78 L. Czerwiecki, G. Wilczyńska
te c h n o lo g ic z n e j, kiedy istn ieje n ie b ez p ie c z e ń stw o u b y tk u , n ie k ied y b a rd z o znacznego, n a tu ra ln e j w ita m in y C. D la te g o te ż n ie z b ę d n e są m e to d y an a lity c z n e u m o żliw iające o z n a c z e n ie je j z a w arto śc i w p ro d u k ta c h spożyw czych. N ie k tó re z m e to d p o zw alają o zn a cz y ć kw as L -ask o rb in o w y , in n e n a to m ia s t łą c z n ą z a w a rto ść kw asów L -askorbi- n o w eg o (A A ) i d e h y d ro a sk o rb in o w e g o (D H A A ). K lasyczna m e to d a m ia re c z k o w a wg T illm ansa [19] p o le g a n a u tle n ie n iu kw asu ask o rb in o w e g o za p o m o c ą 2,6-d ich lo ro - fe n o lo in d o fe n o lu ; m e to d ę tę w y k o rzy stan o te ż w P olskiej N o rm ie [17]. W p rzy p a d k u o z n a c z a n ia całk o w itej za w arto śc i w itam in y C, kw as d e h y d ro a sk o rb in o w y re d u k u je się n a jp ie rw d o kw asu L -a sk o rb in o w eg o . S ia rk o w o d ó r sto so w a n y ja k o r e d u k to r w orygi n aln ej w ersji te g o p o stę p o w a n ia [19] stw a rz ał w iele n ie d o g o d n o śc i; je d n a z p o d s ta w o w ych w ad te g o o d czy n n ik a, to je g o m a ła w ybiórczość ja k o re d u k to r a , co stanow i przyczynę b łę d ó w p o d c z a s o z n a cz an ia.
D o innych, b a rd z ie j now oczesnych m e to d o z n a c z a n ia w itam in y С n a le ż ą m e to d y e le k tro c h e m ic z n e [6], s p e k tro fo to m e try c z n e [1, 16, 18], flu o ry m etry cz n e [5], w reszcie m e to d y z z a sto so w a n ie m te stó w enzym atycznych [3] o ra z m e to d y p o łą cz o n y ch te ch n ik p rzepływ ow ej analizy nastrzykow ej i sp e k tro fo to m e te rii [12].
W y so k o sp ra w n a c h ro m a to g ra fia cieczow a (H P L C ) [7, 8, 9, 11, 13, 20], n ależy bez w ą tp ie n ia d o c o ra z częściej w ykorzystyw anych te c h n ik analitycznych sto so w a n y ch do o z n a c z a n ia w ita m in y С w różn y ch p ro d u k ta c h spożyw czych. D o je j z a le t n ale ż ą : w ysoka specyficzność, czu ło ść i ła tw o ść w y k o n an ia analizy. K o rz y sta jąc z tej te c h n ik i a n a li tycznej m o ż n a sto so w a ć ró ż n e d e te k to ry np.: flu o ry m etry czn y , e le k tro c h e m ic z n y , am - p e ro m e try c z n y o ra z d e te k to r U V [8].
H P L C w o d w ró c o n y m u k ła d z ie faz, ta k ż e z z a sto so w a n ie m p a r jo n o w y ch lu b na k o lu m n a c h am inow ych z d e te k to r e m U V , um o żliw ia b e z p o ś re d n io ła tw e i szybkie o z n a c z e n ie całk o w itej za w arto śc i kw asu L -a sk o rb in o w eg o p o o d p o w ie d n io p rz e p ro w a d zo n e j re d u k c ji je g o form y d e h y d ro za p o m o c ą np. d itio tre ito lu [8, 9] czy D L -h o m o - cysteiny [11]. M ożliw e je s t ró w n ież ró w n o c ze sn e o z n a c z e n ie z a ró w n o kw asu a s k o rb i n o w eg o (A A ) ja k i d e h y d ro a sk o rb in o w e g o ( D H A A ) p o p rz e k sz ta łc e n iu te g o o sta tn ie g o z a p o m o c ą d ic h lo ro w o d o rk u fen y le n o d ia m in y w p o c h o d n ą silniej a b s o rb u ją c ą U V (3 -(l,2 -d ih y d ro k sy e ty lo )fu ro [3 ,4 -b ]c h in o k sa lin o -l-o n ) [7].
