Mikrobiologiczne przekształcenia związków biologicznie aktywnych z grupy steroidów oraz składników wychmielin

Opiniodawca

prof. dr hab. Antoni Polanowski

Redaktor merytoryczny prof. dr hab. inĪ. Ewelina Dziuba

Opracowanie redakcyjne mgr ElĪbieta Winiarska-Grabosz

Korekta: Janina Szydłowska

Łamanie i projekt okładki Teresa Alicja Chmura

Monografie LXI

© Copyright by Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu, Wrocław 2008

ISSN 1898-1151 ISBN 978-83-60574-39-3

WYDAWNICTWO UNIWERSYTETU PRZYRODNICZEGO WE WROCŁAWIU Redaktor Naczelny – prof. dr hab. Andrzej Kotecki

ul. Sopocka 23, 50–344 Wrocław, tel. 071 328–12–77 e-mail: wyd@up.wroc.pl

Nakład 100 + 16 egz. Ark. druk. 5,5 Druk i oprawa: Wydawnictwo Tekst Sp. z o.o.

SPIS TRECI

PRZEDMOWA ...7

1. WSTĉP ...9

1.1. Mikrobiologiczne transformacje steroidów ... 12

1.2. Biologicznie aktywne związki wytwarzane przez chmiel ... 17

1.3. Biotransformacje flawonoidów chmielowych ... 22

1.4. Wychmieliny jako Ĩródło substancji odĪywczych i biologicznie aktywnych ... 29

2. PRZEDSTAWIENIE I DYSKUSJA WYNIKÓW ... 33

2.1. Mikrobiologiczne transformacje steroidów ... 33

2.1.1. Transformacje steroidów przez Absidia glauca ... 34

2.1.2. Transformacje steroidów przez Botrytis cinerea ... 38

2.1.3. Transformacje steroidów przez Beauveria bassiana ... 40

2.2. Mikrobiologiczna degradacja gorzkich kwasów chmielowych ... 44

2.2.1. Selekcja drobnoustrojów degradujących gorzkie kwasy chmielowe ... 44

2.2.2. Degradacja gorzkich kwasów chmielowych przez wyselekcjonowane grzyby ... 47

2.2.2.1. Degradacja gorzkich kwasów chmielowych przez Trametes versicolor ... 52

2.2.2.2. Degradacja gorzkich kwasów chmielowych przez Candida parapsilosis ... 55

2.3. Mikrobiologiczne transformacje ksantohumolu ... 61

2.3.1. Materiały i metody ... 61

2.3.2. Selekcja drobnoustrojów transformujących ksantohumol ... 64

2.3.3. Transformacja ksantohumolu przez Absidia glauca ... 65

2.3.4. Transformacja ksantohumolu przez Beauveria bassiana ... 66

2.3.5. Transformacja ksantohumolu przez Pezicula cinnamomea ... 67

2.3.6. Transformacja ksantohumolu przez Fusarium equiseti ... 68

3. PODSUMOWANIE I WNIOSKI ... 71

PRZEDMOWA

Na niniejszą rozprawĊ habilitacyjną składają siĊ trzy prace dotyczące mikrobiolo-gicznych transformacji steroidów oraz cztery poĞwiĊcone mikrobiologicznym przekształ-ceniom związków zawartych w wychmielinach. Publikacje te zestawiono chronologicz-nie, a numery w nawiasach odpowiadają spisowi cytowanej literatury.

[93] Huszcza E., Dmochowska-Gładysz J.: 2003. Transformations of testosterone and related steroids by Absidia glauca culture. J. Basic Microbiol., 43, 113–120. [94] Huszcza E., Dmochowska-Gładysz J.: 2003. Transformations of testosterone and related steroids by Botrytis cinerea, Phytochemistry, 62, 155–158.

[95] Huszcza E., Dmochowska-Gładysz J., BartmaĔska A.: 2005. Transformations of steroids by Beauveria bassiana, Z. Naturforsch., 60c, 103–108.

[90] Huszcza E., BartmaĔska A., Anioł M., Mączka W., ĩołnierczyk A., WawrzeĔczyk C.: 2007. Screening for the hop bitter acids degrading microorgan-isms, Ecol. Chem. Eng., 14, 57–61.

[89] Huszcza E., BartmaĔska A.: 2008. The implication of yeast in debittering of spent hops, Enz. Microbial Technol., 42, 421–425.

[91] Huszcza E., BartmaĔska A., Anioł A., Mączka W., ĩołnierczyk A., WawrzeĔczyk C.: 2008. Degradation of hop bitter acids by fungi. Waste Manage., 28, 1406–1410.

[92] Huszcza E., BartmaĔska A., Tronina T.: 2008. Glycosylation of xanthohumol by fungi, Z. Naturforsch., 63c, 557–560.

Wyniki opisanych badaĔ, mogące znaleĨü praktyczne zastosowanie, otrzymały ochronĊ patentową bądĨ teĪ czynione są starania o jej uzyskanie:

1. Dmochowska-Gładysz J., Huszcza E., Sposób wytwarzania 11Į-hydroksy-1-dehydrotestosteronu, patent PL 194390.

2. Dmochowska-Gładysz J., Huszcza E., Sposób wytwarzania 14Į-hydroksy-1-dehydrotestosteronu, patent PL 194389.

3. Huszcza E., BartmaĔska A., Anioł M., Mączka W., ĩołnierczyk A., Jarosz A., WawrzeĔczyk C., Sposób rozkładu humulonów i lupulonów, Nr rej. UP RP: P-37044.

4. Huszcza E., BartmaĔska A., Tronina T., Sposób wytwarzania 4’-O-ȕ-D-glukozylo-2’,4-dihydroksy-6’-metoksy-3’-prenylochalkonu, Nr rej. UP RP: P-385440.

5. Huszcza E., BartmaĔska A., Tronina T., Sposób wytwarzania 4’-O-ȕ-D-4’’’-metoksy-glukozylo-2’,4-dihydroksy-6’-metoksy-3’-prenylochalkonu, Nr rej. UP RP: P-385441.

W rozdziałach 2.3.3, 2.3.5 i 2.3.6 rozprawy habilitacyjnej zamieszczono równieĪ niepublikowane wyniki badaĔ, prowadzonych w ramach grantu finansowanego przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa WyĪszego, grant N312279634 „Otrzymywanie pochodnych flawonoidów izolowanych z wychmielin, bĊdących potencjalnymi pro-zdrowotnymi dodatkami do ĪywnoĞci, oraz detoksykacja wychmielin”. Wyniki badaĔ opisane w rozdziale 2.2 były finansowane przez Komitet BadaĔ Naukowych, grant nr 3 PO9B 028 27, „Chemiczne i mikrobiologiczne metody detoksykacji poekstrak-cyjnego odpadu chmielowego pod kątem wymogów paszowych”.

1. WST

ĉP

Biotransformacje to katalizowane przez enzymy przekształcenia związków dla nich obcych (ksenobiotyków). ZawĊĪenie substratów do związków nieswoistych odróĪ-nia biotransformacjĊ od biosyntezy, która odnosi siĊ do zdolnoĞci syntetycznej układów biologicznych w ich Ğrodowisku naturalnym. ChociaĪ rola enzymów w naturze polega na regulacji szlaków metabolicznych, to wyniki badaĔ prowadzonych przez ostatnie trzy-dzieĞci lat wykazały, Īe specyficznoĞü substratowa wielu z nich jest mniejsza niĪ począt-kowo sądzono i akceptują one substraty nawet doĞü znacznie róĪniące siĊ pod wzglĊdem struktury. Na przykład syntaza arbutynowa z rauwolfii Īmijowej (Rauwolfia serpentina) przekształca 35 fenolowych związków o zróĪnicowanej budowie, wĞród nich: fenole, pochodne kumaryny, antrachinonu, chinolinonu i flawonoidy [73].

WyróĪnia siĊ dwie podstawowe strategie prowadzenia biotransformacji: stosowa-nie czystych lub czĊĞciowo oczyszczonych enzymów, albo całych komórek. KaĪda z tych metod ma swoje wady i zalety. Enzymy moĪna obecnie kupowaü tak jak zwykłe odczynniki chemiczne lub teĪ wyizolowaü je w stosunkowo prosty sposób. Dotychczas wykorzystywane były przede wszystkim w laboratoriach biochemicznych, a obecnie coraz czĊĞciej stosowane są równieĪ przez chemików organików.

Biokalizatory są zbudowane z L-aminokwasów i dziĊki temu posiadają zdolnoĞü do wytwarzania optycznie czynnych produktów z prochiralnych lub racemicznych sub-stratów. Od katalizatorów chemicznych odróĪnia je wysoka specyficznoĞü nie tylko w odniesieniu do reakcji, którą katalizują, ale teĪ budowy akceptowanych substratów i tworzonych produktów.

Katalityczna aktywnoĞü enzymów ogranicza siĊ zazwyczaj do jednego typu reakcji, dającej jeden produkt, natomiast powstawanie produktów ubocznych przypisuje siĊ działaniu innych enzymów. Z trójwymiarowej i asymetrycznej budowy miejsc aktywnych enzymów wynika stereoselektywnoĞü, w tym enancjoselektywnoĞü, katali-zowanych reakcji. MoĪna wiĊc otrzymywaü tylko jeden stereoizomer (enancjomer) lub mieszaninĊ z przewagą jednego z nich. „Asymetryczny rozpuszczalnik”, jakim jest dla substratu kieszeĔ enzymu, sprawia, Īe na drodze biotransformacji daje siĊ rozdzielaü mieszaniny stereoizomerów (stereospecyficznoĞü), w tym mieszaniny racemiczne (enancjospecyficznoĞü). Na przykład enzymatyczny rozdział racemicznego octanu cis-3-(acetyloksy)-4-fenylo-2-azetydynonu do odpowiedniego (3S)-alkoholu i nieprzereago-wanego (3R)-octanu (rys. 1), bĊdącego prekursorem leku antynowotworowego o nazwie Taxol, prowadzony jest z uĪyciem lipazy z Pseudomonas sp. SC 13856. WydajnoĞü tej reakcji wynosi ponad 48% (teoretyczne maksimum równe jest 50%), a nadmiar enan-cjomeryczny otrzymanego (3R)-octanu przekracza 99,5% [145].

