W pływ pH na efekt modulacji aktywności kanałów potasowych
K v l.3 przez jony cynku
A n drzej Teisseyre, Jerzy W. M ozrzym as
Akadem ia Medyczna we W rocławiu K atedra i Zakład Biofizyki
Streszczenie
Przy zastosow aniu techniki patch-clam p w konfiguracji whole-cell prowadzono badania nad wpływem zewnątrzkom órkowego pH na efekt m odulacyjny wyw ierany na kanały K vl.3 przez jo n y cynku. Stw ierdzono, że obniżenie pH z 7.35 do 6.8 spowodowało znaczące przesunięcie napięciow ej zależności aktywacji badanych kanałów w stronę dodatnich w artości potencjału błonowego oraz zm niejszenie szybkości ich aktywacji. S tw ierdzono też, że obniżenie pH z 7.35 do 6.8 nie miało istotnego wpływu na przesunięcie napięciowej zależności aktywacji kanałów K vl.3 w stronę dodatnich wartości potencjału błonowego, zm niejszenie am plitudy prądów potasowych oraz spowolnienie ich aktywacji zachodzące podczas aplikacji jon ów cynku w stężeniu 100 цМ. Całkowite przesunięcie napięciowej zależności aktywacji, jak rów nież spow olnienie szybkości aktywacji kanałów pod wpływem działania obydwu wyżej w spom nianych czynników było istotnie większe od zmian spowodowanych przez aplikację jonó w cynku bez zm iany pH. G eneralnie, otrzym ane wyniki pokazały, że addytywne efekty m odulacyjne w yw ierane na kanały K v l.3 przez jo n y cynku i protony m ogą zachodzić przy w artościach zew nątrzkom órkow ego pH i przy stężeniach jo nów cynku osiągalnych w w arunkach fizjologicznych.
Wstęp
W iadom o, że jo n y cynku w ystępują w centralnym układzie nerwowym, gdzie odgryw ają m iędzy innymi rolę m odulatorów aktyw ności elektrycznej neuronów [2,4]. Badania wykazały także, że jon y cynku m odulują aktywność kanałów jonowych, m iędzy innymi, kanałów potasow ych różnych typów [4].
Badania przeprowadzone w naszym laboratorium pozw oliły stw ierdzić
modulujący w pływ aplikacji jonó w cynku na aktywność kanałów potasowych typu K vl .3 [9]. Kanały te w ystępują w limfocytach T, ja k rów nież m.in. w neuronach m ózgowych [6,7]. Efekt modulacji polegał na przesunięciu
napięciowej zależności aktywacji i inaktywacji kanałów K v l.3 w stronę dodatnich w artości potencjału błonowego, znaczącym spow olnieniu kinetyki ich aktywacji oraz zm niejszeniu am plitudy prądów potasow ych w zależności od stężenia [9]. Przeprow adzone niedaw no przez nas badania nad wpływem pH na wyżej w spom niany efekt pozw oliły stwierdzić, że efekt m odulacji aktywności kanałów potasow ych K vl.3 przez jon y cynku nie zależy od wartości zewnątrzkom órkow ego pH [10] ani wewnątrzkom órkowego pH (wyniki nie publikow ane) w zakresie od 6.4 do 8.4. Stwierdzono także, że obniżenie zew nątrzkom órkow ego pH od 7.35 do wartości 6.4 pow odow ało przesunięcie napięciow ej zależności aktywacji badanych kanałów w stronę dodatnich wartości potencjału błonowego, spowolnienie kinetyki aktywacji prądów potasowych oraz zm niejszenie ich am plitudy, przy czym efekt ten był addytywny do efektu w ywieranego przez jony cynku (10]. Natom iast podw yższenie zewnątrzkom órkowego pH od 7.35 do 8.4 nie w pływ ało istotnie na aktyw ność kanałów K v l.3 [10].
Aby móc wnioskować o możliwym fizjologicznym znaczeniu
addytywnego efektu m odulującego wywieranego przez jo n y cynku i protony w kwaśnym pH zaistniała potrzeba przeprowadzenia doświadczeń w warunkach
fizjologicznych wartości pH oraz stężeń jo nó w cynku. Wartość
zew nątrzkom órkowego pH rów na 6.4 jest uważane za leżące poza zakresem fizjologicznym . Z tego względu przeprowadzono dodatkow o dośw iadczenia przy zewnątrzkom órkowym pH równym 6.8, które jest uważane za fizjologiczne w badaniach nad wpływem pH na blisko spokrewnione kanały potasowe K vl,5 [11]. Badania przeprow adzono przy stężeniu jon ów cynku równym 100 |iM , które leży w zakresie stężeń osiąganych w warunkach fizjologicznych w centralnym układzie nerwowym [2, 4].