C e le m nin iejszej p rac y było o p ra c o w a n ie no w o czesn ej m e to d y o z n a c z a n ia w itam in y С w p rz e tw o ra c h ow ocow ych i w arzyw nych ta k ich ja k soki, n a p o je i n e k ta ry , n a k tó re sy stem a ty cz n ie ro śn ie p o p y t w k raju . W ym óg d e k la ro w a n ia p rz e z p ro d u c e n ta n a o p a k o w an ia ch w ym ien io n y ch p ro d u k tó w zaw arto ści tej w itam in y p rz e m a w ia d o d a tk o w o za p o d ję c ie m tej tem aty k i.
N a p o d sta w ie p rz e g lą d u lite ra tu ry i w łasnych b a d a ń w stęp n y ch za n a jo d p o w ie d n ie jsz ą u z n a n o m e to d ę o z n a c z a n ia całkow itej zaw arto ści w itam in y С ja k o kw asu ask o rb in o w e g o te c h n ik ą w yso k o sp raw n ej c h ro m a to g ra fii cieczow ej (H P L C ) w o d w ró c o n y m u k ła d z ie faz, z d e te k c ją w U V i d o d a tk ie m D T T (d itio tre ito l) ja k o czynnika re d u k u ją c e g o .
M ATERIAŁY I M ETODYKA W y p o s a ż e n i e
Wykorzystano chrom atograf cieczowy firmy Milton-Roy/LDC Analytical złożony z następujących elementów: pompy izokratycznej Constam etric III, detektora UV Spectro-M
oni-tor 3100, zaworu dozującego Rheodyne 731 z pętlą o pojemności 20 /xl, kolumny chrom atogra ficznej Nova Pak RP-C18, W aters z przedkolum ną o analogicznych właściwościach. Pracę zesta wu kontrolowano za pomocą kom putera z programem sterującym i integracyjnym Axxiom727. Do rejestracji chromatogramów wykorzystano drukarkę Epson LX-400.
Stosowano ponadto: generator ultradźwięków Btichler, wagę analityczną WA34, wytrząsarkę laboratoryjną Lab-line Instrum ents Inc, mikrostrzykawkę Hamilton poj. 100 ц1, sączki Schotta G-2 z zestawem do sączenia pod zmniejszonym ciśnieniem oraz typowe szkło laboratoryjne takie jak: kolby miarowe, pipety, cylindry miarowe, kolby EHenmayera, lejki szklane.
O d c z y n n i k i i m a t e r i a ł y p o m o c n i c z e
1. W oda redestylowana znad 0,5 g КМПО4 i 5 g N aO H (na każde 2 litry wody destylowanej), 2. roztwór Carreza I: K4[Fe(CN)6] x 2 H 2O o stężeniu 3,6g/100 ml wody, 3. Roztwór Carreza II: ZnS04 x 7 H 2O o stężeniu 7,2g/100ml wody, 4. Fosforan potasowy I zasadowy (K H 2P O 4) cz.d.a., POCh Gliwice, 5. 1,4-ditio-DL-treitol (DTT) 99%, Lancaster, 6. Wzorzec kwasu L-askor- binowego, A nalar BDH, 7. Roztwory robocze kwasu L-askorbinowego w zakresie stężeń 0,005-0,020 mg/ml z dodatkiem 0,1% DTT.
Z a s a d a m e t o d y
Zasada metody polega na oznaczeniu łącznej zawartości kwasów: L-askorbinowego i dehyd- roaskorbinowego w badanej próbce [8, 9]. Kwas dehydroaskorbinowy redukowany jest do kwasu L-askorbinowego za pomocą ditiotreitolu. Witamina С oznaczana jest techniką wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) z zastosowaniem kolumny RP-C18 i detektora U V (X 254
O b r ó b k a w s t ę p n a b a d a n e g o m a t e r i a ł u
Soki: 1 ml soku (bezpośrednio po otwarciu opakowania) pobierano do kolby miarowej poj. 25 ml, do której uprzednio odważano 25 mg DTT i rozpuszczano w 10 ml wody. Zawartość kolby mieszano w łaźni ultradźwiękowej w czasie 15-20 sekund. Próbkę klarowano dodając po 0,1 ml roztworów Carreza I, II, następnie uzupełniano wodą do kreski i ponownie mieszano w łaźni ultradźwiękowej. Tak przygotowaną próbkę przechowywano przez 2 godziny bez dostępu światła w tem peraturze pokojowej. Bezpośrednio przed wykonaniem analizy chromatograficznej próbkę przesączano przez bibułę.
Nektary i soki przecierowe (o zwiększonej zawartości miąższu): Próbkę nektaru (1 ml) wytrząsano przez 30 min na wytrząsarce mechanicznej przy amplitudzie 2,5 x 100 RPM w 25 ml kolbce miarowej z dodatkiem 25 mg DTT i 20 ml wody. Kolbkę zabezpieczano folią aluminiową przed dostępem światła. Dalej postępowano jak z próbkami soków.
