Laktoferyna w profilaktyce i leczeniu zakażeń

PRACA POGLĄDOWA

LAKTOFERYNA W PROFILAKTYCE I LECZENIU ZAKAŻEŃ

LACTOFERRIN IN PROPHYLAXIS AND TREATMENT OF INFECTIONS

✎

Zakład Terapii Doświadczalnej Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk we Wrocławiu

STRESZCZENIE:

W dobie coraz powszechniejszego występowania szczepów bakterii i grzybów opornych na tradycyjne chemioterapeutyki znaczenia nabiera poszukiwanie no-wych substancji, często naturalnego pochodzenia, w tym ekstraktów roślinnych czy związków izolowanych z mleka, które byłyby skuteczne w profilaktyce i le-czeniu chorób infekcyjnych. Preparaty te zwykle mają szerokie spektrum aktyw-ności przeciwmikrobiologicznej i immunomodulującej, a drobnoustroje nie naby-wają na nie oporności. Nie wykazują działań ubocznych i mogą być stosowane w monoterapii lub jako dodatek do tradycyjnej antybiotykoterapii. Jedną z takich substancji jest izolowana z mleka laktoferyna. To białko o plejotropowym działa-niu w ustroju ssaków. Jest ważnym elementem układu odpornościowego, chro-niąc organizm gospodarza przed zakażeniami, zapaleniem, alergią, chorobami autoimmunologicznymi czy nowotworami. Białko jest aktywne wobec wszystkich grup drobnoustrojów: bakterii, grzybów, pierwotniaków oraz wirusów. Hamuje wzrost bądź zabija te drobnoustroje, działając na nie bezpośrednio lub aktywu-jąc inne składniki układu odpornościowego. Działa dwukierunkowo: prozapalnie, skutecznie zwalczając ostre infekcje, oraz przeciwzapalnie, chroniąc przed prze-wlekłymi stanami zapalnymi i ich groźnymi powikłaniami. Równie skuteczne jak natywne białko są jego fragmenty peptydowe. Laktoferyna działa podana doust-nie. Znajduje się w mleku świeżym i pasteryzowanym, na rynku są też dostępne suplementy diety z dodatkiem laktoferyny pozyskanej z mleka krowiego. SŁOWA KLUCZOWE: laktoferyna, odpowiedź immunologiczna, profilaktyka i le-czenie, zakażenie, zapalenie

ABSTRACT:

Widespread occurrence of bacterial and fungal strains resistant to classic che-motherapeutics, poses an aggravating problem for the human population. There-fore, search for new substances, usually of natural origin, like plant extracts or milk-derived compounds, potentially efficient in prophylaxis and therapy, is an important challenge for pharmacy and medicinal chemistry. Such preparations

m

Jolanta Artym

Zakład Terapii Doświadczalnej

Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk we Wrocławiu ul. R. Weigla 12, 53-114 Wrocław Tel.: 71 370 99 18 limbiol@iitd.pan.wroc.pl Wpłynęło: 12.03.2018 Zaakceptowano: 26.03.2018 Opublikowano on-line: 13.04.2018 Zaktualizowano: 24.04.2018

Cytowanie: Artym J, Zimecki M. Laktoferyna w profilaktyce i leczeniu zakażeń.

Zakażenia XXI wieku. 2018;1(1):27–34.

Copyright by MAVIPURO Polska Sp. z o.o., Warszawa, 2018. Wszystkie prawa zastrzeżone. Żadna część niniejszej publikacji nie może być powielana i rozpowszechniana w jakiejkolwiek formie i w jakikolwiek sposób bez zgody wydawcy.

28

usually show a broad spectrum of antimicrobial and immunomodulatory activity, and pathological microorganisms do not develop resistance to these agents. In addition, they do not exhibit side effects and may be used in monotherapy as well as an adjuvant to traditional antibiotic therapies. A good example of such a sub-stance may be milk-derived lactoferrin. Lactoferrin is a protein with pleiotropic functions in the mammalian organism. It represents an important component of the immune system by protecting the host organism against infection, inflamma-tion, allergy, autoimmune and neoplastic diseases. The protein is active towards all types of microorganisms such as bacteria, fungi, protozoa and viruses. It in-hibits growth or kills these microorganisms directly or by activating other com-ponents of the immune system. Its action is bidirectional: pro-inflammatory by efficient combat of acute infection, and anti-inflammatory by protection against sustained inflammatory states and their complications. It also appears that its peptic fragments are equally or even more efficient than the native protein. Lac-toferrin fulfills its preventive and therapeutic function when applied orally. It is present in fresh and pasteurized milk and, as a preparation isolated from bovine milk, is available in the market as a diet supplement.

KEY WORDS: infection, immune response, inflammation, lactoferrin, prevention and therapy

Według Organizacji Współpracy Gospodarczej i Rozwo-ju (OECD) oporność na  antybiotyki może być przyczyną ponad 700 000 zgonów rocznie na całym świecie, przynosi ponadto znaczne straty finansowe związane z chorobowo-ścią i  śmiertelnoz chorobowo-ścią pacjentów nieskutecznie leczonych antybiotykami  [1]. Początkowo szczepy bakterii opornych na  działanie jednego lub wielu antybiotyków (wieloopor-ne, multi-drug resistant –  MDR) pojawiały się głównie w szpitalach, zakażając pacjentów o osłabionej odporności z powodu schorzeń podstawowych, immunosupresji, prze-bytych zabiegów chirurgicznych czy inwazyjnych procedur medycznych (konieczność założenia implantów, cewni-ków, podłączenia do respiratora itp.) [2]. Zagrożeniem dla takich pacjentów może być zarówno ich własna mikroflo-ra (zakażenia endogenne), jak i  drobnoustroje bytujące w  środowisku szpitalnym (zakażenia egzogenne). Najczę-ściej dochodzi do infekcji układu moczowego, oddechowe-go (zapalenia płuc), zakażeń w miejscu operowanym oraz zakażeń ogólnoustrojowych (sepsy). Zakażenia szpitalne wywoływane przez bakterie wielooporne mają przeważ-nie ciężki przebieg i  są  trudne do  wyleczenia, wymagają starannej diagnostyki oraz doboru antybiotyków w terapii celowanej. Największym problemem są obecnie wieloopor-ne szczepy Gram-ujemnych pałeczek z rodziny