Materiały i metody
Poniew aż kanały' potasowe K vl.3 w ystępują endogennie w dużej liczbie w limfocytach T, komórki te wykorzystywane były w naszych doświadczeniach jako układ modelowy. Dośw iadczenia prowadzono zarówno na komórkach izolowanych z krwi obwodowej dawców zdrowych przy zastosow aniu standardowej m etody w irow ania w gradiencie gęstości, ja k rów nież na komórkach linii kom órkowej Jurkat E6-1.
Badania prow adzono z użyciem techniki patch-clam p w konfiguracji whole-cell [3]. Skład roztworów użytych w doświadczeniach był następujący (stężenia w mM): roztw ór zewnątrzkomórkow y - 150 NaCl, 4.5 KC1, 1 CaCI2,
1 MgCI2, 10 H EPES, 10 Glukozy; pH=7.35 lub 6.8, roztwór
pH=7.2. S tandardow y protokół doświadczalny zawierał 7 impulsów napięciowych przykładanych co 20 inV w zakresie od - 6 0 mV do +60 mV, odstęp czasow y pom iędzy impulsami - 10 s; czas pojedynczego impulsu 40 ms, potencjał utrzym ania - 90 mV. Badania przeprow adzone uprzednio w naszym laboratorium wykazały, że prądy jonow e rejestrow ane w tych warunkach są związane z aktyw acją kanałów potasowych typu K v l.3 w lim focytach T [9]. Liniowa (om owska) składowa była odejm owana od m ierzonego prądu z zastosow aniem procedury P/4.
Param etrem opisującym napięciow ą zależność aktywacji badanych kanałów była w artość potencjału, przy którym połowa kanałów ulegała aktyw acji - V„. W artość tą obliczano z funkcji Boltzm anna opisującej
napięciow ą zależność znorm alizowanego przew odnictw a potasowego
limfocytów T: gK(V ) = g K , rax/ ( l + e x p - ( V - V „ ) / k „ ) ; gdzie: gK ITOX - m aksym alna wartość znorm alizow anego przewodnictwa potasowego (równa 1), V - potencjał błonowy, k„ - w spółczynnik nachylenia krzywej. Na rysunkach przedstaw iono przesunięcia wartości V„ pod wpływem zm iany pH oraz aplikacji jo nó w cynku w stosunku do wartości obliczonych przy pH=7.35 w nieobecności jonó w cynku. M iarą szybkości aktywacji kanałów była stała czasow a aktywacji t n obliczana ze wzoru: I(t) = 1„Шх[I-exp(-t/x„)]2; gdzie: I - wartość mierzonego prądu, Iniax - m aksym alna wartość prądu, t - czas. Stałą x„ obliczano dla wartości potencjału błonow ego równych 20, 40 oraz 60 mV. W celu bardziej czytelnego przedstaw ienia wyników na rysunkach przedstaw iono w zględne wartości x„. W artości te obliczono jako stosunek wartości x„ w danych warunkach eksperym entalnych do wartości obliczonej dla tej samej wartości potencjału przy pH równym 7.35 i w nieobecności jon ów cynku.
Wyniki przedstaw iono jako średnia arytm etyczna ± błąd standardowy. W szystkie dośw iadczenia wykonano w tem peraturze pokojowej (22-24 C). • U
'— ś
Wyniki i dyskusja
Przykładow e rejestracje prądów potasowych kanałów K vl.3
w lim focytach T w w arunkach kontrolnych oraz podczas aplikacji jonó w cynku w różnych wartościach zewnątrzkom órkow ego pH zostały przedstawione w pracach opublikow anych przez nas uprzednio [9,10].
Rycina 1 niniejszej pracy przedstawia przesunięcie wartości V n w stronę dodatnich wartości potencjału błonowego przy zm ianie pH z 7.35 do 6.8, podczas aplikacji jo nó w cynku w stężeniu 100 Ц.М przy pH=6.8 oraz obydwa czynniki razem wzięte. Zm iana pH powodowała przesunięcie wartości V n
R ye . 1. Prze sunięcie w artości V n pod wpływem zm iany w artości ze w ną trz kom órkow eg o pH z 7.35 do 6.8, po dc za s aplikacji jonów cynku w stężeniu 100 цМ przy pH = 6 .8 o raz prz ez obydw a czynniki razem . E ê u o <i>' Ф CL 30 25 20 10 5 -... •at **iliii > <« * pH=6.8 pH=7.3 I1-’" 1 Zn - 100 pM
R yc . 2. P rze su nięcie w artości V„ pod w pływ em aplikacji jo n ó w c ynku w stęże niu 100 (iM przy pH = 6.8 ora z pH = 7.35.