P r z y g o t o w a n i e k r z y w e j w z o r c o w e j
Odważano 5 mg kwasu L-askorbinowego i rozpuszczano w wodzie w kolbie miarowej o po jemności 100 ml. N astępnie pobierano po 1, 2 i 3 ml tak przygotowanego roztworu do kolb miarowych pojemności 10 ml, do których dodawano po 10 mg DTT. Zawartość kolb uzupełniano wodą do kreski i mieszano w łaźni ultradźwiękowej. Stężenie tak przygotowanych wzorców wynosiło: 0,005; 0,10 i 0,015 mg/ml. Roztwory przed wykonaniem analizy chromatograficznej przechowywano przez 2 godziny bez dostępu światła.
W y s o k o s p r a w n a c h r o m a t o g r a f i a c i e c z o w a
Analizę chrom atograficzną próbek wykonywano w tem peraturze otoczenia (20-25°C). Fazę rozwijającą stanowił 0,5% roztwór wodny KH2PO4 z dodatkiem 0,1% D TT dozowany z prędkoś cią przepływu 0,3 ml/min. Pomiaru absorbancji w UV dokonywano przy długości fali X 254 nm. W analogicznych warunkach chrom atografowano roztwory wzorcowe witaminy C.
Zawartość witaminy С w mg/ml próbki obliczano z krzywej wzorcowej za pomoc:| program u komputerowego wykorzystującego następujący wzór:
80 L. Czerwiecki, G. Wilczyńska
w którym:
См - stężenie witaminy С w roztworze wzorcowym (mg/ml) P - powierzchnia piku witaminy С w próbce badanej Pst - powierzchnia piku witaminy С w roztworze wzorcowym Vk - końcowa objętość próbki po rozcieńczeniu (ml) V - objętość próbki pobrana do analizy (ml).
W YNIKI I ICH O M Ó W IEN IE
W b a d a n ia c h w stę p n y ch n a ro z tw o ra c h w zorcow ych w itam in y С o k re ś lo n o w aru n k i re d u k c ji kw asu d e h y d ro a sk o rb in o w e g o o ra z w aru n k i w yso k o sp raw n ej c h ro m a to g ra fii cieczow ej. S tw ie rd z o n o , że o p ty m a ln y czas red u k c ji w ynosi 2 godziny.
Z a n ajo d p o w ie d n ie jsz y e lu e n t u z n a n o 0,5% ro ztw ó r w o d n y K H 2P 0 4 z d o d a tk ie m 0 ,1 % D T T . P rzepływ cieczy z p rę d k o śc ią 0,3 m l/m in o k a z a ł się o p ty m a ln y , co p o tw ie r d z o n o ró w n ież w p rz y p a d k u analizy p ró b e k fo rtyfikow anych w ybranych d o b a d a ń p ro d u k tó w . Ś re d n i czas re te n c ji kw asu a s k o rb in o w e g o w ynosił w e w sp o m n ia n y ch w a ru n k a c h 7,7 m in u ty . N a rye. 1 p rz e d sta w io n o p rzykładow y c h ro m a to g ra m kw asu a s k o r b in o w e g o w b a d a n e j p ró b ce .
P rz y d a tn o ść o p isa n e j p ro c e d u ry an ality czn ej d o o z n a c z a n ia w itam iny С w poszczeg ó ln y ch ro d z a ja c h p ró b e k sp ra w d z o n o fo rty fik u jąc p ró b k i soków , p rz e cieró w i n e k ta ró w o k reślo n y m i p o z io m a m i w itam in y C. W p rz y p a d k u p ró b e k zaw ie rających w ita m in ę C , odzysk m e to d y o k re śla n o w sto s u n k u d o te o re ty c z n ie ob liczo n ej za w a rto śc i w ita m in y sta n o w iąc ej su m ę jej o z n a c z o n e g o s tę ż e n ia i p o z io m u fortyfikacji, p rzy jm u jąc tę w a rto ść za 100% . D la o k re śle n ia śre d n ie g o odzysku i p o w tarz aln o śc i p o s tę p o w a n ia a n a lity cz n eg o w y k o n an o se rie o z n a c z e ń za w arto śc i w ita m in y С w p ró b k a c h h an d lo w y ch p rze tw o ró w ow ocow ych, ow ocow o-w arzyw nych i w arzyw nych. W ta b e la c h I - I I z e b ra n o w sp o m n ia n e p a ra m e try . Ja k w ynika z d an y c h zaw artych w ta b e la c h , śre d n i odzysk w itam in y С w a h a ł się w g ra n ic a c h o d 92 d o blisk o 103% w z a le żn o śc i o d ro d za ju p ró b k i i p o zio m u fortyfikacji. W z g lę d n e o d c h y le n ie s ta n d a r do w e (w sp ó łczy n n ik z m ie n n o śc i) w ynosiło 0 ,4 5 -4 ,3 2 % .
