Artyku³ przegl¹dowy Review
U wiñ, w przeciwieñstwie do innych gatunków zwierz¹t, nie opracowano dot¹d skutecznych i prostych metod konserwacji zarodków (13, 20). Pewne nadzie-je wi¹¿e siê z opracowaniem skutecznych metod wi-tryfikacji gwarantuj¹cej uzyskanie satysfakcjonuj¹cych rezultatów. Zastosowanie gwa³townego zamra¿ania pozwala unikn¹æ uszkodzeñ powstaj¹cych podczas stosowania metody tradycyjnej. W efekcie uzyskuje siê wzrost prze¿ywalnoci zarodków wiñ w warun-kach in vitro do poziomu 80%, satysfakcjonuj¹c¹ liczbê ci¹¿ oraz zwiêkszenie liczby prosi¹t. Nowszym osi¹-gniêciem w metodzie witryfikacji jest zmniejszenie objêtoci próby, zwiêkszenie prêdkoci mro¿enia oraz u¿ycie glikolu propylenowego i etylenowego w roz-tworach witryfikacyjnych, zwiêkszaj¹cych efektyw-noæ procesu zamra¿ania zarodków wiñ.
W niniejszym opracowaniu przedstawiono rozwój i bie¿¹ce mo¿liwoci oraz poziom wiedzy odnonie do rozwoju metod kriokonserwacji zarodków wiñ (11, 12).
Metoda trójstopniowa
Pierwsze udane próby zamra¿ania zarodków wini przeprowadzono pod koniec lat 80. ub. wieku. Proces mro¿enia metod¹ trójstopniow¹ odbywa siê z
prêdko-ci¹ odp. oko³o 1°C oraz 0,3°C/min. do temperatur odp. 6°C lub 7°C oraz 35°C do 37°C. Nastêpnie za-rodki umieszczane s¹ w oparach ciek³ego azotu (LN). W celu unikniêcia szoku osmotycznego rozmra¿anie odbywa siê w temperaturze 35°C do 37°C w rozwo-rach sacharozy 0,5-0,3 M, a nawet 0 M. (21, 22). Naj-wy¿sza efektywnoæ mro¿enia metod¹ tradycyjn¹ do-tyczy zarodków w stadium ekspanduj¹cej lub wylêg-³ej blastocysty, podczas gdy wczesne stadia rozwojo-we (morula i wczesna blastocysta) le znosi³y dzia³a-nie niskich temperatur (7).
Jedn¹ z podstawowych trudnoci pojawiaj¹cych siê podczas mro¿enia zarodków wiñ jest obecnoæ lipi-dów wewn¹trzkomórkowych. Podczas zamra¿ania dochodzi do naruszenia ich integralnoci, a w efekcie do uszkodzenia b³on cytoplazmatycznych i nieodwra-calnych zmian degeneracyjnych (23). Najwiêksze ilo-ci lipidów stwierdza siê w zarodkach we wczesnych stadiach rozwojowych (2-8-komórkowych). Jednym ze sposobów zapobiegania uszkodzeniom powsta³ym w zwi¹zku z obecnoci¹ t³uszczy w zarodku jest ich mechaniczne usuniêcie z komórek. W tym celu doko-nywano polaryzacji ziaren t³uszczowych w cytoplaz-mie, a nastêpnie usuwano je przy pomocy
mikropipe-Rozwój metod konserwacji zarodków wiñ
MARCIN JEZIORKOWSKI, PAWE£ ANTOSIK, JÊDRZEJ M. JAKOWSKIKatedra Weterynarii Rolniczej Wydzia³u Hodowli i Biologii Zwierz¹t AR, ul. Wojska Polskiego 28, 60-625 Poznañ
Jeziorkowski M., Antosik P., Jakowski J. M.
