OZNACZANIE ZAWARTOŚCI WITAMIN A I E METODĄ WYSOKOSPRAWNEJ CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ (HPLC) W WYBRANYCH PRODUKTACH SPOŻYWCZYCH

(1)

ŻYW NO ŚĆ 3(24) S u p i, 2000

JO A N N A SO B O LEW SK A , JA C E K RO ŻN O W SK I, TER ESA FO R TU N A

OZNACZANIE ZAWARTOŚCI WITAMIN A I E METODĄ WYSOKOSPRAWNEJ CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ (HPLC)

W WYBRANYCH PRODUKTACH SPOŻYWCZYCH

S t r e s z c z e n i e

W publikacji opisano oznaczanie zawartości podstawow ych form w itam in A i E w margarynie i kieł

basie pasztetow ej, przy w ykorzystaniu HPLC w odwróconym układzie faz, z zastosow aniem detektora UV-VIS. Zwrócono szczególną uw agę na wpływ sposobu przygotowania próbki na oznaczaną zawartość substancji (optym alizacja w arunków zmydlania). Dokonano statystycznego opracow ania wyników na przykładzie badanej m argaryny i w yznaczono w spółczynniki zmienności (RSD ) dla obu witamin.

Wstęp

P od określeniem w itam ina A rozum ie się dw ie grupy związków: w itam ina A! (re

tinol, daw niej zw any akseroftolem ), w itam ina A² (3,4-didehydroretinol; 3-dehydroreti

nol) w raz z ich biologicznie czynnym i izom eram i, pochodnym i aldehydow ym i, k w a

sow ym i i estrow ym i [^{1 1}],

M etody biologiczne oznaczania w itam iny A polegają na podaw aniu jej prepara

tów (w postaci prow itam in i w itam in) szczurom w ykazującym w yraźne objaw y hipo- w itam inozy. Z aletą tego postępow ania je st w szechstronna ocena preparatu, gdyż w yni

ki zależą nie tylko od aktyw ności składników preparatu, ale rów nież od ich przysw a- jalności [6], M etody fizykochem iczne stosow ane do oznaczania tej w itam iny są m eto

dami spektrofotom etrycznym i, fluorescencyjnym i lub chrom atograficznym i. W śród m etod opartych na pom iarze natężenia prom ieniow ania, najw iększą czułością charakte

ryzuje się m etoda fluorym etryczna ( l wzb = 480 nm) [⁶, 10], lecz w ym aga ona chrom a

tograficznego oczyszczenia próbki w celu usunięcia przede w szystkim barw ników

M gr J. Sobolewska, m gr J. Rożnowski, d r hab. T. Fortuna prof. AR, Z akład Analizy i O ceny Jakości Żywności, Wydział Technologii Żywności, A kadem ia Rolnicza im H ugona Kołłątaja w Krakowie, ał. 29 łistopada 46, 31-425 Kraków.

(2)

OZNACZANIE ZA WARTOŚCI WITAMINA I E METODĄ WYSOKOSPRÁ WNEJ CHROMATOGRAFII..

polienow ych. M etoda C arr-P rice’a oparta je st na reakcji w itam iny A i jej estrów z chlorkiem antym onu(III) [ 4 ,6 ,1 0 ] lub kw asem trichloro- lub trifluorooctow ym [⁶, ^{1 0}], w której następuje przesunięcie pasm a absorpcji w iązań podw ójnych, a p o w stający kom pleks m a szybko zanikające niebieskie zabarw ienie (λ = 620 nm). T rzy

krotnie mniej czu łą i w ym agającą znacznie bardziej czystych roztw orów je st m etoda pom iaru absorbancji próbki alkoholow ej (λ = 325 nm ) [4, 10], Znaczny w zrost czuło

ści następuje po uprzednim oczyszczeniu na kolum nie chrom atograficznej w odw róco

nym układzie faz. Zasada ta je st podstaw ą analizy chrom atograficznej w ykorzystującej detektor U V [⁶, 7],

N azw a w itam ina E obejm uje rodzinę tokoferoli, czyli m etylow anych pochodnych

[

11

]:

• tokolu (2-m etylo-2(4’ ^{, 8} ’, ^{1 2}’-trim etylotridecylo)-⁶-hydroksychrom anu),

• tokotrienolu (2-m etylo-2(4’,8 ’,1 2 ’-trim etylotridecylo-3’,7 ’,l 1 ’-trienylo)-6- hydroksychrom anu).