Enterobac-teriaceae, głównie Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli

i  Enterobacter sp., oraz bakterie niefermentujące glukozy:

Pseudomonas aeruginosa i  Acinetobacter sp., a  także

ziar-niaki Gram-dodatnie: Staphylococcus aureus (w tym szcze-py oporne na  metycylinę, methicillin-resistant S. aureus –  MRSA), Staphylococcus epidermidis, Streptococcus

pneu-moniae i  Enterococcus sp. Niestety obecnie coraz częściej

WSTĘP

Powszechne zastosowanie antybiotyków w  pierwszej połowie XX wieku pozwoliło skutecznie leczyć wiele groź-nych zakażeń bakteryjgroź-nych, w tym gruźlicę, błonicę, zapa-lenie płuc, dżumę, kiłę, rzeżączkę czy ropne zakażenia ran. Przez ponad 80 lat trwała „era antybiotyków”. Znacznie ograniczono śmiertelność z  powodu chorób infekcyjnych. Na  początku XXI wieku skuteczność wielu antybiotyków jednak spadła z powodu pojawienia się w środowisku opor-nych na ich działanie szczepów bakterii i grzybów. Przyczyn tego stanu rzeczy należy upatrywać głównie w dwóch zja-wiskach. Pierwszym jest nadużywanie i niewłaściwe stoso-wanie antybiotyków w medycynie ludzkiej i weterynaryjnej, w tym leczenie antybiotykami infekcji wirusowych (często na życzenie samego pacjenta), przyjmowanie zbyt małych dawek i  źle dobranych antybiotyków czy zbyt krótki czas antybiotykoterapii (przerwanie leczenia zaraz po ustąpieniu objawów chorobowych). Drugim niezwykle groźnym zjawi-skiem jest powszechne stosowanie (legalne lub nielegalne) antybiotyków w hodowli zwierzęcej. Szacuje się, że ponad 60% ogólnoświatowej produkcji tych leków jest zużywa-nych w rolnictwie, a 85–90% antybiotyków (głównie tetra-cyklin) jest stosowanych w celach pozaleczniczych (w pre-wencji chorób i jako czynniki wzrostowe w celu uzyskania szybkiego przyrostu masy ciała zwierząt). Tylko w  Polsce w 2015 roku podano zwierzętom prawie 600 ton antybioty-ków. Konsekwencją tak powszechnego ich używania jest ich stała obecność w produktach żywnościowych i środowisku naturalnym (w wodach i glebie są obecne antybiotyki wyda-lane przez organizmy ludzi i zwierząt) [1].

29

do groźnych zakażeń bakteriami opornymi na antybiotyki dochodzi także poza szpitalami, a te infekcje środowiskowe dotykają często osoby w dobrej ogólnej kondycji, ale z grup ryzyka, np. niemowlęta i osoby starsze, osoby przebywające długi czas w dużych skupiskach (np. domach opieki). Co-raz częściej mówi się o nadejściu tzw. ery poantybiotykowej, kiedy większość bakterii będzie oporna na dotąd stosowane antybiotyki. Sprawę dodatkowo pogarsza niechęć wielkich korporacji farmaceutycznych do poszukiwania nowych an-tybiotyków (ze względu na bardzo duże koszty badań, długi okres wdrożeniowy i stosunkowo małe zyski ze sprzedaży tych leków).

Dobrym wyjściem w takiej sytuacji wydaje się bardziej powszechne stosowanie preparatów naturalnych pocho-dzenia roślinnego lub zwierzęcego o działaniu wielokierun-kowym (plejotropowym): hamującym wzrost patogenów i  wzmacniającym odporność pacjenta. Wiele takich sub-stancji z dobrym skutkiem stosuje się od dawna w medy-cynie ludowej. Można tu wspomnieć choćby o produktach pszczelich (miód, propolis, mleczko, kit) czy ekstraktach ro-ślinnych (z czosnku, jeżówki purpurowej, aloesu, eukaliptu-sa). W ciągu ostatnich 20 lat coraz większe zainteresowanie wśród lekarzy i pacjentów wzbudzają też aktywne substan-cje wyizolowane z mleka, w tym: laktoperoksydaza, lakto-albumina, lizozym, peptydy kazeinowe czy laktoferyna. Co szczególnie istotne, preparaty pochodzenia naturalnego nie wykazują działań ubocznych, których, jak wiadomo, nie są  pozbawione antybiotyki. Wiele z  tych substancji działa synergistycznie (tzn. wzajemnie wzmacnia swoje działanie), a drobnoustroje nie nabywają na nie oporności. Mogą więc być bezpiecznie stosowane zarówno w profilaktyce, jak i le-czeniu różnych schorzeń o podłożu infekcyjnym, u pacjen-tów w różnym wieku czy obciążonych dodatkowymi scho-rzeniami. Co  ważne, naturalne substancje aktywne mogą być podawane w  monoterapii lub łącznie z  klasycznymi chemioterapeutykami, wzmacniając ich działanie i skraca-jąc czas terapii oraz ograniczai skraca-jąc jej skutki uboczne.

Celem artykułu jest charakterystyka działania przeciwmi-krobiologicznego laktoferyny ze  szczególnym uwzględnie-niem aktywności białka wobec drobnoustrojów opornych na klasyczne leczenie. Zaprezentowano wyniki niektórych testów laboratoryjnych i  klinicznych oraz nakreślono me-chanizm działania białka.

LAKTOFERYNA – OGÓLNA

CHARAKTERYSTYKA

Laktoferyna (LF) należy do  rodziny białek wiążących żelazo, czyli transferyn. Skład aminokwasowy wykazuje dużą homologię międzygatunkową, np. LF ludzka i bydlę-ca są podobne w 69%, a LF mysia i bydlęi bydlę-ca w 63%. LF jest glikoproteiną, czyli białkiem z  przyłączonymi łańcuchami

cukrowymi [3]. Jej cząsteczka składa się z około 700 ami-nokwasów (niewielkie różnice u różnych gatunków ssaków) ułożonych w globularną, trzeciorzędową strukturę o masie molekularnej 80 kDa (ryc. 1). Dwa płaty N- i C-końcowy są połączone giętkim, krótkim mostkiem, każdy z nich dzie-li się jeszcze na dwie mniejsze części nazywane domenami. W  głębokich rowkach między nimi mogą się ulokować dwa jony żelaza Fe3+_{. Laktoferyna wiąże żelazo z dużą siłą}

i w szerokim zakresie pH. Odłączenie jonów Fe3+ _następuje

dopiero w silnie kwaśnym środowisku, przy pH <3,0, a takie rzadko spotykamy w naszym organizmie (silne zakwaszenie występuje w  miejscach toczącego się zakażenia/zapalenia na skutek nagromadzenia produktów metabolizmu komó-rek mikroorganizmów i własnych gospodarza).