Development of cryoconservation methods in pig embryos
Summary
This review presents evolution and current possibilities, state of knowledge and prospects for cryopreservation of pig embryos. In the early stages the development of this technology for use in the international pig industry was slow. Initially freezing technologies utilized the stepwise method to cryopreserve swine embryos. Conven-tional freezing methods will not work for pigs embryos, which are extremely sensitive to slow cooling below temperatures of approximately 15°C, since, as they cool, they undergo physiological and structural changes that leave them incapable of normal development. Using a rapid cooling processes vitrification is thought to outpace the damaging effects of slow cooling. It allows for an increase of the cryopreserved pig embryo survival rate to more than 80% in the laboratory. At present, vitrification is regarded as an alternative to traditional slow freezing procedures which do not offer satisfactory results for the cryopreservation of porcine embryos. Recently a novel approach consisting of a minimum sample size, increased cooling rate from 2500 C/min to 20.000 C/min, and the use propyleno and ethyleno glicol in the vitrification solution have been effective for crypreservation of pig embryos. Many factors such as the stage of embryonic development, cryoprotectant toxicity, the composition of vitryfication solution, cooling and warming rates can influence the survival of pig emryos after vitrification. Peri-hatching and hatched blastocysts tolerate slow freezing without special pre-treatment, while morula and early blastocysts do not survive this cryopreservation procedure. Vitrification results in higher survival rates after warming when untreated early-to-hatched-blastocysts-stage embryos are used. An increase in cooling rate decreases sensitivity to slow freezing and may permit a reduction of cryoprotectant concentration.
ty. Nastêpnie zarodki umieszczano na 1 h w po¿yw-kach do krótkotrwa³ej hodowli i konserwacji z 10% dodatkiem cielêcej surowicy p³odowej (FCS) oraz po¿ywce Whittnesa z dodatkiem 1,5% BSA, o tempe-raturze 4°C. Mechaniczne usuniêcie lipidów umo¿li-wi³o dalszy rozwój 60% zarodków ze stadium 2-4 ko-mórkowego do blastocysty. Sporód zarodków mro-¿onych metod¹ trójstopniow¹ w obecnoci 1,5 M 1,2 propanodiolu zdolnoæ do dalszego rozwoju po roz-mro¿eniu wykazywa³o 40,6%, jednak stadium blasto-cysty osi¹gnê³o zaledwie 12,5%. Dla porównania, po rozmro¿eniu zarodków, z których nie usuwano lipi-dów, ¿aden zarodek nie wykazywa³ zdolnoci do dal-szego rozwoju (23). Istotn¹ przeszkod¹ w stosowaniu tej metody na szerok¹ skalê s¹ wysokie koszty zabie-gu (22).
W badaniach nad efektywnoci¹ procesu zamra¿a-nia zarodków zwracono tak¿e uwagê na toksyczny wp³yw zastosowanych rodków os³aniaj¹cych. W ba-daniach porównawczych oceniano wp³yw trzech ró¿-nych substancji os³aniaj¹cych: glikolu etylenowego i propylenowego oraz glicerolu. W badaniach wyko-rzystano wy³¹cznie wykluwaj¹ce siê blastocysty, któ-re mro¿ono z zastosowaniem glicerolu z dodatkiem 20% cielêcej surowicy p³odowej (FCS) i 20% suro-wicy cielêcej Calf SupremeTM albo TCM 199 wzglêd-nie 4% glikolu etylenowego, glikolu propylenowe-go oraz dekstranu z dodatkiem 20% SupremeTM. Pro-ces mro¿enia prze¿y³o 44% zarodków (29%-65%), z których przeciêtnie 23% oceniono jako zdatne do transferu po 2-godzinnej hodowli w po¿ywce standar-dowej. W wyniku transferu zarodków urodzi³o siê 2-5 prosi¹t. Powy¿sze badania dowiod³y, ¿e zastosowanie dwóch substancji os³aniaj¹cych glikolu etylenowe-go i propylenoweetylenowe-go zwiêksza prawdopodobieñstwo uzyskania ¿ywego potomstwa po transferze rozmro-¿onych zarodków (15, 17).
Stwierdzono wysok¹ skutecznoæ metody wolnego zamra¿ania zarodków w stadium poprzedzaj¹cym wyklucie i wykluwania siê. Wczesne stadia rozwojo-we zarodka bez dodatkowych zabiegów oraz manipu-lacji wewn¹trz komórkowych nie
wykazuj¹ zdolnoci do dalszego rozwoju po rozmro¿eniu (22, 23). W zwi¹zku ze stosunkowo nisk¹ efektywnoci¹ tradycyjnej metody konserwacji zarodków wini poszukiwano alternatyw-nych metod konserwacji pozwa-laj¹cych na optymalizacjê proce-su mro¿enia i jego wy¿sz¹ efek-tywnoæ.
Tabela 1 przedstawia efektyw-noæ tradycyjnych metod mro¿e-nia zarodków wini substancje os³aniaj¹ce, stadium rozwoju mro¿onych zarodków oraz licz-bê urodzonych prosi¹t.
