Widok Budowa i funkcje białek błony lizosomalnej

K

R

i J

G

-S

Wydzia³ Biologii i Nauk o Ziemi

Instytut Biologii Ogólnej i Molekularnej Uniwersytet Miko³aja Kopernika

Gagarina 7, 87-100 Toruñ e-mail: jgsz@biol.uni.torun.pl

BUDOWA I FUNKCJE BIA£EK B£ONY LIZOSOMALNEJ Lizosomy to subkomórkowe organelle o

strukturze pêcherzykowej otoczone poje-dyncz¹ dwuwarstw¹ lipidow¹. Po raz pierwszy opisane zosta³y w latach 1949-1955 przez Chri-stiana De Duve. Zawieraj¹ zestaw co najmniej 50 enzymów hydrolitycznych aktywnych w ni-skim pH, umo¿liwiaj¹cych degradacjê wiêkszo-œci makrocz¹steczek (BOWERS 1998).

Powszechnie uwa¿a siê lizosomy za koñco-wy przedzia³ w szlaku niespecyficznej degrada-cji materia³u zewn¹trzkomórkowego (endocy-toza absorpcyjna, receptorozale¿na, fluidalna) i wewn¹trzkomórkowego (krinofagia, ma-kroautofagia, mikroautofagia) (KORNFELD i MELLMAN 1989; HUNZIKER i GEUZE 1996; CUERVOi DICE1998; LUZIO i wspó³aut. 2000, 2001). Procesy te w uproszczeniu przedstawio-no na Ryc. 1.

Ostatnio wykazano, i¿ w lizosomach zacho-dzi równie¿ specyficzna proteoliza okreœlo-nych bia³ek cytosolowych. Ten sposób degra-dacji uruchamiany jest jednak tylko w niektó-rych tkankach, w warunkach d³ugotrwa³ego g³odu lub stresu (CUERVOi DICE1996; CUERVO

i wspó³aut. 1995, 1997, 1998).

Lizosomy ró¿nych komórek i tkanek mog¹ tak¿e uczestniczyæ w sekrecji zgromadzonego materia³u poza komórkê (STINCHCOMBE i GRIFFITHS1999, ANDREWS2000). Fuzja lizoso-mów z b³on¹ komórkow¹ i opró¿nienie

pêche-rzyka do przestrzeni zewn¹trzkomórkowej za-chodzi np. w odpowiedzi na podwy¿szenie wewn¹trzkomórkowego stê¿enia jonów Ca2+i jest sposobem naprawy uszkodzeñ b³ony ko-mórkowej (MARTINEZi wspó³aut. 2000, REDDY

i wspó³aut. 2001).

Ze wzglêdu na szczególne funkcje lizoso-mu, b³ona go otaczaj¹ca charakteryzuje siê spe-cyficznymi w³aœciwoœciami. Jej struktura musi efektywnie zabezpieczaæ pozosta³e przedzia³y subkomórkowe oraz sam¹ b³onê przed hydro-lazami zgromadzonymi we wnêtrzu lizosomu. Integralne glikoproteiny b³onowe pe³ni¹ rolê strukturaln¹ i ochronn¹, a niektóre z nich funk-cjonuj¹ jako receptory. Te ostatnie uczestnicz¹, miêdzy innymi, w rozpoznaniu i dostarczaniu do lizosomów materia³u przeznaczonego do specyficznej degradacji bia³ek (CUERVOi DICE

1998).

Dziêki obecnoœci bia³ek tworz¹cych pom-pê protonow¹, b³ona lizosomalna uczestniczy w utrzymaniu kwaœnego pH wnêtrza lizosomu, a tym samym stwarza w³aœciwe œrodowisko dla dzia³ania enzymów hydrolitycznych (BOWERS

1998).

Bia³ka b³onowe o charakterze transporte-rów poœrednicz¹ w „opró¿nianiu” lizosomów z produktów degradacji. Niektóre z nich maj¹ równie¿ charakter glikoprotein. Cechuje je wy-soka specyficznoœæ wzglêdem zwi¹zków

ni-Hsp — bia³ko szoku termicznego, Hsc — bia³ko pokrewne ni-Hsp, lamp, limp — integralne bia³ka b³ony lizosomu, lgp — glikoproteina lizosomalna

Numer 2-3 (259-260)

skocz¹steczkowych takich jak aminokwasy, nukleozydy, cukrowce, jony, witaminy itp. (MANCINI i wspó³aut. 2000).

W niniejszym artykule omówiona zostanie budowa i funkcja kilku bia³ek b³ony lizosomal-nej.

POMPA PROTONOWA Wytworzenie i utrzymanie niskiego pH

wnêtrza lizosomu jest wynikiem ustalenia siê dynamicznej równowagi pomiêdzy zale¿nym od ATP transportem jonów H+do œwiat³a orga-nelli a biernym ich wyp³ywem w ramach wy-miany z jonami jednododatnimi, np. K+, nap³ywaj¹cymi z cytosolu (ZHANG i wspó³aut. 2000, SCHOONDERWOERT i MARTENS 2001).

B³ona lizosomu w warunkach fizjologicz-nych jest przepuszczalna dla jonów jednowarto-œciowych, takich jak K+czy Na+, natomiast prak-tycznie nie przepuszczalna dla jonów H+. Bada-nia ZHANGi wspó³aut. (2000) przeprowadzone na izolowanych lizosomach, wykaza³y wzrost przepuszczalnoœci b³ony lizosomalnej dla H+ wraz ze wzrostem jej p³ynnoœci in vitro. Nie wiadomo jednak jeszcze dok³adnie jakie czynni-ki powoduj¹ w warunkach fizjologicznych zmianê przepuszczalnoœci b³ony dla jonów H+.

Zale¿ny od ATP transport protonów do wnêtrza lizosomu mo¿liwy jest dziêki

obecno-œci w b³onie lizosomalnej pompy protonowej nale¿¹cej do rodziny wakuolarnych H+-ATPaz (ang. v-type H+-ATPase, V-ATPase), obecnych m. in. w cysternach aparatu Golgiego, endoso-mach i pêcherzykach op³aszczonych klatryn¹ wiêkszoœci komórek eukariotycznych oraz w wakuolach komórek dro¿d¿y i roœlin (ARAI i wspó³aut. 1993, FINBOW i HARRISON 1997, FORGAC 1999, SCHOONDERWOERT i MARTENS

2001). V-ATPaza b³ony lizosomalnej jest enzy-mem wielopodjednostkowym z dwiema pod-stawowymi domenami — cytosolow¹ V₁ oraz zakotwiczon¹ w b³onie V₀(FINBOWi HARRISON

1997, SCHOONDERWOERT i MARTENS 2001) (Ryc. 2).

