•>( O
ISiiifia
-msismm
am'Jmil UI (\, "^^E Bibliotheel< TU Delft P 1012 4163 C 2 1 2 7 3 2BIJDRAGE TOT DE KENNIS
DER OXYDATIEVE DISSIMILATIE VAN
ASPERGILLUS NIGER VAN TIEGHEM
PROEFSCHRIFT, TER VERKRIJGING VAN DEN GRAAD VAN DOCTOR IN DE TECHNISCHE WETENSCHAP AAN DE TECHNISCHE HOOGESCHOOL T E DELFT. KRACHTENS ARTIKEL 2 VAN H E T KONINKLIJK BESLUIT VAN 16 SEPTEMBER 1927, STAATSBLAD No. 310 EN OP GEZAG VAN DEN RECTOR MAGNIFICUS DR. IR. C. B. BIEZENO, HOOGLEERAAR IN DE AFDEELING DER W E R K T U I G B O U W K U N D E EN S C H E E P S B O U W K U N D E , VOOR EEN C O M M I S S I E U I T DEN SENAAT TE V E R D E D I G E N OP VRIJDAG 1 J U L I 1938, DES N A M I D D A G S T E 4 UUR. DOOR
LOUIS HENRI CYRIL PERQUIN
GEBOREN TE AMSTERDAMAAN DE NAGEDACHTENIS VAN MIJN VADER. AAN MIJN MOEDER.
Biz.
I N L E I D I N G 13
H O O F D S T U K I.
Beknopt overzicht der vroegere onderzoekingen over de gluconzuur- en citroenzuurvorming door
schim-melsoorten 18 § 1. Eenige algemeene opmerkingen over de
stofwisselings-producten van schimmels 18 § 2. Overzicht der vroegere onderzoekingen over de
vor-ming van gluconzuur door schimmels 20 § 3. Beknopt overzicht der literatuur over de vorming van
citroenzuur door schimmels 24 § 4. Overzicht der vroegere onderzoekingen, welke
be-oogen een inzicht te verschaffen in het chemisme der
citroenzuurvorming 32
§ 5. Conclusie 45
H O O F D S T U K I I .
Critische beschouwing van de waarde der gebruike-lijke methoden van onderzoek voor het verkrijgen van
een inzicht in de schimmelstofwisseling 47
H O O F D S T U K I I I .
Methodiek der eigen onderzoekingen 56 § 1. De aan de toe te passen methodiek te stellen eischen 56
§ 2. Methode ter bereiding van homogeen celmateriaal 56 § 3. Methode ter bestudeering van het gedrag van
gepre-formeerd homogeen celmateriaal 59 § 4. Eenige algemeene opmerkingen over de schudmethode 61
§ 5. Hernieuwde toetsing van de bruikbaarheid der
H O O F D S T U K IV. Biz. D e factoren, welke de gluconzuurvorming door
Asper-gillus niger bepalen 72 § 1. Inleiding 72 § 2. Oriënteerend onderzoek aangaande de factoren, welke
de productie van mycelium met gluconzuurvormend
vermogen bepalen 74 § 3. De invloed van de variatie der minerale bestanddeelen
in bepaalde media op het gluconzuurvormend
ver-mogen van daarin geproduceerde miycelia 85 § 4. Eenige waarnemingen aangaande de
gluconzuurvor-ming door gepreformeerd mycelium op langeren
ter-mijn 100 § 5. Korte samenvatting der in dit hoofdstuk
mede-gedeelde uitkomsten 103
H O O F D S T U K V.
Onderzoekingen over de citroenzuurvorming door
Aspergillus niger in staande cultures 106
§ 1. Inleidende opmerkingen 106 § 2. Proefnemingen omtrent de citroenzuurvorming in
staande cultures 107 § 3. Proefnemingen omtrent de citroenzuurvorming in
staande cultures met behulp van een verbeterde
me-thodiek 115
H O O F D S T U K V I .
Oriënteerend onderzoek aangaande de factoren, welke de citroenzuurvorming door Aspergillus niger bepalen 125
§ 1. Inleiding 125 § 2. Voorloopige waarnemingen omtrent den invloed van
bepaalde factoren op de productie van mycelium met citroenzuurvormend vermogen en op de dissimilatie
van dit mycelium 127 § 3. De invloed van de samenstelling der gasphase op het
citroenzuurvormend vermogen van in verschillende
§ 4. De invloed van den aard en de hoeveelheid van het stik-stofvoedsel op het citroenzuurvormend vermogen van
het geproduceerde mycelium 142 § 5. De invloed van de phosphaatconcentratie in het
me-dium op het citroenzuurvormend vermogen van het
geproduceerde mycelium 149 § 6. De invloed van de saccharose-concentratie in het
medium op het citroenzuurvormend vermogen van het
geproduceerde mycelium 151 § 7. De samenstelling van het door den groei veranderde
medium 106 op het moment, waarop daarin bij ver-hoogde zuurstofspanning citroenzuur kan worden
geproduceerd 152 § 8. Beknopte samenvatting der belangrijkste in dit
hoofdstuk medegedeelde uitkomsten 154
HOOFDSTUK VII.
Proefnemingen aangaande de factoren, welke in de onderzoeksphase de citroenzuurvorming door gepre-formeerd mycelium van Aspergillus niger bepalen . . 157
§ 1. Inleiding 157 § 2. Invloed van de pH bij afwezigheid van minerale
be-standdeelen 159 § 3. Invloed van de toevoeging van bepaalde minerale
bestanddeelen in media met 15 % saccharose,
ammo-niumchloride en pH = 2 , 0 161 § 4. Invloed van den aard der stikstofvoeding in media
met 15% saccharose, K, Zn en pH = 2,0 . . . . 164 § 5. Invloed van de hoeveelheid nitraat-stikstof in media
met 15 % saccharose, K, Zn en pH = 2,0 . . . . 166 § 6. Invloed van de hoeveelheid ammonium-stikstof in
media met 15 % saccharose, K, Zn en pH = 2,0 . 166 § 7. Invloed van de hoeveelheid kalium in media met 15 %
saccharose, ammoniumchloride, Zn en pH = 2,0 . 168 § 8. Invloed van de variatie van de pH in media met
saccharose, ammoniumchloride, K en Zn 169 § 9. De dissimilatie van mycelium 130 bij verlenging van
Biz. § 10. Korte samenvatting der in dit hoofdstuk
medege-deelde uitkomsten 172
H O O F D S T U K V I I I .
D e invloed van de cultuurvoorwaarden op het citroen-zuurvormend vermogen van schudmycelium van
Asper-gillus niger 176 § 1. Inleidende opmerkingen 176
§ 2. Het citroenzuurvormend vermogen van uiteenloo-pende mycelia beoordeeld in hetzelfde optimaal
be-vonden onderzoeksmedium 177 § 3. De invloed van de variatie der minerale bestanddeelen
in medium 130 op het citroenzuurvormend vermogen
van het daarin geproduceerde mycelium 183 § 4. Het citroenzuurvormend vermogen van mycelia 130
van verschillenden ouderdom beoordeeld in dezelfde
onderzoeksmedia 190 § 5. Korte samenvatting der in dit hoofdstuk
medege-deelde uitkomsten 192
H O O F D S T U K IX.
