Artyku³ przegl¹dowy Review
Cytometria przep³ywowa (flow cytometry FCM) ma obecnie szeroki wachlarz zastosowañ w rutynowej diagnostyce klinicznej cz³owieka, ale jej wykorzystanie wzrasta tak¿e w naukach weterynaryjnych, zw³aszcza w immunologii, onkologii, farmakologii i mikrobiologii. U¿ycie przeciwcia³ monoklonalnych, specyficznych w stosunku do konkretnego epitopu na komórkach krwi zwierz¹t towarzysz¹cych cz³owiekowi oraz stanowi¹cych ród³o po¿ywienia, poszerzy³o spektrum testów o poten-cjalnym zastosowaniu klinicznym. Zalicza siê tu takie testy, jak: okrelanie liczby niedojrza³ych i dojrza³ych re-tikulocytów, wykrywanie immunoglobulin wi¹¿¹cych siê z komórkami krwi, immunofenotypowanie bia³aczek i ch³oniaków, analizowanie komórek ró¿nych populacji szpiku kostnego oraz pojedynczych komórek ró¿nych po-pulacji w zawiesinie, niezwi¹zanych z pod³o¿em w p³y-nach tkankowych b¹d komórkach tkanek i narz¹dów wie¿ych, zamro¿onych lub utrwalonych w parafinie celowo uwolnionych z otaczaj¹cej je substancji miêdzy-komórkowej (2, 15, 30).
Analiza uk³adu bia³okrwinkowego
Leukocyty mo¿na analizowaæ w pe³nej krwi lub jako komórki izolowane w gradiencie gêstoci. Badanie
leu-kocytów w pe³nej krwi jest mo¿liwe dziêki wydzielaniu grup komórek przy pomocy programu komputerowego tak zwane ustalanie okna, bramkowanie. Wczeniej nale¿y z krwi usun¹æ erytrocyty przez dodanie buforu lizuj¹cego. Badanie leukocytów polega najczêciej na oznaczaniu ich immunofenotypu, zestawu antygenów ró¿nicowania (CD Cluster Designation, Cluster Diffe-rentiation), który jest charakterystyczny dla danej po-pulacji komórek (2). Przy zastosowaniu odpowiednich przeciwcia³ mo¿na oceniæ zarówno ekspresjê okrelonej cz¹steczki CD na powierzchni ró¿nego typu komórek, jak i ekspresjê ró¿nych antygenów na komórkach jedne-go typu (15, 20).
Cytometriê przep³ywow¹ mo¿na wykorzystaæ do oce-ny stanu czynnociowego neutrofilów. Jedn¹ z najwa¿-niejszych funkcji tych komórek jest fagocytoza. Do jej oceny u¿ywa siê cz¹stek, które s¹ fagocytowane przez komórki ¿erne. S¹ one znakowane barwnikami fluo-rescencyjnymi (izotiocyjanian fluoresceiny FITC, oran¿ akrydyny). Dotychczas w badaniach u¿ywano cz¹stek lateksu (1,8 mm), nanocz¹stek (0,3 mm), zymosanu, liposomów, krwinek czerwonych, mikroorganizmów (Staphylococcus aureus, Escherichia coli i wiele innych) lub grzybów (Candida albicans, dro¿d¿e piekarnicze).
Zastosowanie cytometrii przep³ywowej
w medycynie weterynaryjnej
URSZULA LISIECKA, KRZYSZTOF KOSTRO, £UKASZ JAROSZ
Zak³ad Epizootiologii i Klinika Chorób Zakanych Instytutu Chorób Zakanych i Inwazyjnych Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej AR, ul. G³êboka 30, 20-612 Lublin
Lisiecka U., Kostro K., Jarosz £.
Applying flow cytometry in veterinary medicine Summary
The number of ways in which flow cytometry may be applied in veterinary sciences is continually increasing, especially in the fields of immunology, oncology, pharmacology and microbiology. White blood cell analysis by flow cytometry, and in particular, the study of leukocyte antigens, phagocytosis and intracellular killing, is being applied to an ever growing number of animal species. Moreover, flow cytometry enables red blood cell analysis, including reticulocyte count and maturity, identification of anti-erythrocyte antibodies and intraerythrocyte parasites detection. Through flow cytometry it is possible to make a speedy and precise diagnosis of neoplasms. In diseases of the haematopoietic system, such as leukemia and lymphomas this method allows the cell line which has become malignant to be precisely established. When appropriate procedures are used, solid tissues such as tumors can be investigated, and if there is no direct access to tumors, it is possible to study cells from secondary lesions e.g. pleural fluid or peritoneal fluid. Flow cytometry can provide information about sperm parameters, such as sperm cell chromatin structures or differentiations between X and Y bearing sperm cells. The flow cytometry method enables a wide range of diseases to be diagnosed by studying apoptosis, i.e. programmed cell death. When adequate, modified procedures are applied, it can be utilized in diagnosing bacterial and viral infections and it is the only method which makes it possible to determine cytokines produced by different cell populations, and cytokine sets produced by a single cell.