P o zio m y fortyfikacji (d la soków ow ocow ych 0,10 m g/m l i 1,00 m g/m l soku o ra z dla n e k ta r u i soku p o m id o ro w e g o 0,05 m g/m l i 0,50 m g/m l so k u ) d o sto s o w a n o d o ilości w ita m in y С d e k la ro w a n e j n a o p a k o w a n iu p rz e z p ro d u c e n ta . W szystkie o z n a c z e n ia w y konyw ano w 6-ciu p o w tó rz e n ia c h .
W a rto śc i odzysku w ita m in y С z p ró b e k tak ich p ro d u k tó w ja k m .in.: soki ow ocow e, le m o n ia d a , u zy sk an e p rze z a u to ró w prac, n a któ ry ch o p ie ra n o się p o d c z a s o p ra c o w y w a n ia m e to d y o z n a c z a n ia w itam iny С [8, 9] w ynosiły 9 0 -1 0 6 % , a w ięc były p o ró w n y w alne.
W celu o b ie k ty w n eg o w yzn aczen ia g ranicy w ykryw alności i o z n a cz aln o ści m e to d y za sto so w a n o p o stę p o w a n ie wg H adricha i w sp. [10] sta n o w ią c e m o d y fik a cję p r o c e d u ry z a le c a n e j p rz e z D IN o ra z D e u ts c h e F o rsc h u n g sg e m e isc h a ft ( D F G ). W y k o n a n o w ięc p o 3 ró w n o leg łe o z n a c z e n ia zaw arto ści w itam in y С w e w zm o cn io n y m so k u jabłkow ym
Oznaczanie witaminy С 81
Ryc. 1. Chrom atogram próbki soku z czarnej porzeczki oraz wzorzec witaminy С o stężeniu 0,005 mg/ml
Chrom atogram s o f black currant juice sample and vitamin С standard (C = 0,005 mg/mgl)
00 to
T a b e l a I . Odzyskiwalność i precyzja m etody na przykładzie soku pom idorowego i nektaru marchwiowo-pomarańczowego (n = 6 powtórzeń)
Recovery and precision o f the m ethod for tom ato juice and carrot-orange nectar (n = 6 paraleli determ inations)
SD - odchylenie standardow e
RSD - względne odchylenie standardow e (współczynnik zmienności)
L . C z er w ie c k i, G . W il cz y ń sk a N r 1
T a b e l a I I . K ryteria dla m etod analitycznych stosowanych w urzędowej kontroli C riteria for analytical m ethods using in official control
00 L*J js jr 1 O zna czanie w ita m in y С
Oznaczanie witaminy С 85
Rye. 2. Krzywe odzysku witaminy С z soku jabłkowego Recovery curves o f vitamin С for apple juice
Objaśnienia: G02 graficzne odwzorowanie granicy oznaczalności metody T a b e l a I I I . Zestawienie niektórych statystycznych danych metody
Some statistical data of the method
Sx - odchylenie standardowe dla wszystkich poziomów fortyfikacji, Sy - odchylenie standardowe krzywej regresji,
Ykiyt - maksymalna, graniczna wartość sygnału detektora dla próbki nie zawierającej nznaczanej substancji,
G»i - granica wykrywalności odpowiadającą wartości ykryi,
Gw2 - właściwa granica wykrywalności czyli najniższe stężenie witaminy C, dające się jakościo wo wykryć z praw dopodobieństwem 95%,
Goi - granica oznaczalności czyli najniższe stężenie analizowanej substancji, dla którego syg nały będą zawsze wyższe niż w przypadku wartości G W2,
86 L. Czerwiecki, G. Wilczyńska
W NIOSKI
O p is a n a m e to d a o z n a c z a n ia w itam in y С w so k a c h ow ocow ych i w arzyw nych o ra z w n e k ta r a c h c h a ra k te ry z u je się d o b ry m i p a r a m e tr a m i śre d n ie g o odzysku, p recyzji i ozna- cz aln o ści, co w p o łą c z e n iu z p r o s to tą w y k o n an ia p o zw a la n a jej w y k o rz y sta n ie w a n a liz ie ru ty n o w ej.
