Medycyna Wet. 2008, 64 (11) 1317
Praca oryginalna Original paper
Babeszjoza (piroplazmoza) koni jest ciê¿k¹ chorob¹, wywo³ywan¹ przez paso¿yty krwi Babesia equi (obecnie okrelane jako Theileria equi) i Babesia caballi (8). Cho-roba wystêpuje endemicznie w regionach tropikalnych i subtropikalnych, a jej wektorami s¹ kleszcze: Boophi-lus, Hyalomma, Dermacentor, Rhipicephalus. Objawy babeszjozy s¹ zró¿nicowane: u zara¿onych koni mo¿e wystêpowaæ ¿ó³taczka, s³aboæ miêni, hemoglobinuria i gor¹czka. Badaniem hematologicznym stwierdza siê ane-miê, trombocytopeniê, spadek hematokrytu, za liczba bia³ych krwinek mo¿e byæ podwy¿szona lub obni¿ona w zale¿noci od organizmu (4, 7). Przebieg choroby z re-gu³y jest ostry, niemniej jednak mo¿e ona przebiegaæ w formie podostrej i przewlek³ej (9).
Standardowa diagnostyka babeszjozy na terenach jej enzootycznego wystêpowania opiera siê na danych z wy-wiadu (obecnoæ kleszczy u koni), objawach klinicznych (gor¹czka, anemia, ¿ó³taczka, hemoglobinuria) oraz na mikroskopowej ocenie rozmazów krwi zwierz¹t chorych barwionych metodami Giemzy (3). Coraz czêciej w roz-poznawaniu babeszjozy oraz w ocenie sytuacji epizootycz-nej, w tym w wykrywaniu zara¿eñ subklinicznych tymi pierwotniakami, wykorzystywane s¹ metody biologii molekularnej, a przede wszystkim ³añcuchowa reakcja polimerazy i sekwencjonowanie produktów amplifikacji (1, 2, 5).
Celem badañ by³o okrelenie przyczyny choroby u ko-nia, przebiegaj¹cej z objawami gor¹czki, anemii, braku apetytu i os³abienia miêni.
Materia³ i metody
Opis przypadku. Obiektem badañ by³ koñ rasy Deutsche Reit Ponny w wieku 2 lat, o masie cia³a 400 kg. Jak poda³
w³aciciel, u zwierzêcia od 3 dni obserwowano gor¹czkê (40,2°C), bladoæ b³on luzowych, apatiê, spadek apetytu i prag-nienia oraz s³aboæ miêni. Koñ by³ ¿ywiony standardowo, prze-bywa³ w stajni w zadowalaj¹cych warunkach zoohigienicznych. Zwierzê poddano badaniu klinicznemu oraz pobrano krew z ¿y-³y szyjnej zewnêtrznej do badañ hematologicznych, biochemicz-nych, serologicznych w kierunku boreliozy oraz molekularnych w kierunku babeszjozy i erlichiozy.
Badania hematologiczne wykonywano w analizatorze Medonic CA 530 Oden. Parametrami ocenianymi w badaniu by³y: liczba erytrocytów krwi wyra¿ona w mln/mm3, wartoæ hematokrytu wyra¿ona procentowo, ogólna liczba leukocytów wyra¿ona w tys./mm3 oraz liczba trombocytów wyra¿ona w tys./mm3.
Badania biochemiczne surowicy krwi wykonano w anali-zatorze Pointe euro. Parametrami oznaczanymi by³y: stê¿enie mocznika wyra¿one w mmol/L, stê¿enie kreatyniny wyra¿one w µmol/L, stê¿enie bilirubiny ca³kowitej wyra¿one w µmol/L, aktywnoæ fosfatazy zasadowej (AP), aminotransferazy alani-nowej (ALT) oraz aktywnoæ aminotransferazy asparagialani-nowej (AST) wyra¿one w jednostkach miêdzynarodowych (IU).