M etody biologiczne oznaczania w itam iny E polegają na podaw aniu sam icom szczurów , hodow anych na diecie bez tokoferolu, karm y zawierającej określoną ilość tej w itam iny. W przypadku gdy daw ka je st w iększa od pewnej w artości progow ej, ciąża przebiega i kończy się norm alnie. M etoda ta je st bardzo specyficzna i w ystar

czająco dokładna, chociaż bardzo czasochłonna [6]. Fizykochem icznym i m etodam i są:

spektrofotom etryczne oznaczanie czerw ono zabarw ionego kom pleksu Fe2+ (pow stają

cego w reakcji tokoferoli z F e3+) i 2 ,2 ’-bipirydylu (reakcja Em m erie-Engel) [4, 10], Stężenie kom pleksu je s t proporcjonalne do zaw artości tokoferolu. Po zastąpieniu bipirydylu b atofenantroliną (4,7-difenylo-l,10-fenantroliną), następuje zw iększenie czuło

ści m etody [10], M iareczkow anie czystego a-to k o fero lu m ożna prow adzić używ ając jako titranta alkoholow ego roztw oru siarczanu(V I) ceru(IV ) w obec difenyloam iny jak o w skaźnika [6], K oniec m iareczkow ania w skazuje pojaw ienie się niebieskiego zabar

wienia. A naliza próbek spożyw czych m usi zostać poprzedzona rozdzieleniem a-to k o fero lu od innych substancji tow arzyszących np. za pom ocą cieczowej chrom a

tografii kolum now ej, bibułow ej lub cienkow arstw ow ej. B ardzo przydatna je st m etoda HPLC, a rozdzielone zw iązki m ożna identyfikow ać kolorym etrycznie, spektro- fluorym etrycznie czy spektrofotom etrycznie [4, 6].

Analiza chromatograficzna

Ze w zględu na w łaściw ości fizykochem iczne w itam in A i E m ożliw e je st prze

prow adzenie rów noczesnej analizy obu w itam in stosując m etodę HPLC. Poniew aż w itam iny te są w yjątkow o w rażliw e na działanie światła, obecność tlenu, tem peraturę i środow isko zasadow e, od pierw szego etapu analizy należy zw racać szczególną uw agę

(3)

24 Joanna Sobolewska, Jacek Rożnowski, Teresa Fortuna

na sposób jej prow adzenia, aby nie przyczynić się do rozkładu substancji oznaczanych [9, 12].

Początkow o, przy użyciu alkoholow ego roztw oru w odorotlenku potasu o stężeniu 6 0-80% , prow adzi się zm ydlanie frakcji tłuszczow ej, w której w itam iny są rozpusz

czone [2, 9, 12]. C zęsto zalecane je st w ykonanie wcześniejszej ekstrakcji tłuszczu m etodą Soxhleta [8, 9, 12]. N ależy pam iętać o dodaniu przeciw utleniaczy, którym i m o g ą być: kw as askorbinow y, pirogallol, hydrochinon, BHT (butylohydroksytoluen).

Zalecane je st przeprow adzanie procesu zm ydlania w atm osferze gazu obojętnego [1, 2, 9, 12], N iektórzy autorzy podają, że czas zm ydlania pow inien w ynosić od 20 do 40 m inut w tem peraturze 70°C [4, 12], a naw et wyższej. Inni zaś tw ierdzą, że w arunki te są zbyt agresyw ne i zalecają zm ydlanie w tem peraturze pokojow ej przez całą dobę [1, 1 2].