Witryfikacja
W ostatnich latach badania z zakresu kriokonser-wacji zarodków wini koncentrowa³y siê na ich witry-fikacji. Witryfikacja, czyli zeszklenie jest procesem gwa³townego sch³adzania, które powoduje wzrost lep-koci skoncentrowanej mieszaniny substancji os³ania-j¹cych i zapobiega powstawaniu kryszta³ów lodu we-wn¹trz struktury komórkowej zarodka. Powsta³e amor-ficzne formy zeszklenia umo¿liwiaj¹ równomierne zawieszenie zarodków w cieczy, która zachowuje nor-malne molekularno-jonowe funkcje, lecz przypomina swoj¹ struktur¹ cia³o sta³e. G³ówny problem w wyko-rzystaniu tej metody stanowi opracowanie w³aciwe-go sk³adu mieszaniny witryfikacyjnej, by zneutralizo-waæ chemiczn¹ szkodliwoæ u¿ytych substancji na dalszy rozwój zarodka i uzyskaæ po¿¹dan¹ skutecz-noæ metody (8, 9).
rodki os³aniaj¹ce, stosowane podczas konserwa-cji zarodków, dzielone s¹ na: drobnocz¹steczkowe, rozpuszczalne w wodzie, przenikaj¹ce do wnêtrza zarodka przez b³ony komórkowe, takie jak: glicerol, DMSO, glikol etylenowy i propylenowy, zwi¹zki wiel-kocz¹steczkowe nieprzenikaj¹ce do wnêtrza komórki u³atwiaj¹ce witryfikacjê, jak: poliwinylopirolidyna, gli-kol polietylenowy oraz dekstran, substancje przeciw-zamro¿eniowe oraz naturalne zwi¹zki bia³kowe.
W celu oceny sk³adu roztworu witryfikacyjnego sto-sowano: EFT sk³adaj¹c¹ siê z 7,2 M glikolu etyleno-wego, 0,003 M ficolu i 0,3 M trechalozy; DAP 213 z 2 M DMSO, 1 M acetamidem, 3 M glikolem propy-lenowym; DAP 213-T o sk³adzie 2 M DMSO, 0,3 M trechalozy; EPT z 4 M glikolem etylenowym i 3,1 M glikolem propylenowym. W tecie na toksycznoæ za-rodki poddawano cztero- lub jednostopniowej ekwi-libracji. Nie stwierdzono istotnych ró¿nic pomiêdzy zastosowanymi roztworami witryfikacyjnymi. Odse-tek prze¿ywaj¹cych zarodków poddanych dzia³aniu mieszanin witryfikacyjnych by³ ni¿szy ni¿ przypadku zarodków umieszczonych w po¿ywce nie zawieraj¹-cej zwi¹zków os³aniaj¹cych. Czteroetapowa
ekwilibra-Tab. 1. Efektywnoæ tradycyjnych metod mro¿enia zarodków wiñ substancje os³a-niaj¹ce, stadium rozwoju mro¿onych zarodków oraz liczba urodzonych prosi¹t
Objanienia: stadium zarodka EXB ekspanduj¹ca blastocysta, WB wczesna blastocysta
a i n e ¿ o r m b ó s o p S a r u t a r e p m e t( °C) i k z ¹ i w Z e c ¹ j a i n a ³ s o rozwSotjaudizuamrodka Przzea¿ryowdakólnwoæ Pimiennictwo e i n e ¿ o r m e n l o w o P 5 3 ( °C) S B P O S M D M 5 , 1 S C F % 6 1 + EXB 5prosIin¹v/t1iv1ozarod. iwHsapy.a1s9i89 e i n e ¿ o r m e n l o w o P 6 9 1 ( °C) + l o r e c il g M 5 , 1 S B P a n y t y c e l % 5 0 , 0 S C F % 5 1 + EXB o v i v n I . d o r a z 0 2 / a t ê i s o r p 4 iKwamspe.y1a9m9a0 e i n e ¿ o r m e n l o w o P 6 9 1 ( °C) l o r e c il g M 5 , 1 S C F % 6 1 + S B P iEnXvBi,rtoWWB,B o rt i v n I % 9 6 B W , % 1 5 B X E o rt i v n i % 2 8 B W a m i h s a g a N 2 9 9 1 . p s w i e i n e ¿ o r m e n l o w o P 6 9 1 ( °C) l o r e c il g M 4 , 1 a j a j a k t³ ó ¿ % 0 1 + WB 1prosIniêv/i6vozarod. iwFsup.ijn1o993
cja by³a korzystniejsza ni¿ jednostopniowa, szczegól-nie w odszczegól-niesieniu do blastocyst. Nie stwierdzono istot-nych ró¿nic pomiêdzy zastosowanymi roztworami witryfikacyjnymi w odniesieniu do metody czteroeta-powej. Okrelaj¹c skutecznoæ protoko³u witryfika-cji zarodki poddane zosta³y szybkiemu mro¿eniu w 0,25 ml s³omkach, które umieszczono w ciek³ym azocie (LN). Po rozmro¿eniu nie stwierdzono znacz¹-cych ró¿nic w odniesieniu do odseteka rozwijaj¹znacz¹-cych siê zarodków; we wszystkich próbach by³ on podob-ny, z wyj¹tkiem blastocyst z grupy EPT, w której wsku-tek mro¿enia zamiera³o 60-100% zarodków (26).