Badanie rozmazów krwi. Kroplê krwi pobranej na EDTA nanoszono na odt³uszczone szkie³ko podstawowe i wykony-wano cienki rozmaz barwiony metod¹ Giemsy. Preparat po wyschniêciu ogl¹dano w mikroskopie Olympus CH 20, pod okularem o powiêkszeniu 10 × i obiektywem imersyjnym o powiêkszeniu 100 ×.
Badanie serologiczne w kierunku boreliozy (ELISA). Test ELISA wykonywano wed³ug tefanèíkovej i wsp. (10) w 96--do³kowych p³ytkach (IWAKI), które op³aszczano antygenem Borrelia afzelii (B. burgdorferi sensu lato), rozcieñczonym w buforze wêglanowym o pH 9,6 w stosunku 1 : 100. Nastêp-nie p³ytki inkubowano w temp. 4°C przez 20 godzin, po czym przemywano trzykrotnie roztworem PBS (pH 7,2) i Tween 20. Badane surowice rozcieñczano w stosunku 1 : 400 w
roztwo-Przypadek babeszjozy u konia
£UKASZ ADASZEK, STANIS£AW WINIARCZYK
Katedra Epizootiologii i Klinika Chorób Zakanych Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej UP, ul G³êboka 30, 20-612 Lublin Adaszek £., Winiarczyk S.
Babesiosis in a horse
SummaryThis paper describes a case of babesiosis in a horse in Poland. The horse was a 2-year-old stallion with the symptoms of fever, anemia, loss of appetite and muscle weakness. Blood samples were collected from the animal for the standard hematological and biochemical examinations, serological examination for Borreliae and molecular tests for Babesia spp. and Ehrichia spp. The results of hematological examinations revealed a low level of hemoglobin (11 g/dl), low level of hematocrit (28%), trombocythopenia (145 tys./mm3), and an
increase of total bilirubine level, which are characteristic of hemolytic anemia. In PCR reaction with GF2 and GR2 primers a fragment of Babesia spp 18S RNA gene with the length of 577 bp was detected. The sequence showed a 96% homology with the Babesia equi partial sequence of 18S RNA gene with the GeneBank access number Z15105. On the basis of molecular examination results and the efficacy of a therapy with imidocarb in a dose of 2 ml/100 kg and kanamycin in a dose of 10 mg/kg the diagnose of babesiosis was established. A control PCR examination of the horse blood taken 14 days after finished therapy did not reveal the genetic material of Babesia. Full recovery of the sick animal was observed.
Medycyna Wet. 2008, 64 (11) 1318
rze PBS, Tween 20, 1% BSA i nanoszono w iloci 100 µl do dwóch s¹siednich do³ków, po czym p³ytki inkubowano w tem-peraturze 37°C przez 30 minut, a nastêpnie ponownie przemy-wano roztworem PBS i Tween 20. Kolejny etap badania stano-wi³o dodawanie do do³ków koniugatu (Sigma Antibody IgG) rozcieñczonego w roztworze PBS, Tween 20, 1% BSA w sto-sunku 1 : 3000 i inkubacja p³ytek przez 30 minut w tempera-turze 37°C. Po inkubacji p³ytki przemywano i dodawano do do³ków roztwór cytrynianu sodu (pH 5,0) z substratem OPD (orto-phenylenodiamine Sigma) i 30% H202. P³ytki inkubowa-no w temperaturze 15°C przez 37 minut, po czym reakcjê za-trzymywano 2 M H2SO4. Wyniki testu ELISA uznawano za dodatnie, je¿eli absorbancja próbek surowic przy d³ugoci fali 492 nm by³a równa lub wy¿sza 0,4.
Izolacja DNA. DNA przeznaczony do analizy ekstrahowa-no ze 100 µl wie¿ej krwi. Izolacjê DNA przeprowadzoekstrahowa-no przy u¿yciu zestawu DNA blood mini kit (DNA Gdañsk).
