Wprowadzanie zrekombinowanego DNA do komórek bakterii. Sposoby wprowadzania DNA do innych (niż bakterie) typów komórek

Wprowadzanie zrekombinowanego DNA do komórek bakterii

Sposoby wprowadzania DNA do innych

(niż bakterie) typów komórek

czyli schemat klonowania fragmentu DNA w wektorze plazmidowym:

1. Przygotowanie fragmentu DNA, który chcemy sklonować w wektorze

2. Izolacja i przygotowanie wektora, w którym chcemy sklonować fragment DNA (etapy 1 i 2 zwykle odbywają się równocześnie)

3. Ligacja wektora i wstawki (rekombinacja in vitro) – zrekombinowane DNA

4. Wprowadzenie zrekombinowanego

DNA do odpowiedniego gospodarza np.

transformacja bakterii zrekombinowanym DNA

5. Selekcja i analiza transformantów (screening)

Etapy przygotowania

zrekombinowanego DNA do klonowania molekularnego

Zrekombinowane DNA plazmidowe

Klonowanie molekularne

1. Fragment DNA do klonowania najczęściej uzyskujemy przez trawienie większej cząsteczki odpowiednim enzymem

restrykcyjnym (ale możemy także rekombinować w wektorach fragmenty DNA powielone w reakcji PCR) 2. Elektroforetyczna kontrola jakości, poprawności i wydajności

trawienia (lub amplifikacji, jeśli fragment DNA powielamy w PCR), ewentualne oczyszczenie produktu trawienia przez izolację

fragmentu DNA z żelu agarozowego

OPCJONALNIE „zabiegi” z fragmentem do klonowania:

a) Dodanie nowego miejsca restrykcyjnego po trawieniu enzymem generującym tępe końce - poprzez ligację linkerów DNA np.

wyposażonych w miejsce restrykcyjne

b) Zamiana lepkiego 5’ końca na koniec tępy (np. egzonukleazą, polimerazą Klenowa)

c) Zamiana lepkiego 3’ końca na koniec tępy (np. polimerazą Klenowa)

I. Przygotowanie fragmentu DNA, który chcemy sklonować w wektorze

II. Przygotowanie DNA wektora plazmidowego do rekombinacji in vitro

1. Izolacja plazmidowego wektora z komórek E. coli

2. Wektor do klonowania przed rekombinacją musi być zlinearyzowany (czyli mam mieć wolne lepkie/tępe końce) przez trawienie odpowiednim enzymem (enzymami) restrykcyjnym (najczęściej takimi samymi jak fragment poddawany rekombinacji*). Trawienie odbywa się w obrębie MCS wektora

5'-G^G A T C C-3

3'-C C T A G^G-5' 5'-A^G A T C T-3‘

3'-T C T A G^A-5'

BamHI BglII

*

3. Elektroforetyczna kontrola jakości, poprawności i wydajności trawienia DNA wektora – szczególnie istotna w przypadku wektora!!!

a) Opcjonalnie defosforylacja 5’

końców wektora, która zapobiega

jego autoligacji (defosforylacja

ma sens tylko przy trawieniu

wektora DNA pojedynczym

enzymem)

W rekombinacji in vitro wykorzystuje się ligazę DNA faga T4 (ligaza ta wymaga ATP i poza lepkimi w miarę wydajnie „skleja” także tępe końce DNA)

III. Ligacja wektora i wstawki –rekombinacja DNA in vitro

Optymalna temp. działania ligazy T4 od 4 (dla końców lepkich), 15-25 (dla końców tępych)

W mieszaninie ligacyjnej rekombinowany fragment DNA (wstawka insert,) powinien stanowić molowy nadmiar względem ilości cząsteczek wektora

•Przy małym stężeniu DNA wstawki najbardziej prawdopodobne jest połączenie końców tej samej cząsteczki DNA (recyrkularyzacja).

•Wzrost stężenia DNA w reakcji ligacji zwiększa prawdopodobieństwo połączenia dwóch różnych cząsteczek DNA

•Dla większości aplikacji można przyjąć stosunek molarny wstawka : wektor - 3:1

•W reakcji ligacji prawie nigdy nie powstaje 100% zrekombinowanego DNA, dlatego wektory wyposaża się w systemy wizualnej selekcji

zrekombinowanych klonów, poddaje się je defosforylacji itp.