NH O AcO NH O AcO NH O O H lipaza z Pseudomonas sp. ₊ R S Pseudomonas sp. lipase

Rys. 1. Enancjospecyficzna hydroliza octanu cis-3-(acetyloksy)-4-fenylo-2-azetydynonu

Fig. 1. Enantiospecific hydrolysis of cis-3-(acethyloxy)-4-phenyl-2-azetidinone

Biokatalizatory przewaĪnie rozróĪniają pozycje tych samych bądĨ podobnych grup w cząsteczce substratu i przekształcają tylko jedną z nich (regioselektywnoĞü, diastereoselektywnoĞü). Wysoką regioselektywnoĞü wykazuje subtylizyna wykorzysty-wana do acylacji kastanosperminy (rys. 2). Estryfikacji ulega tylko jedna z czterech drugorzĊdowych grup hydroksylowych o podobnej reaktywnoĞci, wydajnoĞü reakcji wynosi 91%, a powstająca pochodna dwudziestokrotnie silniej hamuje replikacjĊ wirusa HIV [122, 183]. N OH OH O H H O H N OH O H H O H OCOR subtylizyna subtilisin

Rys. 2. Regioselektywna acylacja kastanosperminy

Fig. 2. Regioselective acylation of castanospermine

Otrzymywanie czystych optycznie związków ma szczególne znaczenie w przemy-Ğle farmaceutycznym i agrochemicznym. Na zróĪnicowane właĞciwoĞci biologiczne enancjomerów moĪna podaü wiele przykładów. Jednym z nich, najbardziej spektakular-nym i jednoczeĞnie tragicznym w skutkach, było zastosowanie w latach szeĞüdziesiątych leku o nazwie Thalidomide, którego składnik (R)-talidomid posiada właĞciwoĞci uspoka-jające, natomiast (S)-talidomid teratogenne. Ofiarami medykamentu padło wtedy ok. 12 000 dzieci, które urodziły siĊ z wadami genetycznymi, a takĪe – w sposób poĞred-ni – ich rodziny. Kilka wybranych przykładów róĪpoĞred-nic we właĞciwoĞciach biologicznych enancjomerów pokazano na rysunku 3.

Enzymy przyspieszają reakcje co najmniej milionkrotnie, przewaĪnie ze współ-czynnikiem 108–1010, w łagodnych warunkach, jakie panują w komórkach wytwarzają-cych je organizmów, tj.: w Ğrodowisku wodnym, w temp. poniĪej 40°C, w pH bliskim neutralnemu i przy ciĞnieniu normalnym. Dlatego sam proces biotransformacji bywa zwykle mało kosztowny. NaleĪy jednak zaznaczyü, Īe istnieją równieĪ pewne typowe niedogodnoĞci związane z wysokimi kosztami izolowania i oczyszczania produktów, niskim stĊĪeniem stosowanych substratów, a wiĊc i powstałych produktów, oraz – w przypadku enzymów róĪnych od hydrolaz – dodatkiem i regeneracją koenzymów.

N H O O H N O O N H O O H N O O O O O O O O OH OH OH O O OH O O OH OH teratogenny teratogenic uspokajajcy sedative talidomid thalidomide magnolion magnolione

intensywny zapach jaminowy most intense jasmine odour

bardzo delikatny zapach cytrusowy very weak citrus odour

atraktant seksualny brudnicy nieparki

sex attractant of gypsy moth repelent brudnicy nieparki_{repellent of gypsy moth}

disparlur disparlure

filodulcyna phyllodulcin

bardzo słodka

intense sweet taste bez smaku_tasteless

S S S R R R R R S S S R

Rys. 3. Biologiczna aktywnoĞü enancjomerów [110, 172, 173, 206]

Fig. 3. Biological effect of enantiomers [110, 172, 173, 206]

Jednym ze sposobów obniĪenia kosztów biotransformacji jest zastosowanie komórek roĞlin, zwierząt i drobnoustrojów. Najszersze zastosowanie znalazły transfor-macje mikrobiologiczne ze wzglĊdu na niezwykłą róĪnorodnoĞü wytwarzanych przez drobnoustroje enzymów i dogodnoĞü prowadzenia procesu, w tym rozwiązanie problemu regeneracji koenzymów. Komórki drobnoustrojów z powodu małych rozmiarów

w porównaniu do roĞlinnych i zwierzĊcych są zdolne do relatywnie szybkiego wzrostu. Jest to wynikiem duĪego stosunku powierzchni do objĊtoĞci małych komórek, który daje moĪliwoĞü intensywniejszego pobierania składników odĪywczych z otoczenia. NajczĊ-Ğciej stosowaną metodą jest transformacja we wstrząsanych kulturach wgłĊbnych w wa-runkach namnaĪania lub rzadziej – w hodowlach otrzymanych poprzez zawieszenie bio-masy w odpowiednim buforze. Badania rozpoczyna siĊ zwykle od selekcji drobnoustro-jów przekształcających substrat w poĪądaną pochodną lub pochodne, z jak najwyĪszą wydajnoĞcią i stereoselektywnoĞcią. Wprawdzie przy ich doborze moĪna kierowaü siĊ pewnymi ogólnymi zasadami, np. uĪytecznoĞcią droĪdĪy do reakcji redukcji lub z reguły wiĊkszą przydatnoĞcią grzybów strzĊpkowych do hydroksylacji, to w wiĊkszoĞci przy-padków nie daje siĊ uniknąü badaĔ selekcyjnych dla kaĪdego z przeznaczonych do trans-formacji związków. W uzasadnionych przypadkach drobnoustroje poddaje siĊ immobili-zacji, a takĪe udoskonala ich cechy poprzez mutagenezĊ. Niebagatelne znaczenie dla wydajnoĞci biotransformacji ma oprócz samego biokatalizatora optymalizacja jej warun-ków, tj. dobór odpowiedniej temperatury, natlenienia, pH, Ĩródła substancji odĪywczych, zastosowanie związków powierzchniowo czynnych, rozpuszczalników organicznych, induktorów, inhibitorów enzymów i innych. ChociaĪ mnogoĞü moĪliwych reakcji katali-zowanych przez zestaw enzymów jednego drobnoustroju i wymienionych wyĪej czynni-ków wpływających na przebieg reakcji są dla niektórych chemiczynni-ków zniechĊcające, to nie da siĊ zaprzeczyü, Īe biotransformacje stanowiące swoisty pomost pomiĊdzy chemią i biochemią mają kluczowe znaczenie m.in. w produkcji ĪywnoĞci, witamin, chiralnych leków i związków chemicznych o specjalnych cechach, niedostĊpnych lub trudno do-stĊpnych na drodze klasycznej syntezy. Zastosowanie biokatalizatorów umoĪliwia pro-wadzenie wysoce selektywnych transformacji na najwyĪszym osiąganym obecnie po-ziomie syntezy organicznej. W minionych dwóch dekadach metoda ta stała siĊ jednym z niezbĊdnych narzĊdzi syntezy asymetrycznej, nie tylko w sferze rozwaĪaĔ naukowych, ale teĪ w skali przemysłowej.

OdrĊbnym aspektem mikrobiologicznych transformacji jest ich przydatnoĞü wĞledzeniu przemian substratów w drobnoustrojach i odnoszenie ich do metabolizmu ssaków. Zaproponowana przez Smitha i RosazzĊ w 1974 r. koncepcja zastosowania mi-kroorganizmów jako modeli metabolizmu ssaków (microbial models of mammalian metabolism) wciąĪ znajduje potwierdzenie w badaniach [1, 5, 33, 39, 171, 200]. Na drodze mikrobiologicznych transformacji leków i innych ksenobiotyków uzyskuje siĊ znaczne iloĞci znanych lub nowych metabolitów, mogących słuĪyü jako substancje wzor-cowe metabolitów ssaków, w iloĞciowych i jakoĞciowych badaniach farmakologicznych czy toksykologicznych.

1.1. Mikrobiologiczne transformacje steroidów

Transformacje steroidów przez drobnoustroje były przedmiotem licznych badaĔ, których wyniki znalazły zastosowanie w biotechnologii. PoĞwiĊcono temu zagadnieniu szereg prac przeglądowych i monografii [30, 50, 82, 119, 120, 162].

Począwszy od 1952 roku, kiedy to Murray i Peterson z Upjohn Company [136] opatentowali otrzymywanie 11Į-hydroksyprogesteronu dziĊki mikrobiologicznej

hydro-ksylacji progesteronu z uĪyciem grzybów Rhizopus arrhizus (rys. 4), obniĪając w ten sposób koszt tego leku z 200 do 6 $ za 1 g, zastosowanie biotransformacji do otrzymywania leków i hormonów steroidowych bardzo siĊ upowszechniło.

O O O O O H Rhizopus arrhizus 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 A B C D

Rys. 4. Transformacja progesteronu przez Rhizopus arrhizus

Fig. 4. Transformation of progesterone by Rhizopus arrhizus

Steroidy są szeroko stosowane jako Ğrodki antykoncepcyjne, leki przeciwzapalne, moczopĊdne, antyandrogenne, progestagenne, immunosupresyjne, przeciwnowotworo-we, anaboliczne i inne [108, 187, 205]. NajwiĊksze znaczenie mają reakcje hydroksyla-cji, dehydrogenahydroksyla-cji, a takĪe selektywnej degradacji łaĔcucha bocznego steroli. Mikrobio-logiczna hydroksylacja steroidów, bĊdąca drogą detoksykacji i jednoczeĞnie oksydatyw-nej degradacji ksenobiotyków, jest najczĊĞciej opisywaną biotransformacją steroidów. Niemal kaĪdy atom wĊgla szkieletu steroidowego moĪna hydroksylowaü regio- i stereo-selektywnie, stosując odpowiednie drobnoustroje. Katalityczne zdolnoĞci enzymów po-zwalają przy tym na funkcjonalizacjĊ nieaktywowanych atomów wĊgla szkieletu stero-idowego, co jest trudne do osiągniĊcia metodami chemicznymi. Wprowadzenie atomu tlenu w pozycji 11 ma kluczowe znaczenie dla aktywnoĞci przeciwzapalnej [162], nato-miast steroidy hydroksylowane w pozycji 16Į posiadają wiĊkszą aktywnoĞü glukokorty-koidową [53]. Reakcje hydroksylacji w pozycjach 7Į i 14Į prowadzą do leków antyno-wotworowych i moczopĊdnych [119]. Kilka przykładów zastosowania drobnoustrojów do otrzymywania leków steroidowych w skali przemysłowej zamieszczono na rysunku 5.

O OH COCH 2OH O OH COCH₂OH O H O O O O OH O OH F OH COCH₂OH O OH COCH₂OH O H O O O Cuvrularia lunata

korteksolon (substancja S Reichsteina)

cortexolone (Reichstein's substance S) kortyzol_cortisol

prednizol prednisol triamcynolon triamcinolone progesteron progesterone 16α-hydroksyprogesteron 16a-hydroxyprogesterone Arthrobacter simplex Streptomyces argenteolus Mycobacerium fortuitum sitosterol androstendion androstenedione

Rys. 5. Przykłady hydroksylacji steroidów o znaczeniu przemysłowym

Curvularia lunata hydroksyluje korteksolon w pozycji 11ȕ, dając kortyzol [124]. Tworzenie wiązania podwójnego C1-C2, wzmagające działanie terapeutyczne kortyzonu

i kortyzolu, zachodzi z udziałem Arthrobacter simplex, Bacillus sphaericus i Bacterium cyclooxydans. Otrzymuje siĊ w ten sposób odpowiednio: prednizon i prednizolon [140]. Streptomyces argenteolus utlenia progesteron do 16Į-hydroksyprogesteronu, bĊdącego prekursorem Triamcynolonu (16Į-hydroksy-9Į-fluoroprednizolonu), jednego z najsku-teczniejszych steroidowych leków przeciwzapalnych [162]. Innym waĪnym przemysłowo procesem jest degradacja sitosterolu do androstendionu, katalizowana przez Myco-bacterium fortuitum [81]. Sitosterol izolowany z materiału roĞlinnego jest materiałem wyjĞciowym do produkcji wielu leków steroidowych.