L . C z e r w i e c k i , G . W i l c z y ń s k a
D E TE R M IN A T IO N O F VITAM IN С IN SELECTED F R U IT AND V EG ETA B LE PRO DU C TS
Summary
A simple m ethod was described to determ ine vitamin С as L-ascorbic acid (after reduction of dehydroascorbic acid by means of dithiothreitol) in fruit juices, fruit and vegetable-fruit nectars. Ascorbic acid was analyzed by RP-HPLC technique with UV detection (254 nm).
The average recovery of ascorbic acid was 92-103% and limits of identification and detection were 0,003 and 0,009 mg/ml of products respectively.
PIŚM IENNICTW O
1. Anw ar J., Farooqi M.I., Nagra S.A. i wsp.: A new m ethod for spectrofotom etric determ ina tion of ascorbic acid. J. Chem Soc. of Pakistan, 1990, 12, 75-79.
2. Belitz H.D., Grosch W.: Vitamine w : Lehrbuch der Lebensmittelchem ie, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, 1987, 323-338.
3. Casella L., Gullotti М., Morchesini i wsp.: Rapid enzymatic m ethod for vitamin С assay in fruits and vegetables using peroxidase. J. Food Sci., 1989, 54, 374-375.
4. Charleux J.L.: Beta-carotene, antioxidant vitamins and their role in preventive nutrition. R eprint from F IE Conference Proceedings, 1992, 1.
5. Chung H.K., Ingle J.D.(Jr): Fluorimetric kinetic m ethod for the determ ination o f total ascorbic acid with o-phenylenediamine. Anal. Chim. Acta, 1991, 243, 89-95.
6. Craston D.H.: M icroband electrodes fabricated by screen printing processes: applications in electroanalysis. Talanta, 1991, 38, 17-26.
7. Dodson K.Y., Young E.R., Soliman A .C .M .: D eterm ination of total vitamin С in various food matrixes by liquid chromatography and fluorescence detection. J. AOAC. Int., 1992, 75, 887-891.
8. Gókm en V., AcarJ.: D eterm ination of total vitamin С as ascorbic acid in foods using HPLC. E uro Food Chem, VIII, Vienna, 1995, 2, 345-348.
9. Gókm en V., AcarJ.-. A simple HPLC method for determ ination of total vitamin С in fruit juices and drinks. Fruit Process., 1996, 6, 198-201.
10. Hadrich J., Vogelgesang J. : Konzept 96 zur Erm ittlung von Nachweis, - Erfassungs - und Bestimmungsgrenze. Deutsch. Lebensm. Rdsch., 1996, 92, 341-350.
11. Hoare М., Jones S., Lindsay J.: Total vitamin С analysis of orange juice. Food Australia, 1993, 45, 341-345.
12. Jain A., Chaurasia A., Verma K.K.: D eterm ination of ascorbic acid in soft drinks, preserved fruit juices and pharmaceuticals by flow injection spectrometry: matrix absorbance corre ction by treatm ent with sodium hydroxide. Talanta, 1995, 42, 779-787.
13. Khaled M.Y.: Sim ultaneous HPLC analysis of L-ascorbic acid, L-ascorbyl-2-sulfate and L-ascorbyl-2-polyphosphate. J Liq. Chem. Rel. Technol., 1996, 19, 3105-3118.
14. Nadolna J.: W itam ina С w: Wybrane metody badania składu i wartości odżywczej żywności., ed. U. Rutkowska, PZW L, Warszawa, 1981, 291-298.
Oznaczanie witaminy С 87
15. Nisperos-Caniedo М., Busling B.S., Shaw P.E. : Simultaneous detection of dehydroascorbic, ascorbic and some organic acids in fruits and vegetables by HPLC. J. Agr. Food Chem., 1992, 40, 1127-1130.
16. Ózgur M. U., Sungur S .: Third order derivative spectrophotom etric determ ination of ascorbic acid in fruits and vegetables. Talanta, 1995, 42, 1631-1640.
17. Polska N orm a PN-90/A-75101/11. Przetwory owocowe i warzywne. Przygotowanie próbek i metody badań fizykochemicznych. Oznaczanie zawartości witaminy C, 1990, 1-5.
18. Srividya К., Balasubramanin N.: Indirect spectrophotom etric determ ination of ascorbic acid in pharmaceutical samples and fruit juices. Analyst, 1996, 121, 1635-1655.
19. Tillmans J., Hirsh P.\ Vitamin C. Biochem Z., 1932, 250, 312.
20. Vanderslice J.T., Higgs D.J.\ Q uantitative determ ination of ascorbic, dehydroascorbic, isoas- corbic, and dehydroisoascorbic acids by H PLC in foods and other matrices. J. Nutr. Biochem., 1993, 4, 184-190.