IV. Wprowadzanie zrekombinowanego DNA do bakterii 1. Transformacja

Zjawisko transformacji – czyli pobierania nagiego DNA z podłoża do komórek wykazano po raz pierwszy w bakteriach G+ Streptococcus pneumoniae (a potem także w

Pneumonococcus czy Diplococcus) - Fred Griffiths 1928.

• Griffith sformułował hipotezę, że tzw. "czynnik transformujący" pochodzący od zabitych przez

podgrzewanie bakterii szczepu S dokonał zmiany bakterii R w szczep trwale zjadliwy. Proces ten został nazwany transformacją.

• 16 lat później, w roku 1944, Oswald Avery, Colin MacLeod i Maclyn McCarthy, wyjaśnili mechanizmy leżące u podłoża zjawisk zaobserwowanych w tym eksperymencie, równocześnie dowodząc, że tzw. czynnikiem transformującym jest DNA.

•Zdolność transformacji bakterii zależy od tzw.

stanu kompetencji

•Stan naturalnej kompetencji

uwarunkowany jest genetycznie.

•W takiej transformacji najlepiej

pobierany jest liniowy dsDNA. Jedna nić ulega degradacji, druga

rekombinacji do genomu gospodarza.

•Naturalną zdolność wchodzenia w stan kompetencji wykazują głównie bakterie Gramdodatnie

(Streptococcus, Staphylococcus, Bacillus).

•Bakterie Gram-ujemne zwłaszcza te z rodziny Enterobacteriaceae (m.in.

E. coli) podlegają tego typu

transformacji ze znacznie mniejsza wydajnością

Sztuczna kompetencja –

•transformacja E. coli plazmidowym DNA z użyciem metody chemicznej

•podstawowy sposób wprowadzania zrekombinowanego DNA do bakterii

Procedura transformacji E. coli plazmidowym DNA metodą chemiczną:

1. Przygotowanie hodowli biorcy we wczesnej fazie logarytmicznej (OD₆₀₀ 0.3-0.4) 2. Otrzymanie komórek kompetentnych przez traktowanie bakterii zimnym (0 st.

C) roztworem 50 lub 100mM chlorku wapnia (w niektórych modyfikacjach stosuje się dodatek innych jonów np. Mg lub Rb). Roztwory chlorków sprawiają ze osłona komórkowa staje się przepuszczalna np. dla plazmidu

3. Zmieszanie komórek kompetentnych z preparatem DNA (plazmid adsorbuje się na powierzchni komórki) i poddanie krótkotrwałemu działaniu szoku cieplnego.

Szybkie podwyższanie temperatury (do 42 st. C na ok. 3 min.)

powoduje zmiany w powłokach komórkowych bakterii (podwyższona temperatura wpływa na stan fizyczny lipidów w błonie powodując powiększenie

porów) pozwalające na wniknięcie cząsteczek DNA do wnętrza komórek

4. Pozostawienie komórek w podłożu nieselekcyjnym na okres umożliwiający powrót komórek do normalnego stanu fizjologicznego i wyrażenie się genów zawartych na wprowadzanym plazmidzie lub wektorze fagowym (co najmniej 1 godz. W pożywce bez antybiotyku z napowietrzaniem)- bardzo ważne!!!

5. Wysiew komórek na podłoża selekcyjne lub w przypadku transformacji z

wykorzystaniem wektora fagowego (np. M13) na płytki bez selekcji z agarem miękkim – „top agarem”

Od czego zależy wydajność transformacji bakterii metodą chemiczną?

1. Szczep biorcy powinien być bezplazmidowy (wrażliwy na antybiotyki), mieć nieaktywny system restrykcyjny (Res-) zapobiega degradacji obcego DNA oraz system rekombinacji (RecA-) co zapewnia stabilność wprowadzanych plazmidów w komórce Takie cechy mają np.

szczepy E. coli DH5 i XL1-Blue rekomendowane jako biorcy w transformacji

2. DNA plazmidowy powinien być oczyszczony – nadmiar soli, enzymów restrykcyjnych, resztek fenolu, obniża lub hamuje wydajność transformacji