Laktoferyna jest białkiem powszechnym u  wszystkich gatunków ssaków. Trudno znaleźć miejsce w ustroju, w któ-rym by jej nie było. Jest wytwarzana przez dwa główne typy komórek: budujące błony śluzowe komórki nabłonkowe o  funkcji wydzielniczej oraz komórki krwi –  granulocy-ty obojętnochłonne (neutrofile). Obecna na  powierzchni wszystkich śluzówek chroni organizm przez wnikaniem różnych patogenów ze środowiska zewnętrznego, jest więc ważnym elementem odporności wrodzonej. Z wnętrza gra-nulocytów LF może być uwalniana do krwi i miejsc toczą-cego się lokalnie zakażenia/zapalenia, uczestnicząc w  re-akcji odpornościowej wraz z  innymi składnikami układu immunologicznego. Milion aktywowanych neutrofilów może uwolnić 3–15 μg LF. Najwięcej LF znajdziemy w siarze i mleku (2–15 mg/ml) oraz łzach (2 mg/ml), mniejsze ilości w ślinie, wydzielinie układu pokarmowego, oddechowego, moczowo-płciowego, płynie stawowym, mózgowo-rdzenio-wym, pocie, woskowinie usznej, żółci, moczu i kale. Stężenia LF w surowicy w stanie zdrowia nie są duże i nie przekracza-ją 0,5–2 μg/ml, ale znacznie rosną (do 200 μg/ml) podczas uogólnionego zakażenia czy poważnego urazu (np. oparze-nia dużej powierzchni ciała) [4].

W skład cząsteczki LF wchodzi wiele reszt aminokwasów zasadowych (arginina i lizyna), które układając się w zgru-powania, nadają całej strukturze charakter silnie kationowy (pI 8,5–9,0). Dzięki temu LF łatwo wchodzi w  interakcje z  różnymi cząsteczkami o  ładunku ujemnym, zarówno w naszym ustroju (np. lizozym, glikozaminoglikany, kwasy nukleinowe, liczne receptory komórkowe), jak i pochodze-nia mikrobiologicznego (np. lipopolisacharyd – LPS z bak-teryjnej ściany komórkowej). Dwie istotne cechy struktural-ne LF warunkują większość jej właściwości:

1. dzięki zdolności wiązania jonów żelaza białko m.in.: reguluje wchłanianie żelaza z pokarmu, procesy utle-niania-redukcji i hamuje wzrost drobnoustrojów, 2. zdolność do  wiązania wielu cząsteczek warunkuje

bardzo szeroki zakres aktywności białka, m.in. dzia-łanie przeciwmikrobiologiczne, przeciwnowotwo-rowe, regulacyjne działanie na hematopoezę, układ

30

immunologiczny i  gospodarkę węglowodanowo-li-pidową oraz właściwości hipotensyjne, analgetyczne i przeciwstresowe [5].

LAKTOFERYNA – DZIAŁANIE

PRZECIWMIKROBIOLOGICZNE

I IMMUNOREGULACYJNE

Działanie na  drobnoustroje należy do  najwcześniej odkrytych i  do  dziś najlepiej poznanych właściwości LF. W 1966 roku, już kilka lat po pierwszej izolacji białka z mle-ka, odkryto jego wpływ hamujący na wzrost Staphylococcus

albus, zniesiony przez dodatek żelaza do hodowli. W 1974

roku dostrzeżono związek między nieprawidłowymi ziarni-stościami neutrofilowymi i brakiem w nich LF a zwiększoną podatnością na nawracające infekcje bakteryjne u pacjenta. Ta  obserwacja dodatkowo utwierdziła badaczy w  istotnej roli LF w obronie ustroju przed zakażeniami. Od tego czasu podjęto wiele prób udowodnienia przeciwmikrobiologicz-nego działania LF oraz wyjaśniono jego mechanizm [4].

Uzyskane wyniki licznych badań laboratoryjnych i  kli-nicznych potwierdziły dwukierunkowe działanie LF wo-bec różnych drobnoustrojów: 1) bezpośrednie hamowanie wzrostu bądź zabijanie komórek patogenów oraz 2) dzia-łanie pośrednie poprzez regulację aktywności układu od-pornościowego (ryc. 2) [6]. Białko jest uznawane za istot-ny składnik odporności wrodzonej i nabytej ustroju. Wielu autorów zalicza go do białek ostrej fazy (acute-phase pro-tein)  [5, 7]. Reakcja ostrej fazy jest odpowiedzią układu immunologicznego na uszkodzenie tkanek na skutek ura-zu bądź infekcji i  ma  na  celu szybkie ograniczenie zmian (w  tym izolację i  zniszczenie czynnika zakaźnego) oraz przywrócenie stanu właściwego. Jest elementem odporno-ści nieswoistej i obejmuje wiele czynników bardzo szybko uwalnianych do  krążenia,  m.in. interleukinę (IL)-6, IL-1, czynnik martwicy guza (TNF-α), białko C-reaktywne (C re-active protein – CRP), amyloid A, inhibitory proteaz.

Niektórzy badacze zaliczają ponadto LF do alarmin [8, 9]. To cząsteczki uwalniane z uszkodzonych komórek ustro-ju i sygnalizujące zagrożenie. Mogą to być pozakomórkowe kwasy nukleinowe, ATP, białka szoku cieplnego czy mito-chondria. Wiążą się one do  receptorów rozpoznających wzorce (pattern recognition receptors –  PRR) na  komór-kach gospodarza. Wspólnie z cząsteczkami pochodzącymi z drobnoustrojów (pathogen associated molecular patterns –  PAMP), takimi jak składniki ściany komórkowej (LPS, kwas tejchojowy, mannan), bakteryjne czy wirusowe kwa-sy nukleinowe, aktywują komórki gospodarza do  obrony. W testach in vitro oraz in vivo (na myszach) LF aktywowa-ła komórki prezentujące antygen (antigen presenting cells –  APC) między innymi poprzez receptory komórkowe typu toll (toll-like receptor – TLR) należące do PRR [8, 9].

