w p o ró w n an iu z m ik ro so m aln ą w sto su n k u do C D N B m oże być wynikiem specyficzności G ST m ikrosom alnych. O prócz tego w a rto podkreślić, że w szystkie klasy tran sferaz S -glutationow ych w ykazują wyższą ak tyw ność wobec C D N B niż D C N B [12].
P rzep ro w ad zo n e b a d a n ia w ykazały, że insektycydy fo sfo ro o rg an iczn e w yw ierają wpływ n a aktyw ność enzym atyczną G S T lim focytów krw i o b w odow ej świni (rys. 1-4). N a podstaw ie otrzym anych w yników stw ierdzono o gólnie tendencję w zro sto w ą aktyw ności G S T w zależności od daw k i insektycydu i czasu inkubacji (rys. 5-10).
Z m iany aktyw ności G ST w przy p ad k u m ety lo p ara tio n u obserw uje się ju ż po jednej godzinie inkubacji z tym insektycydem . W ydłużenie tego czasu pow oduje dalszy w zrost aktyw ności enzym u. A k tyw ność m ik ro so m aln y ch G S T w obec C D N B po inkubacji 1-, 2-, 6-, 18-godzinnej z m ety lo p ara tio n e m w daw ce 50 fiM w ynosiła odpow iednio: 35,2; 47,1; 49,1; 52,3 (/zm ol/m g b iałka/m in); (rys. 5), n ato m iast w sto su n k u d o D C N B 31,2; 36,1; 38,8; 41,3 (/¿m ol/m g b ia łk a /m in ) (rys. 6). W tych sam y ch w a ru n k a c h ak ty w n o ść cytozolow ych G ST w obec C D N B w ynosiła 52,8; 67,4; 69,1; 71,1 (/im ol/m g białk a/m in ) (rys. 10).
0 10 50 100 0 10 50 100
CDNB DCNB
R ys. 1. Z m ia n y a k ty w n o śc i en zy m aty czn ej G S T we frak c ji m ik ro s o m a ln e j p o in k u b ac ji z m a ta tio n e m □ 1h M 2h 6h ■ 18h 10 50 CDNB 10 50 DCNB 120
R y s. 2. Z m ia n y a k ty w n o ści enzym atycznej G S T we frak cji m ik ro s o m a ln e j p o in k u b ac ji z p a ra tio n e m m etylow ym
CDNB DCNB
R ys. 3. Z m ian y aktyw ności enzym atycznej G S T we frakcji cytozolow ej p o inkubacji z m atatio n em
□ 1h » 2h fi 6h m 18h !8h 0 10 50 CDNB 10 50 DCNB 120
Z m iany aktyw ności enzym atycznej G S T we frakcji cytozolow ej p o inkubacji z p a ratio n e m m etylow ym
-m - Kontrola Dawka 10 —A— Dawka 50 Dawka 120
godziny inkubacji
R ys. 5. Z m ia n y a k ty w n o śc i enzym atycznej G S T we frak cji m ik ro s o m a ln e j p o in k u b ac ji z p a ra tio n e m m etylow ym C D N il Kontrola Dawka 10 —A— Dawka 50 Dawka 120 godziny inkubacji
R y s. 6. Z m ia n y ak ty w n o śc i enzym atycznej G S T we frak cji m ik ro s o m a ln e j p o in k u b ac ji z p a ra tio n e m m etylow ym D C N B
A k ty w n o ś ć u m o l/m g P /m in ¡s A k ty w n o ś ć u m o l/ m g P /m in -m - Kontrola Dawka 10 —A— Dawka 50 Dawka 120 godziny inkubacji
i. 7. Z m ian y aktyw ności G S T we frakcji m ikrosom alnej p o in kubacji z m elatio n em C D N B
40 r 30 25 20 15 10 5 --0 -I---1---1---1---1---1---1---1---1---1 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 godziny inkubacji Kontrola Dawka 10 - A - Dawka 50 Dawka 120
-m - Kontrola Dawka 10 - ń - Dawka 50 Dawka 120
godziny inkubacji