3. Najbardziej efektywną formą transformacji jest forma ccc DNA plazmidu, transformacja formą liniową jest mało wydajna i stosowana tylko w szczególnych wypadkach

4. Wydajność transformacji zależy od wielkości cząsteczki plazmidu, duże cząsteczki transformują się trudniej

5. Nadmiar DNA nie wpływa na wzrost wydajności, optymalna ilość dla E. coli powinna wynosić od 20-200 ng na reakcję

6. Komórki kompetentne są bardzo wrażliwe i należy się z nimi obchodzić bardzo delikatnie, zwłaszcza podczas wirowania, mieszania z DNA. Wszystkie etapy preparatyki należy

przeprowadzać w lodzie.

Wydajność podaje się jako liczbę transformantów w przeliczeniu na 1 mikrogram DNA.

Dla E. coli wydajność ta w metodzie wapniowej (z chlorkiem wapnia) waha się od 10⁴ do 10⁶ (max. 10⁷ na 1 g plazmidowego DNA).

2. Elektrotransformacja (elektroporacja)

Istotą metody jest przepuszczenie przez zawiesinę komórek (np. bakterii) krótkiego (5-10 msek) impulsu prądu o bardzo wysokim napięciu (1250-2500 V).

Prowadzi do powstawania porów (wielkości do 2 nm) w błonie (impuls elektryczny przejściowo i

odwracalnie przerywa ciągłość błony), przez które do komórek może wnikać DNA.

Po raz pierwszy zastosowana przez Dovera i wsp.

1988 roku dla bakterii, zyskała wielką popularność, ponieważ pozwala transformować gatunki,

które trudno uzyskują kompetencję metodami chemicznymi.

Zalety elektrotransformacji w porównaniu z transformacją bakterii metodą chemiczną :

•można uzyskać bardzo wysoką wydajność transformacji (10

-10

transformantów na g DNA, to co najmniej dwa rzędy wielkości więcej niż w metodzie chemicznej)

•można wprowadzać bardzo duże cząsteczki DNA (np. plazmidy z

insertami wielkości setek kpz) np. zrekombinowane wektory do

konstrukcji bibliotek genowych z dużymi wstawkami

Procedura elektroporacji komórek bakteryjnych plazmidowym DNA:

1. Przygotowanie tzw. komórek elektrokompetentnych

a) Dobór odpowiedniego składu podłoża i fazy hodowli (log faza) – zawiesina musi zawierać dużą ilość żywych komórek bakterii (10¹⁰-10¹²)

b) Bardzo dokładne odmycie od wszelkich składników podłoża, przez

wielokrotne płukanie schłodzoną (0-4 st.) dejonizowaną wodą, która w ostatnich etapach może zawierać 10% glicerol lub inne czynniki buforujące jak Hepes

c) Zawieszenie w bardzo malej objętości wody z glicerolem (1/400 –1/1000) pierwotnej objętości hodowli. (nieużyte komórki można przechowywać w temp. –70 st.)

2. Poddanie komórek i bardzo czystego preparatu plazmidowego DNA (odsolonego !!! np. przez dializę), pulsowi elektrycznemu (dobór

parametrów pulsu indywidualny dla poszczególnych szczepów bakteryjnych) 3. Inkubacja mieszaniny po „strzale” w bardzo bogatym podłożu

nieselekcjnym (SOC, Terrific broth), w czasie której następuje regeneracja osłon komórkowych i wyrażenie genów zawartych na plazmidzie

4. Wysiew na podłoża selekcyjne, zwykle po odpowiednim rozcieńczeniu

V. Selekcja transformantów

Analiza transformantów:

• Namnożenie bakterii niosących zrekombinowane DNA w płynnym podłożu selekcyjnym

• Izolacja plazmidowego DNA

• Kontrolne trawienie plazmidowego DNA – analiza obecności

wstawki w wektorze

Zwykle nie służy to klonowaniu molekularnemu!!! (wyjątkiem są tu drożdże)

Problem z nomenklaturą!!!

