Izabela Steinka, Patrycja Kornaga
WPŁYW WODNYCH ROZTWORÓW CZYSTKA NA LICZEB-NOŚĆ KOMÓREK
SZCZEPU S. AUREUS ATCC 25923
Katedra Towaroznawstwa i Zarządzania Jakością Uniwersytetu Morskiego w Gdyni Kierownik: prof. dr hab. P. Przybyłowski
Skład chemiczny czystka powoduje, że znajduje on zastosowanie w leczeniu układu pokarmowego, w tym biegunek bakteryjnych. Celem pracy była ocena wpływu wodnych roztworów czystka szarego (Cistus incanus) na redukcję ko-mórek szczepu Staphylococcus aureus ATCC 25923. Wodne roztwory czystka powodowały redukcję początkowej liczby komórek gronkowców od 6 do 100%. Czas był istotnym czynnikiem wpływającym na poziom redukcji S. aureus.
Słowa kluczowe: czystek szary, właściwości biostatyczne, S. aureus ATCC 25923. Keywords: Cistus incanus, biostatic properties, S. aureus ATCC 25923.
Czystek jest rośliną, która zyskała znaczenie jako suplement diety z uwagi na obecność licznych związków o charakterze prozdrowotnym. Do takich należy pra-wie pięćdziesiąt substancji o cechach flawanoli i flawonoidów (1). Wśród flawono-idów wymieniane są: rutyna, mirycetyna, kwercetyna i kamferol. Polifenole obecne w liściach to m.in. galokatechina, katechina czy galusan galokatechiny. Z uwagi na znaczną zawartość polifenoli, czystek uważany jest za roślinę o wysokich właści-wościach antyoksydacyjnych i stosowany w profilaktyce chorób nowotworowych. Antynowotworowe właściwości czystka stwierdzono m.in. w badaniach na komór-kach rakowych piersi, szyjki macicy i prostaty (2). Niektórzy autorzy podkreślają także jego znaczenie w profilaktyce antymiażdżycowej (3). Z danych zawartych w piśmiennictwie wynika, że czystek wykazuje również istotne działanie leczni-cze w stosunku do układu pokarmowego, co powoduje możliwość jego stosowania w biegunkach (1). Oprócz działania związanego z neutralizacją wolnych rodników, czystek jest uznawany za roślinę o cechach grzybobójczych, przeciwwirusowych i antybakteryjnych. Przy istotnych działaniach detoksykacyjnych istnieje niewiel-ka liczba danych na temat jego działania w stosunku do bakterii, których toksyny obecne w przewodzie pokarmowym odznaczają się zarówno krótkim czasem in-kubacji zatrucia, jak i znaczną dynamiką ustępowania objawów zatrucia. Dotych-czas prowadzono badania nad aktywnością antydrobnoustrojową różnych gatunków
czystków, mniej uwagi poświęcając ocenie wielkości hamowania rozwoju populacji gronkowców przez gatunek Cistus incanus.
Celem pracy była ocena wpływu wodnych roztworów czystka szarego (Cistus incanus) na liczebność komórek szczepu Staphylococcus aureus ATCC 25923.
MATERIAŁ I METODY
Do badań wykorzystano suszone liście czystka Cistus incanus pochodzące od różnych producentów. Wstępne badania związane z oznaczeniem naturalnego za-nieczyszczenia czystka gronkowcami i określenie liczby bakterii mezofilnych tleno-wych prowadzono z użyciem ziela pochodzącego od sześciu producentów, oznaczo-nych jako I-VI. Analizę mikrobiologiczną przeprowadzono wg normy PN-EN ISO 6888-1:2001 i PN-EN-ISO 4833:2004. W celu oceny biostatycznych właściwości czystka zastosowano szczep gronkowca gatunku S. aureus ATTC 2952 z amerykań-skiej kolekcji drobnoustrojów-ATCC. Produkty wyznaczone do drugiego etapu ba-dań zawierały 100% ziela Cistus incanus i pochodziły z firm-Biofix, Bio-Planet, Ap-teo Natura i Intenson. Do badań zastosowano hodowlę bulionową S. aureus ATCC 25923 o inokulum od 7,82 log jtk/ml do 8,34 log jtk/ml. Inokulum oznaczano po posiewaniu 1 ml kolejnych rozcieńczeń hodowli bulionowej na podłożu Baird-Par-kera firmy bioMerieux i inkubacji przez 48 godz. w temp. 37°C. W dalszym etapie do 9 ml hodowli bulionowej S. aureus dodawano 1 ml wodnego roztworu czystka. Roztwór sporządzano przez zmieszanie 10 g suszu z 90 ml płynu izotonicznego. Próbki do dalszych oznaczeń pobierano po 30 i 120 min przechowywania w temp. 37°C, a następnie po rozcieńczeniu posiewano i inkubowano w temp. 37°C przez 48 h na podłożu Baird-Parkera.