Zanotowano zwiększenie ekspresji cząsteczek kostymulują-cych CD80, CD83 i HLA-DR na powierzchni komórek den-drytycznych oraz wzrost wytwarzania cytokin (IL-1, IL-6, IL-10, IL-12, TNF-α) przez pobudzone komórki. Wiązało się to  z  aktywacją kolejnych komórek odpornościowych: neutrofilów i  makrofagów (komórek odporności nieswo-istej) oraz limfocytów uczestniczących w odpowiedzi anty-genowo-swoistej [8]. Uzyskane wyniki są dowodem na to, że LF indukuje zarówno wrodzoną (nieswoistą), jak i nabytą (swoistą) odpowiedź immunologiczną oraz stanowi ogniwo łączące obie te składowe reakcji odpornościowej. Taka ko-operacja mechanizmów nieswoistych i  swoistych jest nie-zbędna do  rozwoju prawidłowej i  skutecznej odpowiedzi immunologicznej.

LAKTOFERYNA – AKTYWNOŚĆ

WOBEC BAKTERII, GRZYBÓW,

PIERWOTNIAKÓW I WIRUSÓW

Laktoferyna może zarówno hamować wzrost, jak i zabi-jać komórki bakterii, grzybów mikroskopowych oraz pier-wotniaków. Działa na te drobnoustroje w podobny sposób, bezpośrednio wpływając na ich procesy życiowe. Do bezpo-średniego szkodliwego oddziaływania LF na  komórki mi-kroorganizmów możemy zaliczyć sekwestrację jonów żela-za i tą drogą ogranicżela-zanie jego dostępności w środowisku wzrostu patogenów. Prawie wszystkie drobnoustroje do ży-cia potrzebują tego mikroelementu, zatem LF, zmniejszając jego dostępność, skutecznie hamuje namnażanie patoge-nów. Osłabione niedoborem żelaza stają się łatwym łupem dla komórek odpornościowych.

Drobnoustroje (głównie bakterie) często kolonizują or-ganizm gospodarza, tworząc zwartą strukturę na  zajętej powierzchni nabłonka i  zyskując w  ten sposób wzajem-ną ochronę przed możliwym atakiem ze  strony układu odpornościowego czy cząsteczek antybiotyków użytych w  terapii. Biofilm często tworzą  m.in. pałeczki ropy błę-kitnej (P. aeruginosa) na śluzówkach układu oddechowego chorych na  mukowiscydozę (zakażenie oportunistyczne), co  znacznie utrudnia lub nawet uniemożliwia eradykację patogenu. Jak wykazano w kilku testach – LF, wiążąc żelazo w otoczeniu biofilmu bakteryjnego, powodowała osłabienie jego struktury: bakterie, poszukując cennego składnika, za-czynały intensywnie drgać i przemieszczać się po podłożu, co dezintegrowało zwarte kolonie. W testach in vitro LF do-dana do hodowli komórek P. aeruginosa (w stężeniu mniej-szym niż potrzebne do zabicia komórek) hamowała tworze-nie biofilmu oraz zwiększała podatność bakterii na  H₂O₂ i tobramycynę. Działanie białka było skutkiem sekwestracji wolnego żelaza obecnego w płynie hodowlanym [10].

Jak już wspomniano, żelazo mocno związane z cząstecz-ką LF zostaje z  niej uwolnione przy silnym zakwaszeniu

31

Płat N

Płat C

N 1

N 2

C 2

C

1

C 1

środowiska. Z takim zjawiskiem mamy do czynienia w miej-scu toczącego się zakażenia/zapalenia (na skutek nagroma-dzenia metabolitów komórkowych) oraz wewnątrz fagoso-mów – struktur w komórkach żernych, gdzie są degradowane pochłonięte drobnoustroje. Wówczas LF może dostarczać żelazo do reakcji tworzenia reaktywnych form tlenu (RFT). Te drobne i  niezwykle reaktywne cząsteczki: tlenku azotu (NO•_{), anionorodnika ponadtlenkowego (O}

2•-), nadtlenku

wodoru (H₂O₂), rodnika hydroksylowego (•_{OH) czy kwasu}

podchlorawego (HOCl) powstające w procesie tzw. wybuchu oddechowego, niezwykle skutecznie niszczą komórki drob-noustrojów. Udział w tworzeniu RFT jest więc kolejnym spo-sobem przeciwmikrobiologicznego działania LF.

Laktoferyna dzięki swojej kationowej naturze może wią-zać składniki osłon komórkowych mikroorganizmów, pro-wadząc do ich uszkodzenia, a w konsekwencji do zaburzeń osmotycznych i śmierci komórek [4]. Białko wiąże cząsteczki anionowe: kwasy tejchojowe w ścianie komórkowej bakterii Gram-dodatnich oraz LPS w  ścianie komórkowej bakte-rii Gram-ujemnych. Może także kompleksować jony Ca2+

i Mg2+_{, które stabilizują ścianę komórkową oraz białka}

po-rynowe tworzące kanały do poboru jonów i innych składni-ków odżywczych. W taki sposób LF niszczyła komórki m.in.