Po etapie uw olnienia w itam in z próbki przeprow adza się ich ekstrakcję. N ajczę

ściej używ a się heksanu, chloroform u, eteru etylow ego lub nafty. W celu usunięcia resztek m ydeł, po zebraniu ekstraktu przem yw a się go w odą, do m om entu, aż w oda po płukaniu nie będzie w ykazyw ała odczynu zasadow ego (nie zabarw i fenoloftaleiny) [1 ,4 , 12]. N astępnie ekstrakt w itam in zagęszcza się na w yparce próżniow ej. O statecz

nie pozostałość po destylacji rozpuszcza się w niewielkiej ilości fazy ruchom ej.

N ow oczesne m etody przygotow ania próbki, do których należy ekstrakcja do fazy stałej (SPE) p ozw alają na elim inację procesu zm ydlania [2], D zięki tem u m ożna ozna

czyć rów nocześnie w szystkie form y w olnych witam in, w tym także ich form y estrowe.

Do oznaczenia w itam in A i E m ogą służyć zestaw y do H PLC , pracujące zarów no w norm alnym układzie faz (NP) lub w odw róconym układzie faz (RP) [9, 10, 12], W tych pierw szych, fazę ruchom ą stanow i heksan - często z dodatkiem chloroform u i zw iązku bardziej polarnego np. 2-propanolu lub m etanolu. Fazę ruchom ą m ogą tw o

rzyć m ieszaniny: heksan : 2-propanol (99,5 : 0,5) [7, 9], heksan : chloroform (85: 15) [13]. W przypadku odw róconego układu faz, eluentem m oże być m etanol lub jego m ieszanina z wodą, acetonitrylem , kw asem octow ym [1, 9, 14]. Do detekcji używ a się najczęściej detektorów U V -V IS [ 1 , 3 ,7 , 8 ,1 2 ] oraz spektrofluoroscencyjnych [9], a dla bardzo niskich stężeń - elektochem icznych [²],

Material i metody badań

M ateriałem badaw czym były m argaryna Flora w yprodukow ana przez U nilever P olska S.A. oraz kiełbasa pasztetow a z Zakładów M ięsnych „IG A R ” w Rabce. Z a

w artość analizow anych w itam in A i E oznaczono przy użyciu zestaw u do w ysoko

sprawnej chrom atografii cieczowej firmy M erck H itachi w odw róconym układzie faz przy użyciu kolum ny LiChrosfer®100 (250x4,6 nm ) z przedkolum ną. D etekcję spektrofotom etryczną do oznaczania w itam iny A w ykonano przy długości fali λ = 325 nm,

(4)

OZNACZANIE ZAWARTOŚCI WITAMIN A I E METODĄ WYSOKOSPRAWNEJ CHROMATOGRAFII...

a w przypadku w itam iny E - λ = 290 nm. Jako eluentu użyto m etanolu (czystość do HPLC firm y M erck) o szybkości przepływ u 2 m l/m in. A nalizą w ykonano w tem pera

turze pokojow ej. Substancjam i użytym i do w ykonania krzywej kalibracyjnej były czy

ste chem icznie form y w itam in o największej aktyw ności biologicznej: trans-retinol (Sigm a min. 95% ) - w zorzec w itam iny A i a-to k o fero l (Sigm a m in. 95% ) - w zorzec w itam iny E.

Do analizy ilościowej zastosow ano m etodę w zorca zew nętrznego, nastrzykując kolejno m etanolow e roztw ory oznaczanej w itam iny w daw kach o rosnącym stężeniu w zakresie 3,12-5-500,00 μg/cm³ dla w itam iny A. D la w itam iny E zakres stężeń w ynosił 6,25+1000,00 μg/cm 3. Postępow anie takie pozw ala w yznaczyć funkcyjną zależność pow ierzchni pod pikiem chrom atograficznym , od stężenia odpow iedniej w itam iny w próbce.