Aby okreliæ dok³adnie procent fagocytuj¹cych mono-cytów i granulomono-cytów oraz aktywnoæ fagocytarn¹ (red-nia iloæ sfagocytowanych bakterii w przeliczeniu na jedn¹ komórkê), stosuje siê komercyjnie dostêpny test Phagotest (Orpegen, Niemcy). Jest to szybki test, który pozwala okreliæ aktywnoæ fagocytarn¹ w niewielkiej objêtoci krwi pe³nej lub w p³ynie stawowym. Jego sk³ad-nikiem s¹ bakterie E. coli znakowane FITC, opsonizo-wane przeciwcia³ami i sk³adowymi dope³niacza pulowa-nej surowicy (11, 34).
W oparciu o ocenê metabolizmu tlenowego komórki mo¿na wykazaæ, czy materia³ poch³oniêty przez neutro-file zosta³ zdegradowany. W tym celu wykrywa siê pro-dukty powsta³e w czasie aktywacji systemu oksydazy NADPH. W cytometrii przep³ywowej do wykazania obecnoci produktów aktywacji oksydazy stosuje siê dwuoctan 27-dichlorofluorescyny (DCFH-DA). Jest to ma³a cz¹stka, nie wykazuj¹ca fluorescencji, która po prze-nikniêciu przez b³onê wewn¹trz komórki ulega przekszta³-ceniom przez enzymy komórkowe do 27-dichloroflu-oresceiny (DCF), która emituje sygna³ fluorescencyjny (530 nm). Inna metoda polega na zastosowaniu utlenia-nia wewn¹trzkomórkowego hydroetydyny (HE) do brom-ku etydyny, który wykazuje czerwon¹ fluorescencjê. Aby wykazaæ obecnoæ w komórce tych dwóch metabolitów, nale¿y zastosowaæ bardzo silne stymulatory wybuchu od-dechowego, na przyk³ad estry forbolu (PMA) (11, 34). W laboratoriach stosuje siê ponadto wystandaryzowane testy, takie jak Bursttest (Orpegen). Stymulatorem wy-buchu tlenowego jest s³aby aktywator N-formylometio-nyloleucynofenyloalanina (FMLP) oraz opsonizowane E. coli. Substancj¹, która ulega przekszta³ceniom w ko-mórce, jest DHR 123. Mo¿na okreliæ intensywnoæ fluo-rescencji powsta³ej rodaminy 123 i dziêki temu zbadaæ aktywnoæ enzymatyczn¹.
Badanie reaktywnych pochodnych tlenu (ROS) mo¿e przyczyniæ siê do wykrycia szeregu chorób zakanych oraz oceny zaburzeñ czynnoci neutrofilów. Podobne badania wykorzystano do oceny zmian funkcjonalnych neutrofilów u byd³a oraz identyfikacji zwierz¹t podat-nych na chroniczne zapalenie wymion wywo³ane przez Staphylococcus aureus (13, 34). Cytometria przep³ywo-wa zosta³a tak¿e z powodzeniem zastosoprzep³ywo-wana do oceny fagocytozy oraz zabijania wewn¹trzkomórkowego u wiñ, psów, kotów, królików, byd³a, a nawet u wielorybów (6, 11, 13, 23).
Analiza uk³adu czerwonokrwinkowego
Cytometryczna analiza erytrocytów dotyczy przede wszystkim okrelania liczebnoci i dojrza³oci retikulo-cytów, identyfikowania przeciwcia³ skierowanych prze-ciwko erytrocytom oraz wykrywania ich wewn¹trzkomór-kowych paso¿ytów. Erytrocyty mo¿na analizowaæ w pe³-nej krwi pobrape³-nej na antykoagulant lub izolowaæ z war-stwy erytrocytów powsta³ej po wirowaniu krwi ca³ko-witej. Cytometriê stosuje siê czêsto do badania konfliktu serologicznego miêdzy matk¹ a p³odem. Zwykle stosuje siê do tego celu przeciwcia³a przeciwko p³odowej hemo-globinie F. Jest to precyzyjny i czu³y test, pozwalaj¹cy odró¿niæ erytrocyty p³odowe od dojrza³ych erytrocytów zawieraj¹cych ma³¹ iloæ hemoglobiny F (2).