Domena cytosolowa V_1,o masie cz¹steczko-wej oko³o 840 kDa, wykazuje aktywnoœæ katali-tyczn¹ wzglêdem ATP pochodz¹cego g³ównie z cytosolu. Domenê t¹ buduje osiem ró¿nych podjednostek oznaczonych literami od A do H (Tabela 1). Podjednostki A i B tworz¹ tak zwan¹ Ryc. 1. Udzia³ lizosomów w procesach wewn¹trzkomórkowej degradacji makromoleku³.

N — j¹dro komórkowe, M — mitochondrium, L — lizosom, ER — siateczka œródplazmatyczna, AG — aparat Golgiego, PM — b³ona plazmatyczna.

„g³ówkê” odpowiedzialn¹ za wi¹zanie i hydro-lizê ATP, przy czym jedynie podjednostka A

wy-kazuje aktywnoœæ katalityczn¹ (FORGAC1999). Pozosta³e podjednostki domeny V1wchodz¹ w sk³ad czêœci ³¹cz¹cej „g³ówkê” z domen¹ b³onow¹ V₀.

Na domenê V₀, o masie cz¹steczkowej 260 kDa, sk³ada siê piêæ ró¿nych podjednostek (oznaczonych a, c, c’, c’’ oraz d). Podjednostki c, c’ i c’’ s¹ silnie hydrofobowymi, transb³ono-wymi proteolipidami o wysokim stopniu kon-serwatywnoœci (FINBOW i HARRISON 1997, FORGAC1999). Tworz¹ one kana³ w b³onie lizo-somalnej, umo¿liwiaj¹cy translokacjê proto-nów do wnêtrza lizosomu. Hydroliza jednej cz¹steczki ATP umo¿liwia translokacjê dwóch lub trzech jonów H+ (FINBOW i HARRISON

1997).

Sk³ad podjednostkowy i stechiometria do-men V₀i V₁ró¿ni¹ siê nieznacznie w zale¿noœci od pochodzenia enzymu (ARAI i wspó³aut. 1993, SCHOONDERWOERT i MARTENS 2001).

Aktywnoœæ oczyszczonej V-ATPazy uzyska-nej z lizosomów w¹troby szczura jest zale¿na od obecnoœci jonów Mg2+. Hydroliza ATP za-chodzi optymalnie w pH 7.0–8.0. Oczyszczony enzym jest aktywowany przez aniony takie jak Cl, Br i F oraz hamowany przez NO–₃. Inhibito-rami aktywnoœci H+-ATPazy b³ony lizosomu s¹ te¿ bafilomycyna A₁, która jest selektywnym, wysoce specyficznym inhibitorem wakuolar-nych ATPaz oraz zwi¹zki reaguj¹ce z grupami –SH, np. NEM (ang. N-ethylmaleimide, imid kwasu jab³kowego) (ARAI i wspó³aut. 1993, Ryc. 2. Model struktury V-ATPazy b³ony

lizoso-malnej (wg FORGACA1999, FINBOWi HARRISONA 1997, SCHOONDERWOERTA i MARTENSA 2001, zmodyfikowana).

Tabela 1. Sk³ad podjednostkowy V-ATPazy (wg FINBOWA i HARRISONA 1997, FORGACA 1999, SCHOONDERWOERTA i MARTENSA 2001, zmodyfikowana).

*podane masy cz¹steczkowe odnosz¹ siê do podjednostek enzymu izolowanego z pêcherzyków op³aszczonych klatryn¹ z komórek mózgu wo³u

FINBOW i HARRISON 1997). Wysoka selektyw-noœæ dzia³ania powy¿szych inhibitorów po-zwala na odró¿nienie V-ATPazy od ATPazy mi-tochondrialnej, nale¿¹cej do rodziny F-ATPaz. Mechanizm translokacji protonów przez b³onê lizosomu jest podobny jak w innych pompach protonowych i opiera siê na rotacyjnych zmia-nach konformacji podjednostek ATPazy (FINBOW i HARRISON 1997, FORGAC 1999).

Ze wzglêdu na funkcjê V-ATPazy w fizjolo-gii komórek, pompa protonowa w b³onie lizo-somu (i nie tylko) wymaga precyzyjnej regula-cji. Jednym z proponowanych mechanizmów regulacyjnych jest odwracalna inaktywacja en-zymu poprzez tworzenie mostków dwusiarcz-kowych pomiêdzy resztami cysteiny w pozycji 254 i 532 w obrêbie podjednostki katalitycz-nej A (FORGAC1999, SCHOONDERWOERTi M AR-TENS 2001).

W komórkach eukariotycznych odnajdywa-no czêsto pojedyncze podjedodnajdywa-nostki lub ca³e do-meny V0i V1(ARAIi wspó³aut. 1993, S

CHOON-DERWOERTi MARTENS2001), co mo¿e wskazy-waæ na mo¿liwoœæ asocjacji i dysocjacji tych elementów jako sposobu regulacji aktywnoœci. Domena V₀od³¹czona od elementu V₁nie jest zdolna do translokacji protonów, a wyizolowa-na z cytosolu domewyizolowa-na V₁nie wykazuje równie¿ zdolnoœci hydrolizowania ATP (FINBOW i HARRISON 1997).

Efektywnoœæ przenoszenia protonów przez V-ATPazê mo¿e byæ tak¿e kontrolowana przez wewnêtrzne pH lizosomu. Im ni¿sza

war-toœæ pH, tym wiêcej podjednostek c przyjmuje konformacjê uniemo¿liwiaj¹c¹ translokacjê protonów, co znacznie obni¿a efektywnoœæ „pompowania” protonów (SCHOONDERWOERT

i MARTENS2001). W przypadku wakuol roœlin-nych stwierdzono, i¿ znacz¹ca (4–5 jednostek) ró¿nica pomiêdzy wartoœci¹ pH cytosolowego i luminalnego powoduje spadek iloœci przeno-szonych protonów do œrednio 1.75 H+na jedn¹ cz¹steczkê zhydrolizowanego ATP (patrz FINBOW i HARRISON1997). Oprócz wy¿ej wy-mienionych modeli regulacji czynnoœci ATP-a-zy, niew¹tpliwie istnieje jeszcze szereg innych mechanizmów.