Przygotow anie próbki gotowej do nastrzyku składało się z następujących etapów:

izolacji w itam in w procesie zm ydlania, ekstrakcji, zagęszczania próbki i odpow iednie

go rozcieńczenia analitu.

N a etapie zm ydlania potraktow ano próbkę alkoholow ym roztw orem w odorotlen

ku potasu z dodatkiem hydrochinonu jak o przeciw utleniacza, w ytrząsano z częstotli

w ością 150 obr/m in w tem peraturze 45°C przez 60 min, po czym podniesiono tem pe

raturę do 70°C i zm ydlano do m om entu uzyskania jednorodnej m ieszaniny. Po ostu

dzeniu zm ydlonej próbki do tem peratury pokojow ej, prow adzono trzykrotnie ekstrak

cję m ieszaniną h e k sa n : chloroform (2:1; v/v). W celu usunięcia m ydeł, otrzym any ekstrakt przepłukano 3 -4 razy w odą destylow aną w ytrząsając go w rozdzielaczu. E ks

trakt osuszono z pozostałości w ody sącząc go pod próżnią przez sączek Schotta w y pełniony bezw odnym siarczanem (V I) sodu. N astępnie odparow ano rozpuszczalnik w rotacyjnej w yparce próżniow ej w tem peraturze 50°C. Zagęszczony ekstrakt w itam ino

w y odpow iednio rozcieńczono w m etanolu i przesączono przez karbow any sączek z bibuły (prod. PO C h - o średniej szybkości sączenia) do kolby m iarow ej. T ak przygo

tow any ekstrakt nastrzykiw ano na kolumnę.

Wyniki i dyskusja

Sporządzone krzyw e kalibracyjne pozw alają określić czasy retencji analizow a

nych w itam in oraz w yznaczyć w spółczynniki korelacji liniowej.

Zakres liniow ości krzyw ych kalibracyjnych (rys. 1) ze w spółczynnikam i korelacji R > 0,99 dla w itam iny A w ynosi 3,12-5-500,00 μg/cm 3, a dla w itam iny E 6,25-5-1000,00 μg/cm 3. Czas retencji w zorca w itam iny A w ynosi 2,00 m in, a w itam iny E 5,20 min.

Typow e chrom atogram y substancji w zorcow ych przedstaw iono na rys. 2.

(5)

Rys. 1. Krzywe kalibracyjne: 1 - trans-retinolu (λ = 325 nm), 2 - a-tokoferolu (λ = 290 nm).

absorbancja jest wyrażona w jednostkach napięcia [mV] sygnaiu analogowego w ysyłanego na rejestrator.

Fig. 1. Calibration curves: 1 - axophterol (λ = 325 nm), 2 - α -tocopherol (λ = 290 nm).

absorbance was expressed as voltage unit [mV] o f an analog signal sent to data recorder.

Rys. 2. Chrom atogram y wzorców: 1 - trans-retinolu (λ = 325 nm), 2 - oc-tokoferolu (λ = 290 nm).

Fig. 2. H PLC chrom atograms o f standards: 1 - axophterol (λ = 325 nm), 2 - α -tocopherol (λ = 290 nm).

(6)

Rys. 3. Chromatogram ekstraktu witam iny E z margaryny (λ = 290 nm): 1 - optym alne warunki zmydlania, 2 - nieoptym alne w arunki zmydlania.

Fig. 3. HPLC chrom atogram o f vitam in E extract from margarine (λ = 290 nm): 1 - optimal saponifi

cation conditions, 2 - unoptimal saponification conditions.

D ostępne m etody oznaczania w itam in A i E m etodą HPLC w układzie odw róco

nych faz p od ają czas retencji dla w itam iny A w zakresie 0,95-:-5,5 m in, natom iast dla w itam iny E - 1,3+19,0 m in [1, 9, 10]. R ozpiętość czasów retencji je s t dość duża, co jest szczególnie w idoczne w przypadku w itam iny E. Fakt ten m ożna tłum aczyć stoso

w aniem rozm aitych eluentów , zaw ierających różne proporcje w ody, m etanolu, a naw et acetonitrylu [1, 3, 7, 8, 9, 13].