Ocena liczby retikulocytów jest oparta na pomiarze intensywnoci fluorescencji RNA zawartego w retikulo-cycie. Do barwienia RNA retikulocytów stosowane s¹ fluorochromy, takie jak: oran¿ tiazolowy, oran¿ akrydy-ny, auramina czy bromek etydyny. Kluczowym paramet-rem jest odsetek retikulocytów o wysokiej zawartoci RNA, których cech¹ charakterystyczn¹ jest zwiêkszona intensywnoæ fluorescencji (21). U zwierz¹t cytometria przep³ywowa by³a stosowana do oznaczania liczby reti-kulocytów u psów i kotów i w obu przypadkach rezulta-ty by³y porównywalne z obliczeniami manualnymi (30). Cytometria przep³ywowa jest stosowana z powodze-niem do wykrywania wewn¹trzerytrocytarnych paso¿y-tów. Erytrocyty inkubuje siê z hydroetydyn¹, która jest poch³aniana przez ¿ywe komórki i przekszta³cana do ety-dyny. Etydyna jest fluorochromem, wi¹¿¹cym siê z DNA paso¿yta. Ta technika zosta³a wykorzystana do przele-dzenia cyklu rozwojowego Babesia bovis w erytrocytach bydlêcych, a w erytrocytach psich do identyfikacji ko-mórek zainfekowanych Babesia gibsoni. Cytometria jest tak¿e pomocna w ocenie skutecznoci leków przeciw-malarycznych. Zainfekowane zarodcem malarii ludzkie erytrocyty barwi siê z u¿yciem barwnika Hoechst 33258. Zalet¹ cytometrii jest to, ¿e pozwala ona na wykrycie paso¿yta wystêpuj¹cego nawet w bardzo ma³ej iloci (30). Zastosowanie cytometrii przep³ywowej w hematolo-gii weterynaryjnej mo¿e mieæ miejsce przy ocenie ilo-ciowej niedojrza³ych p³ytek krwi, które by³y badane we krwi ludzi, psów i koni w sposób podobny do stosowa-nego przy analizie retikulocytów (21, 31). Wiele testów z wykorzystaniem cytometrii przep³ywowej jest udosko-nalanych w celu identyfikacji kr¹¿¹cych w organizmie p³ytek aktywowanych. Do testów tych zalicza siê m.in.: wi¹zanie fibrynogenu do p³ytek, stosowanie przeciwcia³ przeciwko p³ytkowym markerom zale¿nym od aktywa-cji, wykrywanie p³ytkowych mikrocz¹stek, badanie zmia-ny kszta³tu oraz detekcja agregatów p³ytki-leukocyty. Obecnoæ przeciwcia³ skierowanych przeciwko p³ytkom, która pozwala wykryæ trombocytopeniê, ehrlichiozê i ba-daæ procesy nowotworzenia, by³a badana u ludzi i psów (21, 31). Testy te s¹ pomocne w ocenie stanu zdrowia zwierz¹t.
Diagnostyka nowotworów
Bardzo wa¿ne z punktu widzenia kliniki jest wyko-rzystanie cytometrii przep³ywowej w rutynowej diag-nostyce schorzeñ uk³adu krwiotwórczego, takich jak bia-³aczki i ch³oniaki. Cytometria przep³ywowa umo¿liwia ocenê dok³adnej liczby komórek zmienionych nowotwo-rowo oraz okrelenie linii komórkowej, z jakiej pocho-dzi nowotwór oraz jego potencjalnej z³oliwoci.
Wskanikiem z³oliwoci nowotworu s¹ klonalnoæ i zawartoæ (ploidia) DNA. Klonalnoæ jest dowodem na to, ¿e linia komórek bia³aczkowych pochodzi od poje-dynczej komórki. Pojawienie siê dodatkowych pików na histogramie obrazuj¹cym zawartoæ DNA wiadczy o aneuploidalnoci i jest wskanikiem procesów nowo-tworzenia (21, 30). Ró¿ne typy bia³aczek i ch³oniaków charakteryzuj¹ siê czêsto drobnymi ró¿nicami profilów antygenowych, dziêki temu mo¿na je rozró¿niæ za po-moc¹ cytometrii przep³ywowej (30). Zastosowanie
kli-niczne immunofenotypowania w weterynaryjnej onko-logii wi¹¿e siê z diagnoz¹ psich bia³aczek i ch³oniaków z³oliwych (5) oraz kocich ostrych bia³aczek mieloidal-nych i limfoidalmieloidal-nych (30). Dodatkowo cytometria w prze-p³ywaj¹cym strumieniu cieczy umo¿liwia badanie sku-tecznoci chemioterapii, co udowodniono prowadz¹c tego typu analizê limfocytów krwi obwodowej u psów z wie-locentrycznym ch³oniakiem, przed leczeniem i po poda-niu cytostatyków (5). Cytometria umo¿liwia ponadto wykrycie choroby resztkowej (MRD minimal residual disease) u pacjentów z ostrymi bia³aczkami. Dok³adnoæ i czu³oæ badania pozwala wykryæ nawet pojedyncze ko-mórki bia³aczkowe (21).
Kolejne zastosowanie cytometrii przep³ywowej odno-si odno-siê do charakterystyki antygenowej i ilociowej komó-rek szpiku kostnego (21). Metoda ta umo¿liwia m.in. okrelanie liczby ró¿nych komórek szpiku poprzez ich barwienie dwuoctanem 27-dichlorofluoresceiny, wi¹-¿¹cym siê preferencyjnie z komórkami zawieraj¹cymi peroksydazê, a nastêpnie analizowanie pod k¹tem zielo-nej fluorescencji i rozpraszania wiat³a FSC. W ten spo-sób mo¿liwe jest odró¿nienie populacji proliferuj¹cych i dojrza³ych komórek mieloidalnych, proliferuj¹cych i dojrza³ych komórek erytroidalnych oraz megakariocy-tów. Mo¿liwe jest tak¿e analizowanie nie barwionych próbek szpiku, przy którym, bazuj¹c na stopniu rozpra-szania wiat³a FSC i SSC, identyfikuje siê segmentowa-ne segmentowa-neutrofile, metamielocyty, niedojrza³e komórki mie-loidalne i erytroidalne oraz dojrza³e komórki erytroidal-ne. Jodek propidyny, jak równie¿ bromodeoksyurydyna s¹ wykorzystywane dodatkowo do okrelania aktyw-noci proliferacyjnej szpiku (21).