Wa¿nym elementem protoko³u witryfikacji jest ekwilibracja stosowana przed umieszczaniem zarod-ków w roztworze witryfikacyjnym, a nastêpnie pod-czas usuwania substancji os³aniaj¹cych, polegaj¹ca odpowiednio na przenoszeniu zarodków z roztworu witryfikacyjnego o ni¿szym stê¿eniu do roztworu o stê¿eniu wy¿szym w przypadku zamra¿ania zarod-ków i odwrotnie w przypadku ich rozmra¿ania. Pro-ces ten prowadzi do dehydratacji zarodków, a wodê zastêpuje stê¿ona substancja os³aniaj¹ca. Zarodki pod-dawano 5- lub 15-minutowej ekspozycji na 2 M glikol etylenowy, a nastêpnie umieszczano w s³omkach o poj. 1,25 ml w 8 M EG z dodatkiem 7% roztworu poliwi-nylopirolidyny (PVP) i ci¹gu 40 s wprowadzano do ciek³ego azotu (LN). Po rozmro¿eniu z zarodków usu-wano 2 M EG stosuj¹c roztwór 1,7 M galaktozy i pod-dawano hodowli w modyfikowanej po¿ywce CZB. Po 48 h hodowli procentowa prze¿ywalnoæ poddawanych witryfikacji zarodków w stadium wczesnej ty wynosi³a 21%, blastocysty 32% i pónej blastocys-ty 13%, przy metodzie bezporedniej, 9,40 i 21% dla jednostopniowej ekwlibracji oraz 35, 85 i 71% przy dwustopniowej ekwilibracji (18). Zbli¿one wyniki uzyskiwano wówczas, gdy jako rodków os³aniaj¹cych u¿yto EG i jego kombinacji z PVP. Zarodki poddano 5-minutowej ekspozycji na 2 M EG, a nastêpnie umieszczano w s³omkach w 8 M mieszaninie wym. rodków os³aniaj¹cych i wprowadzono do LN. Po roz-mro¿eniu zarodki hodowano w po¿ywce CZM. Prze-¿ywalnoæ wczesnych, wykluwaj¹cych siê i pónych blastocyst wynosi³a w hodowli in vitro po 24 h 39,6 i 20,3%, a po 48 h 25 i 13%. Sporód zarodków bêd¹-cych w piêciu ró¿nych stadiach rozwojowych, podda-nych witryfikacji i zamro¿opodda-nych na dwa dni w ciek-³ym azocie po 48 h prze¿y³o do 100% wykluwaj¹cych siê i 20% pónych blastocyst (19). Fakt ten wskazuje, ¿e oprócz ekwilibracji, niezbêdny jest tak¿e odpowied-ni dobór parametrów wirtyfikacji oraz zwi¹zków os³a-niaj¹cych (15, 18). Natomiast rodzaj stosowanych zwi¹zków os³aniaj¹cych w mieszaninie witryfikacyj-nej nie ma decyduj¹cego wp³ywu na efektywnoæ wit-ryfikacji. Poszczególne stadia rozwojowe zarodków wini wymagaj¹ zastosowania odpowiednich kombi-nacji substancji os³aniaj¹cych (15).