Jeżeli wprowadzamy zrekombinowane DNA do:

1. Bakterii i drożdży zachodzi proces transformacji (zjawisko opisane przez O. Avery’ego)

2. Komórek roślin – także mówimy o transformacji genetycznej roślin choć to zupełnie inny proces niż w przypadku bakterii

3. Komórek zwierzęcych lub ludzkich mówimy o transfekcji (ponieważ używamy wtedy głownie wektorów pochodzenia wirusowego). W tym wypadku pojęcie transformacji dotyczy transformacji nowotworowej tych komórek

Metody wprowadzania DNA (np. zrekombinowanego)

do innych (niż bakterie) typów komórek

Wprowadzanie zrekombinowanego DNA do drożdży (np.

zrekombinowanych YAC-ów):

• Transformacja metodami chemicznymi komórek drożdży odbywa się na zasadach podobnych jak w przypadku transformacji komórek

bakteryjnych

• zrekombinowane DNA możemy też wprowadzać do drożdży przez elektrotransformację

• zwykle z wykorzystywaniem odpowiednich wektorów np. typu YAC

Wprowadzanie zrekombinowanego DNA do roślin

•Wykorzystuje się bakterie Agrobacterium tumefaciens i Agrobacterium rhizogenes, które mają naturalną zdolność do wprowadzania swojego DNA do roślin.

•Posiadają w swojej komórce plazmidy (Ti, Ri), kodujący geny niezbędne do infekcji rośliny. Jeden z fragmentów plazmidu Ti, nazwany odcinkiem T (T-DNA), integruje się z materiałem genetycznym komórki gospodarza.

•Dzięki usunięciu części sekwencji wewnątrz plazmidu T, w to miejsce można stawić dowolny fragment DNA, który chcemy dostarczyć do roślinny

•Metoda ta ma poważne ograniczenie - można ja stosować wyłącznie do roślin dwuliściennych, ponieważ tylko one ulegają infekcji przez Agrobacterium

Izolacja plazmidu Ti, trawienie ER w sekwencji T- DNA

Miejsce rozpoznania ER

Fragment DNA do rekombinacji w plazmidzie Ti Bakterie Agrobacterium

tumefaciens

Zrekombinowany plazmid Ti

Zrekombinowany wektor Ti jest wprowadzany do komórek

Agrobacterium pozbawionych plazmidu Ti

Bakterie infekując komórki roślin dostarczają obcy gen do genomu gospodarza

T-DNA z obcym genem

wprowadzany do genomu rośliny

Stransformo -wane

wektorem Ti komórki roślinne są hodowane in vitro

Regeneracja rośliny in vitro z populacji wyselekcjonowanych komórek zmodyfikowanych genetycznie

Etap uzyskania plazmidu Ti zrekombinowanego z obcym fragmentem DNA przeprowadza się w komórkach E. coli bo wektor Ti ma szeroki zakres gospodarzy

Schemat transformacji genetycznej roślin dwuliściennych z użyciem

plazmidowego wektora Ti A. tumefaciens

1) Wybór odcinka DNA mającego stanowić „transgen” w roślinie i wstawienie go w odpowiednie miejsce wektora będącego pochodną plazmidu T – zrekombinowany plazmid T

wprowadzamy do E. coli (transformacja metodą chemiczną) 2) Wprowadzeniu zrekombinowanego plazmidu T do

Agrobacterium (transformacja metodą chemiczną lub elektrotransformacja),

3) Inkubacja bakterii niosących wektor z fragmentem tkanki roślinnej (kokultywacja) – umieszczenie eksplantatów w roztworze bakterii

4) Przeniesienie fragmentów tkanki na pożywkę selekcyjno- regeneracyjną z odpowiednim antybiotykiem (czynnik eliminujący Agrobacterium i czynnik selekcyjny

transformantów)

5) Indukcja podziałów komórkowych i powstanie bezkształtnej masy dzielących się komórek zwanej kalusem,

6) Regeneracja roślin z komórek kalusa za pomocą pożywek zawierających hormony roślinne,

7) Ukorzenianie rośliny w odpowiedniej pożywce, 8) Przeniesienie roślin do ziemi, hartowanie; analizy

molekularne, fizjologiczno-biochemiczne

Transformacja genetyczna roślin

dwuliściennych z użyciem Agrobacterium

-Mikrowstrzeliwanie – biobalistyka (nie wymaga tworzenia protoplastów z komórek roślinnych)

Inne metody są stosowane raczej rzadko – w większości wymagają uzyskania protoplastów

Sposoby transformacji genetycznej roślin czyli

wprowadzania obcego np. zrekombinowanego DNA do

roślin jednoliściennych (zboża, trawy i cebulowate)

• Biobalistyka - mikrowstrzeliwanie – pistelet genowy-

„gen gun”

• Biobalistyka jest to technika wprowadzania egzogennego DNA do wnętrza komórek (głównie roślinnych), przez wstrzeliwanie mikrokulek średnicy 0.5-5 mikrometrów z metali szlachetnych lub polimerowych (złota lub wolframu), opłaszczonych zrekombinowanym DNA z zastosowaniem tzw. dział biobalistycznych (dział genowych).