Jedn¹ z najwiêkszych zalet cytometrii przep³ywowej jest mo¿liwoæ przy braku dostêpu do guza pobrania i badania komórek z wtórnego ród³a zmiany chorobo-wej np. p³ynu op³ucnowego czy otrzewnowego (10). Je-¿eli badana jest tkanka lita, komórki musz¹ zostaæ rozbi-te mechanicznie lub enzymatycznie. Metodê enzymatycz-n¹ stosuje siê wówczas, je¿eli materia³ guza zawiera wiele martwych komórek, du¿¹ iloæ podcieliska lub zw³ók-nienia. wie¿o pobrany materia³ z guza powinien byæ transportowany i przechowywany w specjalnym pod³o-¿u (nie w formalinie) w temperaturze 4°C. Materia³ prze-znaczony do badania powinien zawieraæ jak najwiêcej interesuj¹cej nas tkanki, natomiast jak najmniej tkanki t³uszczowej, w³óknistej, naczyñ krwiononych (warstwy naczyniowej) i komórek nekrotycznych (10).
Ocena proliferacji komórek
Cytometriê przep³ywow¹ wykorzystuje siê z powodze-niem do scharakteryzowania cyklu komórkowego ró¿-nych rodzajów komórek w hodowlach. Zastosowanie w tej metodzie barwienia z u¿yciem jodku propidyny umo¿liwi³o obliczenie procentu komórek znajduj¹cych siê w fazie G0/G1, S i G2/M. Do badania cyklu czêsto stosuje siê oznaczanie zawartoci DNA po jego kwanej denaturacji. Po dodaniu do hodowli substancji blokuj¹-cej komórki w fazie M, np. winblastyny i okreleniu indeksu mitotycznego (liczby komórek bêd¹cych w trak-cie podzia³u mitotycznego) w ró¿nym czasie po dodaniu tej substancji, mo¿emy obliczyæ czas podwojenia
(gene-ration time) populacji komórek. Prowadz¹c hodowle ko-mórkowe lub tkankowe mo¿na ledziæ stan hodowli po zabarwieniu DAPI sulforodamin¹ i oran¿em akrydyny. Nag³e pogorszenie siê rozdzielczoci histogramu DNA przy prowadzeniu regularnej kontroli hodowli mo¿e wiadczyæ o zaka¿eniu mykoplazm¹.
Proliferacjê nowotworów mo¿na badaæ analizuj¹c fazê S cyklu komórkowego. Je¿eli odsetek komórek znajdu-j¹cych siê w tej fazie przekroczy kilkanacie procent, oznacza to wzrost proliferacji. W przypadku np. raka sutka wzrost liczby komórek w fazie S stanowi samo-dzielny czynnik rokowniczy. Badaj¹c cykl komórkowy nale¿y tak¿e zwróciæ uwagê na antygeny towarzysz¹ce proliferacji, takie jak Ki-67 czy PCNA. Istnieje zale¿-noæ pomiêdzy ich ekspresj¹ a postêpem choroby nowo-tworowej. Cytometryczna ocena zawartoci DNA jest stosowana tak¿e w badaniach cytogenetycznych. Iloæ kwasu nukleinowego ocenia siê wtedy w poszczególnych chromosomach przy u¿yciu odpowiednich fluorochro-mów (np. DAPI czy jodku propidyny). Proliferuj¹ce lim-focyty mo¿na wykryæ, znakuj¹c je przeciwcia³ami prze-ciwko receptorowi dla interleukiny 2 (CD25) lub recep-torowi dla transferyny (CD71). Oba te receptory znaj-duj¹ siê na powierzchni zaktywowanych limfocytów. Mo¿na tak¿e wykorzystaæ fakt, ¿e proliferuj¹ce komórki wbudowuj¹ analog tymidyny bromodezoksyurydynê (BrdU), któr¹ mo¿na wykryæ za pomoc¹ przeciwcia³ anty--BrdU (2).