Reakcja PCR. Próbki DNA krwi poddawano badaniu tech-nik¹ PCR w kierunku obecnoci materia³u genetycznego pier-wotniaków Babesia spp. i riketsji Ehrlichia spp.
Reakcjê PCR dla Babesia spp. przeprowadzono dwuetapo-wo z zastosowaniem dwóch par starterów (tab. 1). Pierwsza para starterów RIB 19 i RIB 20 pozwala³a na amplifikacjê od-cinka DNA o d³ugoci 1712 pz fragmentu konserwatywnego genu 18S RNA. Druga para starterów GF2 i GR2 pozwala³a na amplifikacjê odcinka 577 par zasad tego samego genu.
Startery do reakcji PCR dla Ehrlichia spp. EHR 521 i EHR 747 amplifikowa³y odcinek DNA konserwatywnej czêci genu 16S rRNA riketsji o d³ugoci 247 par zasad.
£añcuchow¹ reakcjê polimerazy przeprowadzano w termo-cyklerze Biometra. Z powodu braku kontrolnego DNA Babe-sia equi, kontrol¹ dodatni¹ by³o DNA BabeBabe-sia wyizolowane z krwi psa chorego na babeszjozê oraz DNA Anaplasma pha-gocytophilum izolowane z krwi konia chorego na erlichiozê, za kontrol¹ ujemn¹ DNA z krwi zdrowego konia.
Ka¿da reakcja PCR dla Babesia spp. sk³ada³a siê z 50 cykli, w których etap denaturacji przebiega³ w 92°C przez 60 s, przy-³¹czanie starterów odbywa³o siê w temperaturze 52°C przez 60 s, a wyd³u¿anie nici w temperaturze 72°C trwa³o 90 s. W sk³ad mieszaniny reakcyjnej o koñcowej objêtoci 54 µl wchodzi³y: woda dejonizowana 37,4 µl, MgCl2 (25 mM) 3,6 µl, startery RIB 19 i RIB 20 lub GF2 i GR2, (50 pm/µl) w iloci po 1,0 µl, bufor dla Taq polimerazy 5,0 µl, dNTP (10 mM) 0,5 µl, Taq polimeraza (5 u/µl) 0,5 µl i wyizolo-wane DNA 5,0 µl.
Reakcja PCR dla Ehrlichia spp. sk³ada³a siê z 35 cykli, w któ-rych etap denaturacji przebiega³ w 94°C przez 30 s, przy³¹cza-nie starterów odbywa³o siê w temperaturze 56°C przez 30 s, a wyd³u¿anie nici w temperaturze 72°C trwa³o 45 s. Sk³ad mie-szaniny reakcyjnej o objêtoci 54 µl przedstawia³ siê nastêpu-j¹co: woda dejonizowana 36,5 µl, MgCl2 (25 mM) 4,5 µl, startery EHR 521, EHR 747 (50 pm/µl) w iloci po 1,0 µl, bufor dla Taq polimerazy 5,0 µl, dNTP (10 mM) 0,5 µl, Taq polimeraza (5 u/µl) 0,5 µl i wyizolowane DNA 5,0 µl.
Elektroforeza. Uzyskane produkty reakcji PCR analizowa-ne by³y metod¹ elektroforezy w 1% ¿elu agarozowym, w bufo-rze TBE przy napiêciu 10 V/cm pbufo-rzez 50 min. Po wybarwieniu produktów amplifikacji bromkiem etydyny okrelano ich wiel-koæ w odniesieniu do wzorca masowego DNA ladder 100 bp (Gibco BRL).
Sekwencjonowanie. Oczyszczone za pomoc¹ zestawu QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) produkty reakcji PCR Babesia spp. poddawano sekwencjonowaniu w Serwisie Sek-wencjonowania i Syntezy DNA Instytutu Biochemii i Biofizy-ki PAN w Warszawie. WyniBiofizy-ki sekwencjonowania odbierano poprzez pocztê elektroniczn¹, po czym opracowywano je za pomoc¹ programu komputerowego Lasergene DNA Star. Wy-korzystuj¹c ten sam program, analizowano sekwencjê izolatu w³asnego Babesia i porównywano j¹ z sekwencjami Babesia sp. dostêpnymi w banku NCIB GeneBank.