Over de beteekenis van zink voor de stofwisseling van
Aspergillus niger 194 § 1. Inleiding 194 § 2. Beknopt literatuuroverzicht over den invloed van
zink op de stofwisseling van schimmelsoorten, in het
bijzonder van Aspergillus niger 195 § 3. Eigen proefnemingen over den invloed van zink op
den groei van Aspergillus niger 199 § 4. Eigen proefnemingen over den invloed van zink op de
gluconzuurvorming door Aspergillus niger 201 § 5. Eigen proefnemingen over den invloed van zink op de
citroenzuurvorming door Aspergillus niger 204
H O O F D S T U K X. ' Onderzoekingen over de citroenzuurvorming door een
Slotbeschouwingen 213 § 1. Inleiding 213 § 2. Samenvattende beschouwing over de factoren, welke
de vorming van gluconzuur respectievelijk van
citroen-zuur door Aspergillus niger bepalen 213 § 3. De verkregen uitkomsten in het licht van onze huidige
kennis der stofwisseling bepalende factoren . . . . 226
AANHANGSEL.
Het aantal onderzoekingen, dat in den loop der jaren omtrent de stofwisseling van schimmels is gepubliceerd, heeft geleidelijk een geweldigen omvang aangenomen. Een indruk hiervan verkrijgt men, door kennis te nemen van de door TAMIYA en M O R I T A ^) aan het geslacht Aspergillus gewijde bibliographie, waarin niet minder dan 2424 verhandelingen zijn opgenomen. M i n of meer beangstigend wordt het, wanneer TAMIYA ^) in een volgend artikel het verloop van deze publicatiewoede met den tijd aan een mathe-matische behandeling onderwerpt en men op grond hiervan de toekomstige productiviteit op het gebied der Aspergillus-weten-schap tracht te begrooten.
Terwijl de genoemde bibliographie zich tot alle op Aspergillus-soorten betrekking hebbende verhandelingen uitstrekt, mag worden geconstateerd, dat de in latere jaren verschenen publicaties zich in hoofdzaak bezighouden met de stofwisseling van één tot dit geslacht behoorende soort, n.l. Aspergillus niger van Tieghem. In het bijzonder wordt hierbij dan aandacht geschonken aan de door dit organisme bewerkte oxydatieve dissimilatie, waarbij de waarneming op den voorgrond staat, dat somtijds producten als gluconzuur, citroenzuur en oxaalzuur in het cultuur medium worden afgescheiden.
Een zorgvuldige studie der literatuur leert nu o.m., dat alleen reeds over de eerst in 1914 ontdekte citroenzuurvorming door
Aspergillus niger ruim 200 verhandelingen zijn verschenen.
M e n zou nu geneigd zijn te veronderstellen, dat men zich op grond van de in de literatuur bijeengebrachte gegevens een duide-lijke voorstelling zou kunnen maken omtrent de factoren, welke het optreden der genoemde stofwisselingsproducten in cultures van
Aspergillus niger bepalen. M e n komt dan echter bedrogen uit, daar
ondanks de veelheid van de gedane observaties een verscheidenheid ^) H. TAMIYA und S. MORITA, T h e Botanical Magazine Tokyo 43, Heft 506 bis
44, Heft 524, 1929—1930. i *) H. TAMIYA, T h e Botanical Magazine Tokyo 45, Heft 530, 1931. '
14
in conclusies en inzichten wordt aangetroffen, welke verbijsterend werkt.
Onder deze omstandigheden moge het weinig aanlokkelijk schijnen te trachten een nieuwe bijdrage tot onze kennis van de biochemie van de genoemde schimmelsoort te leveren. Dat ik nochtans hiertoe ben overgegaan, vindt zijn oorzaak in de over-weging, dat het meerendeel der tot dusver verrichte onderzoekingen een grootendeels empirisch karakter draagt.
In de literatuur toch treedt slechts in beperkte mate het besef naar voren, dat de ophooping der genoemde producten in de cultures het gevolg is van afwijkingen in het normale stofwisselings-proces van de schimmel, waarbij naast de vorming van nieuw celmateriaal een volledige verbranding der ademhalingssubstraten i tot koolzuur en water plaats vindt.
Met dit gezichtspunt voor oogen komt men er uiteraard toe een analyse te maken van de factoren, welke verantwoordelijk zijn voor het intreden der bedoelde afwijkingen. Zooals elders uitvoerig zal worden toegelicht, is het nu de groote verdienste van den Franschen botanicus MOLLIARD, dat hij als eerste het schimmel-stofwisselingsonderzoek in deze richting heeft geleid.
Toch kunnen ook de belangwekkende door MOLLIARD verkregen uitkomsten heden ten dage niet geheel meer bevredigen. Genoemde onderzoeker bepaalt er zich toch in hoofdzaak toe aan te geven, op welke wijze cultuurmedia moeten worden samengesteld, opdat daarin na enting met de schimmelsoort na lang voortgezette cultuur belangrijke hoeveelheden van een bepaald stofwisselingsproduct zullen worden aangetroffen. Uit een oogpunt van ,,organisme-physiologie" moge dit van waarde zijn, de hedendaagsche cel-physioloog kan dit niet als een uiteindelijke oplossing van het gestelde probleem beschouwen.
I Deze toch realiseert, dat de verkregen uitkomst de resultante is van de stofwisselingsprocessen van een zoowel in aantal als in kwaliteit voortdurend aan wijzigingen onderhevig geweest zijnde cel-populatie, welke daarbij onder voortdurend zich wijzigende uitwendige voorwaarden heeft verkeerd.
In dit proefschrift is er nu naar gestreefd het vraagstuk van de vorming van bepaalde producten der oxydatieve dissimilatie terug te voeren tot het domein der cel-physiologie. Al dadelijk moge worden opgemerkt, dat het gestelde doel zeker geenszins volledig
is bereikt. Maar toch mag wellicht worden vastgesteld, dat in zooverre vooruitgang is verkregen, dat de ingestelde onderzoekingen eenig licht hebben geworpen op de factoren, welke de stofwisseling van de schimmelcellen bepalen. Duidelijk is hierbij naar voren getreden, dat de aard dezer stofwisseling eenerzijds onder den invloed staat der uitwendige voorwaarden, waaronder de cellen verkeeren, maar anderzijds voor een belangrijk deel wordt be-paald door de factoren, welke er voorafgaande aan het beschouwde experiment toe hebben bijgedragen het ontstaan der cellen te bepalen.
Het zal wel geen toelichting behoeven, dat een op de boven aangegeven basis ingesteld onderzoek in hooge mate tijdroovend is. O m deze reden heb ik mij een groote beperking moeten opleggen en heb ik er mee volstaan er naar te streven de factoren vast te stellen, welke het optreden van gluconzuur en citroenzuur in de cultuurmedia van Aspergillus niger beheerschen.
Teneinde de door mij verkregen uitkomsten in een passend kader te plaatsen, kwam het mij wenschelijk voor de bespreking der eigen waarnemingen te doen voorafgaan door een beknopt overzicht van de resultaten van vroegere onderzoekingen, welke op de vorming van gluconzuur en citroenzuur door schimmels in het algemeen betrekking hebben. Hieraan is dan verbonden een critische bespreking van de draagwijdte dezer uitkomsten, waarna de richtlijnen en de daaraan aangepaste methodiek van het eigen onderzoek kort zijn geschetst.
Niet onvermeld moge hier blijven, dat zoowel het gluconzuur als het citroenzuur op groote schaal in de techniek met behulp van Aspergillus niger worden geproduceerd. Terwijl gegevens omtrent de hoeveelheden gluconzuur, welke langs biochemischen weg door de genoemde en door tot het geslacht Penicillium be-hoorende schimmelsoorten worden gevormd, ontbreken, is er wel het een en ander bekend over den omvang van de wereldproductie van het zgn. ,,gistingscitroenzuur", zooals het door aërobe stofwisse-lende schimmelcellen afgescheiden citroenzuur doorgaans abusie-velijk wordt aangeduid.