Wyniki badañ z ostatnich lat wskazuj¹, i¿ w lizosomach funkcjonuje jeszcze inny uk³ad umo¿liwiaj¹cy powstanie gradientu protono-wego i nap³yw jonów H+do wnêtrza lizosomu. W b³onie lizosomu wykryto obecnoœæ przenoœ-ników elektronów, miêdzy innymi cytochro-mu b i ubichinonu, tworz¹cych ³añcuch reakcji utleniania i redukcji. Substratem w tych reak-cjach jest NADH, który ulega utlenieniu po stronie cytosolowej b³ony lizosomalnej, staj¹c siê Ÿród³em jonów H+(GILLEi NOHL2000). Po-wstaj¹cy gradient protonów i ich nap³yw do wnêtrza lizosomu prowadzi do obni¿enia wewn¹trzlizosomalnego pH. Byæ mo¿e jest to mechanizm wa¿niejszy i efektywniejszy od transportu protonów zachodz¹cego z udzia³em H+-ATPazy, poniewa¿ nie wymaga do-starczania ATP z pozalizosomalnych Ÿróde³ (NOHL i GILLE 2001).

GLIKOPROTEINY LIZOSOMALNE Glikoproteiny b³ony lizosomalnej (ang.

ly-sosomal membrane glycoproteins, lgps) stano-wi¹ 50% wszystkich bia³ek w b³onie lizosomu (cyt. za WINCHESTER 2001). Ze wzglêdu na strukturê ³añcucha polipeptydowego oraz komponentu cukrowcowego zosta³y podzielo-ne na dwie rodziny: bia³ka lamp (ang. lysoso-me-associated membrane protein) o masie cz¹steczkowej 90-120 kDa oraz bia³ka limp (ang. lysosomal integral membrane protein) o masie cz¹steczkowej 30–85 kDa (HUNZIKER i GEUZE 1996) (Ryc. 3).

Najlepiej poznane glikoproteiny rodziny lamp — lamp1 (nazywane te¿ lgp A) i lamp2 (nazywane lgp B), s¹ kodowane przez odrêbne lecz ewolucyjnie spokrewnione geny. W obrê-bie lamp2 zidentyfikowano trzy izoformy (na-zwane a, b i c) wykazuj¹ce znaczne

podobie-ñstwo sekwencji aminokwasów w regionie lu-minalnym (HUNZIKERi GEUZE1996, CUERVOi DICE2000b). Bia³ka lamp wystêpuj¹ g³ównie w b³onie lizosomalnej, choæ pewne formy odnaj-dywano tak¿e w œwietle lizosomu (JADOT i wspó³aut. 1996, 1997, CUERVOi DICE2000c).

Glikoproteiny rodziny lamp wykazuj¹ znaczne podobieñstwo w budowie. Domi-nuj¹cym elementem jest silnie glikozylowana domena N-koñcowa zwrócona do œwiat³a pê-cherzyka lizosomalnego. Pojedynczy region transb³onowy zbudowany jest z oko³o 20 ami-nokwasów. Cytosolowa domena C-koñca sk³ada siê z 10–12 reszt aminokwasów, z któ-rych czêœæ to sygna³owa sekwencja sortuj¹ca warunkuj¹ca w³aœciwe kierowanie bia³ka do li-zosomu (KORNFELD i MELLMAN 1989, HUNZIKER i GEUZE 1996).

Podobnie jak wszystkie glikoproteiny w ko-mórce, równie¿ lamp i limp ulegaj¹ potransla-cyjnej obróbce w aparacie Golgiego. Do miej-sca przeznaczenia docieraj¹ prawdopodobnie drog¹ bezpoœredniego sortowania w regionie trans aparatu Golgiego i transportu pêcherzy-kowego przy udziale klatryny i bia³ek adapto-rowych AP (HUNZIKER i GEUZE1996). W pro-ces ten zaanga¿owane s¹ pêcherzyki odmienne

od tych, które transportuj¹ rozpuszczalne bia³ka oznakowane ugrupowaniem manno-zo-6-fosforanowym (KARLSSON i CARLSSON

1998). Sposób poœredni to droga sekrecyjna polegaj¹ca na transporcie i wbudowaniu gliko-protein do b³ony komórkowej z nastêpuj¹cym transportem do endosomów i lizosomów (KORNFELD i MELLMAN 1989, HUNZIKER i GEUZE 1996).

Prawid³owe kierowanie lamp i limp zapew-niaj¹ sygna³owe sekwencje sortuj¹ce w regio-nie cytosolowym bia³ek: motyw zawieraj¹cy resztê tyrozyny w uk³adzie YXXF (gdzie X oznacza dowolny aminokwas, F — aminokwas z rozbudowan¹ domen¹ hydrofobow¹) dla bia³ek lamp1, lamp2 i limpI oraz motyw dile-ucynowy LL dla bia³ek limpII (KORNFELD i

MELLMAN 1989, HUNZIKER i GEUZE 1996, WINCHESTER2001). Sekwencje te rozpoznawa-ne s¹ przez odpowiednie jednostki bia³ek ad-aptorowych, co inicjuje ukierunkowany trans-port glikoprotein (MARKS i wspó³aut. 1996, KIRCHHAUSEN i wspó³aut. 1997).

Rola glikoprotein b³on lizosomalnych nie jest jeszcze w pe³ni poznana. Wiadomo, i¿ ró¿-ne formy bia³ek lamp ulegaj¹ wybiórczej

eks-presji w okreœlonych typach tkanek, co wska-zuje na specyficznoœæ ich dzia³ania (CUERVOi DICE2000c). Udokumentowana jest, jak do tej pory, ich rola w ochronie b³ony lizosomu przed hydrolitycznym dzia³aniem enzymów li-zosomalnych (KORNFELD i MELLMAN 1989, HUNZIKERi GEUZE1996, KUNDRAi KORNFELD

1999). W ostatnim czasie wyjaœniona zosta³a stosunkowo dobrze rola glikoproteiny lamp2a w selektywnej proteolizie bia³ek cytosolowych zachodz¹cej w lizosomach w warunkach stresu i g³odu. Proces ten przebiega z udzia³em bia³ek szoku termicznego (chaperonów, bia³ek opie-kuñczych) i nazywany jest autofagi¹ zale¿n¹ od bia³ek opiekuñczych (ang. chaperone media-ted autophagy).