R ys. 9. Z m ia n y aktyw ności G S T we frakcji cytozolow ej p o in k u b acji z m a ta tio n e m C D N B
Kontrola Dawka 10
-ćx- Dawka 50 Dawka 120
godziny inkubacji
R ys. 10. Z m iany aktyw ności enzym atycznej G S T we frakcji cytozolowej p o inkubacji z p a ratio n em m etylow ym C D N B
W p rzyp ad k u m alatio n u nic obserw uje się żadnych zm ian po inkubacji 1- i 2-godzinnej, lecz d o p iero po 6- i 18-godzinnej. A kty w n ość m ik ro som alnych G S T w obec C D N B po 6 i 18 godzinach ink ub acji z m alatio - nem w daw ce 50/zM w ynosiła o d p o w ied n io 25,5; 37,2 (¿¿mol/mg b ia ł k a /m in ) (rys. 7), n a to m ia st w obec D C N B w tych sam ych w a ru n k a c h inkubacji w ynosiła 20,1 i 28,1 (/¿mol/mg b iałka/m in ) (rys. 8). A k tyw no ść cytozolow ych G ST w obec C D N B przy 6- i 18-godzinnej ink ub acji z m ala- tionem w daw ce 50/iM osiągała w artości 39,9; 56,2 (//m ol/m g b iałk a/m in ) (rys. 9).
O trzym ane wyniki są zgodne z wcześniejszymi obserw acjam i dotyczącym i toksyczności tych insektycydów [5, 10, 14, 15, 18, 19], M a la tio n należący d o najm niej toksycznych IF O wywołuje w zrost aktyw ności G ST po dłuższym czasie działania, podczas gdy w przyp adku m e ty lo p a ra tio n u w ykazującego w iększą toksyczność zm iany aktyw ności enzym u (G S T ) uczestniczącego w detoksykacji insektycydów widoczne są ju ż po k ró tk im czasie działan ia.
N a p o dstaw ie b a d a ń stw ierdzono rów nież, że w raz ze w zrostem daw ki IF O rośnie aktyw ność tran sferaz S-glutationow ych. W p rz y p ad k u m ik ro som alnych G S T w obec C D N B po 18-godzinnej ink ub acji z m alatio n em w daw k ach 10, 50, 100 /¿M aktyw ność w ynosiła odpo w ied nio 27,4; 37,1; 46,2 (/¿m ol/m g białka/m in), n ato m iast po 18-godzinnej inkubacji z m etylo- p aratio n em w daw k ach 10, 50, 120/iM w ynosiła 30,3; 52,3; 59,9 (¿¿mol/mg białka/m in). T e wyniki są potw ierdzeniem zależności w zro stu aktyw ności G S T o d sto p n ia toksyczności IF O (rys. 7 i 6).
Stw ierdzone w pracy zm iany aktyw ności G ST p o działan iu insektycydów fo sforoorganicznych są zgodne z w ynikam i wcześniejszych b a d a ń w pływ u ty ch zw iązków n a aktyw ność w tk an k ac h szczura - w ą tro b ie, n erkach , śledzionie i m ózgu [17]. L IT E R A T U R A [1] B ł a s i a k J., K l e i n w a c h t e r V., W a l t e r Z. , Z a l u d o w a R . (1997), C u rre n t T o p ics in B iophys., 21, (1), 13-16. [2] B ł a s i a k J., K l e i n w a c h t e r V., W a l t e r Z. , Z a l u d o w a R. (1995), N a tu rfo s c h ., 50, 820-823. [3] B ł a s i a k J., K l e i n w a c h t e r V., W a l t e r Z., Z a l u d o w a R . (1996), Pol. S tu d ., 5, (2), 5 -8 . [4] B ł a s i a k J., T r z e c i a k A. , J a ł o s z y ń s k i P., S z y f t e r K . , O s i e c k a R. , B ł a s z c z y k A. , J a ł o s z y ń s k i P., T r z e c i a k A. , S z y f t e r K . (1997), Cell. M o l. Biol. L ett. 2, 389-397.