Terwijl de export van citroenzuur en calciumcitraat uit Italië, waar sinds van ouds het citroenzuur uit onrijpe citroenen wordt
16
gewonnen, in 1920 nog te zamen 11.000 ton bedroeg, is door de ernstige concurrentie, welke door het gistingscitroenzuur werd veroorzaakt, deze export in 1936 tot 4.100 ton gedaald ^). In tal van landen zijn dan ook in de laatste jaren fabrieken, waarin citroenzuur langs biochemischen weg wordt gewonnen, tot ont-wikkeling gekomen.
Aan een opsomming van het door verschillende landen ge-produceerde citroenzuur is te ontleenen ^), dat in 1933 Italië met 1900 ton, België met 1200, Engeland met 2400, Frankrijk met 500, Tsjecho-Slowakije met 1000 en Amerika met 3500 ton aan de wereldproductie, welke op grond van deze cijfers meer dan 10.000 ton bedraagt, deelnamen. Hiervan werd dan nagenoeg 80% door schimmels als stofwissehngsproduct afgescheiden!
M e n mag veilig aannemen, dat de productie in de verschillende landen sindsdien nog is opgevoerd. W a t Amerika betreft is bekend, dat de import van citroenzuur en calciumcitraat, welke in 1922 nog te zamen 8.500 ton met een waarde van 2.7 millioen dollar bedroeg, in 1936 tot 20 kg met een waarde van 12 dollar is gedaald. Dit is het gevolg van het feit, dat Amerika de mogelijkheid heeft aangegrepen zelf in zijn behoefte aan citroenzuur te voorzien en in 1935 reeds 5.200 ton citroenzuur met een waarde van 2.8 millioen dollar met behulp van schimmels produceerde. RAISTRICK ^) deelt in het onlangs verschenen aan Sir FREDERICK GOWLAND H O P K I N S opgedragen werk mede: ,,I have been assured on the best authority that one firm alone in America maintains in constant commission nine acres of the mycelium of Aspergillus niger to meet part of the wants of the American people for citric acid". Dit beteekent, dat het citroenzuur produceerende schimmeldek in deze ééne fabriek een oppervlakte beslaat van niet minder dan 36.500 m^.
Zooals uit het hierboven uiteengezette reeds zal zijn gebleken, heeft aan dit proefschrift geenszins de bedoeling ten grondslag gelegen nieuwe werkwijzen voor de productie van gluconzuur en
') Indien niet anders vermeld, heb ik de hierna volgende gegevens ontleend aan een onlangs verschenen publicatie van P. A. WELLS en H. T. HERRICK — Ind. and Eng. Chem. 30, 255, 1938 — welke tal van bijzonderheden op dit gebied geeft.
') Rubriek voor Handel en Industrie van het Chemisch Weekblad 1935, p. 75.
citroenzuur te vinden, welke voor rechtstreeksche overbrenging in de techniek in aanmerking zouden kunnen komen. Nochtans was het vertrouwen, dat een scherper inzicht in de factoren, welke de productie dezer zuren door schimmelsoorten bepalen, mede zal kunnen werken tot een rationalisatie der in deze industrie toege-paste werkwijzen, één der drijfveeren tot het instellen van het onderzoek.
HOOFDSTUK I.
B E K N O P T O V E R Z I C H T D E R V R O E G E R E O N D E R Z O E K I N G E N O V E R D E G L U C O N Z U U R E N C I T R O E N -Z U U R V O R M I N G D O O R S C H I M M E L S O O R T E N . § 1. E E N I G E A L G E M E E N E O P M E R K I N G E N OVER D E S T O F W I S S E -L I N G S P R O D U C T E N VAN S C H I M M E -L S .Tot kort vóór het einde van de vorige eeuw werden de
schimmel-soorten vrij algemeen beschouwd als aërobe micro-organismen, welke d e geboden organische voedingsstoffen, voor zoover zij deze niet in den opbouw van nieuw celmateriaal betrekken, volledig verbranden tot koolzuur en water. Sinds 1889 treft men echter verhandelingen aan, waarin melding wordt gemaakt van het o p -treden in de cultuurmedia van producten, welke wijzen op een onvolledige oxydatie van de aan deze media toegevoegde suikers.
Onafhankelijk van elkaar vinden HANSEN ^) en DUCLAUX ^) in
het genoemde jaar oxaalzuur als stofwisselingsproduct van
Asper-gillus niger. In 1893 stelt W E H M E R ^) vast, dat in suikerhoudende
cultures van een tweetal Peniciüium-soorten citroenzuur wordt aangetroffen, op grond waarvan hij deze soorten in een afzonderlijk geslacht Citromyces onderbrengt. I n 1907 beschrijft SAITO *) een nieuw stofwisselingsproduct — later door YABUTA kojizuur
ge-noemd — der schimmels van de Aspergillus-flavus-oryzae-gioep. In cultures van Rhizopus nigricans treft E H R L I C H ^) in 1911 het
fumaarzuur aan. SAITO ®) maakt het in hetzelfde jaar waarschijnlijk,
dat Rhizopus chinensis melkzuur kan vormen, terwijl MOLLIARD ')
in 1922 aantoont, dat Aspergillus niger in staat is naast het reeds gevonden oxaalzuur en citroenzuur ook gluconzuur als
stofwisse-») E . C H R . H A N S E N , F l o r a 72, 8 8 , 1889.
') E . D U C L A U X , A n n . d e l ' I n s t . P a s t e u r 3 , 97, 1889.
') C. W E H M E R , Beitrage z u r K e n n t n i s e i n h e i m i s c h e r Pilze. I. Z w e i n e u e S c h i m m e l
-pilze als E r r e g e r einer C i t r o n e n s a u r e - G a r u n g . H a n n o v e r u n d L e i p z i g , 1 8 9 3 . *) K. SAITO, T h e Botanical M a g a z i n e T o k y o 2 1 , 7, 1907.
' ) F . E H R U C H , Ber. d. d e u t s c h . c h e m . G e s e l l s c h . 44, 3737, 1 9 1 1 . «) K. SAITO, C e n t r a l b l . f Bakt. I I , 29, 2 8 9 , 1 9 1 1 .
lingsproduct af te scheiden. In 1928 vindt W E H M E R ^ ) een kleine hoeveelheid appelzuur onder de dissimilatieproducten van
Asper-gillus fumaricus, terwijl RAISTRICK en medewerkers") dit zuur ook in cultures van een tweetal andere schimmelsoorten aantreffen. In dezelfde publicaties wordt eveneens van het optreden van kleine hoeveelheden barnsteenzuur melding gemaakt, waarbij het evenwel twijfelachtig blijft, of dit zuur inderdaad als een product der oxydatieve dissimilatie moet worden beschouwd. Uit den lateren tijd (1931) trekt een mededeeling van KINOSHITA ^), waarin het optreden van itaconzuur in cultures van een bepaalde Aspergillus-soort wordt beschreven, de aandacht, terwijl onlangs door SAKAGUCHI, INOUE en TADA *) de vorming van aethyleenoxyde-dicarbonzuur door een niet nader aangeduide schimmelsoort is gerapporteerd. In d e laatste tien jaar zijn voorts, vóór alles door RAISTRICK en medewerkers in Engeland en door PETERSON en medewerkers in Amerika een groot aantal onderzoekingen verricht, welke in hoofd-zaak t e n doel hadden de producten der assimilatorische stof-wisseling der schimmels aan een nader onderzoek te onderwerpen. Deze onderzoekingen vallen echter geheel buiten het hier b e -schouwde gebied en kunnen dus onbesproken blijven. D e belang-stellende kan zich aangaande het bijeengebrachte feitenmateriaal oriënteeren in een in 1932 verschenen monographic van BERN-HAUER ^), terwijl een aantal samenvattende artikelen van ver-schillende schrijvers °) nog tal van aanvullende bijzonderheden naar voren brengen.