E. coli, Salmonella typhimurium czy S. epidermidis.

W po-dobny sposób LF uszkadza struktury komórkowe grzybów oraz pierwotniaków, co prowadzi do zmian w komórkach

i ich śmierci [11]. Takie działanie LF zaobserwowano m.in. wobec Candida albicans, Candida krusei, Cryptococcus

neo-formans i Giardia lamblia. W interakcjach z komórkami

mi-kroorganizmów uczestniczą niektóre fragmenty cząsteczki LF składające się z  około 20–50 aminokwasów i  zawiera-jące po kilka reszt kationowej argininy oraz hydrofobowe-go tryptofanu  [12]. Takie fragmenty peptydowe powstają podczas trawienia enzymatycznego LF, zarówno w przewo-dzie pokarmowym (po  doustnym przyjęciu białka), jak i w tkankach, gdzie obecne są enzymy proteolityczne ko-mórkowe i pochodzenia mikrobiologicznego. Najważniej-sze z  aktywnych peptydów leżą w  obrębie N-końcowego płata cząsteczki LF i są to: laktoferycyna (reszty 1–49, dla białka ludzkiego) oraz laktoferampina (reszty 266–286, dla białka ludzkiego) (ryc. 1). Ze względu na małe rozmia-ry, silny ładunek dodatni i dużą giętkość peptydowe frag-menty LF przeważnie są bardziej aktywne wobec różnych mikroorganizmów niż natywne białko [11, 13]. W destruk-cji komórek bakterii, grzybów czy pierwotniaków LF i po-chodne peptydy działają synergistycznie z innymi białkowy-mi składnikabiałkowy-mi odporności: lizozymem, laktoperoksydazą, RNA-azą czy immunoglobulinami klasy A (IgA).

Ważnym etapem zakażenia jest adhezja (przyleganie) komórek patogenów do komórek nabłonkowych gospoda-rza. Za ten proces odpowiadają specjalne białka – adhezy-ny lub glikoprotei– adhezy-ny wytwarzane przez patogenne mikro-organizmy. Laktoferyna może wiązać i  unieszkodliwiać te czynniki wirulencji, uniemożliwiając tym samym skuteczne zakażenie. W  testach in vitro LF hamowała adhezję ente-rotoksygennych (ETEC), enteropatogennych (EPEC) oraz uropatogennych szczepów E. coli do ludzkich komórek na-błonkowych. Białko wiązało i blokowało bakteryjne czyn-niki kolonizacyjne: adhezynę CFA I oraz fimbrie typu I [4].

Laktoferyna może także degradować niektóre mikro-biologiczne czynniki wirulencji dzięki swojej aktywności enzymatycznej. Wykazano, że LF działa jako proteaza sery-nowa i cysteisery-nowa, DNA-aza, RNA-aza, ATP-aza, fosfataza i amylaza. Stwierdzono, że dzięki takim właściwościom LF rozkłada białka systemu sekrecji typu III – czynniki wiru-lencji EPEC i Shigella flexneri, co hamowało adhezję bakte-rii i uszkodzenie nabłonka [4]. Ostatnie badania wykazały, że białko może ponadto zwiększać proteolityczną aktywność katepsyny G – białka ziarnistości azurofilnych neutrofilów, które dzięki swojej aktywności proteazy serynowej bezpo-średnio zabija niektóre bakterie i grzyby [7]. Katepsyna G ponadto uwrażliwia komórki patogenów na  lizozym oraz działa chemotaktycznie na monocyty i limfocyty.

Działanie przeciwwirusowe LF polega głównie na hamo-waniu wstępnych etapów zakażenia, czyli wiązania i  wni-kania cząstek wirusowych do komórek gospodarza. Białko i pochodne peptydy mogą przyłączać się zarówno do czą-steczek receptowych na powierzchni wirusa, jak i jego re-ceptorów komórkowych. Efekt w obu przypadkach jest taki

W

Za-znaczono 2 płaty: N- i C-końcowy, z których każdy składa się z dwóch domen: N1 i N2 oraz C1 i C2. Do każdego z płatów przy-łączony jest łańcuch cukrowy. Do łańcucha białkowego w row-ku wewnątrz każdego z płatów mogą przyłączać się jony żela-za. Obwódkami zaznaczono N-końcowe fragmenty cząsteczki: niebieską – laktoferycynę (reszty 1–49) i żółtą – laktoferampinę (reszty 266–286) (baza danych Protein Structure European Bioinformatics Institute, http://www.ebi.ac.uk).

32

sam: wirus nie może skutecznie związać się do docelowej komórki, co jest niezbędnym etapem infekcji. Tą drogą LF hamowała zakażenia wirusami  m.in.: cytomegalii (CMV), hepatitis typu B (HBV) i C (HCV), ludzkiego brodawcza-ka, ludzkiego niedoboru odporności (HIV), opryszczki (HSV), grypy A, paragrypy, dengi, a także adenowirusami, enterowirusami, rotawirusami czy hantawirusami. Częste jest blokowanie przez LF cząsteczek glikozaminoglikanów (GAG), w tym siarczanu heparanu, na powierzchni komó-rek docelowych, co uniemożliwia związanie i wnikanie czą-steczek wirusów do komórek [14]. W dalszych badaniach wykazano, że LF ogranicza także późniejsze etapy infekcji wirusowej. Białko hamuje aktywność odwrotnej transkryp-tazy, proteazy i integrazy – enzymów wirusa HIV-1, które umożliwiają mu cykl replikacyjny w  komórce. W  innym

teście in vitro LF hamowała z kolei replikację wirusa HCV w  hepatocytach, inaktywując wirusowe enzymy: ATP-azę i helikazę NS3. Obserwowano addytywne działanie LF z ry-bawiryną i interferonem (IFN-α-2b), inhibitorami replika-cji, klasycznie stosowanymi w leczeniu zakażenia HCV [15].

LAKTOFERYNA – DZIAŁANIE

IMMUNOMODULUJĄCE

Drugim sposobem zwalczania infekcji przez LF jest regu-lacja działania układu odpornościowego. Białko może sty-mulować bądź hamować odpowiedź immunologiczną, czyli odpowiednio – działać prozapalnie lub przeciwzapalnie [7, 16]. Jego aktywność zależy od aktualnego stanu fizjologicz-nego ustroju, a zatem także jego potrzeb. Przez niektórych badaczy białko jest nazywane supercytokiną, inteligentną cytokiną lub sensorem immunologicznym (immune-sen-sor), gdyż jego aktywność jest dostosowana do danej sytu-acji [7]. Podczas ostrego zakażenia uwolniona z neutrofilów LF działa jako aktywator komórek – składowych układu im-munologicznego (między innymi poprzez receptory TLR2 i TLR4). Wzmacnia działanie komórek prezentujących anty-gen: makrofagów, komórek dendrytycznych i limfocytów B. Wzrasta wtedy wydzielanie prozapalnych cytokin (IL-1, IL-8, IL-6, IL-12) i chemokin oraz aktywność fagocytarna tych komórek. Za ich pośrednictwem aktywowane są limfo-cyty B i T – komórki efektorowe odpowiedzi swoistej. Sama LF także może przyspieszać różnicowanie i  dojrzewanie tych komórek. Może również zmieniać równowagę między populacjami TH1 i TH2 limfocytów T CD4+_{. Wzmocnienie}