0 5.1610.4 mV (n=8), przesunięcie to jest statystycznie istotne (p<0.()5- test t-Studenta). Aplikacja jon ów cynku przy pH=6.8 powodow ała dodatkow o przesunięcie wartości V n o 23.56+0.5 mV (n= 8), natom iast całkow ita wartość przesunięcia pod wpływem obydwu czynników w ynosiła 28.72±0.6 mV (n=8) 1 była istotnie większa (p<0.05) od wartości otrzym anej podczas aplikacji jonów cynku. P rzesunięcie w artości V„ pod wpływem aplikacji jon ów cynku przy pH=6.8 było zbliżone do wartości przesunięcia przy pH=7.35, które wynosiło 22.8310.8 mV (n = 1 0,R y c. 2).
W iadom o, że aplikacja jo nów cynku powodowała rów nież zm niejszenie amplitudy prądów potasowych [9]. Badania wykazały, że aplikacja jo nó w cynku w stężeniu 100 цМ przy pH=6.8 powodowała zm niejszenie am plitudy prądów potasow ych zarejestrow anych przy potencjale +60 mV do 0.69±0.046 wartości kontrolnej (n=8). W artość ta była zbliżona do w artości otrzymanej podczas aplikacji jo nó w cynku w tym samym stężeniu przy pH=7.35 wynoszącej 0.74±0.03 (n=10, Ryc. 3). Natom iast samo obniżenie pH z 7.35 do 6.8 nie powodowało istotnego zm niejszenia amplitudy rejestrowanych prądów (wyniki nie zostały pokazane na rycinie).
1.0 o X 5 Q. *-§ 0.6 яг* o. -o E co QJ С ]g. 0.2 - O) 0.0 pH=6.8 pH=7.35 r ~ 1 Z n - 100 jiM
H yc. 3. W artość w zględn ej am p litud y prądów potas ow ych po dcza s a plika cji jo n ó w cynku w stężeniu 100 |iM przy pH = 6.8 ora z pH =7 .3 5.
Jak wiadom o, zarów no obniżenie wartości zew nątrzkom órkow ego pH jak też aplikacja jo nó w cynku powoduje spowolnienie szybkości aktywacji badanych kanałów. Rycina 4 przestawia względne wartości stałych czasowych aktywacji ( t „ ) prądów zarejestrowanych przy potencjałach błonowych +20, +40 oraz +60 mV. Obniżenie wartości pH z 7.35 do 6.8 spow odowało spow olnienie szybkości aktywacji kanałów, czego odzw ierciedleniem był wzrost względnych wartości t„ do poziom u 1.4-1.5 wartości kontrolnej. W zrost ten był niezależny od potencjału błonowego w zakresie od +20 do +60 mV i był na pograniczu istotności statystycznej (p=0.05). Aplikacja jo nów cynku w stężeniu 100 цМ
przy tej wartości pH powodowała dalszy wzrost względnej wartości T n aż do
poziom u 3.08-4.95 wartości kontrolnej w zależności od potencjału błonowego.
0).
20 mV 40 mV 60 mV
R y c. 4. W zg lędn e w artości x„ ob licz on e dla zm iany w artości zew n ątrzk om órko w e go pH z 7.35 do 6.8 (c zarny słupe k), po dcza s aplika cji jo n ó w cynku w stę żeniu 100 цМ prz y p H = 6.8 (jasny słupek) oraz p rze z ob yd w a czynn iki razem (szary słupek).
W zględna wartość x„ była największa dla potencjału równego +20 mV, zaś najm niejsza przy +60 mV. Spadek ten był spow odow any tym , że efekt spow olnienia szybkości aktywacji badanych kanałów w wyniku aplikacji jon ów cynku był zależny od wartości potencjału błonowego i m alał w raz ze wzrostem potencjału (Ryc. 4). Całkowity wzrost względnej wartości T„ pod wpływem zmiany w artości pH z 7.35 do 6.8 oraz aplikacji jo nów cynku w stężeniu 100 цМ był statystycznie istotnie większy (p<0.05) od wzrostu wartości
spowodow anego przez aplikację jo nów cynku bez zmiany pH. Porównano również względne wartości x„ obliczone podczas aplikacji jo nów cynku przy pH równym 7.35 oraz 6.8 (Ryc. 5). Jak widać, pewne różnice tych w artości przy pH równym 6.8 oraz 7.35 pojawiły się jedy nie przy potencjale błonowym równym +20 mV i w ynikały raczej z dużego rozrzutu wyników otrzym anych przy pH=6.8. Ponadto, przy potencjałach błonowych równych +40 oraz +60 mV względne w artości x„ obliczone dla obydwu w artości pH były niemalże identyczne. G eneralnie m ożna więc stwierdzić, że obniżenie pH z 7.35 do 6.8 nie wpływało na zw iększenie względnych wartości x„ pod wpływem aplikacji jonów cynku.