1) C. WEHMER, Biochem. Z. 197, 418, 1928.
') J. H . BiRKiNSHAW, J. H . V. CHARLES, A . C . HETHERINGTON and H . RAISTRICK,
Phil. Trans. Royal Soc. Ser. B. 220, 153, 1931; J. H . BIRKINSHAW and H . RAISTRICK, ibid., 220, 331, 1931.
') K. KINOSHITA, Acta Phytochimica 5, 271, 1931.
*) K. SAKAGUCHI, T . INOUE and S. TADA, Proc. Imp. Acad. (Tokyo) 13, 9, 1937.
') K. BERNHAUER, Die oxydativen Garungen. Berlin, Julius Springer, 1932. Vgl. eveneens: K. BERNHAUER, Oesterreichische Chemiker Zeitung 34, 159, 167, 1931; Erg. der Enzymf. 3, 185, 1934; K. BERNHAUER, Garungschemisches Praktikum. Berlin, Julius Springer, 1936.
«) F. CHALLENGER, T h e Industrial Chemist 5, 181, 1929; 6, 97, 1930; O . E. M A Y and H . T . HERRICK, Ind. and Eng. Chem. 21, 618, 1929; 22, 1172, 1930; Circular No. 216, United States Department of Agriculture, Washington 1932; Journ. of Bact. 28, 145, 1934; N . N . IWANOFF, Ann. Rev. of Biochem. 1, 675, 1932; H . RAISTRICK,
Erg. der Enzymf. 1, 345, 1932; N . N . IWANOFF and E. S. ZWETKOFF, Ann. Rev. of
Bio-chem. 2, 251,1933; 5, 585,1936; P. W . CLUTTERBUCK, J . Soc. Chem. Ind. 55, 55T, 1936;
T . K. WALKER, J . Soc. Chem. Ind. 55, 6 l T , 1936; J. H . BIRKINSHAW, Biol. Rev. 12,
20
In de hieronder volgende paragrafen zal worden volstaan met het geven van een denkbeeld van de belangrijkste onderzoekingen, voor zooverre deze betrekking hebben op de voorwaarden, waar-onder de vorming van gluconzuur, respectievelijk van citroenzuur door schimmels plaats heeft.
§ 2. O V E R Z I C H T DER VROEGERE O N D E R Z O E K I N G E N OVER D E V O R M I N G VAN G L U C O N Z U U R DOOR SCHIMMELS.
Bij kennisneming van de literatuur der schimmelstofwisseling treft het, dat oxaalzuur en citroenzuur — waarvan men zich het ontstaan uit de suiker niet eenvoudig kan denken — reeds in de vorige eeuw als stofwisseUngsproducten van schimmels zijn her-kend, terwijl het gluconzuur, dat toch een primair oxydatieproduct der glucose is, pas sedert de in 1922 gepubliceerde, voortreffelijke onderzoekingen van MOLLIARD ook algemeen als dissimilatie-product van uiteenloopende schimmelsoorten is aangetoond. T o c h was gluconzuur als stofwisselingsproduct der azijnbacteriën reeds sinds het in 1880 verrichte onderzoek van BOUTROUX ^) goed bekend.
MOLLIARD ^) stelde dan buiten twijfel, dat gluconzuur onder de stofwisselingsproducten van Aspergillus niger {Sterigmatocystis
nigra) kan optreden. Indien de genoemde schimmel werd
ge-cultiveerd in een medium, dat naast rietsuiker slechts geringe hoeveelheden minerale bestanddeelen bevatte, trad gluconzuur sterk op den voorgrond.
Dit resultaat werd in eenige latere onderzoekingen van MOLLIARD ^) en spoedig daarna ook door BUTKEWITSCH *) bevestigd. Hoewel deze aanvankelijk ^) ,,die ein lösliches Ca-Salz liefernde Saure in den Kuituren von Aspergillus niger auf Zucker" aanziet voor parasaccharinezuur werd hij door MOLLIARD'S uitkomsten blijkbaar op het goede spoor gebracht en identificeerde hij dit zuur eveneens als gluconzuur *). D e hierna volgende twee verhandelingen van BUTKEWITSCH *) worden hier slechts volledigheidshalve vermeld.
1) L . BOUTROUX, C . r. d. l'Acad. d. Sc. 91, 236, 1880. ") M . M O L L I A R D , C . r. d. l'Acad. d. Sc. 174, 8 8 1 , 1922. ») M . M O L L I A R D , C . r. d. l'Acad. d. Sc. 178, 4 1 , 1 6 1 , 1924; 192, 313, 1 9 3 1 . *) W L . S . B U T K E W I T S C H , B i o c h e m . Z . 154, 177, 1924. ' ) W L . S . B U T K E W I T S C H , B i o c h e m . Z . 136, 224, 1 9 2 3 ; 142, 195, 1923. «) W L . S . B U T K E W I T S C H , J a h r b . f. wissensch. B o t a n i k 6 4 , 637, 1925; B i o c h e m . Z . 182, 99, 1927.
Kort voordat BUTKEWITSCH tot zijn definitieve uitspraak komt, wordt de vondst van MOLLIARD bevestigd door een voorloopige mededeeling van BERNHAUER ^), welke spoedig wordt gevolgd door een reeks verhandelingen ^), waarin op de gluconzuur-vorming door een aantal Aspergillus niger-stammen nader wordt ingegaan.
Eveneens in 1924 constatéèfden FALCK e n ' ^J^^J^t^ ^) dan het optreden van gluconzuur onder de stofwisseUngsproducten van
Aspergillus cinnamomeus, van Aspergillus fuscus en van vier stammen
van Aspergillus niger.
In de nu volgende jaren verschijnt dan een stroom van publi-caties, waarin de vorming van gluconzuur door schimmelsoorten onder zeer uiteenloopende voorwaarden wordt beschreven. W i j noemen hier slechts de publicaties van TAMIYA en H I D A * ) , ANGELETTI en medewerkers^), SUMIKI *), SAKAGUCHI ' ) , SCHOBER *),
SCHREYER *), KARDO-SYSSOJEVA " ) , WASSILJEW " ) en BOLCATO ^^). Het heeft weinig zin hier op de door deze onderzoekers ver-kregen uitkomsten in te gaan, daar men niet te ver gaat met te
1) K. BERNHAUER, Biochem. Z. 153, 517, 1924.
') K. BERNHAUER, Biochem. Z. 172, 296, 313, 324, 1926; 197, 278, 1928; 205, 240, 1929; K. BERNHAUER, F. DUDA und H. SIEBENAUGER, Biochem. Z. 230, 475, 1931. ») R. FALCK und S. N . KAPUR, Ber. d. deutsch. chem. Gesellsch. 57, 920, 1924. Vgl. ook: R. FALCK, W . SCHOELLER und S. MICHAEL, Biochem. Z. 262, 280, 1933;
S. MICHAEL, Biochem. Z. 274, 397, 1934.
*) H . TAMIYA und T . HIDA, Acta Phytochimica 4, 343, 1928—1929.
') A. ANGELETTI e C. F. CERUTTI, Ann. chim. applicata 20, 424, 1930; 21, 491,1931; A. ANGELETTI, ibid., 22, 59, 404, 1932; A. ANGELETTI e D . PONTE, ibid., 23, 33, 1933; A. ANGELETTI, ibid., 23, 84, 1933; A. ANGELETTI e D . PONTE, ibid., 24, 232, 1934; A. ANGELETTI e L. MERLO, ibid., 24, 468, 1934; A. ANGELETTI e D . PONTE, ibid., 25, 217, 1935; A. ANGELETTI, Ann, Schiapparelli 6, 83, 1932 ref resp. in: Chem. Abstr. 25, 533, 1931; 26, 1637, 3540, 5987, 1932; 27, 3499, 4270, 1933; 28, 6170, 1934; 29, 681, 6357, 1935; 26, 6062, 1932.