odpowiedzi typu TH1 (z przewagą mechanizmów komór-kowych i syntezą IFN-γ oraz IL-2) przy jednoczesnym ogra-niczeniu odpowiedzi typu TH2 (z przewagą mechanizmów humoralnych i  syntezą IL-4, IL-5, IL-13) odgrywa istotną rolę podczas ostrego zakażenia i  pomaga szybko usunąć czynnik zakaźny. Ma  też znaczenie przy ograniczeniu re-akcji alergicznych (np. w katarze siennym, astmie) i auto-immunologicznych (np. we wrzodziejącym zapaleniu jelita grubego, łuszczycy). Nadmiernie nasilona odpowiedź typu TH1 podczas zakażenia może być groźna, gdy trwa zbyt długo, jak w przewlekłych zakażeniach, może bowiem pro-wadzić do uszkodzenia tkanek przy jednoczesnej niemoż-ności skutecznego usunięcia patogenów.

Molekularne mechanizmy aktywującego/hamującego (czyli regulacyjnego) działania LF na układ immunologicz-ny nie są jeszcze w całości poznane. Wiadomo już jednak, że duży udział w takiej aktywności białka ma jego zdolność do wiązania bakteryjnego LPS (endotoksyny). Z jednej stro-ny uszkadza to komórki bakteryjne, powodując ich śmierć, z  drugiej związana endotoksyna staje się trudno dostęp-na dla receptorów TLR, co  hamuje aktywację wewnątrz-komórkowych szlaków sygnałowych i  wycisza komórki

W

Neutrofile aktywowane czynnikiem zakaźnym lub urazem uwalniają zawartość ziarnistości komórkowych, w tym laktofe-rynę. Białko dostaje się do tkanek lokalnie objętych procesem zapalnym, może być też uwalniane do krążenia. Oddziałuje na komórki drobnoustrojów oraz na różne składniki wrodzonej i nabytej odpowiedzi immunologicznej. Po lewej stronie rysunku pokazano bezpośrednie działanie na komórki patogenów: bak-terii, grzybów i pierwotniaków oraz cząsteczki wirusów; po pra-wej stronie pośrednie działanie poprzez regulację aktywności układu immunologicznego: w czasie ostrego zakażenia/ostrego stanu zapalnego oraz przewlekłego zakażenia/zapalenia.

ZAKAŻENIE URAZ Neutrofil (granulocyt obojętnochłonny) ziarnistości wtórne cząsteczki LF (uwalniane podczas degranulacji) DZIAŁANIE NA DROBNOUSTROJE

BEZPOŚREDNIE _{(na układ immunologiczny)} POŚREDNIE

 wiązanie jonów Fe3+  uszkodzenie struktur komórkowych  hamowanie adhezji do komórek gospodarza  enzymatyczny rozkład czynników wirulencji na bakterie, grzyby i pierwotniaki

na wirusy  hamowanie wiązania do komórek gospodarza  hamowanie replikacji w komórkach w ostrym zakażeniu/zapaleniu  indukcja cytokin prozapalnych  aktywacja komórek prezentujących antygen i neutrofilów

 aktywacja limfocytów T i B  utrzymanie równowagi TH1/TH2 z przewagą TH1

w przewlekłym zakażeniu/zapaleniu  indukcja cytokin prozapalnych  wygaszanie zapalenia  utrzymanie równowagi TH1/TH2 z przewagą TH2

33

odpornościowe [12]. W ten sposób dochodzi do wygaszenia stanu zapalnego. Należy pamiętać, że LPS jest bardzo silnym aktywatorem układu immunologicznego i indukując takie prozapalne mediatory jak TNF-α, może powodować prze-wlekłe zapalenie, niezwykle groźne w skutkach dla pacjen-ta [12]. Ze względu na wspomniane działanie regulacyjne LF może mieć szczególne znaczenie przy zwalczaniu zaka-żeń przewlekłych czy uogólnionych, w tym spowodowanych szczepami opornymi bakterii czy grzybów.

Laktoferyna podawana w aerozolu myszom zakażonym klinicznym izolatem P. aeruginosa nie tylko redukowała licz-bę bakterii w płucach, ale też hamowała tworzenie nacieków neutrofilowych i makrofagowych oraz wytwarzanie cytokin prozapalnych: IL-1, IL-8, IL-12 i MIP-1 [17]. P. aeruginosa powoduje przewlekłe zakażenia oportunistyczne u  osób z mukowiscydozą (cystic fibrosis). Mimo intensywnej anty-biotykoterapii zakażenia nie udaje się wyleczyć, czego skut-kiem jest przewlekłe zapalenie, uszkodzenie tkanki płucnej, pogorszenie jej funkcji i stanu ogólnego pacjentów.

Białko również skutecznie zwalczało bezobjawowe zaka-żenie bakteryjne Chlamydia trachomatis u  ciężarnych ko-biet [18]. Laktoferynę (w dawce 100 mg) podawano w tablet-kach dopochwowych 3×/dzień przez 30 dni. Po tym czasie u 6 spośród 7 pacjentek nie stwierdzono obecności patoge-nów, a stężenie IL-6 w płynie z szyjki macicy było obniżo-ne, wskazując na wygaszenie przewlekłego stanu zapalnego.

C. trachomatis jest bezwzględnym patogenem

wewnątrzko-mórkowym, przenoszonym drogą płciową, powoduje często bezobjawowe przewlekłe zakażenia z uszkodzeniem tkanek i poważnymi powikłaniami (m.in. niepłodnością). Na sku-tek długiego i  nieskutecznego leczenia nabywa oporność na różne rutynowo stosowane antybiotyki.