Ryc. 3. Struktura glikoprotein b³ony lizosomalnej(wg KORNFELDA i MELLMANA 1989, HUNZIKERA i GEUZE 1996, zmodyfikowana).

GLIKOPROTEINA LAMP2A W SPECYFICZNEJ DEGRADACJI BIA£EK CYTOSOLOWYCH Substratami dla lizosomalnej degradacji

specyficznej s¹ bia³ka cytosolowe, zawieraj¹ce pentapeptyd KFERQ (Lys-Phe-Glu-Arg-Gln) pe³ni¹cy funkcjê sekwencji kieruj¹cej do lizo-somu. Oko³o 30% bia³ek cytosolowych posiada motyw KFERQ, a wiêc potencjalnie mog¹ one byæ substratami w procesie specyficznej degra-dacji (patrz CUERVO i wspó³aut. 1998).

Przyk³adem bia³ek z powy¿szym motywem s¹: rybonukleaza A, dehydrogenaza 3-fosfoglic-eroaldehydu (CUERVO i DICE 1996) oraz inne enzymy glikolityczne, czynniki transkrypcyjne (ANIENTO i wspó³aut. 1996) i ich regulatory

(CUERVOi wspó³aut. 1998), a tak¿e podjednost-ki proteasomu (CUERVO i wspó³aut. 1995).

Za prawid³owe rozpoznanie bia³ek objê-tych procesem specyficznej degradacji i ich transport do wnêtrza lizosomu odpowiedzial-na jest integralodpowiedzial-na glikoproteiodpowiedzial-na b³ony lizoso-malnej — lamp2a (lgp96) o masie cz¹steczko-wej 96 kDa oraz bia³ka szoku termicznego.

Masa cz¹steczkowa glikoproteiny lamp2a okreœlona na podstawie sekwencji cDNA

wy-nosi 45 kDa, co w zestawieniu z mas¹ cz¹stecz-kow¹ 96 kDa wskazuje na znaczn¹ zawartoœæ reszt cukrowcowych w strukturze tej glikopro-teiny. Najbardziej rozbudowana czêœæ bia³ka receptorowego to silnie glikozylowana dome-na lumidome-naldome-na, stanowi¹ca N-koniec polipepty-du. Krótki, cytosolowy C-koniec zbudowany jest zaledwie z 12 aminokwasów, których czêœæ tworzy sygna³ow¹ sekwencjê sortuj¹c¹ zawie-raj¹c¹ resztê tyrozyny i odpowiedzialn¹ za pra-wid³owe kierowanie glikoproteinylamp2ado lizosomu (CUERVOi DICE1996). Domena C-ko-ñcowa uczestniczy tak¿e w rozpoznawaniu

substratów przeznaczonych do degradacji czy-li bia³ek z sekwencj¹ KFERQ (CUERVO i DICE

2000b). Schemat budowy glikoprotein rodziny

lamp2 przedstawia Ryc. 3.

Glikoproteina lamp2a mo¿e polimeryzo-waæ z wytworzeniem form tetra-, okta- i multi-merycznych, co sugeruje mo¿liwoœæ tworzenia w b³onie lizosomu kana³ów o ró¿nej œrednicy u³atwiaj¹cych transport bia³ek (patrzCUERVOi DICE2000b).

Ryc. 4. Model transportu bia³ek cytosolowych do lizosomu (wg CUERVOi DICE2000a, AGARRABERESAi DICE 2001b, zmodyfikowana).

Populacje lizosomów wyodrêbnione z w¹troby szczura, szczególnie aktywnie uczest-nicz¹ce w selektywnej degradacji bia³ek cyto-solowych z sekwencj¹ KFERQ, wyró¿nia³y siê zwiêkszon¹ zawartoœci¹ bia³ka lamp2a (CUERVOi DICE2000b), a tak¿e by³y bogate w bia³ko szoku termicznego Hsc73. Cytosolowe bia³ko Hsc73, syntetyzowane konstytutywnie, jest niezbêdne dla rozpoznania sekwencji KFERQ na drodze ATP-zale¿nej (AGARRABERESi DICE2001a) oraz dla rozfa³dowania substratu przeznaczonego do degradacji, co umo¿liwia jego przejœcie przez b³onê lizosomaln¹ (SALVADOR i wspó³aut. 2000).

Oprócz cytosolowego bia³ka Hsc73 istniej¹ jeszcze dwie izoformy obecne odpowiednio w œwietle lizosomu (tzw. ly-Hsc73) i w b³onie li-zosomalnej od strony cytosolu (tzw. ly-m-Hsc73) (TERLECKY i DICE 1993, A GAR-RABERESi DICE2001b). Bia³ka te s¹ niezbêdne dla wspomagania translokacji substratu do wnêtrza lizosomu (CUERVO i wspó³aut. 1997, AGARRABERESi wspó³aut. 1997). Wy¿sza zawar-toœæ lizosomalnych form bia³kaHsc73 w lizoso-mach z wysokim poziomem selektywnej degra-dacji jest wynikiem zwiêkszonej jego internali-zacji z cytosolu i obni¿onej degradacji (CUERVO

i wspó³aut. 1997).

Najnowsze badania wskazuj¹ ponadto na udzia³ szeregu innych bia³ek szoku termiczne-go w procesie specyficznej degradacji bia³ek w lizosomach (CUERVO i DICE 2000a; A GAR-RABERES i DICE2001a, b). Na cytosolowej po-wierzchni b³ony lizosomalnej oprócz bia³ka

lym-Hsc73 funkcjonuje kompleks bia³ek opie-kuñczych, nieodzowny dla translokacji sub-stratu (bia³ek przeznaczonych do degradacji) przez b³onê lizosomu. W sk³ad kompleksu wchodzi bia³ko Hsp40 wzmacniaj¹ce aktyw-noœæ ATP-azow¹ cytosolowego bia³ka Hsc73, co u³atwia identyfikacjê substratu z sekwencj¹ KFERQ. Kolejne bia³ka kompleksu to Hsp90, Hip (ang. Hsc73 interacting protein) oraz Hop (ang. Hsc73-Hsp90 organizing protein), które stabilizuj¹ po³¹czenie kompleksów Hsc73 z substratem kierowanym do lizosomów.