• Są to urządzenia wykorzystujące ładunek pirotechniczny lub efekt eksplozji kropli wody poddanej krótkiemu

wyładowaniu elektrycznemu do wystrzelenia mikrokulki.

• Metoda ta pozwala na wprowadzenie DNA do komórek lub organelli.

• Wstrzelone DNA ulega dufuzji i integracji z chromosomami.

• Dominują metody biologiczne, które są

najbardziej skuteczne (ale nie całkowicie wolne od wad) -transfekcja z użyciem

zrekombinowanych wektorów wirusowych tj.

inkubacja linii odpowiednich komórek z zawiesiną zrekombinowanego wirusa w odpowiednich

warunkach (pożywka, temp. itd.)

Inne metody niewirusowego transferu DNA

• Elektrotransformacja – zwykle DNA bezwektorowe (oparta na podziale komórki)

• Lipofekcja (DNA bezwektorowe) (oparta na podziale komórki)

• Mikroiniekcja dojądrowa - DNA bezwektorowe (niezależna od podziału komórki)

• Nukleofekcja – transfer do jądra komórkowego (niezależna od podziału komórki)

Wprowadzanie zrekombinowanego DNA do komórek zwierzęcych i ludzkich:

• Liposomy to drobne syntetyczne pęcherzyki lipidowe. Powstają one

spontanicznie, jeżeli pewne typy lipidów zawiesi się w roztworze wodnym. Ich

błonę stanowi podwójna warstwa lipidowa, tak więc budową przypominają np. błonę komórki.

Wykorzystanie liposomów i lipopleksów – lipofekcja

• Liposomy wiążą i kondensują DNA spontanicznie, tworząc kompleksy o wysokim powinowactwie do błon

komórkowych

• DNA zawarte w liposomach jest dostarczane do komórki na zasadzie endocytozy

• najczęściej ze względu na ograniczoną pojemność liposomów wprowadza się DNA bezwektorowe

• w celu zakończenia lipofekcji konieczny jest

podział komórki, ponieważ DNA wchodzi do jądra podczas rozpadu otoczki jądrowej po podziale komórki lub dzięki określonej sekwencji

lokalizacyjnej lokalizacyjną

W związku z zależnością lipofekcji od podziału komórki liposomy są dodatkowo wyposażone w:

• elementy kierujące DNA do jądra komórkowego

• peptydy, zdolne niszczyć błony endosomalne i zapobiegać lizosomalnej degradacji DNA

• rekombinazy, wspomagające wbudowanie wprowadzonego DNA do genomu komórki

• białka i RNA, które mogą służyć ekspresji wprowadzonego DNA

Wykorzystanie liposomów i lipopleksów – lipofekcja

Mikroiniekcja dojądrowa (dotyczy głównie komórek zwierzęcych np.

modyfikowanych w procesie transgenezy)

•Metoda powstała w latach 70 XX wieku.

•Polega na wstrzykiwaniu DNA bezpośrednio do jąder komórek za pomocą szklanych mikroigieł,

kontrolowanych przez sterowane hydraulicznie

mikromanipulatory, przy równoczesnej obserwacji pod mikroskopem o wysokiej rozdzielczości.

•Metoda ta jest bardzo wydajna ale bardzo trudna technicznie, praco - i czasochłonna (przez to jej zastosowanie jest ograniczone)

•Zazwyczaj wprowadzane DNA jest bezwektorowe

• nukleofekcja –wykorzystuje kombinację

parametrów elektrycznych (elektroporacji), z odczynnikami specyficznymi dla danego typu komórki, dzięki czemu materiał genetyczny może być przeniesiony bezpośrednio do cytoplazmy i jądra komórkowego

• Zatem nukleofekcja zapewnia zdolność do

transfekcji nawet niedzielących się komórek, takich jak neurony i komórki krwi w stanie spoczynku.