[5] C z a j k o w s k a A. , W a l t e r Z. (1980), H um . G en et. 56, 189-194.
[6] C z e r s k i P., S z m i e g i e l s k i S., L i t w i n J. (1966), V ox S ang., 11, 734-737. [7] H a b i g W . H „ P a b s t H. J., J a k o b y W . B. (1974), J. Biol. C hem ., 249, 7130-7139.
[8] H u n t S. V. (1987), [w:] L ym p h o cytes apracical approach, ed. C. C . B. K l a u s , IR L P R E S S , 1-34. [9] J a c o b y W . B. (1985), M eth o d s in E n z y m o l, 113, 495-495. [10] K a p l o w i z N , S p i m a C , G r a h a m M , K u h l e n k a m p J. (1978), B iochem . 169, 465-470. [11] W i s z k o w s k a H , K u l a m o w i c z I , M a l i n o w s k a A , W a l t e r Z , (1986), E nvironm . R es., 41, 372-377.
[12] M i k s a c k a R ., 1988, Postępy Biochem ii, 34, 47-57.
[13] M i t c h e l l A. E , M a r i n D , L a k r i t z J , J o n e s A. D , B iochem . J , (1997), 325 ( P il) , 207-216.
[14] R i c c i G. B e l l o U. L., C a c c u r i A. M. , P a s t o r e A , N u c c e t e l l i M , P a r k e r M. W ., Biol. C hem ., 270, 1243-1248.
[15] W a l t e r Z. (1997), Ekologia. J e j zw ią zk i z różnym i dziedzinam i wiedzy, red. A. K u r n a t o w s k a , P W N W arszaw a.
[16] W a l t e r Z , C z a j k o w s k a A , L i p e c k a K. (1980), H u m . G e n e t , 53, 375-381. [17] W a l t e r Z., J a s i c k i P , Z a s t a w n y T. H „ (1989), Buli. Soc. Sci. Ł ó d ź, (21), (1-10). [18] W a l t e r Z. , W i s z k o w s k a H. (1990), F E B S L etl., 346, 26-31.
[19] W a l t e r Z., (1994), Białka kom órek prawidłowych i patologicznych, Ł T N , Ł ódź, 118, 151-171. [20] W i a d e r k i e w i c z R. , W a l t e r Z ., (1990), A cta U niv. L odz. F o lia B iochem . Biophys.
7, 27-40.
[21] W o j t y s i a k M. , W a l t e r Z., (1989), Buli. Soc. Sci. Ł ódź, 19, 1-10.
W p ły n ęło d o R ed ak cji K a te d ra G en ety k i M o le k u la rn ej
F o lia bio ch im ica et biop h y sica U n iw e rsy tet Ł ó d zk i
24.04.1998
M agdalena W o jty sia k-S ta n ia szczyk, M arzena P rzepiórkiew icz, Z o fia W alter
T H E E F F E C T O F IF O O N T H E A C T IV IT Y O F M IC R O S O M A L A N D C Y T O S O L IC G L U T H A T H IO N E S -T R A N S F E R A S E IN P IG L Y M P H O C Y T E S
T h e effects o f o rg a n o p h o s p h o ru s insecticid es (IF O ), o n th e a ctiv ity o f g lu th a th io n e S -tran sferase (G S T ) o f p ig lym phocytes were investigated. A ctivity o f m icro so m al G S T w ith b o th C D N B an d D C N B as su b stra tes w as observed, activ ity o f cytosolic G S T only with C D N B . A fte r in cu b a tio n o f lym focytes w ith IF O (m alath io n and m e th y lp ara th io n ), activ ity o f G S T w as increased. T h e observed changes w ere d ep en d en d on th e s tru c tu re o f tested co m p o u n d s, its d o se an d tim e in cu b a tio n .