Hipotetyczny model transportu bia³ek cyto-solowych do lizosomu przedstawiono na Ryc.4 (patrz CUERVO i DICE 2000a, AGARRABERES i DICE 2001b). Sekwencja wydarzeñ pro-wadz¹ca do degradacji polega na rozpoznaniu cytosolowego bia³ka z sekwencj¹ KFERQ przez cytosolow¹ formê Hsc73, które przy wspó³udziale innych bia³ek opiekuñczych

two-rzy aktywny kompleks. Kolejny etap prowadzi do rozfa³dowania bia³ka i wytworzenia konfor-macji optymalnej dla translokacji. Na cytosolo-wej powierzchni b³ony lizosomu bia³ko w kompleksie z Hsc73 zostaje rozpoznane przez receptor lamp2a i przy udziale dodatkowych bia³ek opiekuñczych lym-Hsc73, Hsp40, Hsp90, Hip oraz Hop przechodzi przez b³onê lizosomaln¹. Od strony œwiat³a lizosomu trans-lokacjê wspomaga bia³ko ly-Hsc73.

Regulacja specyficznej degradacji bia³ek wewn¹trz lizosomów odbywa siê miêdzy inny-mi poprzez regulowanie poziomu bia³ka lam-p2a w b³onie lizosomu. Ogólna zawartoœæ bia³ka lamp2a w b³onie lizosomalnej wynosi 5,8mg na 100 mg bia³ek b³onowych i jest skore-lowana z poziomem autofagii zachodz¹cej z udzia³em bia³ek opiekuñczych (CUERVOi DICE

1996, 1998, 2000c). Badania CUERVO i DICE

(1996) potwierdzi³y, i¿ wzrost poziomu eks-presji lamp2a w fibroblastach ludzkich powo-duje zwiêkszenie wydajnoœci szlaku specyficz-nej proteolizy. Zmiany w zawartoœci glikopro-teiny lamp2a w b³onie lizosomu zale¿¹ od jej odpornoœci na degradacjê oraz od dystrybucji pomiêdzy b³on¹ a wnêtrzem lizosomu (JADOTi wspó³aut. 1996, 1997). W warunkach stresu ro-œnie odpornoœæ lamp2a na degradacjê, wsku-tek czego wzrasta wydajnoœæ autofagii z udzia³em bia³ek opiekuñczych. Ponadto trans-port substratów przez b³onê lizosomu przy udziale lamp2a powoduje czêœciow¹ internali-zacjê tej glikoproteiny do œwiat³a lizosomu, a dziêki procesowi reinsercji receptor powraca do b³ony lizosomalnej (CUERVOi DICE2000c). W populacjach lizosomów z wysok¹ aktywno-œci¹ proteolizy specyficznej a¿ 78% lamp2a znajduje siê w b³onie, a 22% we wnêtrzu lizoso-mu, natomiast w lizosomach z nisk¹ aktywno-œci¹ tego procesu tylko 57% lamp2a pozostaje w b³onie lizosomu, a 43% obecne jest w jego wnêtrzu (CUERVOi DICE2000b). Wynika st¹d, i¿ internalizacja i reinsercja glikoproteiny lam-p2a jest jednym z mechanizmów reguluj¹cych poziom procesu specyficznej proteolizy bia³ek cytosolowych z sekwencj¹ KFERQ.

Zaanga¿owanie w interakcjê z substratem cytosolowej i lizosomalnej formy Hsc73 oraz glikoproteiny lamp2a mo¿e byæ sposobem po-trójnej kontroli prawid³owoœci wyboru bia³ka przeznaczonego do degradacji. Kontrola taka pozwala komórce ustrzec siê przed przypad-kow¹ proteoliz¹ bia³ek istotnych dla jej funk-cjonowania (AGARRABERES i DICE2001b).

BIA£KA B£ONY LIZOSOMALNEJ W ROLI TRANSPORTERÓW METABOLITÓW I JONÓW

Hydroliza makrocz¹steczek w obrêbie lizo-somu prowadzi do powstania wielu prostych zwi¹zków, które mog¹ byæ wykorzystane przez komórkê. Specyficzna hydroliza bia³ek, za-chodz¹ca w szczególnoœci w warunkach g³odu, chroni bia³ka szczególnie wa¿ne metabolicz-nie i równoczeœmetabolicz-nie dostarcza substraty dla przemian energetycznych. S³abo przepuszczal-na b³oprzepuszczal-na lizosomalprzepuszczal-na nie pozwala przepuszczal-na uwolnie wiêkszoœci produktów degradacji, uwol nie-mniej jednak przedostaj¹ siê one do cytosolu. Pokonanie bariery b³ony lizosomalnej umo¿li-wiaj¹ specyficzne noœniki, bêd¹ce integralny-mi bia³kaintegralny-mi b³onowyintegralny-mi (patrz LLOYD 2000). Tworz¹ one systemy transportuj¹ce jony, sub-stancje i zwi¹zki niskocz¹steczkowe przez b³onê lizosomu. Znanych jest oko³o 20 syste-mów transportuj¹cych, kilka z nich dok³adnie poznano i scharakteryzowano (MANCINI i wspó³aut. 2000, WINCHESTER 2001).

Za eksport cystyny z lizosomów do cytoso-lu odpowiedzialne jest bia³ko cystynozyna (MANCINIi wspó³aut. 2000). Wykazuje ono lo-kalizacjê identyczn¹ z glikoproteinami rodziny

lamp2. Prawid³owe funkcjonowanie transpor-tu cystyny stymulowane jest ponadto przez kwaœne pH wnêtrza lizosomu, transport ten jest wiêc poœrednio zale¿ny od ATP (KALATZISi wspó³aut. 2001). Cystynozyna zosta³a wyizolo-wana z ró¿nych Ÿróde³, miêdzy innymi z komó-rek w¹troby szczura i ludzkich erytrocytów (MANCINI i wspó³aut. 2000).