20 mV 40 mV 60 mV
ШШШ Aplikacja Zn przy pH=7.35
I i Aplikacja Zn przy pH=6.8
R yc. 5. W zg lędn e w artości t„ ob liczo ne podczas aplikacji jo n ó w c ynku w stę żen iu 100 цМ przy PH=6.8 (jasny słu pe k) o ra z 7.35 (cz arny słupek).
Wyniki przeprowadzonych przez nas doświadczeń p ozw alają stwierdzić, że obniżenie w artości zew nątrzkomórkow ego pH z 7.35 do 6.8 powodowało Przesunięcie w artości V„ w stronę dodatnich wartości potencjału błonow ego oraz spow olnienie kinetyki aktyw acji badanych kanałów , co objaw iało się zwiększeniem względnych wartości xn. Należy stw ierdzić, że zarów no przesunięcie w artości V„, jak również wzrost względnych wartości x„ przy wartości pH=6.8 był znacznie mniejszy niż obserwowany wcześniej przy PH=6.4 [10]. Był jed n ak na tyle znaczący, by osiągnąć istotność statystyczną. Równocześnie stwierdzono, że obniżenie pH z 7.35 do 6.8 nie m iało istotnego
wpływu na efekt przesunięcia wartości V n, jak również na zm niejsznie amplitudy badanych prądów potasowych oraz na wzrost względnych wartości x„ pod wpływem aplikacji jonów cynku w stężeniu 100 цМ. Całkowite przesunięcie wartości V n, jak również wzrost względnych wartości T„ pod wpływem działania obydwu czynników było istotnie większe od zmian spow odowanych przez aplikację jonów cynku bez zm iany pH.
Otrzym ane wyniki pozostają w zgodzie z wynikam i doświadczeń przeprow adzonych na kanałach potasowych K v l.3 przez Lee i Deutsch, którzy stwierdzili, że obniżenie zew nątrzkomórkowego pH pow odow ało przesunięcie napięciowej zależności aktywacji tych kanałów w stronę dodatnich wartości potencjału błonow ego oraz spowolnienie kinetyki ich aktywacji, przy czym wielkość tych efektów była tym większa, im większa była zm iana wartości pH [1]. Z kolei brak wpływu zmiany wartości pH z 7.35 do 6.8 na efekt m odulujący wywierany na badane kanały przez jo ny cynku pozostaje w zgodzie z wynikam i naszych doświadczeń, które pokazały, że efekt ten nie zależy od wartości zew nątrzkom órkow ego pH w zakresie od 6.4 do 8.4 [10].
Przyczyna wzajem nej niezależności efektów m odulacyjnych
wywieranych na badane kanały przez jo ny cynku i protony w kwaśnym pH tkwi praw dopodobnie w tym, że obydwa efekty zachodzą w oparciu o różne m echanizm y [10]. W przypadku efektów w ywieranych przez jon y cynku jest to, jak się sugeruje, m echanizm obejm ujący specyficzne oddziaływania jonów cynku z dwom a m iejscami wiążącym i [9]. N atom iast przesunięcie napięciowej zależności aktyw acji kanałów K vl,3 w stronę dodatnich wartości potencjału błonowego oraz spow olnienie ich aktywacji przez zew nątrzkom órkow e protony je st najpraw dopodobniej wynikiem kompensacji ładunku pow ierzchniow ego [1]. Z kolei badania przeprow adzone przez nas uprzednio nad m echanizm em efektu m odulacji aktywności kanałów K vl.3 przez jo ny cynku pozw alają wykluczyć mechanizm polegający na kom pensacji ładunku pow ierzchniow ego [9]. Generalnie można więc uznać, że miejsca oddziaływ ania jo nó w cynku i protonów na kanały K v l.3 są prawdopodobnie różne.
N ależy zauważyć, że wyniki te są sprzeczne z doniesieniam i odnośnie kanałów potasowych napięciowozależnych typu Shaker a nawet blisko spokrewnionych z kanałam i K vl.3 kanałów typu K vl.5 [5,8,11]. W przypadku tych kanałów udow odniono, że jon y cynku i protony od działują na te same m iejsca wiążące zaw ierające histydynę [5,8,11]. W ykazano też, że w przypadku kanałów potasowych typu Shaker w wyniku konkurencji pom iędzy jonam i cynku a protonam i o m iejsca w iążące efekt m odulacyjny jon ów cynku ulegał znacznemu osłabieniu w kwaśnym, zaś wzmocnieniu w alkalicznym pH [8].
zew nątrzkom órkowego pH na efekt modulacyjny jo nó w cynku m ogą być różne dla różnych typów kanałów potasowych.