•) Y. SUMIKI, J . Agr. Chem. Soc. Japan 6, 17, 23, 1930 ref. in: Chem. Abstr. 24, 3811, 3812, 1930.
') K . SAKAGUCHI, J . Agr. Chem. Soc. Japan 6, 317, 1930; 7, 748, 1931; 8, 264, 1932
ref. in: Chem. Abstr. 27, 1379, 1933.
') R. SCHOBER, Jahrb. £ wissensch. Botanik 72, 1, 1930.
•) R. SCHREYER, Biochem. Z. 240, 295, 1931.
»") E. KARDO-SYSSOJEVA, Biochem. Z. 266, 337, 1933; Proc. Inst. Sci. Research Food Ind. 3, N o . 1, 83, 1935 ref. in: Chem. Abstr. 30, 5257, 1936.
" ) G. WASSILJEW, Biochem. Z. 278, 226, 1935; Archiv f. Mikrob. 6, 250, 1935.
") V. BOLCATO, Giom. chim. ind. applicata 16, 552, 1932; LTndustria Saccarifera
Italiana 28, 12, 454, 1935; Ann. chim. applicata 25, 423, 515, 1935 ref in: Chem. Abstr. 29, 2198, 1935; 30, 745, 1835, 3461, 1936.
22
constateeren, dat deze geheel zijn achterhaald door de fraaie reeks van onderzoekingen, welke door de Amerikaansche geleerden M A Y , HERRICK en h u n medewerkers zijn verricht.
Deze onderzoekingen nemen een aanvang met de studie van M A Y , HERRICK, T H O M en CHURCH ^) betreffende de stofwisseling van een aantal Penicil/ium-soorten, zooals Penicillium citrinum,
Penicillium divaricatum, Penicillium luteum purpurogenum en Peni-cillium purpurogenum var. rubrisclerotium ( T h o m N o . 2670).
In een tweede artikel stelden zij ^) in hoofdzaak vast, dat voor de gluconzuurvorming door de laatstgenoemde schimmelsoort een medium, bevattend 200 g glucose; 1,0 g NaNOsi 0,1 g N a 2 H P 0 4 . 12 H2O; 0,05 g KCl; 0,25 g M g S O i . 7 H^O per liter, optimaal is en dat hierin 55—62,5 % der verbruikte glucose wordt omgezet in gluconzuur. I n aansluiting aan dit onderzoek werden met Penicillium luteum purpurogenum proefnemingen op semi-tech-nische schaal ingesteld ^), waarbij de in het bovengenoemde medium aanwezige hoeveelheid Na2HP04 . 12 H2O werd ver-vangen door 0,028 gram H3PO4 per liter. Vijf jaar later verschijnt een mededeeling *), waaruit blijkt, dat bij cultiveeren van
Peni-cillium chrysogenum onder een luchtdruk van 3 atmospheer in een
medium van de volgende samenstelling: 200 g glucose; 3 g NaNOa; 0,15 g KH2PO4; 0,125 g M g S 0 4 . 7 H 2 0 per liter, 80—87% der verbruikte glucose werd omgezet in gluconzuur.
In 1935 deelen HERRICK, HELLBACH en M A Y ^) mede, dat zij er in zijn geslaagd, bij cultiveeren van Penicillium chrysogenum in roteerende trommels onder druk in 56 u u r , ongeveer 20%-ige glucose-oplossingen om te zetten in 18%-ige gluconzuur-op-lossingen, waarbij het rendement ruim 8 0 % bedraagt. MOYER, M A Y en HERRICK °) verrichtten daarna nog een uitvoerige studie met een anderen stam van Penicillium chrysogenum.
1) O . E. M A Y , H , T . HERRICK, C . T H O M and M. B. CHURCH, J . biol. Chem. 75, 417, 1927.
«) H . T . HERRICK and O . E. MAY, J . biol. Chem. 77, 185, 1928.
') O. E. MAY, H . T . HERRICK, A . J . MOYER and R. HELLBACH, Ind. and Eng. Chem. 21, 1198, 1929; vgl. ook: Am. P. 1.726.067 (1929).
*) O . E. M A Y , H . T . HERRICK, A . J . MOYER and P. A. WELLS, Ind. and Eng. Chem. 26, 575, 1934.
^) H. T . HERRICK, R . HELLBACH and O. E. MAY, Ind. and Eng. Chem. 27, 681, 1935.
In recente onderzoekingen ^) wordt door hen ook Aspergillus
niger in roteerende trommels onder druk en aëratie op
semi-technische schaal gecultiveerd, waarbij uitgaande van 15 % glucose-oplossingen in 18 u u r rendementen van 9 7 % , berekend op de verbruikte suiker, aan gluconzuur werden bereikt. Deze methode blijkt vooruitzichten te bieden voor de technische productie van gluconzuur met behulp van Aspergillus niger, daar de genoemde auteurs ^) onlangs onderzoekingen publiceerden, waarin groote hoeveelheden glucose in ,,fermentation d r u m s " met een capaciteit van 420 gallons op gluconzuur worden verwerkt.
Uit de hieronder geciteerde patentliteratuur ^) moge voorts blijken, dat voor de technische productie van gluconzuur door schimmels veelzijdige belangstelling bestaat *).
Wanneer wij al deze onderzoekingen overzien, dan mogen wij samenvattende concludeeren, dat voor tal van Penici/Üum-soorten, maar ook voor Aspergillus niger, afdoende is komen vast te staan, dat zij onder bepaalde voorwaarden belangrijke hoeveelheden glucose in gluconzuur omzetten.
Maar bovendien mag worden vastgesteld, dat het in de aller-laatste jaren aan de Amerikaansche onderzoekers M A Y en HERRICK is gelukt, deze voorwaarden zoo te kiezen, dat de bedoelde om-zetting practisch quantitatief verloopt. Uiteraard is dit alleen bereikbaar geworden, doordat genoemde onderzoekers een schei-ding hebben teweeg gebracht tusschen een groeiphase der schimmels en een ,,bereidingsphase", welke laatste dan tot de vermelde hooge opbrengsten leidt. Dit doende hebben zij dus tot op zekere hoogte slechts toegepast het in J.933 door KLUYVER en PERQUIN met
^) P. A. W E L L S , A . J . MOYER, J . J . STUBBS, H . T . HERRICK and O . E. M A Y , Ind. and Eng. Chem. 29, 653, 1937; A. J. MOYER, P . A . W E L L S , J . J . STUBBS, H . T . H E R
-RICK and O. E. MAY, Ind. and Eng. Chem. 29, 777, 1937.
2) P. A. W E L L S , D . F. J. LYNCH, H . T . HERRICK and O . E. M A Y , Chem. and Metallurg. Engin. 44, 188, 1937.
') I. BAKONYI, Hong. P. 117.222 (1937); K. BERNHAUER, Fr. P. 707.614 (1930); E. P. 370.039 (1930); D . R. P. 587.819 (1933); K. BERNHAUER and L. SCHULHOF, Am. P. 1.849.053 (1932); J. N . CURRIE, J . H . KANE and A. FINLAY, Am. P. 1.893.819 (1933); R. FALCK, D . R . P . 553.238 (1924); H . T . HERRICK and O. E. MAY, Am. P. 1.726.067 (1929); O . E. M A Y , H . T . HERRICK, A . J . MOYER and P. A. W E L L S , Am. P. 2.006.086 (1935); SCHERING-KAHLBAUM A . G . , D . R . P . 541.545 (1927); voor de met de bioche-mische methode concurreerende electrochebioche-mische bereidingswijze vergelijke men b.v.:
H. S. IsBELL, H . L. FRUSH and F. J. BATES, Ind. and Eng. Chem. 24, 375, 1932.
*) Vgl. ook; C. FROST, J . L . ST. JOHN and H . W . GERRITZ, Ind. and Eng. Chem. 28, 75, 1936.