Uzyskanie cDNA z komórek ludzkich po-zwoli³o na poznanie struktury cystynozyny. Bia³ko zbudowane jest z 367 aminokwasów z kilkoma funkcjonalnymi domenami. Domena N-koñcowa zawiera 7 miejsc potencjalnej gli-kozylacji. Tu¿ za ni¹ znajduje siê odcinek transb³onowy, który siedmiokrotnie przecho-dzi przez b³onê lizosomu. W obrêbie 10 reszt aminokwasowych tworz¹cych domenê C-ko-ñca znajduje siê sygna³owa sekwencja sor-tuj¹ca GYDQL oparta na tyrozynie, niezbêdna dla w³aœciwego kierowania bia³ka do lizoso-mów (MANCINI i wspó³aut. 2000, KALATZIS i wspó³aut. 2001). Prawid³owe dotarcie cystyno-zyny do miejsca przeznaczenia zale¿ne jest ta-k¿e od wspó³udzia³u dodatkowego motywu – YFPQA, zlokalizowanego w obrêbie jednej z pêtli cytosolowych bia³ka. Motyw ten nie przy-pomina ¿adnej z dotychczas poznanych se-kwencji sortuj¹cych, chocia¿ kluczow¹ rolê od-grywa w nim równie¿ reszta tyrozyny.

Prawdo-podobnie rozpoznawany jest przy udziale bia³ek adaptorowych AP, ale nie wiadomo dok³adnie w jaki sposób zapewnia kierowanie do lizosomu (CHERQUI i wspó³aut. 2001).

Sialina odpowiada w b³onie lizosomalnej za transport poza lizosom kwasu sialowego i kwa-œnych monosacharydów (MANCINIi wspó³aut. 2000). Dowiedziono, ¿e mo¿e te¿ poœredni-czyæ w transporcie kwasów mono- i dikarbok-sylowych, a tak¿e stanowi uniwersalny przeno-œnik anionów (HAVELAAR i wspó³aut. 1998b, 1999).

Sialina jest bia³kiem zbudowanym z 495 reszt aminokwasów, jej masa cz¹steczkowa przewidziana na podstawie sekwencji cDNA wynosi 53 kDa (nie uwzglêdnia komponentu cukrowcowego). Domeny N-koñcowa i C-ko-ñcowa zwrócone s¹ do cytosolu. Odcinek transb³onowy przechodzi przez b³onê 12 razy, a na utworzonych w ten sposób pêtlach lumi-nalnych znajduje siê 6 miejsc potencjalnej gli-kozylacji. Sugeruje siê, ¿e funkcjonowanie no-œnika stymulowane jest przez jednoczesny symport jonówH+, a wiêc konieczne jest istnie-nie gradientu protonów w poprzek b³ony. Do-tychczas brak jednak danych na temat obecno-œci w strukturze sialiny sygna³owej sekwencji sortuj¹cej kieruj¹cej to bia³ko do b³ony lizoso-malnej. Mo¿e to wskazywaæ, i¿ sialina zlokalizo-wana jest nie tylko w lizosomach lecz tak¿e w b³onach innych struktur wewn¹trzkomórko-wych. Gen koduj¹cy bia³ko transportuj¹ce ule-ga ekspresji g³ównie w komórkach mózgu, w¹troby, ³o¿yska, p³uc, miêœni i nerek cz³owie-ka (MANCINI i wspó³aut. 2000).

Bia³ko MTP (ang. mouse transporter prote-in) umo¿liwia eksport nukleozydów do cytoso-lu, dostarczaj¹c w ten sposób substraty do bio-syntezy kwasów nukleinowych oraz reguluj¹c wewn¹trzkomórkowy poziom nukleozydów. Wkrótce po sklonowaniu bia³ka MTP z komó-rek myszy, uzyskano homologiczne bia³ko HUMORF13 o nieznanej dotychczas funkcji, obecne w komórkach ludzkich. Oba bia³ka wy-kazuj¹ 98% identycznoœci sk³adu aminokwaso-wego przewidywanego na podstawie sekwen-cji cDNA. Wysoki stopieñ homologii sugeruje istotn¹ rolê tych bia³ek w funkcjonowaniu ko-mórek (HOGUE i wspó³aut. 1996, CABRITA i wspó³aut. 1999). MTP i jego odpowiedniki w komórkach innych ssaków rezyduj¹ w b³onach ró¿nych przedzia³ów wewn¹trzkomórko-wych, g³ównie cystern aparatu Golgiego,

póŸ-nych endosomów i lizosomów (HOGUE i wspó³aut. 1996).

Bia³ko MTP to niewielki polipeptyd zbudo-wany z 233 reszt aminokwasów, o masie cz¹steczkowej oko³o 25 kDa, z czterokrotnie przechodz¹cym przez b³onê odcinkiem transb³onowym. Zarówno MTP, jak i HUMORF13 posiadaj¹ w obrêbie domeny C-ko-ñcowej sekwencjê odpowiadaj¹c¹ wzorowi YXX, co upodabnia je do glikoprotein lamp i pozwala przypuszczaæ, ¿e jest to bia³ko malne. W³aœciwe kierowanie bia³ka do lizoso-mu wymaga jednak¿e obecnoœci dodatkowej sygna³owej sekwencji sortuj¹cej opartej na reszcie tyrozyny, podobnie jak w przypadku cystynozyny (HOGUE i wspó³aut. 2002). Brak

natomiast danych na temat glikozylacji powy¿-szych bia³ek.

Wprowadzenie genu koduj¹cego MTP do komórek Saccharomyces cerevisiae powoduje ekspresjê bia³ka normalnie nieobecnego w ko-mórkach dro¿d¿y i prowadzi do wzrostu od-pornoœci komórek na ró¿ne zwi¹zki, m. in.: an-tybiotyki, jonofory i hormony steroidowe (HOGUE i wspó³aut. 1999). Mo¿liwe, ¿e po-dobn¹ rolê spe³nia to bia³ko w komórkach ssa-ków, gdzie w³aœnie lizosomy s¹ odpowiedzial-ne za akumulowanie i unieczynnianie trucizn docieraj¹cych do komórki (patrz CABRITA i wspó³aut. 1999).

Wymienione powy¿ej bia³ka to tylko nie-które, najlepiej poznane, systemy transportu

b³ony lizosomalnej. Liczne prace donosz¹ o ist-nieniu równie¿ innych transporterów (Tabe-la 2). W wiêkszoœci s¹ to bia³ka eksportuj¹ce

zwi¹zki niskocz¹steczkowe z lizosomu do cyto-solu, jedynie niektóre z nich poœrednicz¹ w transporcie w przeciwnym kierunku.