Za proces hydroksylacji steroidów oraz innych hydrofobowych ksenobiotyków przez drobnoustroje odpowiadają monooksygenazy cytochromu P-450, szeroko rozpo-wszechnione równieĪ w Ğwiecie zwierząt i roĞlin. Są ostatnim ogniwem łaĔcucha trans-portu elektronów. Katalizują wprowadzenie jednego z dwóch atomów tlenu cząsteczko-wego do substratu z jednoczesną redukcją drugiego atomu w cząsteczce wody. ReakcjĊ moĪna podsumowaü nastĊpująco:

RH + O₂ + 2H+ _{+ 2e}- _{ROH + H}

2O

cytochrom P-450; cytochrome P-450

KaĪdy cytochrom P-450 (CYP) zawiera hem jako grupĊ prostetyczną, do której koordynacyjnie wiązany jest tlen cząsteczkowy, przez co ulega aktywacji. Redukujące równowaĪniki pochodzą z NAD(P)H. Cytochromy mitochondrialne nie pobierają elek-tronów bezpoĞrednio z NADPH i wymagają poĞrednictwa dwóch dodatkowych białek: reduktazy zawierającej FAD i FMN, odbierającej elektrony z NADPH i białka posiadają-cego centrum Īelazowo-siarkowe, zwanego ferredoksyną, poĞredniczącego w transporcie pomiĊdzy reduktazą a związanym z błoną CYP. Monooksygenazy związane z retikulum endoplazmatycznym wymagają jedynie flawoproteinowej reduktazy NADPH cytochro-mu P-450 [147]. Cytochromy P-450 są niestabilnymi, związanymi z błonami enzymami, które trudno jest izolowaü bez utraty aktywnoĞci. Po solubilizacji z mikrosomalnej błony łatwo przechodzą w nieaktywną formĊ P-420. W literaturze moĪna znaleĨü informacje o izolowaniu i oczyszczaniu tych białek oraz o klonowaniu kodujących je genów z wielu organizmów [188]. Jak dotąd opisano stosunkowo niewiele mikrobiologicznych hydrolaz steroidowych, np.: 7Į-hydroksylazĊ z Phycomyces blakesleeanus [2], 11Į-hydroksylazĊ z Aspergillus ochraceus [156], Aspergillus fumigatus [170], Rhizopus nigricans [22], 14Į-hydroksylazĊ z Mucor piriformis [117], 15Į-hydroksylazĊ z Penicillium raistrickii [97], 16Į-hydroksylazĊ ze Streptomyces roseochromogenes [14], 6ȕ-hydroksylazĊ z Bacillus thermoglucosidasius [166], 7ȕ-hydroksylazĊ z Botryospaeria obtusa [169], 11ȕ-hydroksylazĊ z Cochliobolus lunatus [100] i 15ȕ-hydroksylazĊ z Bacillus megate-rium [13]. Badania nad oddziaływaniami hydroksylaza – steroid prowadzono na niewielu przykładach, ze wzglĊdu na wspomniane wyĪej problemy z izolowaniem i zachowaniem aktywnoĞci enzymu. Ustalono, Īe tylko dla nielicznych drobnoustrojów moĪna przewi-dzieü pozycjĊ substratu, w której nastąpi hydroksylacja, np. dla Aspergillus ochraceus i Beauveria bassiana (zwanego wczeĞniej Sporotrichum sulphurescens i Beauveria

sulphurescens), tworzących przede wszystkim 11Į-hydroksypochodne [11, 65, 163]. CzĊsto obserwuje siĊ hydroksylacje konkretnego związku w kilku pozycjach, prowadzo-ne przez ten sam mikroorganizm. Na podstawie badaĔ z uĪyciem Aspergillus tamarii i róĪnych androgenów Brannon i wsp. zaobserwowali, Īe substrat moĪe wiązaü siĊ z enzymem poprzez funkcje tlenowe pierĞcieni A (C-3) i D (C-17) w czterech róĪnych orientacjach, co sprawia, Īe pewne pozycje w cząsteczce steroidu stają siĊ ekwiwalentne [20] (rys. 6). E-O O-E E-O O-E O-E E-O E-O O-E I II III IV 2α 7α 11β 16α

Rys. 6. MoĪliwe ułoĪenia steroidu w kieszeni enzymatycznej cytochromu P-450, wynikające

z dwupunktowego wiązania

Fig. 6. Possible orientation of steroid in the enzyme pocket of cytochrome P-450 as a result of two-side binding

Zjawisko to potwierdzono póĨniej, stosując metodĊ ukierunkowanej mutagenezy [99]. Przykładowo, za ekwiwalentne uwaĪa siĊ pozycje 11ȕ i 7Į, jeĞli cząsteczkĊ steroidu obróci siĊ z pozycji oznaczonej jako I, do II, a takĪe pozycje 2Į i 16Į, jeĞli cząsteczkĊ steroidu obróci siĊ z pozycji oznaczonej jako I, do III. Rhizopus nigricans, R. arrhizus i Aspergillus ochraceus wykazują zdolnoĞü do hydroksylowania pozycji 11ȕ i 7Į [16, 30, 101], a cytochrom P-450 2C11 z wątroby szczura – w pozycjach 2Į i 16Į [158].

ChociaĪ mikrobiologiczne transformacje steroidów mają juĪ długą, udokumento-waną licznymi artykułami naukowymi historiĊ, nadal są efektywną metodą otrzymywa-nia nowych, coraz aktywniejszych pochodnych oraz narzĊdziem do Ğledzeotrzymywa-nia metaboli-zmu leków steroidowych w organizmach ssaków. Na przestrzeni dwóch lat, 2006 i 2007, w samym czasopiĞmie „Steroids” pojawiło siĊ 12 doniesieĔ tego typu.

1.2. Biologicznie aktywne zwi

ązki wytwarzane przez chmiel

Jak dotąd zidentyfikowano ponad 1000 związków chemicznych obecnych w chmielu [48]. Tak zwane gorzkie kwasy stanowią od ok. 5 do 25% suchej masy doj-rzałych szyszek chmielowych [137, 192]. Dzieli siĊ je na Į-kwasy, inaczej humulony orazȕ-kwasy, zwane lupulonami, które są odpowiednio di- lub triprenylowymi pochod-nymi floroglucynolu (rys. 7).

O R O OH O H O H O R O OH O H O O R OH O H O H O O R OH O O H H α-kwasy (humulony) α-acids (humulones) β-kwasy (lupulony) β-acids (lupulones) R= -CH2CH(CH3)2 humulon/lupulon humulone/lupulone -CH(CH3)2 kohumulon/kolupulon cohumulone/colupulone -CH(CH3)CH2CH3 adhumulon/adlupulon adhumulone/adlupulone cis-izohumulony

cis-isohumulones trans-izohumulonytrans-isohumulones

R= -CH2CH(CH3)2 cis/trans izohumulon cis/trans isohumulone -CH(CH3)2 cis/trans izokohumulon cis/trans isocohumulone -CH(CH3)CH2CH3 cis/trans izoadhumulon cis/trans isoadhumulone

Rys. 7. Główne gorzkie kwasy chmielowe

Fig. 7. The main hop bitter acids

Naturalne humulony są izomerami R. W stanie czystym wystĊpują jako opalizują-ce Īółtawe ciało stałe, są słabymi kwasami, bardzo słabo rozpuszczają siĊ w wodzie i prawie wcale nie są gorzkie. Cechuje je wysoka aktywnoĞü bakteriostatyczna, bĊdąca wynikiem ingerencji charakterystycznych dla tych związków grup prenylowych w funk-cjonowanie błony cytoplazmatycznej drobnoustrojów. Z tego wzglĊdu ȕ-kwasy posiada-jące wiĊcej grup prenylowych niĪ Į-kwasy są silniejszymi bakteriostatykami. Połączenie takich właĞciwoĞci z przeciwutleniającymi sprawia, Īe związki te mogą w przyszłoĞci znaleĨü wiele zastosowaĔ, przede wszystkim w przemyĞle spoĪywczym, poza browarnic-twem, w którym ȕ-kwasy uwaĪa siĊ za składnik niepoĪądany, gdyĪ są bardzo podatne na utlenienie, a wiĊkszoĞü produktów ich psucia posiada nieprzyjemny smak i zapach.

NajwiĊksze zainteresowanie wykazuje przemysł cukrowniczy, w którym lupulony wyko-rzystuje siĊ do obniĪania aktywnoĞci bakterii w trakcie ekstrakcji buraków cukrowych, zamiast uĪywanej dotąd formaliny [12].

Chmielowe Į-kwasy izomeryzują w trakcie warzenia do izo-Į-kwasów, bezpo-Ğrednio odpowiedzialnych za sensoryczne właĞciwoĞci piwa (rys. 8). Ich gorycz jest porównywalna do chininy, związku wzorcowego w porównywaniu gorzkiego smaku. W tym samym czasie ȕ-kwasy ulegają rozkładowi i nie pojawiają siĊ w produkcie final-nym [79]. Handlowo dostĊpny „preizomeryzowany ekstrakt chmielowy”, uĪywany w browarnictwie do zwiĊkszania stĊĪenia gorzkich izo-Į-kwasów w piwie, otrzymuje siĊ najczĊĞciej w pH zasadowym. Ostatecznie izo-Į-kwasy stanowią do 80% wszystkich składników pochodzenia chmielowego w piwie. Oprócz nadawania piwu charaktery-stycznego zapachu i goryczy przyczyniają siĊ do ochrony przed zakaĪeniami bakteryj-nymi i stabilizowania piany. ReakcjĊ izomeryzacji Į-kwasów do izo-Į-kwasów moĪna teĪ prowadziü metodą naĞwietlania Ğwiatłem ultrafioletowym o długoĞci fali 365 lub 254 nm [43]. Coraz czĊĞciej obok ekstraktu chmielowego stosuje siĊ „zredukowany pre-izomeryzowany ekstrakt chmielowy”, zawierający dihydroizo-Į-kwasy i tetrahydroizo-Į--kwasy, które sprawiają, Īe piwo jest bardziej odporne na działanie Ğwiatła i ma stabil-niejszą pianĊ [42].

Ekstrakt chmielowy znajduje zastosowanie w farmaceutykach o działaniu usypiającym i uspokajającym [159], hamującym resorpcjĊ koĞci [185], w których Į-kwasy odgrywają główną rolĊ. Liczne badania wykazały jego aktywnoĞü przeciwbak-teryjną i przeciwgrzybiczną [114, 132, 155, 167], przeciwutleniającą [179], przeciwza-palną [201], przeciwwirusową [25] i przeciwnowotworową [164].

Olejki eteryczne z chmielu zawierają wiele składników, z których do dziĞ ziden-tyfikowano około 300 [48]. W procesie produkcji piwa wiĊkszoĞü z nich ulatnia siĊ pod-czas gotowania brzeczki. W suchych szyszkach chmielu znajduje siĊ od 0,5 do 2% olej-ków eterycznych, przy czym od 57 do 82% stanowią myrcen, ȕ-kariofilen i humulen. Szczegółowa analiza składu olejku eterycznego moĪe byü podstawą do okreĞlenia od-miany chmielu, z której został on otrzymany [111]. Ostatnie badania wykazały, Īe droĪ-dĪe browarnicze wykazują zdolnoĞü do transformacji terpenoidów obecnych w olejku chmielowym [105]. Chmielowy olejek eteryczny ma zastosowanie w przemyĞle perfu-meryjnym, kosmetycznym, tytoniowym i spoĪywczym [116].