Obiektywizację zmian liczby komórek gronkowców prowadzono poprzez zasto-sowanie analizy statystycznej, za pomocą programu Microsoft Excel 2010. Wyzna-czono równania korelacji liniowej i współczynniki determinacji R2do oceny wpływu
czasu interakcji roztworów czystka z gronkowcami na zmiany liczby ich komórek. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE
Badania zanieczyszczenia czystka gronkowcami wykazały, że żadne z dostęp-nych na rynku ziół nie wykazywało niezgodności w zakresie wymagań zawartych w Farmakopei Polskiej XI. Obecności gronkowców koagulazododatnich nie stwier-dzono w żadnej próbce ziela czystka w 1 g (tab. 1). Ogólna liczba bakterii mezo-filnych tlenowych wahała się od 2,72 log jtk/g do 4,65 log jtk/g. Wielkość popu-lacji tych bakterii nie przekraczała dopuszczalnego limitu ustalonego na 107 jtk/g.
Stwierdzono, że zanieczyszczenie ziela czystka pochodzącego z upraw ekologicz-nych wykazywało większy stopień zanieczyszczenia tymi bakteriami w porównaniu z produktami pozostałych firm H, I i FV (tab. 1).
Z uwagi na nieobecność S. aureus w każdej badanej próbce czystka, do dalszych analiz dotyczących właściwości biostatycznych wybrano po dwa rodzaje ziół pocho-dzących z upraw tradycyjnych i ekologicznych, oznaczone symbolami AN, I, BP i BF.
Tabela 1.Wybrane wyróżniki mikrobiologiczne preparatów Cistus incanus dostępnych na krajowym rynku. Table 1. Selected microbiological characteristics of the herb Cistus incanus available on the domestic market.
Rodzaj czystka preparatu Symbol S. aureus (log jtk/g)Liczba komórek mezofilnych tlenowychOgólna liczba bakterii (log jtk/g)
Czystek Herbapol H nb 2,72
Czystek BioPlanet BP nb 4,39
Czystek BioFix BF nb 4,11
Czystek Apteo Natura AN nb 4,39
Czystek Intension I nb 2,53
Bio czystek organiczny
Herba Nord Pol HNP nb 4,65
Czystek Farm Vit FV nb 3,48
Wyniki uzyskane w dalszym etapie badań wykazały, że zdolności inhibicyjne liści czystka w roztworze wodnym są zróżnicowane w zależności od rodzaju producenta. Zioła powodowały hamowanie liczby S. aureus średnio o 7,34 log jtk/ml dla produk-tów firmy BP i AP oraz o 0,21 log jtk/ml dla liści firmy I (ryc.1). Równania korelacji liniowej wskazywały na istotny wpływ czasu wspólnej inkubacji hodowli bulionowej S. aureus z roztworem czystka. Stwierdzono, że w przypadku ziół firmy BP czasem interakcji można było tłumaczyć redukcję 74,3% (R2 0,743) liczby gronkowców.
Za-leżne od czasu interakcji bakterii z ziołami firmy AP było 83,6% zmian liczby S. au-reus ATCC 25923 (tab. 1).
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
susz BP susz I susz AP susz BF 7,34 7,34 7,34 8,34 7,4 6,08 6,48 6,67 0 7,23 0 8,38 log jtk/cm3 Rodzaje czystka 0 30 120
Ryc. 1. Zmiany liczby gronkowców podczas interakcji. Fig. 1. Changes in staphylococci count during interaction.
Zioła pochodzące z firmy I nie przyczyniały się do istotnych statystycznie zmian liczby S. aureus. Nie stwierdzono korelacji liniowej między czasem interakcji a wielkością populacji po 120 min oddziaływania. Zachowanie S. aureus podczas wspólnej inkubacji z czystkiem dobrze opisywało równanie kwadratowe wskazują-ce na działanie innych poza czasem czynników powodujących zmiany liczebności populacji gronkowców (tab. 2).