Otwarte metody witryfikacji
Ostatnio opracowano tzw. otwarte metody witryfi-kacji. Termin metody otwarte wynika z faktu bez-poredniego kontaktu witryfikowanego p³ynu z ciek-³ym azotem. Czêciej metody te okrela siê jako me-tody witryfikacji w zminimalizowanych próbach lub kroplach. Wród nich wyró¿nia siê cztery metody: OPS (Open Pulled Straw), która opiera siê na maksymal-nym ograniczeniu iloci p³ynu zawieraj¹cego witryfi-kowane zarodki (byd³o, winie), metodê kropelkow¹, w której witryfikacja zarodków zachodzi w kropli roz-tworu, wprowadzanego w opary ciek³ego azotu (byd-³o, winie), metodê pêtelkow¹ stosowan¹ przy krio-konserwacji zarodków chomika i cz³owieka, a pole-gaj¹c¹ na nanoszeniu zarodków na nylonow¹ niæ oraz metodê siateczki mikroskopowej, w której na miedzia-n¹ siateczkê o rednicy oczek 3 µm nanosi siê roztwór substancji os³aniaj¹cych wraz z zarodkami, a nastêp-nie umieszcza w ciek³ym azocie. Zalet¹ tych metod jest osi¹gniêcie tempa zamra¿ania zarodków w grani-cach od 10 do 40 tys. °C/min. w efekcie szybszego przejcia komórek przez szkodliwy dla nich przedzia³ temperatur (od +20°C do 20°C), wyeliminowania stê¿onych rodków os³aniaj¹cych oraz skrócenia cza-su przebywania zarodków w mieszaninie roztworów witryfikacyjnych do ok. 20-30 sekund. Sam proces ze-szklenia jest szybszy i skuteczniejszy (24).
Rodzaj mieszaniny witryfikacyjnej i genotyp zarod-ka mia³y wp³yw na efektywnoæ OPS. Zarodki loszek rasy wielkiej bia³ej (LWh) oraz meishan (MS) umiesz-czano w dwóch róznych roztworach witryfikacyjnych, z których pierwszy zawiera³ TCM (zbuforowany he-pes TCM199 z dodatkiem 20% po¿ywki NBCS), dru-gi natomiast PBS (PBS z dodatkiem 20% po¿ywki NBCS). Po dwustopniowej ekwilibracji w glikolu ety-lenowym, sulfotlenku dwumetylu (DMSO) i sacharo-zy 2-5 blastocyst umieszczano w s³omkach OPS i za-nurzano w ciek³ym azocie. Po rozmro¿eniu blastocys-ty wiñ LWh, zamra¿ane w PBS wykazywa³y ni¿sza prze¿ywalnoæ w warunkach in vitro ni¿ zarodki wiñ MS (27 wobec 67%). Zarodki umieszczane w miesza-ninie zawieraj¹cej TCM wykazywa³y porównywaln¹ prze¿ywalnoæ (LWh 41%, MS 43%). Odsetek prze¿ywaj¹cych morul umieszczanych w PBS by³ nis-ki i wynosi³ 11% dla LWh i 14% dla MS. Zanotowano tak¿e pewne ró¿nice w odniesieniu do efektywnoci transferu zarodków u obu ras wiñ. Przyk³adowo, do-konuj¹c transferu 20 blastocyst u wiñ rasy MS, uzys-kiwano rednio 4 prosiêta, podczas gdy u wiñ rasy LWh 5 prosi¹t.
W innych badaniach uzyskiwano 80% odsetek loch ciê¿arnych w 25 dniu ci¹¿y oraz 70% poziom wypro-szeñ, dokonuj¹c transferu 20 morul do ka¿dej z 10 przygotowanych uprzednio biorczyñ. Morule z niena-ruszon¹ os³onk¹ przejrzyst¹ poddawano witryfikacji po dwustopniowej ekwilibracji z zastosowaniem gli-kolu etylenowego, DMSO i sacharozy w TCM199
z 20% po¿ywk¹ NBCS. W badaniach u¿ywano zmo-dyfikowanej mieszaniny witryfikacyjnej stosowanej do zamra¿ania zarodków myszy NCSU23 z dodatkiem cytochalazyny B. Dodatek cytochalazyny B zapobie-ga depolimeryzacji aktyny w strukturach cytoszkiele-tu komórek zarodka. Po ekwilibracji w glikolu etyle-nowym zarodki umieszczano w ciek³ym azocie i szyb-ko zamra¿ano w temperaturze 204°C (4). W bada-niach terenowych po transferze wczesnych blastocyst mro¿onych metod¹ OPS uzyskiwano 29% ci¹¿y. Od-setek rodz¹cych loszek wynosi³ 21,6%, a przeciêtna liczba prosi¹t w miocie 8,2. Równoczenie nie stwier-dzono znacz¹cych ró¿niæ w liczbie rodz¹cych siê pro-si¹t w odniesieniu do zarodków pozyskiwanych od loch lub loszek. Efektywnoæ OPS mo¿e byæ zale¿na od typu s³omek stosowanych podczas procesu mro¿enia. Dotychczas u¿ywano s³omek zgrzewanych na koñcach typu heat-sealed (HS) oraz s³omek o otwartych zakoñ-czeniach tzw. open straw (OS). Prze¿ywalnoæ po roz-mro¿eniu, przy zastosowaniu s³omek OS w odniesie-niu do blastocyst wynios³a zarówno po 24, jak i 48 godzinach 58,8%. Tymczasem po zastosowaniu s³o-mek HS prze¿y³o w analogicznych okresach tylko 15,4% zarodków. Prze¿ywalnoæ zarodków traktowa-nych cytochalazyn¹ B i witryfikowatraktowa-nych w 6,5 M gli-cerolu oraz 6% BSA po ich zamro¿eniu w s³omkach HS lub OS znacz¹co poprawia³o wirowanie. W przy-padku stosowania s³omek HS prze¿ywa³o po 24 godz. 62,8%, a po 48 godz. 60,5% zarodków oraz w przy-padku s³omek OS 75 i 63,3% zarodków po 24 i 48 godzinach. Umieszczenie zarodków w cytochalazynie B oraz witryfikowanie w 8 M glikolu etylenowym i 7% PVP prze¿ywalnoæ przypadku zastosowania s³omek OS pozwala³o poprawiæ prze¿ywalnoæ zarodków po 24 godzinach do 80 i 76,7% po 48 godzinach hodowli (7, 18).