DuĪe zainteresowanie budzą ostatnio izolowane z chmielu flawonoidy. Są one wydzielane wraz z kwasami gorzkimi i olejkami eterycznymi przez gruczoły lupulinowe, a wyizolowano ich dotąd około 30 [129, 131, 174,176–178, 210].

Flawonoidy wystĊpują szeroko w Ğwiecie roĞlinnym, w owocach, warzywach i produktach otrzymywanych z roĞlin, takich jak: herbata i wino oraz w dodatkach do ĪywnoĞci i lekach ziołowych. Obok powszechnie znanych właĞciwoĞci przeciw-utleniających, przeciwrakowych [133] wykazują teĪ aktywnoĞü antygrzybiczną, antybak-teryjną i antywirusową [37].

O O O O H H O H O O O O H O H O O O O H H O O O OH O H O H O O OH O O H H B -H+ -H+ cis-izohumulon cis-isohumulone trans-izohumulon trans-isohumulone humulon humulone

Rys. 8. Mechanizm izomeryzacji humulonu [44]

Fig. 8. Mechanism of the isomerization of humulone [44]

Grupy prenylowe obecne w wielu cząsteczkach flawonoidów, charakterystyczne dla produktów metabolizmu chmielu, wzmacniają ich działanie przeciwutleniające [9], co stwierdzono w róĪnych układach utleniających lipidy in vitro, np. we frakcji mikro-somalnej wątroby szczura [153].

Flawonoidem wystĊpującym w chmielu w najwiĊkszej iloĞci jest ksantohumol. Stanowi od 0,1 do 1% suchej masy szyszek. Izolowało go wiele grup badawczych, które stwierdziły, Īe w stĊĪeniu od 10- do 100-krotnie mniejszym towarzyszą mu miĊdzy innymi: izoksantohumol, 5’-prenyloksantohumol, dezmetyloksantohumol, ksantogalenol, 8-prenylonaringenina i 6-prenylonaringenina [174, 175] (rys. 9). PoniewaĪ

poekstrak-cyjny odpad chmielowy stanowi bardzo dogodne Ĩródło ksantohumolu, nie obserwuje siĊ wiĊkszego zainteresowania jego chemiczną syntezą. Znaleziono dwie prace dotyczące totalnej syntezy ksantohumolu [103, 194].

Ze wzglĊdu na pozytywne działanie ksantohumolu na organizm ludzki coraz po-wszechniejsze staje siĊ wzbogacanie piwa i innych napojów w ten związek, poprzez dodawanie specjalnych ekstraktów dostĊpnych handlowo [8, 54]. JednoczeĞnie prowa-dzone są badania zmierzające do zwiĊkszenia zawartoĞci tego flawonoidu w ekstrakcie chmielowym, a takĪe w samych szyszkach chmielowych, poprzez selekcjĊ i genetyczną modyfikacjĊ chmielu [123, 143]. Opatentowano równieĪ uĪycie ksantohumolu jako leku

na osteoporozĊ [184], pojawiają siĊ teĪ doniesienia o moĪliwoĞci stosowania go jako nowego terapeutyku w zakaĪeniach HIV-1 [197], leku na raka piersi [66], prostaty [35] i inne rodzaje nowotworów [45, 60, 63, 130], leku antywirusowego [25] i przeciwzapal-nego [32].

8-Prenylonaringenina, rzadziej zwana hopeiną, to najsilniejszy poznany dotąd fitoestrogen, działający jak 17-ȕ-estradiol [29]. Z tego wzglĊdu podejmowane są próby stosowania 8-prenylonaringeniny przy dolegliwoĞciach związanych z menopauzą, w tym takĪe osteoporozą [29] oraz w celu powiĊkszania piersi [55, 62]. Leki stosowane dotąd w hormonalnej terapii zastĊpczej, oparte na mieszaninie estrogenów izolowanych z mo-czu koĔskiego (np. Premarin), wykazują efekty ubocze, m.in. w postaci zwiĊkszonego ryzyka zapadania na rozmaite choroby nowotworowe [207]. Dlatego opracowuje siĊ alternatywne terapie estrogenowe, w których 8-prenylonaringenina budzi uzasadnione nadzieje na zastosowanie. Poza chmielem, w którym wystĊpuje jako mieszanina race-miczna, izolowano ją takĪe z tajlandzkiego drzewa Anaxagorea luzonensis, perełkowca (Sophora flavescens) i innych roĞlin z rodziny Compositae [17, 107]. Nieustannie trwają poszukiwania nowych, wydajnych metod chemicznej syntezy tego związku [61, 198].

Izoksantohumol wystĊpuje w ekstrakcie chmielowym w 10-krotnie wiĊkszej iloĞci niĪ 8-prenylonaringenina [62] i dodatkowo powstaje z ksantohumolu w procesie wytwa-rzania piwa. Wykazuje aktywnoĞü cytotoksyczną i antyproliferacyjną wobec komórek raka płuc [130], lecz nie posiada właĞciwoĞci estrogennych. Ze wzglĊdu na jego obec-noĞü w piwie – sporo uwagi poĞwiĊca siĊ temu związkowi jako prekursorowi 8-prenylonaringeniny. Wiadomo, Īe enzymy wątrobowe i drobnoustroje przewodu pokarmowego człowieka zdolne są do demetylacji izoksantohumolu do 8-prenylo-naringeniny [67, 139, 148, 149], opracowuje siĊ teĪ chemiczne metody demetylacji [198]. Izoksantohumol i dezmetyloksantohumol, który w wyniku prostej reakcji cykliza-cji w Ğrodowisku zasadowym przekształca siĊ w 8-prenylonaringeninĊ, nazywane są proestrogenami.

Biologicznej aktywnoĞci składników chmielu z uwzglĊdnieniem najnowszych doniesieĔ poĞwiĊcono ostatnio aĪ dwie prace przeglądowe [29, 204].

OH R₃O O O OR1 OH R₂O O OH OR₁ OH O OMe OH O H O H OH O OH O O H OH O OMe OH O H OH O OMe OH O OH OH O OMe OH O OH O OMe OH O OH 1 4 2' 3' 4' 6' 6 4' A A B B C α β flawanony / flavanones 3 R3 R4 R4 R₂ ksantohumol B xanthohumol B ksantohumol C xanthohumol C ksantohumol D xanthohumol D ksantohumol E xanthohumol E α,β−dihydroksantohumol α,β-dihydroxanthohumol wodzian izodehydrocykloksantohumolu iso-dehydrocycloxanthohumol hydrate 7 *) Pn = prenyl, Gn = geranyl 8 5' 2 4 5 1 1' chalkony / chalcones

Rys. 9. Główne flawonoidy chmielowe Fig. 9. The main hop flavonoids

R1 R2 R3* R4* Me H H Pn ksantohumol; xanthohumol H H H Pn dezmetyloksantohumol; desmethylxanthohumol H H Me Pn ksantogalenol; xanthogalenol Me Me H Pn 4’-O-metyloksantohumol; 4’-O-methylxanthohumol H H H Gn 3’-geranylochalkonaringenina; 3’-geranylchalconaringen H H Pn Pn 3’,5’-diprenylochalkonaringenina Me H Pn Pn 5’-prenyloksantohumol; 5’-prenylxantohumol Me Me H H flawokawina; flavokawin R1 R2* R3* R4* Me H H Pn izoksantohumol; isoxanthohumol H Pn Me H 7-O-metylo-6-prenylonaringenina; 7-O-methyl-6-prenylnaringenin H H Me Pn 7-O-metylo-8-prenylonaringenina; 7-O-methyl-8-prenylnaringenin Me H Me Pn 5,7-di-O-metylo-8-prenylonaringenina; 5,7-di-O-methyl-8-prenylnaringenin Me H Me H 5,7-di-O-metylonaringenina; 5,7-di-O-methylonaringenin H Pn H H 6-prenylonaringenina; 6-prenylnaringenin H H H Pn 8-prenylonaringenina; 8-prenylnaringenin H Pn H Pn 6,8-diprenylonaringenina; 6,8-diprenylnaringenin H Gn H H 6-geranylonaringenina; 6-geranylnaringenin H H H Gn 8-geranylonaringenina; 8-geranylnaringenin

1.3. Biotransformacje flawonoidów chmielowych

Do badania metabolizmu flawonoidów chmielowych w organizmie człowieka, przede wszystkim ksantohumolu i 8-prenylonaringeniny, zastosowano jako modele: szczury, frakcje mikrosomalne wątroby ludzkiej i szczurzej, ludzkie enzymy oraz drob-noustroje.

W procesie transformacji ksantohumolu przez mikrosomy wątroby ludzkiej i szczurzej nastĊpowała glukuronidacja w pozycjach C-4 i C-4’ (rys. 10, 11), przy czym druga z wymienionych pozycji była uprzywilejowana ze wzglĊdu na przestrzenną zawa-dĊ, którą stanowi grupa prenylowa w pierĞcieniu A [203].

OH OH O H O OMe O H R₂O OH O OMe OR₁ OH O OH OMe O O H OH OH O H O OMe O H OH OH O H O OMe OH OH OH O OMe O 4' 4 R1= H R2 = β-glukuronyl/β-glucuronyl R1 = β-glukuronyl/β-glucuronyl R2 = H ksantohumol C xanthohumol C

Rys. 10. Produkty transformacji ksantohumolu przez mikrosomy ludzkiej wątroby

Enzymy mikrosomalnej frakcji wątroby ludzkiej hydroksylowały metylową grupĊ podstawnika prenylowego, dając tylko izomer trans, a takĪe pozycjĊ C-2”’ łaĔcucha prenylowego [139]. Mikrosomy wątroby ludzkiej i szczurzej wytwarzały dodatkowo jeden produkt hydroksylacji w pierĞcieniu B oraz kilka produktów cyklizacji łaĔcucha prenylowego [139, 202]. R₂O OH O OMe OR₁ OH O OH OMe O O H OH O OH OMe O OH OH OH O H O OMe OH OH O OMe O OH 4' ₄ ksantohumol C xanthohumol C R1= H R2 = β-glukuronyl/β-glucuronyl R1 = β-glukuronyl/β-glucuronyl R2 = H

Rys. 11. Produkty transformacji ksantohumolu przez mikrosomy wątroby szczura

Fig. 11. Rat liver microsomes transformation products of xanthohumol

Z odchodów szczurów karmionych ksantohumolem (1 g na 1 kg masy ciała) wy-izolowano, oprócz ksantohumolu stanowiącego 89% ekstraktu, 11% metabolitów, wĞród których oznaczono 16 związków pokazanych na rysunku 12. Były to produkty hydroksy-lacji, O-metyhydroksy-lacji, O-acetyhydroksy-lacji, epoksydacji i cyklizacji łaĔcucha prenylowego oraz glukuronidacji w pozycji C-4’ [141]. Zastosowanie ludzkich glukuronozylotransferaz i sulfotransferaz do badania drugiej fazy metabolizmu ksanthumolu in vitro wykazało moĪliwoĞü tworzenia róĪnych monoglukuronidów i monosiarczanów w przewodzie pokarmowym [154].