Obserwow ane dośw iadczalnie addytywne efekty m odulacyjne wyw ierane przez protony w kwaśnym pH oraz jo ny cynku na kanały K v l.3 m ogą mieć potencjalnie znaczenie fizjologiczne. Wiadomo, że kanały K vl.3 w ystępują również w kom órkach centralnego układu nerwowego, zw łaszcza w kom órkach narządu w ęchow ego, gdzie ich aktywność stabilizuje proces tonicznego generowania potencjałów czynnościowych [6]. Jak ju ż w spom niano, stężenie jonów cynku równe 100 цМ, jak rów nież wartość pH równa 6.8 leży w zakresie osiąganym w centralnym układzie nerw owym w w arunkach fizjologicznych. Pozostaje do zbadania, czy i na ile addytywne efekty m odulacyjne wywierane na kanały K v l,3 przez jo n y cynku i protony w pływ ają na aktyw ność elektryczną neuronów.
D oświadczenia, których wyniki zaprezentow ano w ram ach niniejszej pracy zostały wykonane w ramach realizacji grantu KBN N r 2 P 0 5 A 010 27.
Piśmiennictwo
1- D eutsch C., Lee S. (1 989 ) M o dulation o f K+ curren ts in hu m a n ly m phocy tes by pH.
J. P hysiol. 413: 39 9-41 3.
2. F rede rickso n C ., K lite nick М ., M ento n W ., K irpa trick J. (198 3) C y to arch ite c ton ie d istribu tio n o f zinc in the h ip po ca m pu s o f m an an d the rat. B rain Res. 273: 33 5-33 9.
3. H am ill 0 . , M a rty A., N eh er E., Sakm ann B., Sig w orth F. (19 81 ) Im p rove d pa tch-clam p te ch niqu es for h ig h -res o lutio n c urren t re cording from c ells a nd cell-fre e m em b rane patc hes.
P fliigers A rch. 391: 85-100.
4. H arris on N.. G ib bo ns S. (1 994 ) Zinc: an en dog enou s m o du la to r o f lig an d and vo ltag e-gated ion ch anne ls. N e u ro p ha rm ac o lo g y 33: 935-952.
5. Kehl S., E d u lje e C., K w an D „ Z h an g S., Fedida D. (20 02) M o le cu lar d ete rm ina nts o f the inh ibitio n o f h um an K v l.5 p otassium c urrents by external proton s and Z n. J P hysiol. 541: 9-24.
6 K ü pp er J., Prin z A., Fro m h erz P. (2002) R ec om b inan t K v l.3 potas siu m ch an ne ls sta bilize ton ic firing o f c ultured rat hippocam pal neurons. P fliigers A rch. 443: 54 1-54 7.
7- Shieh C h., C o gh lan M „ Su lliva n J., G op alak risha n M. (2 000) P otas sium ch anne ls: m o lecu lar defec ts, dise ase s an d th erap eutic opportunities . P harm acol. Rev. 52: 557-5 93.
8 - Spires S., B egenis ich T. (1 994) M odu latio n o f p ota ssiu m chan nel ga ting by ex ternal d ivale nt cations. J. Gen. P hysiol. 104: 675-6 92.
9 - T eisseyre A., M o zrzym as J.W . (2002) Inhib ition o f the a ctiv ity o f T lym phoc yte K v l.3 c hann els by e xtrac e llu la r zinc. B iochem . P harm ac ol. 64: 59 5-60 7.
10. T eisscy re A., M oz rzym as J.W. (2 005) Influence o f e xtra ce llula r pH on the m odulatory effect o f zin c io ns on K v l.3 po tassium chann els. J. P hysiol. P harm ac ol. Pra ca prz yjęta do druku. 11. T rapan i J., K orn S. (2 003 ) E ffe ct o f external pH on activation o f the K vl .5 p otas siu m channel.
B iophys. J. 84: 195-204.
A dre s do k ore sp o n de n c ji: A n d rz e j T e iss ey re A k ad em ia M edyc zna w e W rocław iu K a te dra i Z a kład Biofizyki ul. C hału bińs kie go 10 50-368 W rocław tel. (48 71) 784 14 14 e-m ail: ate iss@ biofiz.am .w ro c.p l