W metodach otwartych witryfikacja zarodków we wczesnych stadiach rozwojowych pozwala po rozmro-¿eniu na rozwój wiêkszej liczby zarodków oraz zmniej-sza ryzyka niekorzystnego wp³ywu czynników ze-wnêtrznych (mikroorganizmy chorobotwórcze) (4). Stwierdzono równie¿, ¿e decyduj¹cy wp³yw na nieod-wracalne zniszczenia struktury cytoszkieletu zarodka we wczesnym stadium rozwoju wywiera temperatura mro¿enia (196°C). Niekorzystny wp³yw stê¿onych substancji os³aniaj¹cych oceniany jest jako drugorzêd-ny. Zastosowanie cyto-B nie powoduje wzrostu prze-¿ywalnoci mro¿onych zarodków poddawanych uprzednio procesowi witryfikacji, jednak zwiêksza trzykrotnie odsetek przezywaj¹cych zarodków w sta-dium ekspanduj¹cej blastocysty (do 60%) i wylêg³ej blastocysty, o ile ich rednica jest mniejsza od 400 µm (do 90%) (7).
Metoda OPS gwarantuje po rozmro¿eniu doæ wy-sok¹ prze¿ywalnoæ zarodków wini w stadium mo-ruli i blastocysty. Dowodz¹ tego badania, w których po wczeniejszej hodowli zarodków w po¿ywce NCSU-23 poddawano je 2-stopniowej ekwilibracji
w mieszaninie witryfikacyjnej EFS zawieraj¹cej 40% glikolu etylenowego, 18% fikolu i 0,3 sacharozy. Na-stêpnie zarodki przenoszono do s³omek, mro¿ono i przechowywano w ciek³ym azocie od 3 do 6 miesiê-cy. Po rozmro¿eniu i usuniêciu substancji os³aniaj¹-cych zarodki przenoszono do jajowodu lub macicy biorczyñ. Sporód 8 biorczyñ, którym wprowadzono do jajowodów ogó³em 147 blastocyst, u 5 stwierdzo-no ci¹¿ê w 30. dniu po zabiegu, uzyskuj¹c od 3 (37,5%) po oproszeniu 18 prosi¹t (13). W wyniki domacicznej transplantacji zarodków nie uzyskano ich pe³nego roz-woju in vivo.