PODSUMOWANIE B³ona lizosomalna odgranicza wnêtrze

lizo-somów zawieraj¹ce enzymy umo¿liwiaj¹ce de-gradacjê wszystkich makromoleku³ a tak¿e uczestniczy czynnie w utrzymaniu odpowied-niego œrodowiska dla procesów degradacji.

1. Kompleks bia³ek lizosomalnejH+-ATPazy

uczestniczy w pompowaniu protonów do wnêtrza lizosomów, co zapewnia optymalne warunki dzia³ania enzymom lizosomalnym hy-drolizuj¹cym wiêkszoœæ cz¹steczek.

2. Glikoproteiny lamp2a uczestnicz¹ w pro-cesie specyficznej proteolizy bia³ek z sekwen-cj¹ KFERQ w warunkach stresu i g³odu.

3. Specyficzne bia³ka b³onowe umo¿liwiaj¹ eksport z lizosomów takich produktów degra-dacji makromoleku³ jak aminokwasy, dipepty-dy, cukrowce i nukleozydy jak równie¿ eksport i import kationów i anionów.

STRUCTURE AND FUNCTIONING OF LYSOSOMAL MEMBRANE PROTEINS

S u m m a r y The lysosomal membrane delimits the interial part

of lysosomes containing the enzymes capable of de-grading practically all cellular macromolecules, and actively participates as well in establishing an efficient environment for the degradation processes.

1. H+-ATPase — the main membrane protein com-plex ensures the low pH environment needed for effi-cient activity of lysosomal hydrolases.

2. Glycoproteins lamp2a are involved in specific degradation of proteins containing the KFERQ se-quence (chaperone mediated autophagy) under con-dition of stress and starvation.

3. Specific lysosomal membrane proteins partici-pate in export from and import to of low molecular weight compounds such as amino acids, dipeptides, sugars, nucleosides, or ions.

LITERATURA

AGARRABERESF. A., TERLECKYS. R., DICEJ. F.,1997. An

in-tralysosomal hsp70 is required for a selective pa-thway of lysosomal protein degradation. J. Cell

Biol. 137, 825–834.

AGARRABERESF. A., DICEJ. F., 2001a. Protein

transloca-tion across membranes. Biochim. Biophys. Acta

1513, 1–24.

AGARRABERESF. A., DICEJ. F., 2001b. A molecular

chape-rone complex at the lysosomal membrane is requ-ired for protein translocation. J. Cell Sci. 114,

2491–2499.

ANDREWSN. W., 2000. Regulated secretion of

conven-tional lysosomes. Trends Cell Biol. 10, 316–321.

ANIENTO F., PAPAVASSILIOU A. G., KNECHT E., ROCHEE.,

1996. Selective uptake and degradation of c-Fos

and v-Fos by rat liver lysosomes. FEBS Lett. 390,

47–52.

ARAIK., SHIMAYAA., HIRATANIN., OHKUMAS., 1993.

Puri-fication and characterization of lysosomal H+ -A-TPase. An anion-sensitive v-type H+-ATPase from rat liver lysosomes. J. Biol. Chem. 268, 5649–5660.

BOWERS W. E., 1998. Christian De Duve and the

di-scovery of lysosomes and peroxisomes. Trends

Cell Biol. 8, 330–333.

CABRITAM. A., HOBMANT. C., HOGUED. L., KINGK. M.,

CASS C. E., 1999. Mouse transporter protein, a

membrane protein that regulates cellular

multi-drug resistance, is localized to lysosomes. Cancer

Res. 59, 4890–4897.

CHERQUIS., KALATZISV., TRUGNANG., ANTIGNACC., 2001. The targeting of cystinosin to the lysosomal mem-brane requires a tyrosine-based signal and a novel sorting motif. J. Biol. Chem. 276, 13314–13321.

CUERVOA. M., DICEJ. F., 1996. A receptor for the

selec-tive uptake and degradation of proteins by lysoso-mes. Science 273, 501–503.

CUERVOA. M., DICEJ. F., 1998. Lysosomes, a meeting

po-int of proteins, chaperones and proteases. J. Mol.

Med. 76, 6–12.

CUERVOA. M., DICEJ. F., 2000a. When lysosomes get old.

Exp. Geront. 35, 119–131.

CUERVOA. M., DICEJ. F., 2000b. Unique properties of

lamp2a compared to other lamp2 isoforms. J. Cell.

Sci. 113, 4441–4450.

CUERVOA. M., DICEJ. F., 2000c. Regulation of lamp2a

levels in the lysosomal membrane. Traffic 1,

570–583.

CUERVOA. M., PALMERA., RIVETTA. J., KNECHTE., 1995. Degradation of proteasomes by lysosomes in rat liver. Eur. J. Biochem. 227, 792–800.

CUERVOA. M., DICEJ. F., KNECHTE., 1997. A population

uptake and degradation of cytosolic proteins. J.

Biol. Chem. 272, 5606–5615.

CUERVOA. M., HUW., LIMB., DICEJ. F., 1998. IB is a

sub-strate for a selective pathway of lysosomal proteo-lysis. Mol. Biol. Cell 9, 1995–2010.

FINBOWM. E., HARRISONM. A., 1997. The vacuolar H+ -A-TPase, a universal proton pump of eukaryotes.

Biochem. J. 324, 697–712.

FORGACM., 1999. Structure and properties of the

vacu-olar H+-ATPases. J. Biol. Chem. 274, 12951–12954.

GILLEL., NOHLH., 2000. The existence of a lysosomal re-dox chain and the role of ubiquinone. Arch.

Bio-chem. Biophys. 375, 347–354.

HAVELAARA. C., DEGASTI. L., SNIJDERSS., BEERENSC. E. M. T., MANCINIG. M. S., VERHEIJENF. W., 1998a. Charac-terization of a heavy metal ion transporter in the lysosomal membrane. FEBS Lett. 436, 223–227.

HAVELAARA. C., MANCINIG. M. S., BEERENSC. E. M. T., SOURENR. M. A., VERHEIJENF. W., 1998b. Purifica-tion of the lysosomal sialic acid transporter. Func-tional characteristics of a monocarboxylate transporter. J. Biol. Chem. 273, 34568–34574.