W modelu mysim LF oraz LF podawana łącznie z lakto-peroksydazą skutecznie zwalczała zapalenie płuc induko-wane klinicznymi izolatami Acinetobacter baumannii [19]. Spadła liczba bakterii w  płucach i  krwi, mniejsze było uszkodzenie tkanki płucnej oraz większe wytwarzanie cyto-kin przeciwzapalnych (IL-4 i IL-10). Kombinacja obu białek była skuteczniejsza niż antybiotyk imipenem. A. baumannii jest czynnikiem etiologicznym ciężkich zakażeń płuc, skó-ry, układu moczowego czy sepsy u pacjentów z osłabioną odpornością, trudnych do wyleczenia ze względu na coraz większe rozpowszechnienie w szpitalach i środowisku szcze-pów wieloopornych.

Laktoferyna skutecznie zwalczała eksperymentalne za-palenie jamy otrzewnej indukowane MRSA u myszy [20]. Zanotowano spadek liczby bakterii, lepsze przeżycie zwie-rząt oraz spadek stężenia cytokin prozapalnych (IL-1, IL-6 i IL-17) w krążeniu.

Opisywane białko było także skuteczne w  mysim mo-delu gruźlicy indukowanym podaniem Mycobacterium

tuberculosis lub antygenu M. tuberculosis – czynnika

rdze-niowego (TDM) [7]. W tkance płucnej powstały komórki

wytwarzające IFN-γ oraz IL-17 (cytokiny odpowiedzi TH1), co sprzyjało szybkiej eliminacji czynnika zakaźnego poprzez aktywację makrofagów i rekrutację neutrofilów. Co ważne, po kilku dniach od wywołania infekcji stwierdzono znacz-ne ograniczenie uszkodzeń w tkance płucznacz-nej spowodowaznacz-ne tworzeniem ziarniniaków przez naciekające komórki zapal-ne, większe było też wytwarzanie cytokin przeciwzapalnych (IL-10 i TGF-β). Obecnie skuteczność leczenia gruźlicy spa-da z  powodu pojawienia się szczepów prątków opornych na dotąd stosowane antybiotyki.

W  kilku badaniach klinicznych (łącznie n=1500) po-twierdzono skuteczność LF w profilaktyce powikłań infek-cyjnych u wcześniaków z niską masą urodzeniową [21]. Ob-serwowano mniej przypadków późnej sepsy, martwiczego zapalenia jelit (necrotizing enteroco litis –  NEC), zakażeń szczepami bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych oraz zakażeń grzybiczych, również uogólnionych. Mechanizm korzystnego działania białka niewątpliwie jest wielokierun-kowy, w tym może obejmować także normalizację mikro-bioty jelitowej noworodków, co potwierdzono w kolejnym badaniu klinicznym [22]. Do najczęstszych czynników etio-logicznych zakażeń na oddziałach noworodkowych należą: paciorkowce z  grupy B, E. coli, S. aureus, S. epidermidis,

Pseudomonas sp., Candida sp. oraz wirusy HSV, CMV

i en-terowirusy, często nabywane ze środowiska szpitalnego.

LAKTOFERYNA JAKO SUPLEMENT

DIETY

Działanie LF endogennej można skutecznie wzmacniać, przyjmując białko egzogenne, najwygodniej drogą pokar-mową. Laktoferyna jest dość oporna na działanie enzymów proteolitycznych, szczególnie u  noworodków, u  których może wchłaniać się do krążenia. U dorosłych przypuszcza się, że natywne białko lub jego pochodne peptydy działają głównie lokalnie na śluzówkę przewodu pokarmowego (już w jamie ustnej), a tą drogą, dzięki istnieniu zintegrowanej odporności śluzówkowej, także na inne tkanki ustroju, na-wet odległe od przewodu pokarmowego. Źródłem LF może być dieta, a konkretnie mleko i przetwory (LF jest obecna w mleku świeżym i mikrofiltrowanym, w nieco mniejszych ilościach w mleku pasteryzowanym w temp. 72°C, nie ma jej w  mleku sterylizowanym, czyli UHT). Szklanka świeżego mleka dostarczy nam dziennie 25–75 mg LF, a więc ilości, w których białko jest już aktywne. Od ponad 40 lat na rynku światowym, a od kilkunastu także na rynku polskim są do-stępne preparaty (suplementy diety) zawierające w  swoim składzie LF izolowaną z  mleka krowiego. Mają postać ta-bletek do połykania, ssania, granulek do sporządzania roz-tworu, sprayu czy syropu. Dotychczas przeprowadzone ba-dania potwierdziły bezpieczeństwo stosowania bydlęcej LF. Przez amerykańską Agencję ds. Żywności i  Leków (FDA)

34

i jej europejski odpowiednik – Europejski Urząd ds. Bezpie-czeństwa Żywności (EFSA) białko to zostało uznane za bez-pieczne i  może być stosowane jako dodatek do  żywności oraz składnik suplementów diety [23].

PODSUMOWANIE

Laktoferyna wykazuje wielokierunkowe aktywności, z  których najważniejszą jest działanie przeciwmikrobio-logiczne oraz immunomodulujące. Hamuje wzrost bądź zabija komórki patogenów, działając na  nie bezpośred-nio. Ponadto aktywuje składniki układu odpornościowego do walki z zakażeniem. Może działać synergistycznie z in-nymi białkami odporności wrodzonej: lizozymem, laktope-roksydazą, RNA-azą czy katepsyną G. Uwrażliwia komórki patogenów na  działanie antybiotyków. Skutecznie hamuje infekcje bakteriami opornymi na klasyczne chemioterapeu-tyki i odpowiedzialnymi za zakażenia przewlekłe, jak m. in.

P. aeruginosa, A. baumannii, enteropatogenne szczepy E. coli, S. flexneri, MRSA, M. tuberculosis czy C. trachoma-tis. W tego typu zakażeniach, którym towarzyszy

przewle-kły stan zapalny, zastosowanie LF ogranicza reaktywność układu immunologicznego i powstałe uszkodzenia tkanek poprzez usunięcie/neutralizację patogenów i  ich toksyn, osłabienie aktywności komórek odpornościowych i  przy-spieszenie regeneracji tkanek. Laktoferyna jest aktywna po  przyjęciu doustnym. To  substancja o  potwierdzonym bezpieczeństwie, może być stosowana w  monoterapii lub podczas antybiotykoterapii, u osób w różnym wieku i obar-czonych schorzeniami towarzyszącymi.