Obecnie prowadzone s¹ badania nad udoskonale-niem metody OPS dla zarodków we wczesnych sta-diach rozwoju (tj. moruli i wczesnej blastocysty) i nie-naruszon¹ os³onk¹ przejrzyst¹. Istotnym czynnikiem, maj¹cym wp³yw na efektywnoæ metody jest w tym przypadku prêdkoæ zamra¿ania. Mo¿na j¹ znacz¹co przyspieszyæ, stosuj¹c s³omki typu SOPS (superfine open pulled straw) oraz aparat Vit-Master, pracuj¹cy w warunkach obni¿onego cinienia i umo¿liwiaj¹cy obni¿enie temperatury LN2 do 210°C. Dowodz¹ tego badania, w których zarodki poddawano witryfikacji z zastosowaniem mieszaniny TCM 199 z dodatkiem 20% p³odowej surowicy cielêcej wed³ug protokó³u opisanego przez Berthelotego i wsp. (3, 5) i bez-porednio po czterostopniowej ekwilibracji, w liczbie 4 do 6 sztuk przenoszono do s³omek typu SOPS lub OPS oraz umieszczono pionowo w LN. Pozosta³¹ czêæ zarodków w s³omkach typu SOPS wprowadza-no do aparatu Vit-Master. Po 15 dniach przechowy-wania zarodki rozmra¿ono i ekwilibrowano w po¿yw-ce TCM-NBCS, a nastêpnie poddawano hodowli in vitro przez 96 h w po¿ywce TCM 199 z dodatkiem 10% FCS, w temperaturze 39°C, z 5% zawartoci¹ CO2 w powietrzu. Odsetek zarodków w stadium moruli prze¿ywaj¹cych proces mro¿enia przy u¿yciu OPS, SOPS oraz Vit-Master SOPS wyniós³ 56,3%, 57,4% oraz 67,6%, natomiast w stadium wczesnej blastocys-ty 81,8%, 76,9% i 94,7%. Redukcja gruboci cian s³omki oraz minimalizacja objêtoci próby zastosowa-na w rurkach typu SOPS pozwoli³y zastosowa-na zwiêkszenie prêdkoci mro¿enia nawet do 40 000°C/min. Okrelo-no równie¿ optymaln¹ szybkoæ mro¿enia zarodków wiñ na nie wiêksz¹ ni¿ 20 000°C/min. (5).
Stosunkowo najnowszym osi¹gniêciem w procesie mro¿enia zarodków wiñ jest zastosowanie kropelko-wej metody witryfikacji. Umo¿liwia ona pominiêcie dodatkowych zabiegów (wstêpna hodowla zarodka) oraz manipulacji wewn¹trzkomórkowych. Zarodki w stadium moruli i wczesnej blastocysty umieszczane s¹ bezporednio w roztworze witryfikacyjnym, za-wieraj¹cym 40% glikol etylenowy 0,6 M sacharozê i 2% glikol polietylenowy (ESP). Po przeprowadze-niu trój- lub czterostopniowej ekwilibracji, zarodki umieszczone w kropli o maksymalnej objêtoci 1 µl przenoszono na czubek pipety. Formuj¹c¹ siê na nim kroplê sch³adzano, a nastêpnie zanurzano w parach
ciek³ego azotu. Po odciêciu kropla ESP wraz z koñ-cówk¹ pipety przechowywana jest w specjalnej tubie. Po rozmro¿eniu zarodków i ich inkubacji in vitro od-setek rozwijaj¹cych siê morul i wczesnych blastocyst wynosi³ odpowiednio: 91,3 i 69,6%. Wysoki by³ tak¿e odsetek urodzonych prosi¹t w stosunku do liczby za-rodków przeniesionych do macicy piêciu biorczyñ, który dla morul wynosi³ 31,4%, a dla blastocyst 20% (21). Reasumuj¹c, zastosowanie ultraszybkich metod mro¿enia umo¿liwia mro¿enie zarodków we wczes-nych stadiach rozwoju. Tym samym pomin¹æ mo¿na proces usuwania zwi¹zków lipidowych, stabilizacjê cy-toszkieletu lub odwirowywanie substancji os³aniaj¹-cych (5).
Pimiennictwo
1.Beeb L. F., Cameron R. D., Blackshaw A. W., Higgins A., Nottle M. B.: Pig-lets born from centrifuged and vitrified early and peri-hataching blastocysts. Theriogenology 2002, 57, 2155-2165.
2.Berthelot F., Martinat-Botte F., Perreau C., Terqui M.: Birth of piglets after OPS vitrification and transfer of compacted morula stage embryos with in-tact zona pellucida. Reprod. Nutr. Dev. 2001, 41, 267-272.
3.Berthelot F., Martinat-Botte F., Perreau C., Terqui M.: Piglets born after vitrification of embryos using the open pulled straw method. Cryobiology 2000, 41, 116-124.
4.Cameron R. D., Beebe L. F., Blachshaw A. W., Keates H. L.: Farrowing rates and litter siae following transfer of vitrified porcine embryos into a commer-cial swine herd. Theriogenology 2004, 56, 1533-1543.
5.Cuello C., Antonia Gil M., Parrilla I., Tornel J.,Vazquez J. M., Roca J., Berthelot F., Martinat-Botte F., Martinez E. A.: Vitrification of porcine em-bryos at various developmental stages using different ultra-rapid cooling pro-cedures. Theriogenology 2004, 62, 353-361.