Tabela 2. Wpływ czasu interakcji S. aureus ATCC 25923 z roztworem wodnym Cistus incanus. Table 2. Effect of interaction time of S. aureus ATCC 25923 with an aqueous solution of Cistus incanus.
Producent ziela Równanie korelacji liniowej i wielomianowe opisujące zmiany liczby gronkowców Współczynnik determinacji R2
BP N = -3,67x + 12,25 0,743
AP N= -3,67x + 11,94 0,836
BF N = x2 - 4x + 11,4 1,0
I N = -0,055x + 6,993 0,006
N = 1,205x2 – 4,875x + 11,01 1,0 N- liczba S. aureus ATCC 25923 x- czas interakcji
Podobne wyniki uzyskano w badaniach, w których zastosowano czystek firmy BF. Rezultaty pozwoliły na stwierdzenie, że w pierwszej fazie interakcji, po 30 min, zachodziła redukcja liczby S. aureus pod wpływem wodnego roztworu czystka do-chodząca do 1,73 log jkt/ml. Przechowywanie mieszaniny przez kolejne 90 min powodowało wzrost populacji o 1,71 log jtk/ml (ryc. 1). W tym przypadku zacho-wanie populacji S. aureus w obecności wodnego roztworu czystka dobrze opisywało równanie kwadratowe, świadczące o braku liniowej zależności między czasem in-kubacji a liczbą komórek S. aureus (ryc. 1, tab. 2).
Doniesienia innych autorów odnośnie biostatycznych właściwościowości czyst-ka są zgodne co do wpływu składników tej rośliny na drobnoustroje (7-13). Badania potwierdziły, że Cistus sp. odznacza się wyższą aktywnością hamującą w stosunku do bakterii niż do grzybów (7). Obserwowano również skuteczność działania in-hibicyjnego w stosunku do bakterii gram-dodatnich, a w szczególności S. aureus i S. epidermidis. Zwrócono uwagę na istotne znaczenie części rośliny oraz gatunku czystka na hamujące oddziaływanie w stosunku do bakterii (8). Zahamowanie wzro-stu S. aureus MIC (Minimal Inhibition Concentration) w przypadku zastosowania liści przekraczały 1,5 mg/ml, natomiast strefa zahamowania rozwoju gronkowców przez kwiaty wymagała od 1,5 do ponad 3 mg/ml, w zależności od gatunku czystka. Badania Guvenc i współpr. (9) potwierdziły różnice w oddziaływaniu na drob-noustroje ekstraktów olejowych w porównaniu z wodnymi. Strefy hamowania S. aureus przez olejki pochodzące z różnych gatunków Cissus sp. wahały się od 8 do
14,5 mm. Średnica zahamowania tych bakterii przez roztwory wodne, pochodzące z liści badanych gatunków, obejmowała zakres od 12 do 15 mm.
MIC stwierdzone w doświadczeniach Thielmann i współpr. (10) dla olejowych ekstraktów liści i łodyg gatunku Cisus landaniferus to nawet 400 μg/ml, świadczące o słabszych właściwościach hamujących frakcji olejowych.
Bouamama i współpr. (11), badając hamowanie bakterii przez ekstrakty z ziela czystka na bazie octanu etylu, acetonu czy alkoholi, takich jak metanol czy etanol, wykazali, że ekstrakt metanolowy był najbardziej skuteczny w hamowaniu gron-kowców. Wartość MIC dla S. aureus była 2-4 krotnie wyższa niż ta wyznaczona dla Pseudomonas aeruginosa, ale jednocześnie 2-krotnie niższa w porównaniu z uzyskaną dla S. typhi. Świadczy to o uwarunkowaniu zdolności biostatycznych ziela zarówno od sposobu ekstrakcji, jak i od testowanego gatunku czystka.
Wrażliwość gronkowców na działanie czystka jest też cechą zależną od gatun-ków czystka i testowanych szczepów gronkowców. Badania Mahmoudi i współpr. (12) potwierdziły biostatyczne właściwości wodnych ekstraktów liści czystka także w stosunku do szczepu S. aureus 29213.