Rys. 12. Metabolity ksantohumolu obecne w odchodach szczura Fig. 12. Xanthohumol metabolites in faeces of rats

OH O H O OH OMe R O OMe OH O H O O H O OH OMe O OH R OH O OH OMe O O H R O H O H OH OH O OMe R2O OR1 OH O OH OMe O R OH O H O OMe OH O OH O H R OMe O O O H OH O OH OMe O R O H OH O OH OMe O O OH OMe O O H R R = R1 = H R1 = Me R2 = H R1 = Ac R2 = H R = R = H R = OMe R = H R = H R = OH 1" 4" 5" 1" 4" 5" 3' 4' 4 α β 3" 2" 4" R = H ksantohumol C/xanthohumol C R = OMe 3" ksantohumol D xanthohumol D izoksantohumol isoxanthohumol R = H R = OH R2 = b-glukuronyl/b-glucuronyl

OH O H O OH OMe OH O OMe R₁O OR2 OH O H OMe O O OH OMe O O RO OH OMe O O O O H O H O OH OMe O OH OH O OH OMe O O H Penicillium chrysogenum Cunninhamella elegans Rhizopus oryzae R1= b-glukopiranozyl/b-glucopyranosyl, R2 = H R1= b-glukopiranozyl/b-glucopyranosyl, R2 = b-glukopiranozyl/b-glucopyranosyl izoksantohumol isoxanthohumol R = b-glukopiranozyl/b-glucopyranosyl ksantohumol xanthohumol Pichia membranifaciens

Rys. 13. Mikrobiologiczne transformacje ksantohumolu Fig. 13. Microbial transformation of xantohumol

Mikrobiologicznej transformacji ksantohumolu poĞwiĊcono dotychczas jedynie cztery prace, z których jedna jest wynikiem badaĔ autorki niniejszej rozprawy, przedsta-wionych w rozdziale 2.3 [76, 77, 92, 104]. W wyniku selekcji drobnoustrojów obejmują-cych sumarycznie 59 mikroorganizmów wyłoniono cztery grzyby, transformujące ksan-tohumol z wysoką wydajnoĞcią. Produktami biotransformacji z ich udziałem były chal-konowe produkty cyklizacji grupy prenylowej, obecne równieĪ w odchodach szczurów karmionych ksantohumolem i glukozylacji w pozycjach C-4 i/lub C-4’, a takĪe flawanony: izoksantohumol, jego C-7 glukozyd oraz produkt cyklizacji jego grupy prenylowej (rys. 13).

8-Prenylonaringenina została intensywnie przetestowana pod kątem aktywnoĞci estrogennej, jednak jej metabolizmowi poĞwiĊcono niewiele prac. Nikolic i wsp. uĪyli mikrosomów ludzkiej wątroby i zaobserwowali 12 produktów metabolizmu 8-prenylonaringeniny (rys. 14) [138]. Biotransformacja zachodziła w łaĔcuchu prenylo-wym i szkielecie flawanonu. Utlenianie miało miejsce głównie w terminalnej grupie metylowej, a w powstających produktach przewaĪał izomer trans. Dwa z powstałych związków: trans-8-(4’’-hydroksyprenylo)naringenina i trans-8-(4’’-oksoprenylo)narin-genina, wykazywały aktywnoĞü estrogenną in vitro [209]. Nie znaleziono doniesieĔ lite-raturowych o metabolizmie 8-prenylonaringeniny przez drobnoustroje, za to inne chmie-lowe flawanony: 6-prenylonaringeninĊ i 6,8-diprenylonaringeninĊ zastosowano jako substraty do transformacji w hodowlach grzybów Aspergillus flavus, Botrytis cinerea i Ascochyta rabiei [180]. Drobnoustroje nie transformowały drugiego z substratów, natomiast z 6-prenylonaringeniny powstawały: 3-hydroksy- i 2,3-di-hydrodihydro-ksyprenylo-podstawiona naringenina oraz dihydrofurano-podstawiona naringenina.

Transformacje izoksantohumolu prowadzono głównie w celu okreĞlenia dróg jego przekształceĔ w organizmie człowieka i potwierdzenia słusznych, jak siĊ okazało, przy-puszczeĔ, Īe moĪe on byü prekursorem 8-prenylonaringeniny. Enzymatyczne transfor-macje z udziałem ludzkich cytochromów P-450 dały produkt demetylacji, czyli 8-prenylonaringeninĊ oraz produkty hydroksylacji terminalnej grupy metylowej zarówno izoksantohumolu, jak i 8-prenylonaringeniny, przede wszystkim jej izomer trans (rys. 15) [67]. 8-Prenylonaringenina powstawała równieĪ podczas transformacji izoksan-tohumolu przez frakcjĊ mikrosomalną wątroby ludzkiej [139]. ZdolnoĞü do demetylacji izoksantohumolu wykazywały drobnoustroje przewodu pokarmowego człowieka, w tym wyodrĊbnione bakterie Eubacterium limosum [148, 149].

OH O O O O H OH OH O O O OH OH OH O O OH O O H O O OH OH O H O O OH OH OH O H O O OH OH O H O O OH R OH O H O O OH OH O H O O OH O OH OH OHC O H OH R =

Rys. 14. Produkty transformacji 8-prenylonaringeniny przez mikrosomy wątroby ludzkiej

OH O H O O OMe OH O H O O OMe R OH O H O O OH R OH O H O O OH OH O H OH O H O H OH OH O H O O OMe OH OH O H O O OMe O H O H O O OMe OH O OMe OH O O O H O 8-prenylonaringenina 8-prenylnaringenin R= R=

Rys. 15. Produkty transformacji izoksantohumolu przez ludzkie mikrosomy wątroby i cytochromy

P-450

Fig. 15. Human liver microsomes and cytochromes P-450 transformation products of isoxantho-humol

1.4. Wychmieliny jako

Ĩródło substancji odĪywczych

i biologicznie aktywnych

Poekstrakcyjny odpad chmielowy, okreĞlany najczĊĞciej jako wychmieliny, jest produktem odpadowym przemysłu browarniczego i stanowi bogate Ĩródło cennych związków zarówno odĪywczych, jak i wykazujących róĪnorodną aktywnoĞü biologiczną. Powstaje podczas ekstrakcji szyszek chmielowych, ĪeĔskich kwiatostanów chmielu (Humulus lupulus L.), prowadzonej w celu uzyskania gorzkich kwasów oraz olejków eterycznych. Ekstrakt taki dodaje siĊ do piwa, by nadaü mu charakterystyczny zapach i gorzki smak.

Wychmieliny nie znalazły dotąd innego powszechnego zastosowania niĪ jako na-wóz. DuĪe browary dodają czasem niewielkie iloĞci wychmielin, ok. 5%, do suszonych wysłodzin przeznaczonych na paszĊ. Jedne z wczeĞniejszych badaĔ dotyczyły uĪycia wychmielin jako karmy dla owiec [195] i krów [38]. Podejmowano próby zastosowania ich do produkcji olejków eterycznych [115], jako Ĩródła cukrów i kwasów organicznych [51, 142, 189] oraz do usuwania metali ciĊĪkich z roztworów wodnych [58].

Poekstrakcyjny odpad chmielowy ze wzglĊdu na bardzo duĪą, porównywalną z suszem lucerny zawartoĞü białka, 20–30% w zaleĪnoĞci od gatunku chmielu, moĪe stanowiü podstawowy składnik mieszanek paszowych dla zwierząt. JednakĪe obecnoĞü gorzkich kwasów, poĪądana w przypadku ekstraktu chmielowego, tolerowana w wych-mielinach przeznaczonych na nawóz, jest nie do przyjĊcia w wychwych-mielinach przeznaczo-nych na dodatki do pasz. Warunkiem tego ostatniego sposobu wykorzystania jest zmiana gorzkiego smaku, powodującego niechĊü zwierząt do spoĪywania wychmielin, oraz pozbycie siĊ innych niepoĪądanych składników. Jest nim przede wszystkim działa-jący uspokajająco i nasennie 2-metylo-3-buten-2-ol, powstadziała-jący podczas rozkładu gorz-kich kwasów [199]. Tak wiĊc usuniĊcie z wychmielin gorzgorz-kich kwasów rozwiązuje jednoczeĞnie dwa problemy: niechĊtnego spoĪywania paszy i ospałoĞci karmionych nią zwierząt.

Produkty chmielowe, takie jak: szyszki, proszki, granulaty i ekstrakt chmielowy, są podatne na degradacjĊ, dlatego ich przechowywanie wymaga odpowiednich warun-ków. Na przykład granulaty pakuje siĊ próĪniowo w foliĊ i magazynuje w temp. od –2 do +4°C, aby uniknąü utlenienia i polimeryzacji Īywicy chmielowej oraz olejków eterycznych [26]. Granulat o wilgotnoĞci 7%, przechowywany w temp. 30°C z dostĊpem i bez dostĊpu tlenu, tracił odpowiednio 70 i 3% ȕ-kwasów i 62 i 19% Į-kwasów, przy czym ubytek tych ostatnich moĪna tłumaczyü czĊĞciowym przekształceniem w izo-Į-kwasy [52]. Degradacja gorzkich kwasów chmielowych powoduje nie tylko obniĪenie goryczki sensorycznej, ale równieĪ powstawanie rozmaitych produktów. Mechanizm degradacji i budowa wszystkich produktów tego procesu nie została jeszcze do koĔca poznana [190].

Głównymi czynnikami wpływającymi na rozkład gorzkich kwasów w piwie są: Ğwiatło, temperatura i tlen atmosferyczny. Ulegają one przede wszystkim autooksydacji i reakcji wolnorodnikowej, przyspieszanej przez jony Īelaza, miedzi i nadtlenek wodoru [102]. Jony metali przejĞciowych katalizują reakcje typu Fentona (Fe2+

) i Habera-Weissa (Cu+), dające aktywne formy tlenu, takie jak rodniki hydroksylowe. W nienasyconych

łaĔcuchach bocznych kwasów gorzkich, na atomach wĊgla sąsiadujących z wiązaniem podwójnym, tworzą siĊ nadtlenki, rozpadające siĊ nastĊpnie do izobutanalu i acetonu (rys. 16). Dlatego ȕ-kwasy z geminalnymi grupami izoprenylowymi są najbardziej podatne na autooksydacjĊ, a zredukowane kwasy gorzkie są na nią odporne.

H H CHR C H₃ C H₃ CHR O₂ H CHR C H₃ C H₃ HOO H C H₃ C H₃ OOH R H C H₃ C H₃ C H₃ C H₃ O CH₂R H C H₃ CH₂R C H₃ C H₃ H₃C O H H O C C C C C C

.

.

.

-H C C C C C CH C C + C

Rys. 16. Proponowany mechanizm autooksydacji łaĔcucha prenylowego [23]

Fig. 16. Proposed autooxidation of prenyl side chain [23]

Reakcje autooksydacji dotyczą nie tylko łaĔcuchów izoprenylowych, ale równieĪ pierĞcienia. Utlenianie humulonu daje m.in. humulinon o intensywnie gorzkim smaku, zȕ-kwasów powstają hulupony (rys. 17), dwukrotnie bardziej gorzkie niĪ izo-Į-kwasy i ok. 40 innych związków opisanych przez Verzelego i De Keukeleirego [192].