O znaczona zaw artość w itam iny A w badanej m argarynie w ynosiła 924 μg/100 g, w kiełbasie pasztetow ej 3256 μg/100 g, natom iast zaw artość w itam iny E odpow iednio:

31 m g/100 g i 0,24 mg/łOOg. W yniki zaw artości w itam in A i E w m argarynie porów nano z ilościam i deklarow anym i przez producenta na opakow aniu (tab. 1). Porów nano je także z w artościam i podanym i w tabelach składu i w artości odżyw czych [5], które w odniesieniu do 100 g m argaryny wynoszą: 600 μg w itam iny A oraz 31,51 m g w itam i

ny E. W tablicach brak jest pozycji "kiełbasa pasztetow a". Poniew aż składa się ona głów nie z podrobów i w ątroby w ieprzow ej, tę ostatnią przedstaw iono poniżej; opisana w ątroba zaw iera średnio około 2931 μg w itam iny A (w artość bliska w oznaczonej próbce) oraz 0,11 m g w itam iny E (wartość dw ukrotnie niższa od oznaczonej) [5].

(7)

N a podstaw ie siedm iu pow tórzeń analizy m argaryny (od etapu pobrania próbki, do w łaściw ego oznaczenia chrom atograficznego) oszacow ano precyzję m etody. U zy

skane w yniki pozw oliły w yznaczyć odchylenia standardow e s oraz w zględne odchyle

nia standardow e (w spółczynniki zm ienności) RSD. W yniki zestaw iono w tab. 1.

T a b e l a 1

D eklarow ane na opakowaniu i średnie oznaczone zawartości w itam in A i E w margarynie, wraz z odchy

leniami standardow ym i i współczynnikami zmienności.

Declared at consum er package and mean chrom atographically determined contents o f vitamins A and E in margarine, their standard deviations and coefficients o f variation.

Substancja oznaczana Component

Zawartość / Content Odchylenie standardowe Standard deviation

(•s)

W spółczynnik zmienności Coefficient o f variation

(RSD) [%]

deklarowana declared

oznaczona determined witam ina A

vitam in A

^ g / 100g]

900 924 72,80 7,88

witam ina E vitam in E [m g/100g]

26 31 2,35 7,55

Podczas analizy chrom atogram ów zw rócono uw agę na w pływ w arunków zm y

dlania, na w y znaczoną zaw artość w itam in. O brazuje to rys. 3. C hrom atogram 1. (za

znaczony linią ciągłą) obrazuje analizę próbki zm ydlanej w tem peraturze 45°C przez 60 min. Po tym czasie tem peraturę podniesiono do 70°C, a proces został zakończony po uzyskaniu jednorodnej m ieszaniny. N atom iast chrom atogram 2. (zaznaczony linią przeryw aną) został w ykonany dla próbki zm ydlanej przez dłuższy okres czasu (pow y

żej 1,5 godziny), w tem peraturze powyższej 70°C. Czasy retencji dla odpow iadających sobie pików w obu przypadkach są takie same, natom iast zm ieniają się proporcje ich w ielkości (3,8 : 1 w przypadku a-tokoferolu). Sugeruje to pow staw anie tych sam ych produktów , lecz w innych proporcjach. W przypadku oznaczania w itam iny A prow a

dzenie analizy w w arunkach niepraw idłow ych skutkuje zm niejszeniem w ielkości piku o 42%.

N a chrom atogram ie w itam iny E oprócz piku charakterystycznego dla tej w itam i

ny (tret = 5,2 m in), w idoczny je st pik w itam iny A (tret = 2 min). N iestety, z pow odu obecności w ielu innych pików o podobnych czasach retencji ( t = 1,2 - 2,5 min) nie m ożna określić jednoznacznie stężenia retinolu przy tej długości fali (λ = 290 nm).