Ocena parametrów nasienia
Badanie jakoci nasienia polega zwykle na wykrywa-niu nieprawid³owej struktury chromatyny plemników. DNA znakuje siê oran¿em akrydyny (AO). Barwnik ten, ³¹cz¹c siê z DNA dwuniciowym, daje zielon¹ fluorescen-cjê, natomiast w po³¹czeniu z jednoniciowym DNA wie-ci na czerwono. Zwiêkszona liczba komórek o czerwo-nej fluorescencji wiadczy o nieprawid³owej strukturze chromatyny plemników. Plemniki mo¿na tak¿e znako-waæ rodamin¹ 123 i jodkiem propidyny PI, dziêki czemu wykrywa siê zmiany w potencjale b³ony mitochondrial-nej, a co za tym idzie ruchliwoci plemników. Czerwo-na fluorescencja pochodz¹ca od PI wiadczy o du¿ej licz-bie martwych komórek, natomiast intensywna zielona fluorescencja jest wskanikiem ¿ywotnoci i du¿ej ruch-liwoci plemników. Wyniki oceny ¿ywotnoci plemni-ków w nasieniu ogierów z zastosowaniem cytomerii prze-p³ywowej oraz innych metod by³y porównywalne. Za po-moc¹ cytometrii badano ¿ywotnoæ i integralnoæ akro-somu psich plemników oraz ¿ywotnoæ i integralnoæ b³ony komórkowej plemników knura (25). Dziêki tech-nikom cytometrycznym wykrywa siê w ludzkim nasie-niu komórki takie, jak leukocyty czy komórki prostaty, co jest pomocne we wczeniejszym wykryciu raka pro-staty (24). Cytometria umo¿liwia ponadto okrelenie nie-wielkich ró¿nic w zawartoci DNA w plemnikach nios¹-cych chromosomy X i Y. Plemniki zawieraj¹ce chromo-som X lub Y sortuje siê za pomoc¹ specjalnego typu cy-tometrów wyposa¿onych w sortery komórkowe, dziêki temu mo¿liwa jest regulacja p³ci zwierz¹t hodowlanych (1, 22).
Badanie apoptozy
Apoptoza jest czynnym procesem, który przyczynia siê do regulacji liczby komórek w organizmie. Zachwianie równowagi miêdzy proliferacj¹ komórek a ich mierci¹ prowadzi do powstania licznych schorzeñ. W komórkach apoptotycznych nastêpuj¹ zmiany sk³adu fosfolipidów w b³onie zewnêtrznej komórki pojawia siê tam, prze-niesiona z czêci wewnêtrznej b³ony fosfatydyloseryna. Do jej wykrycia stosuje siê aneksynê V zwi¹zan¹ che-micznie z barwnikiem fluorescencyjnym (najczêciej FITC). Równoczenie wybarwia siê komórki jodkiem propidyny, który pozwala oceniæ integralnoæ b³ony ko-mórkowej. Nastêpnie bada siê fluorescencjê za pomoc¹ cytometru. Komórki ¿ywe nie barwi¹ siê ¿adnym odczyn-nikiem, komórki nekrotyczne barwi¹ siê jodkiem propi-dyny, a komórki apoptotyczne barwi¹ siê w ró¿nym stop-niu aneksyn¹ V. Komórki barwi¹ce siê jednoczenie anek-syn¹ V i jodkiem propidyny znajduj¹ siê w pónym sta-dium apoptozy (28).
Apoptozê mo¿na tak¿e badaæ, wykrywaj¹c pêkniêcia ³añcucha DNA w komórkach apoptotycznych. W tym celu stosuje siê trifosforan deoksyurydyny (dUTP) lub bro-modeoksyurydyny (Br-dUTP) sprzê¿ony z fluorescein¹ lub digoksygenin¹, który przy u¿yciu enzymów, takich jak terminalna transferaza czy polimeraza DNA jest wbudowywany w miejscach pêkniêæ ³añcucha DNA. Fluorescencja Br-dUTP po³¹czonego z kwasem nuklei-nowym jest nastêpnie mierzona cytometrycznie. Jest ona proporcjonalna do liczby pêkniêæ ³añcucha DNA. Ten sposób badania apoptozy zwany jest metod¹ TUNEL (28). Za pomoc¹ cytometrii przep³ywowej mo¿liwe jest ba-danie aktywacji kaspaz (proteinaz cysteinowych) en-zymów, które s¹ obecne w komórkach apoptotycznych. Najczêciej wykrywa siê kaspazê 3, stosuj¹c komercyj-ne zestawy odczynników (kity), które zawieraj¹ substra-ty fluorescencyjne, rozszczepiane przez kaspazê.
Ocena apoptozy mo¿e mieæ znaczenie w zrozumieniu przebiegu wielu chorób zwierz¹t i cz³owieka (choroby nowotworowe, autoagresja, choroby neurodegeneracyj-ne i infekcyjneurodegeneracyj-ne). W badaniach klinicznych za pomoc¹ cytometrii oznaczano spontaniczn¹ i indukowan¹ apop-tozê limfocytów w przebiegu infekcji wirusem HIV u ludzi (20) oraz apoptozê w przebiegu infekcji wirusem niedoboru odpornoci u kotów (FIV) (19). Badano tak¿e apoptozê leukocytów u byd³a (27), trzody chlewnej (29), kotów (8, 19) i psów (34). Porównywano proces apopto-zy zdrowych i zainfekowanych wirusem Panleukopenia limfocytów kotów (8). U trzody chlewnej oznaczano apoptozê zainfekowanych wirusem choroby Aujesz-kyego leukocytów krwi obwodowej (29). Ponadto ba-dano apoptozê kocich, mysich i szczurzych tymocytów (34).