Wyniki i omówienie
Wyniki badañ hematologicznych i biochemicznych krwi zebrano w tab. 2. Niska zawartoæ hemoglobiny w ery-trocytach (11 g/dl), obni¿ony hematokryt (28%), trombocytope-nia (145 tys./mm3),
wzrost poziomu bili-rubiny (39,8 µmol/l) wskazuj¹, ¿e u bada-nego konia wystêpo-wa³a anemia t³a hemo-litycznego. W rozma-zach krwi nie stwier-dzono obecnoci w ery-trocytach i leukocy-tach pierwotniaków Babesia ani riketsji Ehrlichia. Badanie se-rologiczne w kierunku boreliozy da³o wynik ujemny, absorbancja próbki badanej suro-wicy wynosi³a 0,232. Badaniem PCR wkierunku Babesia spp. z u¿yciem pary starterów RIB 19 i RIB 20 wykazano w elektroforegra-mie obecnoæ s³abego pr¹¿ka DNA o wielkoci oko³o 1700 pz. W kolejnej reakcji z zastosowaniem starterów GR2 i GF2 uzyskano wyrany produkt amplifikacji o d³ugoci oko³o 580 pz (ryc. 1). W badanej próbce nie stwierdzono natomiast materia³u genetycznego Ehrlichia spp.
Komputerowo opracowana sekwencja uzyskanego pro-duktu PCR Babesia spp o d³ugoci 577 pz. (tab. 3) z u¿y-ciem programu Lasergene DNA Star wykazywa³a 96% podobieñstwo z sekwencj¹ fragmentu genu 18S RNA Babesia equi umieszczon¹ w banku genów pod numerem Z15105. Na tej podstawie przyjêto, ¿e w opisywanym przypadku koñ by³ zara¿ony pierwotniakiem B. equi. W leczeniu przyczynowym zwierzêcia zastosowano Imi-zol (imidokarb dipropionate Schering Plough Animal Health) w dawce 2,0 ml/100 kg m.c. i.m. podzielonej na dwie porcje, co 12 godzin s.c. Pierwsze podanie imido-karbu spowodowa³o wyst¹pienie u konia po oko³o 20 minutach reakcji nadwra¿liwoci w postaci pokrzywki i pobudzenia, przyspieszenia têtna (61/min.) i oddechów (23/min.). W tej sytuacji zwierzêciu zaaplikowano
dek-Tab. 2. Wyniki badania hematolo-gicznego i biochemicznego krwi po-branej od konia a k s W kni Wynik 0 1 ( C B R 6/mm3) 7,46 % t H 28 0 1 ( C B W 3/mm3) 8,5 l d / g b H 11 0 1 ( T L P 3/mm3) 145 )l / U ( T S A 182 )l / U ( T L A 33 )l / U ( P A 145 )l /l o m µ ( a ti w o k ³ a c a n i b u ri li B 39,8 )l /l o m m ( k i n z c o M 9,25 )l /l o m µ ( a n i n y t a e r K 144 a r e tr a t s a w z a N Sekwencja 9 1 B I R 5-'CGGGATCCAACCTGGTTGATCCTGC-3' 0 2 B I R 5-'CCGAATTCCTTGTTACGACTTCTC-3' 2 F G 5-'GTCTTGTAATTGGAATGATGG-3' 2 R G 5-'CCAAAGACTTTGATTTCTCTC-3' 1 2 5 R H E 5-'TGTAGGCGGTTCGGTAAGTTAAAG-3' 7 4 7 R H E 5-'GCACTCATCGTTTACAGCGTG-3'
Tab. 1. Startery u¿yte w reakcji PCR dla Babesia spp. i Ehrli-chia spp.