(8)

OZNACZANIE ZAWARTOŚCI WITAMINA I E METODĄ WYSOKOSPRAWNEJ CHROMATOGRAFII.

Wnioski

1. A daptow ana m etoda oznaczania w itam in A i E, dzięki dobrej pow tarzalności i dokładności uzyskanych w yników , m oże znaleźć zastosow anie w ilościow ym oznaczaniu w itam in w produktach spożyw czych; decydujący w pływ na pow tarzal

ność w yników m a etap przygotow ania próbki.

2. D uży w pływ na oznaczaną zawartość w itam in A i E m a tem peratura i długość procesu zm ydlania próbki.

LITERATURA

[1] A lbala-Huratta S., Novella-Rodriguez S.: Determ ination o f vitamins A and E in infant milk formulae by high-performance liquid chrom atography. Journal o f Chromatography A, 778, 1997, 243.

[2] Delgado Zam arreno M ., Sanchez Perez A.: D eterm ination o f fat-soluble vitamins in yogurt by HPLC with electrochem ical detection. Talanta, 43, 1996, 1555.

[3] Hewavitharana A.: Simultaneus Liquid Chromatographic D eterm ination o f V itam ins A, E and β-carotene in Com m on D airy Foods. International Dairy Journal, 6 , 1996, 613.

[4] K rełow ska-K ułas M.: B adanie jakości produktów spożywczych. PWE, W arszawa 1993.

[5] Łoś-K uczera M. (red): Produkty spożywcze. Skład i wartość odżywcza. Instytut Żywności i Ż y

w ienia im. Prof. A. Szczygła, W arszawa 1990.

[6] M oszczyński P., Pyć R.: Biochem ia witamin. Część II. W itaminy lipofilne i kwas askorbinowy.

PW N, W arszawa, Łódź 1999.

[7] M ulhollard M ., D olphin R.: Analysis o f the fat-soluble vitamins using narrow bore high-performence liquid chrom atography w ith multichanel UV-VIS detection. Journal o f Chrom atography, 350, 1995, 285.

[8] Pikkarainen S., Parviainen M.: D eterm ination o f retinyl palm itate and total vitam in A content in liver and liver-based ready-to-eat foods. Journal o f Chromatography, 577, 1992, 163.

[9] Rizzolo A., Polesallo S.: Chromatographic determination o f vitamins in foods. Journal o f C hrom ato

graphy, 624, 1992, 103.

[10] Rutkow ska U. (red.): W ybrane metody badania składu i w artości odżywczej żywności. PZW L, W ar

szawa 1981.

[11] Sikorski Z. (red.): Chemiczne i funkcjonalne właściwości składników żywności. W NT, W arszawa 1996.

[12] Tyszkiew icz S. (red.): Postęp w analizie żywności. Tom I, W arszawa 1990.

[13] W idicus W ., K irk J.: H igh Pressure Liquid Chromatographic determ ination o f vitamins A and E in cereal products. Journal o f the A ssociation o ff Official A nalytical Chemists, 62, 1979, 637.

[14] V inäs P., Campillo N.: Liquid chrom atographic determ ination o f fat-soluble vitamins in paprica and paprica oleoresin. Food Chemistry, 45, 1992, 349.

(9)

30 Joanna Sobolewska, Ja c e k Rożnowski, Teresa Fortuna

DETERMINATION OF VITAMINS A AND E IN SOME FOOD PRODUCTS BY HIGH- PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

S u m m a r y

This paper describes the determ ination o f basic forms o f vitamins A and E in m argarine and liver sau

sage using reversed phase o f HPLC w ith UV-VIS detection. Special attention w as paid on influence o f sample preparation on appointed content o f substance (optimization o f saponification conditions). Also statistical data analysis, based on m argarine analysis and relative standard deviation (RSD ) for both vita

mins was perform ed. ||§