6.Cuello C., Berthelot F., Martinat-Botte F., Guillouet Ph., Furstoss V., Boisseau Ch., Manceau P., Locatelli A., Martinez E. A.: Transfer of vitrified blastocysts from one or two superovulated Large White hyperprolific donors to Meishan recipients: reproductive parameters at day 30 of pregnancy. The-riogenology 2004, 61, 843-850.
7.Drobinsky J. R., Pursel V. G., Long C. R., Johnson L. A.: Birth of piglets after transfer of embryos cryopreserved by cytoskeletal stabilization and vitrifica-tion. Biol. Reprod. 2000, 62, 564-570.
8.Drobinsky J. R.: Cryopreservation of swine embryos: a chilly past with a vitrifying future. Theriogenology 2001, 56, 1333-1344.
9.Drobinsky J. R.: Cryopreservation of pig embryos, adaptation of vitrification technology for embryo transfer. Reprod. Suppl. 2001, 58, 325-333. 10.Fujino Y., Ujisato Y., Endo K., Tomizuka T., Kojima T., Oguri N.:
Cryopro-tective effect of egg yolkin cryopreservation of porcine embryos. Cryobiolo-gy 1993, 30, 299-305.
11.Gajda B., Smor¹g Z.: Survival of pig morula and blastocyst after exposure to vitrification media or vitrification. CryoLetters 2000, 21, 231-236. 12.Gajda B., Smor¹g Z.: Kriokonserwacja oocytów i zarodków wini.
Biotech-nologia 2003, 60, 138-150.
13.Gajda B., Smor¹g Z.: Prosiêta uzyskane po transplantacji witryfikowanych blastocyst; Medycyna Wet. 2004, 60, 371-373.
14.Hayashi S., Kobayashi K., Mizuno J., Saitoh K., Hirano S.: Birth of piglets from frozen embryos. Vet. Rec. 1989, 125, 43-44.
15.Jakowski J. M., Twardoñ J., Zbylut J., Czech K.: Konserwacja zarodków wiñ metody, ich skutecznoæ oraz g³ówne problemy. Medycyna Wet. 1999, 55, 655-657.
16.Kameyama K., Takedomi T., Itakura H., Onihara T.: Effect of lecithine on cryopreservation of porcine embryos. Proc. 78th Ann. Conf. Japanese Society
of Animal Reproduction. Nigata, Japan 1990, 22 abstr.
17.Kameyama K., Kudoh O., Takedomi T., Fukawa K.: Transfer of cryopre-served pig embryos. Theriogenology 1997, 47, 366.
18.Kobayashi S., Takei M., Kano M., Tomita M., Leibo S.: Piglets produced by transfer of vitrified porcine embryos after stepwise dilution of cryoprotec-tants. Cryobiology 1998, 36, 20-31.
19.Kuwayama M., Holm P., Jacobsen H., Greve T., Callesen H.: Successful cryopreservation of porcine embryos by vitrification. Vet. Rec. 1997, 141, 365.
20.Misumi K., Suzuki M., Sato S., Saito N.: Successful production of piglets derived from vitrified morulae and early blastocysts using a microdroplet method. Theriogenology 2003, 60, 253-260.
21.Nagashima H., Yamakawa H., Niemann H.: Freezability of porcine blasto-cyts at different peri-hatching stages. Theriogenology 1992, 37, 839-850. 22.Nagashima H., Kashiwazaki N., Ashman R., Grupen C., Seamark R. F.,
Nottle M.: Recent advances in cryopreservation of porcine embryos. Therio-genology 1994, 41, 113-118.
23.Nagashima H., Kuwayama M., Grupen C. G., Ashman R. J., Nottle M. B.: Vitrification if porcine esrly cleavage stage embryos and oocytes after remo-val of cytoplasmic lipid droplets. Theriogenology 1996, 45, 180 (abstr.) 24.Papis K.: Otwarte metody witryfikacji komórek i ich zastosowanie do
krio-konserwacji oocytów i zarodków ssaków. Medycyna Wet. 2001, 57, 547--551.
25.Smidt D., Niemann H.: Biotechnology in genetics and reproduction. Live-stock Prod. Sci. 1999, 59, 207-221.
26.Yoshino J., Kojima T., Shimizu M., Tomizuka T.: Cryopreservation of porcine blastocysts by vitrification. Cryobiology 1993, 30, 413-422.
Adres autora: mgr in¿. Marcin Jeziorkowski, ul. w. Jerzego 9A/7, 61-546 Poznañ; e-mail: marjezo@wp.pl