24
nadruk naar voren gebrachte beginsel, dat, zooals wij zullen zien, ook aan de in dit proefschrift beschreven proefnemingen ten grondslag ligt.
Alvorens van de gluconzuurvorming af te stappen, moge hier nog even worden aangestipt, dat een aantal onderzoekers ^) er in zijn geslaagd uit de daartoe geschikte schimmelsoorten enzymprae-paraten te bereiden, zoodat de oxydatieve omzetting van glucose tot gluconzuur met behulp van biokatalysatoren thans ook los van de levende cel is gerealiseerd.
§ 3. B E K N O P T O V E R Z I C H T DER L I T E R A T U U R OVER D E V O R M I N G VAN C I T R O E N Z U U R D O O R SCHIMMELS.
In 1893 heeft WEHMER in een voorloopige publicatie ^) mede-gedeeld, dat twee door hem geïsoleerde schimmelsoorten, n.l.
Citromyces Pfefferianus en Citromyces glaber tot een betrekkelijk hoog rendement citroenzuur uit suiker produceeren. Nog in het-zelfde jaar heeft WEHMER zijn bevindingen in een uitvoeriger verhandeling ^) samengevat, welke ook nog in den vorm van tijdschriftartikelen *) is verschenen.
Als gevolg van deze onderzoekingen is de vraag, of de citroen-zuurproductie door Citrom^'ces-soorten op technische schaal zou zijn door te voeren, eenigen tijd in studie geweest in de Fabriques de Produits Chimiques de Thann et de Mulhouse te Thann (Alsace). In 1903 zijn de plannen hiertoe opgegeven, waarvoor WEHMER later als oorzaken heeft aangegeven^): de onmogelijkheid om te komien tot ,,eine befriedigende Lösung der Apparaturfrage" en ,,der dann stark fallende Marktpreis der Saure".
Na zijn aanvankelijke onderzoekingen stelt WEHMER ') later ook
1) D. MULLER, Biochem. Z. 199, 136, 1928; 205, 111, 1929; 213, 211, 1929; 232,
423, 1931; Ergeb. d. Enzymf 5, 259, 1936; K. BERNHAUER, Z . f physiol. Chem. 177, 86, 1928; K. BERNHAUER und H. W O L F F , ibid., 177, 270, 1928; W. FRANKE und F . LORENZ, Ann. 532, 1, 1937.
') C. WEHMER, Sitzungsb. der königl. Preuss. Akad. der Wissensch. zu Berlin 519, 1893.
') C. WEHMER, Beitrage zur Kenntnis einheimischer Pilze. I. Zwei neue Schimmel-pilze als Erreger einer Citronensaure-Garung. Hannover und Leipzig, 1893.
') C. WEHMER, C . r. d. l'Acad. d. Sc. 117, 332, 1893; Buil. Soc. chim. d. Paris (3), 9, 728, 1893; Math, natw. Mitt. Berlin 295, 1893 ref in: Chem. Centralbl. 1893, II, 457; Ber. d. deutsch. botan. Gesellsch. 11, 333, 1893.
' ) C. WEHMER, Chem. Ztg. 57, 313, 1933. •) C. WEHMER, Chem. Ztg. 21, 1022, 1897.
citroenzuurvorming vast bij Penicillium luteum en Mucor piriformis en bij een aantal nieuwe Citromyces-soorten ^). Nadat nog eenige publicaties ") zijn gewijd aan de citroenzuurvorming door
Citro-myces-soorten moet — zooals uit latere verhandelingen blijkt ^) —
W E H M E R reeds in 1914 tot de ontdekking zijn gekomen, dat ook
Aspergillus niger — welke schimmelsoort door W E H M E R eerder werd beschouwd als een uitsluitende oxaalzuurproducent — in staat is citroenzuur te produceeren. Naar aanleiding hiervan werd het onderzoek naar de mogelijkheid o m te komen tot een tech-nische productie nogmaals opgenomen door de Chemische Fabrik Winkel, vorm. Goldenberg, Géromont u n d Co., echter zonder resultaat.
In den loop der jaren is W E H M E R steeds zijn aandacht aan het vraagstuk der citroenzuurvorming door schimmels blijven geven, zooals uit zijn later werk *) en dat van zijn leerlingen ^) blijkt. T o t het jaar 1904 is W E H M E R de eenige onderzoeker, die zich met de citroenzuurvorming door schimmels bezighoudt. In genoemd jaar verschijnen een tweetal verhandelingen van M A Z E en PERRIER *), later gevolgd door een d e r d e ' ) , waarin verslag wordt uitgebracht omtrent de citroenzuurproductie door een viertal, morphologisch niet nader gekarakteriseerde Citromyces-soorten. In tegenstelling tot W E H M E R , die het citroenzuur be-schouwt als een onvolledig oxydatieproduct van de suiker, komen M A Z E en PERRIER tot d e conclusie, dat citroenzuur indirect ontstaat door ontleding van, uit de suiker ontstane, hoogmoleculaire eiwit-stoffen: ,,racide citrique formé par les citromyces est u n produit de désassimilation accidentelle qui prend naissance lorsque les
1) C. WEHMER, Chem. Ztg. 33, 1281, 1909.
') C. WEHMER, Chem. Ztg. 36, 1106, 1912; 37, 37, 1393, 1913.
') Vgl. hiervoor: C. WEHMER, Ber. d. deutsch. chem. Gesellsch. 57, 1659, 1924; Chem. Ztg. 57, 313, 1933.
*) C. WEHMER, Ber. d. deutsch. chem. Gesellsch. 57, 1659, 1924; 58, 2616, 1925;
Centralbl. f Bakt. II, 73, 161, 1928; Ber. d. deutsch. chem. Gesellsch. 62, 2672, 1929; Chem. Ztg. 57, 313, 1933. Voor een uitvoerige beschrijving van het leven en werk van C. WEHMER zij verwezen naar: E. JAHN, Ber. d. deutsch. botan. Gesellsch. 52, (223), 1935 en R. KOCH, Zentralbi. f Bakt. II, 93, 417, 1936.
') H. SuHR, Diss. Hannover 1924; R. SCHREYER, Ber. d. deutsch. chem. Gesellsch. 58, 2647, 1925; H. AMELUNG, Diss. Hannover 1927; Z. f physiol. Chem. 166, 161,1927;
187, 171, 1930; Chem. Ztg. 54, 118, 1930.
•) P. MAZE et A. PERRIER, C . r. d. l'Acad. d. Sc. 139, 311, 1904; Ann. de l'Inst.
Pasteur 18, 553, 1904.
26
milieux de culture épuisés en azote assimilable sont encore riches en aliments ternaires: sucres, glycerine, alcool". D e door genoemde onderzoekers waargenomen vorming van citroenzuur uit glycerine en alcohol vormt één der argumenten voor deze theorie, aangaande het ontstaan van citroenzuur.
Spoedig hierop bevestigen HERZOG en POLOTZKY in een mede-deeling ^), welke een voorloopig karakter draagt, dat citroenzuur-vorming kan worden waargenomen in media met uiteenloopende C-bronnen, waaronder glycerine. In alcoholhoudende media wordt volgens hen geen citroenzuur geproduceerd. Eenige jaren later houdt ook W E H M E R ^) zich met de omzetting van glycerine en alcohol in citroenzuur bezig, waarbij hij tot dezelfde resultaten als HERZOG en POLOTZKY komt.