HAVELAARA. C., BEERENSC. E. M. T., MANCINI G. M. S., VERHEIJENF. W., 1999. Transport of organic anions

by the lysosomal sialic acid transporter, a functio-nal approach towards the gene for sialic acid sto-rage disease. FEBS Lett. 446, 65–68.

HOGUED. L., ELLISONM. J., YOUNGJ. D., CASSC. E., 1996.

Identification of a novel membrane transporter associated with intracellular membranes by phe-notypic complementation in the yeast Saccharo-myces cerevisiae. J. Biol. Chem. 271, 9801–9808.

HOGUED. L., KERBYL., LINGV., 1999. A mammalian ly-sosomal membrane protein confers multidrug re-sistance upon expression in Saccharomyces ce-revisiae. J. Biol. Chem. 274, 12877–12882.

HOGUED. L., NASHC., LINGV., HOBMANT. C., 2002.

Lyso-some-associated protein transmembrane 4a (LAPTM4a) requires two tandemly arranged tyro-sine-based signals for sorting to lysosomes.

Bio-chem. J. 365, 721–730.

HUNZIKERW., GEUZE H. J., 1996. Intracellular

traffic-king of lysosomal membrane proteins. BioEssays

18, 379–389.

JADOT M., WATTIAUX R., MAINFERME F., DUBOIS F., CLAESSENSA. M., WATTIAUX-DECONINCKS., 1996.

So-luble form of Lamp II in purified rat liver lysoso-mes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 223,

353–359.

JADOTM., DUBOISF. WATTIAUX-DECONINCKS., WATTIAUX

R., 1997. Supramolecular assemblies from

lysoso-mal matrix proteins and complex lipids. Eur. J.

Biochem. 249, 862–869.

JONASA. J., JOBEH., 1990. Sulfate transport by rat liver

lysosomes. J. Biol. Chem. 265, 17545–17549.

KALATZISV., CHERQUIS., ANTIGNACC., GASNIERB., 2001. Cystinosin, the protein defective in cystinosis, is a H+-driven lysosomal cystine transporter. EMBO J.

20, 5940–5949.

KARLSSONK., CARLSSONS. R., 1998. Sorting of lysosomal membrane glycoproteins lamp-1 and lamp-2 into vesicles distinct from mannose-6-phosphate recep-tor/-adaptin vesicles at the trans-Golgi network. J.

Biol. Chem. 273, 18966–18973.

KIRCHHAUSENT., BONIFACINOJ. S., RIEZMANH., 1997.

Lin-king cargo to vesicle formation, receptor tail inte-ractions with coat proteins. Curr. Opin. Cell Biol.

9, 488–495.

KORNFELDS., MELLMANI., 1989. The biogenesis of

lysoso-mes. Annu Rev. Cell Biol. 5, 483–525.

KUNDRAR., KORNFELDS., 1999. Asparagine-linked oli-gosaccharides protect Lamp-1 and Lamp-2 from intracellular proteolysis. J. Biol. Chem. 274,

31039–31046.

LLOYDJ. B., 2000. Lysosome membrane permeability, implications for drug delivery. Adv. Drug Del. Rev.

41, 189–200.

LUZIO J. P., ROUS B. A., BRIGHT N. A., PRYOR P. R., MULLOCKB. M., PIPERR. C., 2000. Lysosome-endoso-me fusion and lysosomal biogenesis. J. Cell Sci.

113, 1515–1524.

LUZIOJ. P., MULLOCKB. M., PRYORP. R., LINDSAYM. R., JAMESD. E., PIPERR. C., 2001. Relationship between endosomes and lysosomes. Biochem. Soc. Trans.

29, 476–480.

MANCINIG. M. S., BEERENSC. E. M. T., VERHEIJENF. W., 1990. Glucose transport in lysosomal membrane

vesicles. Kinetic demonstration of a carrier for neutral hexoses. J. Biol. Chem. 265, 12380–12387.

MANCINIG. M. S., HAVELAARA. C., VERHEIJENF. W., 2000.

Lysosomal transport disorders. J. Inherit. Metab.

Dis. 23, 278–292.

MARKSM. S., WOODRUFFL., OHNO H., BONIFACINOJ. S., 1996. Protein targeting by tyrosine- and

di-leuci-ne-based signals, evidence for distinct saturable components. J. Cell Biol. 135, 341–354.

MARTINEZI., CHAKRABARTIS., HELLEVIKT., MOREHEADJ., FOWLERK., ANDREWSN. W., 2000. Synaptotagmin

VII regulates Ca2+-dependent exocytosis of lysoso-mes in fibroblasts. J. Cell Biol. 148, 1141–1149.

NOHLH., GILLEL., 2001. The existence and significance

of redox-cycling ubiquinone in lysosomes.

Proto-plasma 217, 9–14.

PISONI R. L., 1991. Characterization of a phosphate

transport system in human fibroblast lysosomes.

J. Biol. Chem. 266, 979–985.

REDDYA., CALER E. V., ANDREWSN. W., 2001. Plasma

membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes. Cell 106, 157–169.

SAGNEC., AGULHONC., RAVASSARDP., DARMONM., HAMON

M., EL MESTIKAWY S., GASNIER B., GIROS B., 2001.

Identification and characterization of a lysoso-mal transporter for slysoso-mall neutral amino acids.

PNAS 98, 7206–7211.

SALVADORN., AGUADOC., HORSTM., KNECHTE., 2000.

Im-port of a cytosolic protein into lysosomes by cha-perone-mediated autophagy depends on its fol-ding state. J. Biol. Chem. 275, 27447–27456.

SCHOONDERWOERTV. Th. G., MARTENSG. J. M., 2001.

Pro-ton pumping in the secretory pathway. J. Membr.

Biol. 182, 159–169.

STINCHCOMBEJ. C., GRIFFITHSG. M., 1999. Regulated

se-cretion from hemopoietic cells. J. Cell Biol. 147,

1–5.

TERLECKYS. R., DICEJ. F., 1993. Polypeptide import and degradation by isolated lysosomes. J. Biol. Chem.

WINCHESTERB. G., 2001. Lysosomal membrane

prote-ins. Eur. J. Paediatr. Neurol. 5 (Suppl. A), 207–215.

ZHANGG. J., LIUH. W., YOUNGL., ZHONGY. G., ZHENGY. Z., 2000. Influence of the membrane physical state

on the lysosomal proton permeability. J. Membr.