Efektem naĞwietlania izo-Į-kwasów jest powstawanie 3-metylo-2-buten-1-tiolu o bardzo nieprzyjemnym zapachu skunksa, tzw. „skunky thiol”, wyczuwanego przez niektórych ludzi nawet w stĊĪeniu 0,4 ng dm-3. Z tego powodu piwo konfekcjonuje siĊ w ciemnych butelkach i przechowuje w ciemnych pomieszczeniach. WyĪej wymieniony związek pochodzi z reakcji fotolizy łaĔcucha bocznego, uwalniającej rodnik 4-metylo-3- -pentenoilowy, ulegający dekarboksylacji, a nastĊpnie reakcji z rodnikiem tiolowym, pochodzącym np. z cysteiny, tworząc wspomniany wyĪej merkaptan i kwas dehydrohu-mulinowy (rys. 18). WraĪliwym na Ğwiatło UV chromoforem w izohumulonach jest acyloinowa grupa utworzona z trzeciorzĊdowej grupy hydroksylowej na C-4 i karbony-lowej grupy łaĔcucha bocznego. Przedstawiony na rys. 18 mechanizm, zaproponowany

przez KuroiwĊ i współpracowników [113], potwierdził obecnoĞü 3-metylo-2-buten-1- -tiolu w naĞwietlanych piwach. PoniewaĪ izohumulony nie absorbują Ğwiatła widzialne-go, pod jego wpływem opisany wyĪej proces zachodzi w obecnoĞci fotoreaktywnych, absorbujących to Ğwiatło związków, tzw. fotosensytyzerów, takich jak ryboflawina [96].

R O OH O H OH R O O O O R O OH O H _OH CO O R O OH O H O humulinony humulinones hulupony hulupones R= -CH2CH(CH3)2 -CH(CH3)2 -CH(CH3)CH2CH3 deoksyhumulony deoxyhumulones kwasy humulinowe humulinic acids

Rys. 17. Niektóre produkty oksydatywnego rozkładu chmielowych kwasów gorzkich Fig. 17. Some oxidative degradation products of hop bitter acids

O O OH O O H O OH O O H O O OH O O SH izohumulon isohumulone

.

.

kwas dehydrohumulinowy dehydrohumulinic acid 3-metylo-2-buten-1-tiol 3-methylbut-2-ene-1-thiol

.

-H -CO +HS

.

4 UV light or visible light (350-500 nm) + photosensitizer

wiatło UV lub wiatło widzialne (350-500 nm) + fotosensytyzer

Rys. 18. Powstawanie w piwie związków zapachowych typu „uderzenie Ğwietlne”

Problem mikrobiologicznego psucia produktów chmielowych, poza piwem, jest mało zbadany. Poza pracami autorki tej dysertacji [89–91] nie ma innych doniesieĔ o mikrobiologicznych przekształceniach gorzkich kwasów chmielowych, co moĪe wyni-kaü z ogólnie znanych właĞciwoĞci przeciwbakteryjnych i przeciwgrzybicznych tych związków. PodjĊto natomiast próby takich biotransformacji z uĪyciem zawiesinowych kultur komórkowych roĞlin: chmielowych komórek kalusowych [152] i rozdrobnionego miąĪszu owoców i warzyw [125]. Pierwsza z przytoczonych prac powstała jako nastĊp-stwo obserwacji, Īe w zebranych dojrzałych szyszkach chmielowych zachodzi degrada-cja Į-kwasów. Wykazano w niej, Īe wytwarzane przez komórki kalusowe enzymy utle-niają humulon i kohumulon do humulinonu i kohumulinonu, znanych produktów perok-sydacji tych substratów [191] posiadających gorzki smak. Druga z prac wykazała zdol-noĞü enzymów zawartych w miąĪszu owoców i warzyw, takich jak jabłko, chrzan i pie-truszka, do transformacji Į- i ȕ-kwasów do nieokreĞlonych bliĪej produktów o zwiĊkszo-nej polarnoĞci [125].

Rozpuszczalnikiem szczególnie obecnie polecanym do produkcji ekstraktu chmie-lowego jest nadkrytyczny dwutlenek wĊgla, poniewaĪ wydobywa z szyszek chmielo-wych niemal cały olejek eteryczny, daje wysoki stosunek humulonów do mniej gorzkich lupulonów oraz zawiera małe iloĞci twardych Īywic, triglicerydów, wosków, chlorofili i nieorganicznych soli, przez co produkt finalny, którym jest piwo, ma lepiej wywaĪony smak i aromat. Metoda ta ma jednak swoje ograniczenia, np. związki polarne, takie jak flawonoidy nie mogą byü wydajnie ekstrahowane czystym nadkrytycznym dwutlenkiem wĊgla [72, 127]. W tej przemysłowo stosowanej metodzie ekstrakcji wiĊkszoĞü flawono-idów pozostaje w materiale odpadowym, w wychmielinach, przez co stanowi on szcze-gólnie dogodne Ĩródło tych naturalnych związków o bardzo szerokim spektrum aktyw-noĞci biologicznej. Związki takie jak ksantohumol mogą staü siĊ substancjami wiodący-mi do syntezy nowych pochodnych i z duĪym prawdopodobieĔstwem moĪna załoĪyü, Īe produkty te bĊdą wykazywaü aktywnoĞü biologiczną. Są teĪ składnikami nutraceuty-ków, których przykładami mogą byü preparaty Meridium XN (BioNovix Inc.) i VitaXan (ProMedX Health, Inc.).

2. PRZEDSTAWIENIE I DYSKUSJA WYNIKÓW

2.1. Mikrobiologiczne transformacje steroidów

W wyniku selekcji drobnoustrojów transformujących 17Į-metylotestosteron (2) wyłoniono trzy grzyby, które zastosowano do modyfikacji hormonów: testosteronu (1), progesteronu (6) i dehydroepiandrosteronu (7) oraz ich syntetycznych pochodnych: 17Į-metylotestosteronu (2), 19-nortestosteronu (3), 1-dehydrotestosteronu (4) i 1-de-hydro-17Į-metylotestosteronu (5) (rys. 19). Były to: Absidia glauca AM177, Beauveria bassiana AM446 oraz Botrytis cinerea AM235, pochodzące z kolekcji Katedry Biologii i Botaniki Akademii Medycznej we Wrocławiu.

O OH O OH O OH O OH O OH O O O O H 1 2 3 5 4 6 7 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111213 14 15 16 17 18 19

Rys. 19. Substraty steroidowe: testosteron (1), 17Į-metylotestosteron (2), 19-nortestosteron (3),

1-dehydrotestosteron (4), 1-dehydro-17Į-metylotestosteron (5), progesteron (6) i

dehy-droepiandrosteron (7)

Fig. 19. Steroids substrates: testosterone (1), 17Į-methyltestosterone (2), 19-nortestosterone (3),

1-dehydrotestosterone (4), 1-dehydro-17Į-methyltestosterone (5), progesterone (6) and

Substraty dobrano w taki sposób, by moĪna było Ğledziü zaleĪnoĞü przebiegu bio-transformacji od ich budowy. RóĪnice w stosunku do testosteronu (1) polegały na obec-noĞci dodatkowego wiązania podwójnego C1-C2(związki 4, 5), dodatkowej grupy

17Į--metylowej (związki 2, 5) i braku grupy metylowej w pozycji 19 (związek 3). Wiadomo, Īe wspomniane modyfikacje budowy zwiĊkszają aktywnoĞü anaboliczną i obniĪają androgenną, sprawiając, Īe takie pochodne mogą byü efektywnymi anabolikami [4]. W przypadku Beauveria bassiana, gatunku dobrze rozpoznanego, wrĊcz modelowego w dziedzinie biotransformacji [65], zastosowano dwa dodatkowe substraty – powszech-nie badany progesteron (6) i rzadziej stosowany dehydroepiandrosteron (7).

2.1.1. Transformacje steroidów przez Absidia glauca

Przedstawione w tym rozdziale wyniki biotransformacji zostały opublikowane w artykule „Transformations of testosterone and related steroids by Absidia glauca cultu-re” [93].

Rodzaj Absidia znany jest ze zdolnoĞci do hydroksylacji steroidów [24, 30, 34, 118, 165, 186, 196, 208]. W przypadku gatunku A. glauca, przede wszystkim w stero-idach, o 21 wĊglach odnotowano nastĊpujące typy hydroksylacji: 1ȕ, 3ȕ, 6ȕ, 7ȕ, 11Į, 11ȕ i 14Į [30, 34, 118, 208]. WczeĞniejsze badania prowadzone przy uĪyciu A. coerulea wykazały wyraĨną zaleĪnoĞü pomiĊdzy strukturą substratu a przebiegiem biotransforma-cji [24].

Wzory produktów biotransformacji steroidów przez Absidia glauca AM177 zamieszczono na rys. 20a i 20b, natomiast wydajnoĞci otrzymanych związków pokazuje tabela 1.

Transformacje prowadzono do momentu przereagowania całego substratu, co zajmowało drobnoustrojom od 3 do 7 dni. Wszystkie testowane substraty ulegały hydroksylacji, a w przypadku związków 1, 3 i 4, obserwowano dodatkowo utlenienie grupy hydroksylowej przy C-17 do karbonylowej. Hydroksylacja w pozycji 6ȕ miała miejsce w biotransformacji kaĪdego z uĪytych związków, jest wiĊc stosunkowo nieza-leĪna od budowy substratu, chociaĪ moĪna zauwaĪyü, Īe najwiĊksze stĊĪenia 6ȕ-alkoholi (9, 11, 13) otrzymano z substratów bez wiązania podwójnego w pozycji C1-C2. Tego

typu transformacja jest w przypadku 4-en-3-oksosteroidów powszechna zarówno u ssa-ków, jak i mikroorganizmów [30, 126, 151]. 1-Dehydrosteroidy (4, 5) były hydroksylo-wane od strony ȕ, w pozycjach 6ȕ, 7ȕ i 15ȕ, przy czym 7ȕ- i 15ȕ-produkty izolowano wyłącznie z transformacji substratów posiadających wiązanie podwójne C1-C2.

Nato-miast 12ȕ-hydroksylacja miała miejsce tylko w substratach z dodatkową grupą 17Į-metylową lub przy braku grupy 19-metylowej, 7Į-hydroksylacja tylko w przypadku testosteronu (1), a 11Į-hydroksylacja w przypadku testosteronu i 17Į-metylotestosteronu (2). 17Į-Metylowa grupa nie hamowała hydroksylacji w pierĞcieniu D. PoniewaĪ atomy wodoru w pozycjach 6ȕ i 12ȕ mogą znajdowaü siĊ w analogicznym połoĪeniu wobec centrum aktywnego enzymu po obrocie cząsteczki o 180° wokół osi wyznaczonej przez C3 i C17 oraz jednoczesnej zamianie pozycji wiązania steroidu C-3 na C-17 (rys. 6, połoĪenia I i III), transformacje te mogą byü prowadzone przez ten sam układ enzyma-tyczny. Potwierdzeniem tego przypuszczenia moĪe byü produkt podwójnej hydroksylacji 6ȕ,11Į-dihydroksy-17Į-metylotestosteron (11).