In het jaar 1908 verschijnt de onder leiding van BUCHNER bewerkte dissertatie van WÜSTENFELD ^), waarin vóór alles aan-dacht wordt besteed aan de vraag, of m e n zich het citroenzuur ontstaan moet denken volgens den door W E H M E R gedachten
directen weg of langs den indirecten door M A Z E en PERRIER aangegeven weg. T o t een definitieve conclusie kon WÜSTENFELD niet komen:,, So wahrscheinlich es also nach diesen Tatsachen erscheint, dass ein Teil der in der Nahrlösung sich ansammelnden Citronensaure auf indirektem Wege entstanden ist, ebenso unannehmbar er-scheint die Ansicht, dass dieser indirekte u n d fast komplizierte W e g der Saurebildung der von den Pilzen einzig u n d allein benützte sein sollte".
Met dit onderzoek wordt eigenlijk de eerste periode der onder-zoekingen, welke zich met het probleem der citroenzuurvorming door Citromjces-soorten bezighouden en waarin men algemeen van meening was, dat citroenzuur uitsluitend wordt gevormd door de genoemde schimmelsoorten, afgesloten. Alleen W E H M E R publi-ceerde nog eenige — reeds boven vermelde — korte mededeelingen, welke evenwel geen nieuwe gezichtspunten opleveren.
D e nu volgende periode wordt ingeleid door de vondst van ZAHORSKI *) in 1913, die aantoonde, dat Sterigmatocystis nigra
') R. O. HERZOG und A. POLOTZKY, Z . f physiol. Chem. 59, 125, 1909. ") C. WEHMER, Chem. Ztg. 37, 37, 1393, 1913.
') H. WÜSTENFELD, Diss. Berlijn 1908; E. BUCHNER und H. WÜSTENFELD, Biochem.
Z. 17, 395, 1909.
(d.i. Aspergillus niger) eveneens tot citroenzuurproductie in staat is. Deze ontdekking blijft jarenlang onopgemerkt. In een in 1916 verschenen verhandeling over citroenzuurvorming, acht M A R T I N ^) toch alleen nog het physiologisch gedrag van de Citromyces-soorten van belang. Aangaande de andere, door hem geïsoleerde schimmelsoorten uit hij zich als volgt: ,,the remaining thirty-one specimens being identified as various species of Penicillium,
Aspergillus and Mucor. T h e fermentative action of these three
genera being well known, they were discarded".
In een uitvoerig onderzoek van een groot aantal, ook morpho-logisch beschreven, stammen van Aspergillus niger op h u n ver-mogen tot oxaalzuurvorming, stelden T H O M en CURRIE ^) vast, dat althans door een zeker aantal dezer stammen naast het gevormde oxaalzuur ook citroenzuur wordt gevormd. In een latere mede-deeling van CURRIE ^) wordt vastgesteld, dat een door hem geselec-teerde stam van Aspergillus niger veel meer citroenzuur produceert dan iedere Citromyces-stam, waarmede hij ooit werkte. Zeer uit-voerig gaat CURRIE in op de voor de citroenzuurproductie optimale samenstelling van het voedingsmedium, terwijl bijzondere aan-dacht wordt besteed aan den invloed van de p H .
Ook ELFVING *) verwerpt reeds in 1918 de gedachte, dat alleen Citromyces-soorten het vermogen tot citroenzuurproductie bezitten. Hij toonde aan, dat ook bij stammen van Aspergillus niger citroen-zuur onder de stofwisselingsproducten optreedt en isoleerde zelfs bepaalde stammen, welke alleen citroenzuur en geen oxaalzuur produceeren. O p advies van ELFVING maken de door Aspergillus
niger teweeggebrachte omzettingen een onderwerp van studie
uit van de door LAPPALAINEN ^) bewerkte dissertatie, waarin als belangrijk gezichtspunt naar voren komt, dat de chemische samenstelling van het gebruikte glaswerk ,,eine in samtliche Lebensprozesse des Pilzes eingreifende RoUe spielt".
1) J. A. MARTIN, Amer. J. of Pharm. 88, 337, 1916.
^) C. T H O M and J. N. CURRIE, J . of Agr. Research 7, 1, 1916. ') J. N. CURRIE, J . biol. Chem. 31, 15, 1917.
*) F. ELFVING, Ofversigt af Finska Vetenskaps-Societetens Förhandlingar Afd. A. 61, No. 15, 1918—1919 ref in: Centralbl. f Bakt. II, 52, 305, 1921 en Physiol. Abstr. 6, 162, 1920—1921.
^) H. LAPPALAINEN, Akademische Abhandlung, Helsingfors, 1919; Ofversigt af Finska Vetenskaps-Societetens Förhandlingar Afd. A. 62, No. 1, 1919—1920.
28
Ongeveer tegelijkertijd als CURRIE en ELFVING ontdekt ook MOLLIARD ^) citroenzuur onder de stofwisselingsproducten van
Sterigmatocystis nigra, welke ontdekking als eerste succes van zijn
in het volgende hoofdstuk nader te bespreken ,,methode des milieux déséquilibrés" kan worden beschouwd. In het later onder-zoek van MOLLIARD ^) is het probleem der citroenzuurvorming door Sterigmatocystis nigra nog herhaaldelijk aan de orde.
In de laatste vijftien jaar treft men in de literatuur een groot aantal publicaties, welke de citroenzuurvorming door schimmel-soorten behandelen, aan. Ik zal mij hier moeten beperken tot een korte vermelding van de verschenen verhandelingen.
In de geheele, genoemde periode heeft BUTKEWITSCH zich met de citroenzuurproductie door schimmelsoorten beziggehouden: aanvankelijk •'') werden alleen d e Citrom3'ces-soorten bestudeerd, later *) eveneens tal van stammen van Aspergillus niger. Het tot 1925 verrichte onderzoek heeft BUTKEWITSCH in een samenvattend artikel *) beschreven. N a 1932 zijn wederom een groot aantal verhandelingen *) verschenen, waarvan de inhoud later nog ten-deele ter sprake zal komen.
Sinds 1926 maakt BERNHAUER ' ) een intensieve studie van het
•) M . MOLLIARD, C . r. d. l'Acad. d. Sc. 168, 360, 1919.
') M . MOLLIARD, C . r. d. 1. Soc. d, Biol. 87, 967, 1922; C. r. d. l'Acad. d. Sc. 178,
41, 1924; C. r, d. 1. Soc. d. Biol. 90, 1395, 1924; C. r. d. l'Acad. d. Sc. 189, 417, 1929;
192, 313, 1931.
') W L . S. BUTKEWITSCH, Biochem. Z. 131, 327, 338, 1922.
*) W L . S . BUTKEWITSCH, Biochem. Z. 136, 224, 1923; 142, 195, 1923; 145, 442, 1924; 154, 177, 1924.
') W L . S. BUTKEWITSCH, Jahrb. f. wissensch. Botanik 64, 637, 1925.