Diagnostyka i patogeneza zaka¿eñ bakteryjnych i wirusowych
Przy u¿yciu cytometrii przep³ywowej zaka¿enia bak-teryjne i wirusowe mo¿na badaæ bezporednio b¹d po-rednio, monitoruj¹c zmiany, jakie zachodz¹ w uk³adzie immunologicznym. W wyniku zaka¿enia bakteryjnego nastêpuj¹ du¿e zmiany w komórkach obronnych. Jedn¹
z tych zmian jest tzw. parali¿ immunologiczny, który jest spowodowany utrat¹ przez monocyty krwi antygenu HLA-DR. Zmiany ekspresji tego antygenu mo¿emy le-dziæ dziêki cytometrii przep³ywowej (33).
Za pomoc¹ cytometrii mo¿na tak¿e badaæ oddzia³y-wanie wirusa z komórk¹, okrelaj¹c ekspresjê wybranych antygenów powierzchniowych i cytoplazmatycznych komórki, z zastosowaniem przeciwcia³ monoklonalnych. Analizuj¹c fenotypy komórek zaka¿onych wirusem mo¿-na monitorowaæ przebieg zaka¿enia i okrelaæ jego ro-kowania (18). Za pomoc¹ tej metody ledzono stan cho-rych zaka¿onych wirusem HIV (20). W diagnostyce we-terynaryjnej cytometriê przep³ywow¹ stosowano miêdzy innymi do oceny progresji infekcji kocimi wirusami FIV i FeLV (19), wirusami bia³aczki byd³a, wirusem BIV i BLAD (wrodzonym zespo³em niedoboru leukocytar-nych cz¹stek adhezyjleukocytar-nych). Analizowano komórki od-pornociowe we krwi owiec w przebiegu dowiadczal-nego zaka¿enia wirusem BIV (12) oraz wykrywano zaka¿enia wirusem zapalenia têtnic koni w nasieniu ogie-rów (4). Badano tak¿e zmiany w subpopulacjach limfo-cytów u kurcz¹t zaka¿onych Salmonella enteritidis (32). Cytometriê przep³ywow¹ mo¿na zaadaptowaæ tak¿e do bezporedniej wieloparametrowej analizy mikroorganiz-mów, jednak ze wzglêdu na to, ¿e ró¿ni¹ siê one od orga-nizmów eukariotycznych, niezbêdna jest modyfikacja standardowych procedur wykorzystywanych do charak-teryzowania komórek zwierzêcych. Barwienie barwni-kiem fluorescencyjnym brombarwni-kiem etydyny (BE) po-zwala tak¿e na wykrycie bakterii w p³ynach fizjologicz-nych, takich jak: ¿ó³æ, wydzieliny ropne z ran, p³yn suro-wiczy oraz wydzieliny oskrzelowe (33).
Cytometria znajduje zastosowanie w bezporednim badaniu komórek bakteryjnych do zliczania i wykrywa-nia okrelonych gatunków bakterii w populacjach mie-szanych, np. Legionella pneumophila w wie¿ach ch³od-niczych (9), Listeria monocytogenes w mleku (3), Esche-richia coli O157:H7 w zanieczyszczonym miêsie (14) oraz subpopulacji bakterii w produktach probiotycznych (probiotykach) i produktach mlecznych (3).
Cytometriê mo¿na tak¿e wykorzystaæ w badaniach serologicznych. Za jej pomoc¹ wykrywano przeciwcia³a przeciwko Yersinia pestis w surowicach pobranych od chorych na d¿umê pacjentów. Mo¿liwa jest tak¿e detek-cja przetrwalników (spor) bakteryjnych np. Bacillus an-thracis (26).
Metoda cytometrii przep³ywowej znajduje tak¿e za-stosowanie w testowaniu wra¿liwoci bakterii na anty-biotyki. Do detekcji martwych komórek bakterii stosuje siê barwniki wi¹¿¹ce siê z DNA, np. jodek propidyny, oraz barwniki wi¹¿¹ce siê z DNA i RNA, takie jak SYTO--13 czy SYTO-17. Barwienie komórek oran¿em akrydy-ny pozwala oceniæ zmiaakrydy-ny integralnoci b³oakrydy-ny komórko-wej wskutek dzia³ania antybiotyków (33).
Cytometria przep³ywowa zosta³a z powodzeniem za-stosowana do detekcji wirusów z rodzin Baculoviridae, Herpesviridae, Myoviridae, Phycodnaviridae, Picorna-viridae, PodoPicorna-viridae, Retroviridae i Siphoviridae. Kwa-sy nukleinowe wirusów barwiono u¿ywaj¹c takich barw-ników, jak: SYBR Green I, SYBR Green II, OliGreen, PicoGreen, YO-PRO oraz YOYO-1. Prowadzone s¹ tak¿e
badania leków antywirusowych przeciwko ludzkiemu wirusowi niedoboru odpornoci (HIV), wirusowi cyto-megalii oraz wirusom opryszczki (HSV) (17, 18).