O OH O OH O OH O O O O H OH O OH O OH OH O OH OH OH O OH O H O OH OH O O O OH OH O OH OH + + + + + 1 2 3 8 9 10 11 12 14 16 15 13 +

Rys. 20a. Transformacje steroidów przez Absidia glauca Fig. 20a. Transformation of steroids by Absidia glauca

O OH OH O O OH OH O OH O O OH OH O OH OH O OH OH O OH OH O OH OH + + ₊ + + 4 5 17 18 19 20 21 22 23

Rys. 20b. Transformacje steroidów przez Absidia glauca Fig. 20b. Transformation of steroids by Absidia glauca

Wprowadzenie grupy hydroksylowej do 19-nortestosteronu w pozycji 10ȕ jest typowe dla 19-nor-4-en-3-oksosteroidów [70, 83]. W wielu przypadkach odnotowano konkurencjĊ pomiĊdzy 6ȕ- a 10ȕ-hydroksylacją w tego typu związkach i postuluje siĊ, Īe są efektem działania tej samej 6ȕ-hydroksylazy [161]. Dla rodzaju Absidia opisano juĪ hydroksylacjĊ w pozycji 15ȕ [34, 208], ale informacje te nie dotyczą gatunku A. glauca. Nie znaleziono równieĪ doniesieĔ o 12ȕ-hydroksylacji prowadzonej przez grzyby Absidia.

Tabela 1 Table 1 Transformacja steroidów przez Absidia glauca

Transformation of steroids by Absidia glauca Substrat Substrate Produkty Products WydajnoĞüa Yielda [%] testosteron 1 testosterone 1 7Į-hydroksyandrostendion 8 7Į-hydroxyandrostenedione 8 6ȕ,11Į-dihydroksyandrostendion 9 6ȕ,11Į-dihydroxyandrostenedione 9 38 30 17Į-metylotestosteron 2 17Į-methyltestosterone 2 12ȕ-hydroksy-17Į-metylotestosteron 10 12ȕ-hydroxy-17Į-methyltestosterone 10 6ȕ,11Į-dihydroksy-17Į-metylotestosteron 11 6ȕ,11Į-dihydroxy-17Į-methyltestosterone 11 11Į-hydroksy-17Į-metylotestosteron 12 11Į-hydroxy-17Į-methyltestosterone 12 32 26 19 19-nortestosteron 3 19-nortestosterone 3 6ȕ-hydroksy-19-nortestosteron 13 6ȕ-hydroxy-19-nortestosterone 13 19-norandrostendion 14 19-norandrostenedione 14 12ȕ-hydroksy-19-nortestosteron 15 12ȕ-hydroxy-19-nortestosterone 15 10ȕ-hydroksy-19-nortestosteron 16 10ȕ-hydroxy-19-nortestosterone 16 23 21 18 16 1-dehydrotestosteron 4 1-dehydrotestosterone 4 7ȕ-hydroksy-1-dehydrotestosteron 17 7ȕ-hydroxy-1-dehydrotestosterone 17 15ȕ-hydroksy-1-dehydrotestosteron 18 15ȕ-hydroxy-1-dehydrotestosterone 18 7ȕ-hydroksy-1-dehydroandrostendion 19 7ȕ-hydroxy-1-dehydroandrostenedione 19 6ȕ-hydroksy-1-dehydrotestosteron 20 6ȕ-hydroxy-1-dehydrotestosterone 20 50 22 10 9 1-dehydro- 17Į-metylotestosteron 5 1-dehydro- 17Į-methyltestosterone 5 15ȕ-hydroksy-1-dehydro-17Į-metylotestosteron 22 15ȕ-hydroxy-1-dehydro-17Į-methyltestosterone 22 7ȕ-hydroksy-1-dehydro-17Į-metylotestosteron 23 7ȕ-hydroxy-1-dehydro-17Į-methyltestosterone 23 6ȕ-hydroksy-1-dehydro-17Į-metylotestosteron 24 6ȕ-hydroxy-1-dehydro-17Į-methyltestosterone 24 28 26 20 a

wydajnoĞü wyznaczona metodą GC a _{yield determined by GC}

2.1.2. Transformacje steroidów przez Botrytis cinerea

Przedstawione w tym rozdziale wyniki biotransformacji zostały opublikowane w artykule „Transformations of testosterone and related steroids by Botrytis cinerea” [94].

Botrytis cinerea to powszechnie wystĊpujący patogen infekujący wiele przemy-słowo uprawianych roĞlin, w tym: winoroĞl, sałatĊ, marchew, truskawki i tytoĔ. Z tego wzglĊdu znaczna czĊĞü prac dotyczących tego drobnoustroju to biotransformacje ewen-tualnych czynników przeciwgrzybicznych oraz warunkujących jego patogennoĞü [3]. Literaturowe przykłady transformacji pokazały zdolnoĞü B. cinerea do hydroksylacji 4-en-3-oksosteroidów głównie w pozycjach 11Į i 11ȕ, w steroidach o 21 wĊglach w pozycjach 2ȕ i 6ȕ [30], 7ȕ w testosteronie oraz 11Į i 16ȕ w pregnenolonie [49].

Wzory produktów biotransformacji steroidów przez Botrytis cinerea AM235 pokazano na rys. 21, natomiast wydajnoĞci otrzymanych związków zamieszczono w tabeli 2. Transformacje prowadzono do zaniku substratu, od 3 do 11 dni.

O OH O OH O OH O OH O OH O OH OH O OH OH O OH O O OH OH O OH OH OH O OH + 1 2 3 4 5 24 26 27 28 29 25

Rys. 21. Transformacja steroidów przez Botrytis cinerea Fig. 21. Transformation of steroids by Botrytis cinerea

Tabela 2 Table 2 Transformacja steroidów przez Botrytis cinerea

Transformation of steroids by Botrytis cinerea Substrat Substrate Produkty Products WydajnoĞüa Yielda [%] testosteron 1 testosterone 1 7Į-hydroksytestosteron 24 7Į-hydroxytestosterone 24 76 17Į-metylotestosteron 2 17Į-methyltestosterone 2 7Į-hydroksy-17Į-metylotestosteron 25 7Į-hydroxy-17Į-methyltestosterone 25 82 19-nortestosteron 3 19-nortestosterone 3 10ȕ-hydroksy-19-norandrost-4-en-3,17-dion 26 10ȕ-hydroxy-19-norandrost-4-en-3,17-dione 26 78 1-dehydrotestosteron 4 1-dehydrotestosterone 4 14Į-hydroksy-1-dehydrotestosteron 27 14Į-hydroxy-1-dehydrotestosterone 27 7Į-hydroksy-1-dehydrotestosteron 28 7Į-hydroxy-1-dehydrotestosterone 28 68 27 1-dehydro- 17Į-metylotestosteron 5 1-dehydro- 17Į-methyltestosterone 5 7Į-hydroksy-1-dehydro-17Į-metylotestosteron 29 7Į-hydroxy-1-dehydro-17Į-methyltestosterone 29 52 a

wydajnoĞü wyznaczona metodą GC a _{yield determined by GC}

Wszystkie produkty, z wyjątkiem 26 i 27, posiadają grupĊ 7Į-hydroksylową. Tylko jeden substrat, 1-dehydrotestosteron (4), uległ hydroksylacji w pozycji 14Į. Drugi z substratów z wiązaniem nienasyconym C1-C2, 1-dehydro-17Į-metylotestosteron (5) był

hydroksylowany tylko w pozycji 7Į. Wynik ten jest zgodny z obserwacjami poczynio-nymi dla grzybów z rzĊdu Mucorales, Īe duĪy podstawnik w pozycji C-17 utrudnia hydroksylacjĊ w pozycji 14Į [24, 168], podczas gdy 17ȕ-hydroksysteroidy, jak np. testosteron (1), podlegają wspomnianej modyfikacji [112]. Biotransformacja 19-nortestosteronu (3) dostarczyła jeden produkt bĊdący efektem, wspomnianej w roz-dziale 2.1.1, typowej dla 19-nor-4-en-3-oksosteroidów hydroksylacji w pozycji 10ȕ [70, 83] oraz utlenienia C-17 alkoholu do ketonu. Porównanie dróg transformacji testosteronu (1) i 17Į-metylotesosteronu (2) pokazuje, Īe dodatkowa grupa 17Į-metylowa nie wpływa na pozycjĊ hydroksylacji, chociaĪ czĊĞciowa redukcja wiązania podwójnego C1-C2, miała

miejsce tylko w obecnoĞci tego podstawnika, tj. wtedy, gdy substratem był 1-dehydro- -17Į-metylotestosteron (5). W prowadzonych wczeĞniej badaniach nad przekształcenia-mi Į-kamfolenonów, ten sam szczep wprowadzał grupĊ hydroksylową w pozycjĊ allilo-wą lub poprzez uprzednią epoksydacjĊ [46]. W przypadku transformacji steroidów alli-lowa pozycja C-6 pozostawała niezmieniona, nie obserwowano teĪ epoksydacji, co jed-nak nie wyklucza takich związków poĞrednich w przebiegu hydroksylacji.

Szczep Botrytis cinerea AM235 wydajnie hydroksyluje 4-en-3-oksosteroidy w pozycji 7Į. Pochodne te stanowiły 26–82% wszystkich ekstrahowanych z hodowli związków. W literaturze nie znaleziono doniesieĔ o tego typu transformacji prowadzonej

przez B. cinerea. Oprócz interesującej ze wzglĊdów praktycznych 7Į-hydroksylacji, prowadzącej do związków wyjĞciowych w syntezie diuretyków, obserwowano takĪe 14Į-hydroksylacjĊ wykorzystywaną do syntezy hormonów i leków nasercowych [86, 120].

2.1.3. Transformacje steroidów przez Beauveria bassiana

Przedstawione w tym rozdziale wyniki biotransformacji zostały opublikowane w artykule „Transformation of steroids by Beauveria bassiana” [95].

Beauveria bassiana to szeroko rozpowszechniony grzyb owadobójczy, atakujący ponad sto gatunków [69]. Stosowany jest do zwalczania owadzich szkodników w rolnic-twie [15, 135]. Gatunek ten hydroksyluje 4-en-3-oksosteroidy przede wszystkim w pozy-cji 11Į [10, 27, 28, 64, 160], rzadziej w pozycjach 6ȕ i 11Į, [27, 28, 64]. Hydroksylacje w pozycjach 6ȕ, 11Į, 11ȕ i 15ȕ obserwowano w B-norsteroidzie, 17Į, 21-dihydroksy-B- -nor-pregn-4-en-3,20-dionie [157]. Poza reakcjami hydroksylacji Beauveria bassiana wykazuje zdolnoĞü do redukcji 17-ketonu do 17ȕ-alkoholu [10] i degradacji łaĔcucha bocznego w progesteronie, prowadzącej do testosteronu [160].

Wzory produktów biotransformacji steroidów przez Beauveria bassiana AM446 pokazano na rys. 22a i 22b, natomiast wydajnoĞci otrzymanych związków zamieszczono w tabeli 3.