Medycyna Wet. 2008, 64 (11) 1319
sametazon (Dexafort Intervet) w dawce 0,06 mg/kg m.c., s.c. Wspomagaj¹co w terapii babeszjozy u konia zastoso-wano kanamycynê (Kanavet, ScanVet) w dawce 10 mg/ kg m.c., 10% witaminê C (Scan Vet) w dawce 30 ml/ konia oraz wlewy do¿ylne PWE i glukozy 5%. Antybio-tykoterapiê kontynuowano przez 4 dni, w czasie których stan pacjenta uleg³ znacznej poprawie, ust¹pi³a gor¹czka, i s³aboæ miêni, powróci³ apetyt i pragnienie, koñ od-zyska³ dawny temperament. Kontrolne badanie krwi po-branej od zwierzêcia 14. dnia po zakoñczonym leczeniu metod¹ PCR nie wykaza³o obecnoci materia³u genetycz-nego pierwotniaków Babesia.
Niniejsze doniesienie jest pierwszym laboratoryjnie po-twierdzonym przypadkiem babeszjozy u konia w Polsce. Dotychczasowe badania w³asne powiêcone chorobom transmisyjnym pozwoli³y na stwierdzenie przypadków erlichiozy i boreliozy u tego gatunku zwierz¹t, i bêd¹ te-matem odrêbnych publikacji. Fakt wystêpowania tych chorób w Polsce, jeszcze do niedawna uwa¿anych raczej za egzotyczne, wskazuje na coraz szersze rozprzestrze-nianie siê etiologicznych czynników chorobowych na te-reny dotychczas od nich wolne. Sytuacja taka niew¹tpli-wie zwi¹zana jest ze zwiêkszonym obrotem zniew¹tpli-wierzêtami pomiêdzy ró¿nymi rejonami geograficznymi, jednak nie bez znaczenia wydaj¹ siê zmiany klimatyczne manifestu-j¹ce siê ocieplaniem, co w efekcie prowadzi do wykszta³-cenia korzystnych warunków rodowiskowych dla wek-torów chorób transmisyjnych w rejonach dotychczas od nich wolnych.
W opisywanym przypadku rozpoznanie babeszjozy u konia oparto o wyniki ³añcuchowej reakcji polimerazy i sekwencjonowanie uzyskanego produktu PCR. Wyka-zanie materia³u genetycznego pierwotniaków Babesia we krwi konia, przy jednoczesnym ujemnym wyniku bada-nia mikroskopowego rozmazu krwi pobranej od chorego zwierzêcia, nie jest niczym zaskakuj¹cym. W przeciwieñ-stwie do Babesia canis, pierwotniaki Babesia equi, nie posiadaj¹ charakterystycznego gruszkowatego kszta³tu. Ponadto s¹ one znacznie mniejsze ani¿eli paso¿yty ata-kuj¹ce krwinki psów i ³atwo pomyliæ je z cz¹stkami nie-wyp³ukanego barwnika. Tak¿e stopieñ parazytemii w prze-biegu zara¿enia B. equi wydaje siê znacznie ni¿szy ani¿e-li obserwowany w babeszjozie psów. Wszystko to spra-wia, ¿e w przypadkach, w których babeszjozê u koni stwierdzono metodami molekularnymi, potwierdzenie za-ra¿enia poprzez mikroskopow¹ ocenê rozmazu nie prze-kracza 30% stwierdzonych przypadków choroby (6, 9).
Pimiennictwo
1.Adaszek £., Winiarczyk S.: Molecular characterization of Babesia canis canis iso-lates from naturally infected dogs in Poland. Vet. Parasitol. 2008, 152, 235-241. 2.Alhassan A., Govind Y., Tam N. T., Thekisoe O. M., Yokoyama N., Inoue N., Igarashi I.: Comparative evaluation of the sensitivity of LAMP, PCR and in vitro
culture methods for the diagnosis of equine piroplasmosis Parasitol. Res. 2007, 100, 1165-1168.