Oznaczanie poziomu cytokin
Cytokiny s¹ nonikami informacji miêdzy uk³adem odpornociowym a nerwowym i hormonalnym. Popula-cje limfocytów produkuj¹ okrelone, specyficzne tylko dla nich zestawy cytokin. W trakcie procesów chorobo-wych synteza cytokin mo¿e byæ zaburzona, wiêc anali-zuj¹c ich ekspresjê mo¿emy wnioskowaæ o stanie funk-cjonalnym uk³adu odpornociowego.
Cytometria przep³ywowa umo¿liwia oznaczanie ró¿-nych cytokin produkowaró¿-nych przez odrêbne populacje komórek, a tak¿e zestawów cytokin produkowanych przez pojedyncz¹ komórkê. Po 4-6-godzinnej inkubacji z czynnikiem stymuluj¹cym, wewn¹trzkomórkowe cy-tokiny znakuje siê przeciwcia³ami po³¹czonymi z fluoro-chromem (16). Zazwyczaj stosuje siê stymulatory poli-klonalne, takie jak: lektyny, konkanawalina A (ConA), estry forbolu (PMA), jonomycyna, niektóre przeciwcia-³a monoklonalne i superantygeny (7). Aby syntetyzowa-ne cytokiny nie by³y wydzielasyntetyzowa-ne na zewn¹trz komórki, stosuje siê inhibitory transportu bia³ek, takie jak brefel-dyna A czy monensyna (7, 16).
Badanie cytokin wewn¹trzkomórkowych mo¿e stano-wiæ pomoc w diagnostyce zaka¿eñ bakteryjnych, wiru-sowych, paso¿ytniczych, chorób nowotworowych, auto-immunizacyjnych, alergicznych i niedoborów odporno-ci. Stosuje siê je obecnie przy ró¿nicowaniu limfocytów. Na przyk³ad, jedyn¹ ró¿nic¹ miêdzy subpopulacjami Th1 i Th2 jest spektrum wydzielanych cytokin (7). W przy-sz³oci badanie cytokin mo¿e znaleæ zastosowanie w monitorowaniu dzia³ania leków i innych rodków te-rapeutycznych in vivo (7, 16).
Pimiennictwo
1.Bochenek M., Smor¹g Z.: Regulacja p³ci u byd³a poprzez separacjê plemni-ków X i Y wstêpne wyniki badañ. Medycyna Wet. 2005, 61, 50-52. 2.Brown M., Wittwer C.: Flow cytometry: principles and clinical applications
in hematology. Clin. Chem. 2000, 46, 1221-1229.
3.Bunthof Ch. J., Abee T.: Development of a flow cytometric method to analyze subpopulations of bacteria in probiotic products and dairy starters App. Environment. Microbiol. 2002, 68, 2934-2942.
4.Cierpisz J., Golnik W., Laskowska A., Ugorski M.: Wykrywanie zaka¿eñ wirusem zapalenia têtnic koni w nasieniu ogierów metod¹ cytometrii prze-p³ywowej. Medycyna Wet. 1998, 54, 626-627.
5.Culmsee K, Simon D, Mischke R, Nolte I.: Possibilities of flow cytometric analysis for immunophenotypic characterization of canine lymphoma. J. Vet. Med. A. 2001, 48, 199-206.
6.De Guise S., Flipo D., Boehm J. R., Martineau D., Beland P., Fournier M.: Immune functions in beluga whales (Delphinapterus leucas): Evaluation of phagocytosis and respiratory burst with peripheral blood leukocytes using flow cytometry. Vet. Immunol. Immunopathol. 1995, 47, 351-362. 7.Drela N.: Wykrywanie wewn¹trzkomórkowych cytokin metod¹ cytometrii
przep³ywowej zastosowanie i problemy. Post. Biol. Kom. 2001, 28, 129--146.
8.Ikeda Y., Shinozuka J., Miyazawa T., Kurosawa K., Izumiya Y., Nishimura Y., Nakamura K., Cai J., Fujita K., Doi K., Mikami T.: Apoptosis in feline panleukopenia virus-infected lymphocytes. J. Virol. 1998, 72, 6932-6936. 9.Ingram M., Cleary T. J., Price B. J., Castro A.: Rapid detection of Legionella
pneumophila by flow cytometry. Cytometry 1982, 3, 134-147.
10.Iwaszkiewicz-Paw³owska A., Ho³ownia A.: Cytometria przep³ywowa przy-datnoæ diagnostyczna, lecznicza i rokownicza w litych guzach. Pol. Mer. Lek. 1999, 6, 104-106.
11.Kostro K., Wojcicka-Lorenowicz K., Leniewska K., Madany J., Majer--Dziedzic B.: Cytometryczna ocena aktywnoci fagocytarnej i metabolizmu
tlenowego granulocytów krwi obwodowej królików z przewlek³¹ trichofi-toz¹. Medycyna Wet. 2006, 62, 423-426.
12.Kozaczyñska B., Bicka L., Kumak J., Winnicka A.: Analiza komórek odpor-nociowych krwi owiec w przebiegu dowiadczalnego zaka¿enia wirusem (BIV). Medycyna Wet. 2001, 57, 129-134.