KONFLIKT INTERESÓW: nie zgłoszono.

PIŚMIENNICTWO

1. https://www.nik.gov.pl, NIK o stosowaniu antybiotyków w hodowli zwierząt (artykuł z 08.03.2018).

2. Dzierżanowska D, Pawińska A. Zakażenia szpitalne. W: Baumann--Popczyk A, Sadkowska-Todys M, Zieliński A (red.). Choroby zakaź-ne i pasożytnicze – epidemiologia i profilaktyka. Wydawnictwo Medyczne α-Medica Press, Bielsko-Biała, 2014.

3. Baker EN, Baker HM. A structural framework for understanding the functional character of lactoferrin. Biochimie 2009;91(1):3–10 [doi: 10.1016/j.biochi.2008.05.006].

4. Artym J. Laktoferyna – niezwykłe białko. Wydawnictwo Borgis, Warszawa, 2016.

5. Jenssen H, Hancock RE. Antimicrobial properties of lactoferrin. Biochimie 2009;91(1):19–29 [doi: 10.1016/j.biochi.2008.05.015]. 6. Mayeur S, Spahis S, Pouliot Y, Levy E. Lactoferrin, a

pleio-tropic protein in health and disease. Antioxid Redox Signal 2016;24(14):813–836 [doi: 10.1089/ars.2015.6458].

7. Spadaro M, Montone M, Arigoni M, Cantarella D, Forni G, Pericle F, Pascolo S, Calogero RA, Cavallo F. Recombinant human lactoferrin induces human and mouse dendritic cell maturation via Toll-like receptors 2 and 4. FASEB J 2014;28(1):416–429 [doi: 10.1096/fj. 13-229591].

8. de la Rosa G, Yang D, Tewary P, Varadhachary A, Oppenheim JJ. Lactoferrin acts as an alarmin to promote the recruitment and ac-tivation of APCs and antigen-specific immune responses. J Immu-nol.2008;180(10):6868–6876.

9. Singh PK, Parsek MR, Greenberg EP, Welsh MJ. A component of innate immunity prevents bacterial biofilm development. Nature 2002;417(6888):552–555 [doi: 10.1038/417552a].

10. Fernandes KE, Carter DA. The antifungal activity of lactoferrin and its derived peptides: mechanisms of action and synergy with drugs against fungal pathogens. Front Microbiol 2017;8:2 [doi: 10.3389/ fmicb.2017.00002].

11. Drago-Serrano ME, de la Garza-Amaya M, Luna JS, Campos-Ro-driguez R. Lactoferrin-lipopolysaccharide (LPS) binding as key to antibacterial and antiendotoxic effects. Int Immunopharmacol 2012;12(1):1–9 [doi: 10.1016/j.intimp.2011.11.002].

12. Yin C, Wong JH, Ng TB. Recent studies on the antimicro-bial peptides lactoferricin and lactoferrampin. Curr Mol Med 2014;14(9):1139–1154 [doi: 10.2174/1566524014666141015151749]. 13. Kruzel ML, Zimecki M, Actor JK. Lactoferrin in a context of

in-flammation-induced pathology. Front Immunol. 2017;8:1438 [doi: 10.3389/fimmu.2017.01438].

14. Berlutti F, Pantanella F, Natalizi T, Frioni A, Paesano R, Polimeni A, Valenti P. Antiviral properties of lactoferrin – a natural immunity molecule. Molecules 2011;16(8):6992–6718 [doi: 10.3390/molecu-les16086992].

15. Picard-Jean F, Bouchard S, Larivee G, Bisaillon M. The intracel-lular inhibition of HCV replication represents a novel mechanism of action by the innate immune Lactoferrin protein. Antiviral Res. 2014;111:13–22 [doi: 10.1016/j.antiviral.2014.08.012].

16. Drago-Serrano ME, Campos-Rodriguez R, Carrero JC, de la Ga-rza M. Lactoferrin: balancing ups and downs of inflammation due to microbial infections. Int J Mol Sci 2017;18(3):501 [ doi: 10.3390/ ijms18030501].

17. Valenti P, Frioni A, Rossi A, Ranucci S, De Fino I, Cutone A, Rosa L, Bragonzi A, Berlutti F. Aerosolized bovine lactoferrin reduces neutrophils and pro-inflammatory cytokines in mouse models of Pseudomonas aeruginosa lung infections. Biochem Cell Biol 2017;95(1):41–47 [doi: 10.1139/bcb-2016-0050].

18. Sessa R, Di Pietro M, Filardo S, Bressan A, Rosa L, Cutone A, Frio-ni A, Berlutti F, Paesano R, Valenti P. Effect of bovine lactoferrin on Chlamydia trachomatis infection and inflammation. Biochem Cell Biol. 2017;95(1):34–40 [doi: 10.1139/bcb-2016-0049].

19. Mahdi L, Mahdi N, Al-kakei S, Musafer H, Al-Joofy I, Essa R, Zwa-in L, Salman I, Mater H, Al-Alak S, Al-Oqaili R. Treatment strategy by lactoperoxidase and lactoferrin combination: immunomodula-tory and antibacterial activity against multidrug-resistant

Acineto-bacter baumannii. Microb Pathog 2018;114:147–152 [doi: 10.1016/j.

micpath.2017.10.056].

20. Hwang SA, Kruzel ML, Actor JK. Immunomodulatory effects of re-combinant lactoferrin during MRSA infection. Int Immunopharma-col. 2014;20(1):157–163 [doi: 10.1016/j.intimp.2014.02.029].

21. Ochoa TJ, Sizonenko SV. Lactoferrin and prematurity: a promising milk protein? Biochem Cell Biol 2017;95(1):22–30 [doi: 10.1139/bcb-2016-0066].

22. Sherman MP, Sherman J, Arcinue R, Niklas V. Randomized control trial of human recombinant lactoferrin: a substudy reveals effects on the fecal microbiome of very low birth weight infants. J Pediatr. 2016;173(Suppl.):S37–42 [doi: 10.1016/j.jpeds.2016.02.074].

23. EFSA Panel on Dietetic Products, Nutrition and Allergies (NDA). Scientific opinion on bovine lactoferrin. EFSA Journal 2012;10(5):2701 [doi: 10.2903/j.efsa.2012.2811].