Inni autorzy wyznaczyli najmniejsze stężenie hamujące MIC dla gronkow-ców po interakcji z ekstraktami liści takich gatunków czystka jak: C. saliviifolias i C. monspeliensis i uzyskali wartość 1,56 mg/ml, podczas gdy najmniejsze stęże-nie bakteriobójcze ekstraktów z obu gatunków wynosiło 3,125 mg/ml (8). Strefy zahamowania wzrostu gronkowców przez wodne ekstrakty wahały się w zależ- ności od stężenia liści w tych roztworach i wynosiły od 13 do 20 mm (13). Mak-symalna wartość MIC była obserwowana dla rozcieńczeń czystka od 1 do 2 v/v, a minimalna dla proporcji od 1 do 8 v/v. Już jednak olejowy ekstrakt liści czystka gatunku Cistus ladanifens testowany w tym doświadczeniu był zdolny do hamo-wania metycylinoopornych gronkowców MRSA dopiero przy wartości MIC wyno-szącej 50 μg/ml. W zależności od stopnia ekstrakcji, minimalne stężenie hamujące MIC dla szczepów gronkowców meticylino-opornych MRSA 13199 i MRSA 12673 wynosiło 4 mg/ml.
Dane zawarte w piśmiennictwie dotyczące innego gatunku czystka wskazują na wysoką aktywność hamowania wzrostu komórek bakterii S. aureus przez wodne ekstrakty pochodzące z Cistus ladaniferus (14). Autorzy tłumaczą to wysokim stę-żeniem fenoli i flawonoidów w fazie wodnej oraz znaczną wrażliwością bakterii gram-dodatnich wynikającą z budowy ściany komórkowej tych mikroorganizmów.
Szczep zastosowany w niniejszych badaniach nie syntetyzuje enterotoksyn. Jed-nakże to liczebność komórek S. aureus wpływa na możliwość wywoływania rze-komobłoniastego zapalenia jelita grubego po długotrwałym narażeniu organizmu na obecność gronkowców. W literaturze przedmiotu brak jest danych dotyczących wielkości redukcji liczby S. aureus przez wodne roztwory czystka. Prezentowane w piśmiennictwie dane związane z MIC i strefami zahamowania gronkowców przez wodne ekstrakty czystka odzwierciedlają jedynie możliwy kierunek interakcji.
Wyniki uzyskane w naszych badaniach wskazywały na zróżnicowane działanie substancji ekstrahowanych z czystka podczas pierwszych 30 min interakcji
roztwo-rów wodnych z S. aureus ATCC 25923. W zależności od kraju pochodzenia zie-la czystka (producenta czy firmy dystrybucyjnej), dalsze zmiany liczby popuzie-lacji S. aureus ATCC 25923 między 30 a 120 min były zależne od rodzaju zastosowanego produktu.
Jest to prawdopodobnie wynikiem zróżnicowanego stężenia związków występu-jących w suszach czystka stosowanych w niniejszych badaniach. Dotyczy to takich substancji jak: apigenina, kamferol, karwakrol i tymol, uważanych za substancje o charakterze antybakteryjnym. Ich stężenie było prawdopodobnie odmienne w pro-duktach oferowanych przez różnych producentów.
WNIOSKI
1. Zanieczyszczenie bakteriami mezofilnymi tlenowymi i gronkowcami suszo-nych liści Cistus incanus dostępsuszo-nych w handlu nie przekraczało graniczsuszo-nych warto-ści zawartych w Farmakopei Polskiej XI.
2. Właściwości biostatyczne czystka były ściśle uzależnione od pochodzenia zie-la stosowanego do badania, tj. od producentów i konfekcjonerów.
3. Czas był istotnym czynnikiem wpływającym na poziom redukcji liczby komó-rek S. aureus w przypadku produktów BP i AP.
4. Obserwowana redukcja liczby komórek S. aureus ATTC 25923 po 2 godz. interakcji między wodnym roztworem ziela czystka i gronkowcami wahała się od 6,1 do 100% początkowej wielkości populacji.
I . S t e i n k a , P. K o r n a g a
INFLUENCE OF AQUEOUS CISTUS SOLUTIONS ON THE NUMBER OF S. AUREUS ATCC 25923 CELLS
S u m m a r y
Introduction. The chemical composition of the cistus makes it useful in the treatment of the digestive
system, including bacterial diarrhea.
Aim. Aim of the study was to evaluate the effect of Cistus incanus aqueous solutions on the reduction
of the population of Staphylococcus aureus ATCC 25923.