3.Battsetseg B., Lucero S., Xuan X., Claveria F. G., Inoue N., Alhassan A., Kanno T., Igarashi I., Nagasawa H., Mikami T., Fujisaki K.: Detection of natural infection of Boophilus microplus with Babesia equi and Babesia caballi in Brazilian horses using nested polymerase chain reaction Vet. Parasitol. 2002, 107, 351-357. 4.Camacho A. T., Guitian F. J., Pallas E., Gestal J. J., Olmeda A. S., Habela M. A.,
Telford S. R., Spielman A.: Theileria (Babesia) equi and Babesia caballi infections in horses in Galicia, Spain. Trop. Anim. Health Prod. 2005, 37, 293-302. 5.Criado A., Martinez J., Buling A., Barba J. C., Merino S., Jefferies R., Irwin P. J.:
New data on epizootiology and genetics of piroplasms based on sequences of small ribosomal subunit and cytochrome b genes. Vet. Parasitol. 2006, 142, 238--247.
6.Heim A., Passos L. M., Ribeiro M. F., Costa-Júnior L. M., Bastos C. V., Cabral D. D., Hirzmann J., Pfister K.: Detection and molecular characterization of Babesia caballi and Theileria equi isolates from endemic areas of Brazil. Parasitol. Res. 2007, 102, 63-68.
7.Kumar S., Gupta A. K., Pal Y., Dwivedi S. K.: In vivo therapeutic efficacy trial with artemisinin derivative, buparvaquone and imidocarb dipropionate against Babesia equi infection in donkeys. J. Vet. Med. Sci. 2003, 65, 1171-1177. 8.Mehlhorn H., Schein E.: Redescription of Babesia equi Laveran, 1901 as
Theile-ria equi. Parasitol. Res. 1998, 84, 467-475.
9.Rampersad J., Cesar E., Campbell M. D., Samlal M., Ammons D.: A field evalu-ation of PCR for the routine detection of Babesia equi in horses. Vet. Parasitol. 2003, 114, 81-87.
10.tefanèíková A., Adaszek £., Peko B., Winiarczyk S., Dudiòák V.: Serological and immunochemical evidence of Borrelia burgdorferi sensu lato in horses and cattle from Poland and diagnostic problems of Lyme borreliosis. Ann. Agric. Environ. Med. (praca w druku).
Adres autora: dr £ukasz Adaszek, ul. G³êboka 30, 20-612 Lublin; e-mail: ukaszek0@wp.pl
Ryc. 1. Wynik badania PCR na obecnoæ materia³u genetycz-nego Babesia spp. Produkt amplifikacji fragmentu genu 18S RNA ze starterami GF2 i GR2 o wielkoci 577 par zasad. cie¿-ki: 1 marker masowy Gibco BRL DNA Ladder 100bp; 2 kontrola negatywna; 3 kontrola pozytywna; 4, 5 wynik badania PCR krwi zdrowych koni; 6 wynik badania PCR konia chorego GTCTTGTAATTGGAATGATGGTAACCCAAACCCCTACCAGAGTATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGC CGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAACTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGTATTTCTGCTGTTTC GTTGACTGCGTTTGGCCATTGTGATCGTTGCGGCTTATTTCGTTTTCGATTTTGCGTTTCCCGGCGTTTACTTTGA GAAAATTAGAGTGTTTCAAGCAGACTTTTGTCTTGAATACTTTAGCATGGAATAACAGAGTAGGACTTTGGTTCTAT TTTGTTGGTTTTAGGAGCCTGAGTAATGGTTAATAGGAACAGTTGGGGGCATTCGTATTTGACTGTCAGAGGTGAA ATTCTTAGATTTGTCAAAGACGAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTTA GGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCCTAACCATAAACGATGCCGACTAGAGATTGGAGGTCGTCAGT TTGAACGACCCCTTCAGCACCTTGAGAGAAATCAAAGTCTTTGG