• Przed wprowadzeniem technologii Nucleofector efektywny transfer genów do komórek pierwotnych był ograniczony jedynie do wykorzystania

wektorów wirusowych

• Optymalne warunki nukleofekcji zależą od indywidualnego typu komórki, a nie od

dostarczanego substratu. Oznacza to, że identyczne warunki mogą być użyte do nukleofekcji DNA, RNA, siRNA, shRNA, mRNA i pre-mRNA, peptydów lub innych biologicznie aktywnych cząsteczek

Nukleofekcja

Po co to wszystko?

czyli przykład bardzo praktycznego wykorzystania

technologii rekombinowanego DNA

Technologia rekombinowanego DNA w biotechnologii:

• zielona biotechnologia obejmująca rolnictwo i szeroko pojęty przemysł rolno-przetwórczy

• czerwona biotechnologia — związana z różnymi

aspektami ochrona zdrowia ludzi i zwierząt (włącznie z

diagnostyką, farmacją, jak również weterynarią)

Podstawą współczesnej zielonej biotechnologii jest transgeneza – przeniesienie na stałe do jakiegoś organizmu jednego lub więcej genów pochodzących z jakiejś komórki lub innego organizmu – konstrukcja organizmów typu GMO

Podstawą transgenezy jest

rekombinacja in vitro - łączenie dowolnych cząsteczek DNA

Przykłady modyfikacji genetycznych roślin

Przykłady modyfikacji genetycznych zwierząt

transgeniczne myszy -

niezastąpiony model w badaniu chorób człowieka, np. nowotworów, otyłości, starzenia, chorób układu krążenia, cukrzycy itp

„brainbow mouse”, ma ekspresję różnych zestawów białek

fluorescencyjnych w komórkach układu nerwowego. Pozwala to prześledzenie procesu rozwoju układu nerwowego i formowania połączeń między neuronami

1. Wydajna produkcja rekombinowanych białek (leków, hormonów) w mikroorganizmach i liniach komórek eukariotycznych

Technologia rekombinowanego DNA w czerwonej biotechnologii - ochrona zdrowia ludzi i zwierząt

• Insulina „Gensulin” jest otrzymywana na bazie szczepu E. coli transformowanego zrekombinowanym plazmidem z

ludzkim genem, kodującym zmodyfikowany prekursor ludzkiej insuliny.

• W wyniku kolejno następujących procesów otrzymywana jest cząsteczka insuliny

identyczna z endogennym ludzkim hormonem.

Rekombinowane biofarmaceutyki:

• Do chwili obecnej na świecie do użytku dopuszczonych jest ponad 650

leków białkowych, z czego 400 to leki oparte na białkach rekombinowanych

• Kolejne 1300 rekombinowanych biofarmaceutyków jest w fazach testów, z wyraźną tendencją wzrostu udziału w ich produkcji komórek

eukariotycznych

Jakiego typu schorzenia próbujemy leczyć za pomocą

rekombinowanych biofarmaceutyków?

2. Medycyna - choroby genetyczne

• W genomie ludzkim zidentyfikowano nieco ponad 20 000 genów;

• Szacuje się, że mutacje 6000–10 000 genów są związane z chorobami genetycznymi;

• są to mutacje dziedziczne, które zmieniają ekspresję genów (syntezę RNA lub białka);

• znaczną część stanowią geny, których mutacje powodują wystąpienie nowotworów

Metody inżynierii genetycznej umożliwiają

• Naprawę uszkodzonych genów – terapia genowa

• Precyzyjną diagnostykę defektów genetycznych

Możliwe schematy terapii genowej Terapia genowa - leczenie chorób genetycznych

(z wykorzystaniem technologii rekombinowanego DNA) poprzez:

• wprowadzenie terapeutycznego DNA (zamiana uszkodzonego genu na prawidłową kopię),

• wprowadzenie tzw. genu samobójczego – zniszczenie chorych

komórek np. nowotworowych

Terapia genowa - różne schematy postępowania i różne wektory DNA

wektor AAV

wektor retrowirusowy