13.Krakowski L., Kostro K., Wrona Z., Krakowska I., Brodzki P., Piech T., Kostrzewa A.: Metabolizm tlenowy neutrofilów i monocytów krwi w okresie oko³oporodowym u krów zdrowych i z zatrzymaniem ³o¿yska. Medycyna Wet. 2004, 60, 1080-1083.
14.Kusunoki H., Bari M. L., Kita T., Sugii S., Uemura T.: Flow cytometry for the detection of enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7 with latex beads sensitized with specific antibody. J. Vet. Med. B. 2000, 47, 551-559. 15.Lisiecka U., Kostro K., Jarosz £.: Cytometria przep³ywowa jako nowoczesna
metoda w diagnostyce i prognozowaniu chorób. Medycyna Wet. 2006, 62, 998-1001.
16.Maino V. C.: Rapid assessment of antigen induced cytokine expression in memory T cells by flow cytometry. Vet. Immunol. Immunopathol. 1998, 63, 199-207.
17.Marie D., Vaulot D., Partensky F.: Application of the novel nucleic acid dyes YOYO-1, YO-PRO and PicoGreen for flow cytometric analysis of marine prokaryotes. Appl. Environ. Microbiol. 1996, 62, 1649-1655.
18.McSharry J. J.: Analysis of virus-infected cells by flow cytometry. Methods 2000, 21, 249-257.
19.Momoi Y., Mizuno T., Nishimura Y., Endo Y., Ohno K., Watari T., Goitsu-ka R., Tsujimoto H., Hasegawa A.: Detection of apoptosis induced in peri-pheral blood lymphocytes from cats infected with feline immunodeficiency virus. Arch Virol. 1996, 141, 1651-1659.
20.Owens M. A., Loken M. R.: Flow cytometry principles for clinical laboratory practice. Quality assurance for quantitative immunophenotyping. Wiley-Liss, Inc. 1995.
21.Pietruczuk M.: Cytometria przep³ywowa w diagnostyce laboratoryjnej. Diag-nosta laboratoryjny 2004, 4, 8-10.
22.Pena A. I., Quintela L. A., Herradon P. G.: Flow cytometric assesment of acrosomal status and viability of dog spermatozooa. Reprod. Dom. Anim. 1999, 34, 495-502.
23.Riber U., Lind P.: Interaction between Salmonella typhimurium and phago-cytic cells in pigs. Phagocytosis, oxidative burst and killing in polymorpho-nuclear leukocytes and monocytes. Vet. Immunol. Immunopathol. 1999, 67, 259-270.
24.Ricci G., Presani G., Guaschino S., Simeone R., Perticarari S.: Leukocyte detection in human semen using flow cytometry. 2000. Human Reprod. 15, 1329-1337.
25.Siemieniuch M., Bielas W., Dubiel A., Zbyryt I., Chorbiñski P.: Ocena ¿ywotnoci i integralnoci b³on komórkowych plemników knura w nasieniu wie¿ym i mro¿onym. Medycyna Wet. 2005, 61, 184-187.
26.Stopa P. J.: The flow cytometry of Bacillus anthracis spores revisited. Cyto-metry 2000, 41, 237-244.
27.Van Oostveldt K., Dosogne H., Burvenich C., Paape M. J., Brochez V., Van den Eeckhout E.: Flow cytometric procedure to detect apoptosis of bovine polymorphonuclear leukocytes in blood. Vet. Immunol. Immunopathol. 1999, 70, 125-133.
28.Vermes I., Haanen C., Steffens-Nakken H., Reutelingsperger C.: A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expres-sion on early apoptotic cells using fluorescein labelled annexin V. J. Immu-nol. Methods 1995, 184, 39-51.
29.Wang F. I., Pang V. F., Hahn E. C.: Flow cytometric analysis of porcine peripheral blood leukocytes infected with pseudorabies virus. J. Leuk. Biol. 1988, 43, 256-264.
30.Weiss D. J.: Application of flow cytometric techniques to veterinary clinical hematology. Vet. Clin. Pathol. 2002, 31, 72-74.
31.Weiss D. J., Townsend E.: Evaluation of reticulated platelets in dogs. Comp. Haematol. Int. 1998, 8, 166-170.
32.Wieliczko A., Kuczkowski M., Mazurkiewicz M.: Zachowanie siê subpopu-lacji limfocytów T CD3+, CD4+ i CD8+ u kurcz¹t w przebiegu zaka¿enia Salmonella enteritidis. Medycyna Wet. 2002, 58, 527-530.
33.Woniak-Kosek A., Reiss J., Kawiak J.: Cytometria przep³ywowa w klinicz-nych analizach bakteriologiczklinicz-nych. Post. Mikrobiol. 2003, 42, 235-254. 34.Zeman K.: Wykorzystanie cytometrii przep³ywowej do badañ granulocytów
obojêtnoch³onnych. Materia³y z I Konferencji szkoleniowej nt. Przeciwcia³a monoklonalne w immunologii i diagnostyce. Pu³awy 1995, s. 99-117. Adres autora: mgr Urszula Lisiecka, ul. Krasiñskiego 12/100, 20-709 Lublin; e-mail: ula.lisiecka@op.pl