Transformacje prowadzono do momentu przekształcenia całego substratu, tj. od 3 do 10 dni. Wszystkie produkty transformacji 4-en-3-oksosteroidów posiadały grupĊ 11Į-hydroksylową. Oprócz reakcji hydroksylacji zaobserwowano dwie inne reakcje typu red-oks: nasycenie wiązania podwójnego C4-C5 w testosteronie (1) i wiązania C1-C2

w 1-dehydrotestosteronie (4) oraz utlenienie 17ȕ-alkoholu do 17-ketonu w tych samych substratach (1,4). ObecnoĞü grupy 17Į-metylowej hamowała redukcjĊ wiązaĔ podwój-nych C4-C5 w 17Į-metylotestosteronie (2) i wiązania C1-C2 w 1-dehydro-17

Į-metylo-testosteronie (5). Warto zauwaĪyü, Īe w przypadku 19-nortestosteronu (3) nie zachodziło ani utlenienie wĊgla C-17, ani nasycenie wiązania podwójnego C4-C5. Związek ten był

stosunkowo słabo metabolizowany, co jest zgodne z wynikami badaĔ Shibahary i wsp., którzy pomimo indukcji 11Į-hydrolazy z Aspergillus ochraceus otrzymywali 11Į-hydroksy-19-nortestosteron z niewielką wydajnoĞcią [163].

Transformacja progesteronu (6) prowadziła do 11Į-hydroksytestosteronu (30), powstającego z wysoką 94% wydajnoĞcią. Interesujące jest, Īe odciĊcie łaĔcucha bocz-nego i hydroksylacja dały w efekcie jeden produkt, co dotąd nie było obserwowane dla Īadnego szczepu B. bassiana, okazało siĊ takĪe, iĪ 11Į-hydroksytestosteron (30) lepiej jest otrzymywaü na drodze transformacji progesteronu (6) niĪ testosteronu (1).

Z przedstawionych w tym rozdziale wyników moĪna wyciągnąü wniosek, Īe róĪ-nice strukturalne zastosowanych 4-en-3-oksosteroidów nie wpływały na regio- i stereose-lektywnoĞü hydroksylacji. Szkielet steroidowy był zawsze atakowany od strony Į w pozycji C-11. ChociaĪ pozycje 6ȕ i 11Į są ekwiwalentne w kompleksie enzym- -substrat (rys. 6), to w Īadnym z eksperymentów nie otrzymywano produktów 6ȕ-, ani 6ȕ,11Į-hydroksylacji. W przypadku innych, znanych z hydroksylowania steroidów w pozycji 11Į drobnoustrojów, takich jak: Rhizopus nigricans [211], Aspergillus ochra-ceus [181] i Cephalosporium aphidicola [19], obserwowano zaleĪnoĞü pomiĊdzy struktu-rą substratu, a dokładniej podstawnika przy wĊglu C-17, a przebiegiem transformacji.

O OH O OH O OH O OH O OH O H O O H OH O OH OH O OH O H O OH O H O O H OH O O H O O O H O O O H O O O O H + + + + + + 1 2 3 4 31 32 ₃₃ 34 35 36 30 30 12 32

Rys. 22a. Transformacja steroidów przez Beauveria bassiana Fig. 22a. Transformation of steroids by Beauveria bassiana

O OH O OH O H O OH O H O O O H O H OH O H O OH O H OH O O H + + 5 6 7 30 37 38 39 40

Rys. 22b. Transformacja steroidów przez Beauveria bassiana Fig. 22b. Transformation of steroids by Beauveria bassiana

W celu poszerzenia puli substratów uĪyto do biotransformacji dodatkowo C5-C6

nienasycony steroid, dehydroepiandrosteron (7), oczekując typowej dla stosowanego drobnoustroju 11Į-hydroksylacji, z drugiej zaĞ strony – typowej dla 5-ensteroidów hydroksylacji w allilowej pozycji C-7. Jako główny produkt otrzymano 5-androsten- -3ȕ,11Į,17ȕ-triol (38), powstający w wyniku reakcji obserwowanych na przykładzie 4-en-3-oksosteroidów. ObecnoĞü wĞród produktów transformacji androstendiolu (40) sugeruje, Īe 11Į-hydroksylacjĊ poprzedza redukcja C-17-ketonu do 17ȕ-alkoholu. 11Į-Hydroksylacja dehydroepiandrosteronu (7) bez utlenienia na C-3 jest charaktery-styczna dla tzw. „11Į-hydroksylatorów”, jakimi są: Rhizopus nigricans [150], Rhizopus arrhizus [84] i Aspergillus ocraceus [11]. Natomiast 7Į-hydroksydehydroepiandrosteron (39) jest produktem nietypowym dla Beauveria bassiana AM446, za to powstaje po-wszechnie w hodowlach innych grzybów, np. Fusarium culmorum [109] i wraz z andro-stendiolem (40) w róĪnych komórkach myszy. 7Į-hydroksydehydroepiandrosteron (39) jest silniejszym aktywatorem procesu odpowiedzi immunologicznej od dehydroepiandro-steronu (7) [134].

Tabela 3 Table 3 Transformacja steroidów przez Beauveria bassiana

Transformation of steroids by Beauveria bassiana Substrat Substrate Produkty Products WydajnoĞüa Yielda [%] testosteron 1 testosterone 1 11Į-hydroksytestosteron 30 11Į-hydroxytestosterone 30 5Į-androstan-11Į,17ȕ-diol-3-on 31 5Į-androstan-11Į,17ȕ-diol-3-one 31 11Į-hydroksyandrost-4-en-3,17-dion 32 11Į-hydroxyandrost-4-ene-3,17-dione 32 5Į-androstan-11Į-ol-3,17-dion 33 5Į-androstan-11Į-ol-3,17-dione 33 55 15 10 8 17Į-metylotestosteron 2 17Į-methyltestosterone 2 11Į-hydroksy-17Į-metylotestosteron 12 11Į-hydroxy-17Į-methyltestosterone 12 95 19-nortestosteron 3 19-nortestosterone 3 11Į-hydroksy-19-nortestosteron 34 11Į-hydroxy-19-nortestosterone 34 40 1-dehydrotestosteron 4 1-dehydrotestosterone 4 11Į-hydroksy-1-dehydrotestosteron 35 11Į-hydroxy-1-dehydrotestosterone 35 11Į-hydroksyandrost-1,4-dien-3,17-dion 36 11Į-hydroxyandrost-1,4-diene-3,17-dione 36 11Į-hydroksytestosteron 30 11Į-hydroxytestosterone 30 11Į-hydroksyandrost-4-en-3,17-dion 32 11Į-hydroxyandrost-4-ene-3,17-dione 32 56 13 11 9 1-dehydro- 17Į-metylotestosteron 5 1-dehydro- 17Į-methyltestosterone 5 11Į-hydroksy-1-dehydro- 17Į-metylotestosteron 37 11Į-hydroxy-1-dehydro- 17Į-methyltestosterone 37 87 progesteron 6 progesterone 6 11Į-hydroksytestosteron 30 11Į-hydroxytestosterone 30 94 dehydroepiandrosteron 7 dehydroepiandrosterone 7 5-androsten-3ȕ,11Į,17ȕ-triol 38 7Į-hydroksydehydroepiandrosteron 39 7Į-hydroxydehydroepiandrosterone 39 androstendiol 40 androstenediol 40 60 13 8 a

wydajnoĞü wyznaczona metodą GC a

Istnieje wiele doniesieĔ naukowych na temat bardzo wysokiej regio- i stereoselek-tywnoĞci reakcji katalizowanych przez enzymy Beauveria bassiana. Jeden ze szczepów tego gatunku, B. bassiana ATCC 7159, znany równieĪ jako B. sulfurescens i Sporotri-chum sulfurescens, uznano nawet za drobnoustrój modelowy, a przez to stosowany do róĪnego typu reakcji, takich jak: hydroksylacja nasyconych i aromatycznych atomów wĊgla, przekształceĔ keton-alkohol, redukcji i utleniania alkenów, utleniania siarczków, utleniania typu Baeyera-Villigera, glukozydacji, hydrolizy estrów i epoksydów oraz dealkilacji. Wyniki tych badaĔ zostały zebrane przez Grogana i Hollanda [65]. Dla tych autorów najistotniejsze wydaje siĊ byü uĪycie B. bassiana do selektywnej hydroksylacji szerokiego spektrum związków organicznych, takich jak amidy, laktamy, karbaminiany, azydki i sulfonamidy.

Beauveria bassiana AM446 wytwarza 11Į-hydroksylowane pochodne steroidów, szczególnie dehydroepiandrosteronu (7), 17Į-metylotestosteronu (2) i 1-dehydro- -17Į-metylotestosteronu (5). Przy niskiej specyficznoĞci substratowej charakteryzuje siĊ szczególnie wysoką regio- i stereoselektywnoĞcią.

2.2. Mikrobiologiczna degradacja gorzkich kwasów

chmielowych

W przeprowadzonych badaniach związkami modelowymi były Į- i ȕ-kwasy (rys. 7), składniki dostĊpnego handlowo ekstraktu chmielowego. Ekstrakt ten wprowa-dzano do uprzednio naroĞniĊtych kultur z powodu jego dobrze poznanych właĞciwoĞci przeciwbakteryjnych i przeciwgrzybicznych, opisanych w rozdziale 1.2. Dlatego teĪ próby hodowania drobnoustrojów na poĪywkach zawierających 100 mg gorzkich kwasów w dm-3, czyli w iloĞci odpowiadającej maksymalnej zawartoĞci izo-Į-kwasów w bardzo gorzkich piwach angielskich [42], nie dały pozytywnych rezultatów.

2.2.1. Selekcja drobnoustrojów degraduj

ących gorzkie kwasy

chmielowe

Przedstawione w tym rozdziale wyniki badaĔ zostały opublikowane w artykule „Screening for the hop bitter acids degrading microorganisms” [90].

Poszukiwanie mikroorganizmów degradujących gorzkie kwasy chmielowe prze-prowadzono wĞród 54 drobnoustrojów, głównie grzybów. Pochodziły one z nastĊpują-cych kolekcji: Katedry Biologii i Botaniki Akademii Medycznej we Wrocławiu (ozna-czone AM), Katedry Fitopatologii LeĞnej Akademii Rolniczej w Krakowie (oznaczone ARK), Katedry Biotechnologii i Mikrobiologii ĩywnoĞci (oznaczone AR) oraz Katedry Chemii Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu (oznaczone KCh), a takĪe NCAIM i CBS. Zastosowano równieĪ drobnoustroje dostĊpne handlowo, oferowane przez firmy: Biowin, Biomed, Biocodex i Coopers Brewery.

Po dodaniu ekstraktu chmielowego do hodowli inkubowano mieszaniny biotrans-formacyjne przez 7 dni w warunkach laboratoryjnych, przy wytrząsaniu i naturalnym Ğwietle. Początkowe stĊĪenie gorzkich kwasów w kaĪdej próbie wynosiło sumarycznie 297,32 mg dm-3 (kohumulon 57,8 mg dm-3, humulon i adhumulon 139,76 mg dm-3,