Material and methods. Six products from various distributors and packers were tested for the
pres-ence of staphylococci and for the determination of the number of aerobic mesophilic bacteria and staphy-lococci. A broth culture of S. aureus ATCC 25923 with an inoculum of 7.82-8.34 log cfu/ml was used for the study. The analysis was performed after 30 and 120 minutes of storage of the mixture of cistus solution and staphylococcal culture at 37° C. The samples were incubated after these times in Baird-Parker RPF medium at 37°C for 48 h.
Results. Cistus samples taken for testing were characterized by microbiological contamination not
exceeding the limits contained in the Polish Pharmacopea. Cistus water solutions reduced the number of S. aureus, depending on the producer, from 6 to 100%.
Conclusion. Time was a significant factor in the level of S. aureus reduction. Different biostatic
PIŚMIENNICTWO
1. Kubica P., Ekiert H., Ekiert R.J., Szopa A: Gatunki rodzaju Cistus sp. – taksonomia, występowan-ie, skład chemiczny, aplikacje terapeutyczne i badania biotechnologiczne. Post Fitoter., 2016; 17(3): 179-188. – 2. Stępień A., Aebisher D., Bartusik-Aebisher D: Biological properties of Cistus species, Eur. J. Clin. Exp. Med., 2018;16(2):127–132. – 3. Kuchta A., Konopacka A., Waleron K., Viapiana A., Wesołowski M., Dąbkowski K., Ćwiklińska A., Mickiewicz A., Śledzińska A., Wieczorek E., Gliwińska A., Kortas-Stempak B., Jankowski M.: The effect of Cistus incanus herbal tea supplementation on oxida-tive stress markers and lipid profile in healthy adults. Cardiology J., 2019; 40,20(10): 1–9. – 4. PN-EN ISO 6888-1:2001 Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzontalna metoda oznaczania liczby gronkowców koagulazo-dodatnich (Staphylococcus aureus i innych gatunków. Część I. Metoda z zastosowaniem poży-wki agarowej Baird –Parkera. – 5. PN-EN-ISO 4833:2004 Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzontalna metoda oznaczania liczby drobnoustrojów. Metoda płytkowa w temperaturze 30 stopni C. – 6. Farmakopea Polska. Wydanie X. Polskie Towarzystwo Farmaceutyczne. Warszawa 2014. – 7. Viapiana A., Konopacka A., Waleron K., Wesolowski M.: Cistus incanus L. commercial products as a good source of polyphe-nols in human diet. Industrial Crops & Products, 2017; 107: 297-304. – 8. Rebaya A., Souad I., Ham-mrouni S., Maaroufi A., Ayadi M., Chérif J.: Antibacterial and Antifungal Activities of Ethanol Extracts of Halimium halimifolium, Cistus salviifolius and Cistus monspeliensis, Int. J. Pharm Clin. Res., 2016; 8(4): 243-247. – 9. Guvenc A., Yıldız S., Özkan A.M., Erdurak C.S., Coşkun M., Yılmaz G., Okuyama T., Okada Y: Antimicrobiological Studies on Turkish Cistus. Species, Pharmaceutical Biology., 2005; 43(2): 178–183. – 10. Thielmann J., Muranyi P., Kazman P.: Screening essential oils for their antimicrobial activities against the foodborne pathogenic bacteria Escherichia coli and Staphylococcus aureus, Heliyon, 2019; 5(6): 1-6.
11. Bouamama H., Noel T., Villard., Benharref A., Jana M.: Antimicrobial activitiesof the leaf ex-tracts of two Moroccan Cistus L. species, J. Ethnopharmacol., 2006; 104: 104–107. – 12. Mahmoudi H., Aouadhi C., Kaddour R., Gruber M., Zargouni Z., Zaouali W., Ben Hamida N., Ouerghi Z., Hosni K.: Comparison of antioxidant and antimicrobial activities of two cultivated Cistus species from Tunisia, Biosci. J., Uberlândia, 2016; 32(1): 226-237. – 13. Benayad N., Z. Mennane Z., Charof R., Hakiki A., Mo-saddak M.: Antibacterial activity of essential oil and some extracts of Cistus ladaniferus from Oulmes in Morocco. J. Mater. Environ. Sci., 2013; 4 (6):1066-1071. – 14. Benali T., Chtibi H., Booouyahya A., Khab-bach A., Hammani K.: Detection of antioxidant and antimicrobial activites in phenol components and essential oils of Cistus landaniferus and Mentha suaveolens extracts. Biomed. Pharm. J., 2020; 13(2):1-6.