') W L . S . BUTKEWITSCH, Microbiology 1, 1, 1932 ref in: Buil. de l'Inst. Pasteur
33, 311, 1935; W L . S . BUTKEWITSCH and S. A. B/RINOWA, Proc. Inst. Sci. Research
Food Ind. 2, 163, 1932 ref in: Chem. Abstr. 27, 5468, 1933; W L . S. BUTKEWITSCH, E. W . MENZSCHINSKAJA und E. I. TROFIMOVA, Biochem. Z. 272, 290, 364, 1934; W L . S . BUTKEWITSCH, Biochem. Z. 272, 371, 1934; W L . S . BUTKEWITSCH and A . G . TIMOFEEWA, Microbiology 3, 574, 1934; 4, 490, 495, 1935; Biochem. Z. 275, 405, 1935; W L . S . BUTKEWITSCH, E. W . MENZSCHINSKAJA und E. I. TROFIMOVA, Biochem. Z. 276, 446, 1935; W L . S . BUTKEWITSCH et M . S. GAEVSKAYA, Compt. Rend. Acad. Sc. de l'U. R. S. S. 3, 405, 1934 ref in: Chem. Abstr. 30, 1837, 1936; W L . S. BUTKEWITSCH and A. A. MELNIKOVA, Microbiology 5, 259, 1936; S. A. BARINOWA, Zentralbi. f. Bakt. II, 95, 63, 1936; S. A. BARINOWA and W L . S . BUTKEWITSCH, Microbiology 5, 768, 1936; W L . S . BUTKEWITSCH, Compt. Rend. Acad. Sc. de l'U. R. S. S. 4, 427, 1935; W L . S . BUTKEWITSCH et E. I. TROFIMOVA, ibid., 17, 221, 1937 ref resp. in: Chem. Abstr. 31, 1842, 1937; 32, 2559, 1938.
') K. BERNHAUER, Biochem. Z. 172, 296, 324, 1926; 197, 278, 287, 309, 327, 1928; K. BERNHAUER und K. SCHÖN, Biochem. Z . 202,164,1928; K. BERNHAUER, Biochem. Z .
probleem der citroenzuurvorming; van Russische zijde trekken naast het reeds genoemde werk van BUTKEWITSCH de publicaties van KOSTYTSCHEW ^) en leerlingen de aandacht. I n later jaren is het vraagstuk eveneens bestudeerd door IWANOFF en zijn staf van medewerkers ^) aan het ,,Mikrobiologisches Laboratorium des wissenschaftlichen Forschungsinstituts für Nahrungsmittelkunde" te Leningrad. I n Engeland werd het onderhavige probleem bestu-deerd door CHALLENGER, W A L K E R en medewerkers ^); de Poolsche
205, 240, 1929; K. BERNHAUER, H . SIEBENAUGER und H . TSCHINKEL, Biochem. Z. 230, 466, 1931; K. BERNHAUER, F . DUDA und H . SIEBENAUGER, Biochem. Z. 230, 475, 1931; K. BERNHAUER und H. SIEBENAUGER, Biochem. Z. 240, 232, 1931; K. BERNHAUER und Z. SCHEUER, Biochem. Z. 253, 11, 1932; K. BERNHAUER und N . BÖCKL, Biochem. Z. 253, 16, 25, 1932; K. BERNHAUER und H . T H E L E N , Biochem. Z. 253, 30, 1932; K. BERN-HAUER, N . BÖCKL und H. SIEBENAUGER, Biochem. Z. 253, 37, 1932; K. BERNHAUER und F . SLANINA, Biochem. Z. 274, 97, 1934; K. BERNHAUER und H . IGLAUER, Biochem. Z.
286, 45, 1936; 287, 153, 1936.
' ) S. KOSTYTSCHEW und W . TSCHESNOKOW, Planta 4, 181, 1927; S. KOSTYTSCHEW, Proc. Inst. Sci. Research Food Ind. 2, 70, 1932 ref in: Chem. Abstr. 27, 5141, 1933; S. KOSTYTSCHEW and V. BERG, Bulletin of the State Institute of Agricultural Microbio-logy 5, 8, 1933; V. BERG, ibid., 5, 28, 1933.
') N . N . IWANOFF, Proc. Inst. Sci. Research Food Ind. 3, No. 1, 3, 1935; 3, No. 4, 5, 1936; M. A. DRBOGLAV and M. A. FRANTZUZOVA, ibid., 3, No. 1, 143, 1935; M. A. DRBOGLAV and S. A. DEVYASHINA, ibid., 3, No. 1, 131, 1935; M. A. GUDLET, ibid., 3, N O . 1, 45, 1935; 3, No. 4, 65, 157, 1936; M. A. GUDLET, V. A. KIRSANOWA and V. V. MAKAROWA, ibid., 3, No. 4, 85, 1936; E. KARDO-SYSSOJEVA, ibid., 3, No. 1, 25,1935; 3, No. 4, 96, 1936; Zentralbi. f Bakt. I I , 93, 264, 1936; E. KRESLING, Proc. Inst. Sci. Research Food Ind. 3, No. 4, 49, 130, 1936; E. KKESLING and E. STERN, ibid., 3, No. 1, 5, 1935; Zentralbi. f Bakt. II, 95, 327, 1936; L. K. OSNITZKAYA, Proc. Inst. Sci. Research Food Ind. 3, No. 4, 31, 1936; T . PALEY, ibid., 3, No. 1, 70, 94, 1935; Archiv f Mikrob. 7, 206, 1936; T . PALEY and A. G. OSUICHEVA, Proc. Inst. Sci. Research Food Ind. 3, No. 4, 146, 1936; T . PALEY and M . A. FRANTZUZOVA, ibid., 3, No. 4, 7, 1936; O . P. PROTOD'YAKONOW, Bulletin of the State Institute of Agricultural Microbiology 5, 231, 1933; O . P. PROTOD'YAKONOW and E. KRESLING, Proc. Inst. Sci. Research Food Ind. 3, N o . 1, 101, 1935; L. N . RUBEL and E. KARDO-SYSSOJEVA, ibid., 3, No. 4, 116, 1936; E. SOTNIKOW, Compt. Rend. Acad. Sc, de l'U. R. S. S. 3, 273, 279, 544, 1934 — ref in: Zentralbi. f Bakt. II, 92, 290, 1935 —; E. SOTNIKOW and T . PALEY, ibid., 4, 139, 1935 — ref in: Chem. Abstr. 29, 3364, 1935 —. Voor de publicaties in Proc. Inst. Sci. Research Food Ind. zie: Chem. Abstr. 30, 5256 en vlg., 1936. Vgl. ook: N . N . IWANOFF and E. S. ZWETKOFF, Ann. Rev. of Biochem. 5, 585, 1936.
' ) F . CHALLENGER, V. SUBRAMANIAM and T . K. WALKER, Journ. Chem. Soc. 200, 1927; T . K. WALKER, V. SUBRAMANIAM and F . CHALLENGER, Journ. Chem. Soc. 3044, 1927; F . CHALLENGER, V. SUBRAMANIAM and T . K. WALKER, Nature 119, 674, 1927; F . CHALLENGER, L . KLEIN, V. SUBRAMANIAM and T . K. WALKER, Nature 121, 244, 1928; A. J. SUTHERS and T . K. WALKER, Biochem. J. 26, 317, 1932; E. M. JOHNSON, Thesis, Manchester University 1934; T . K. WALKER, J . Soc. Chem. Ind. 55, 61 T , 1936; E. M . JOHNSON, E. C. KNIGHT and T . K. WALKER, Biochem. J. 31, 903, 1937.
30
onderzoeker CHRZASZCZ ^) en zijn school hebben er voorts eengroot aantal studies aan gewijd.
Verder zij de aandacht gevestigd op het werk van SHAPOSHNIKOV en MANTEUFEL '), van FALCK — in 1924 met VAN BEIJMA THOE KINGMA ^) in 1933 m e t SCHOELLER en M I C H A E L *) — van KUSNET-zow ^), P R O W E D I *), FILOSOFOV ' ) , TAMIYA en H I D A *), VAN BEIJMA THOE KINGMA ' ) , SCHOBER ^"), VIRTANEN en PULKKI ^^), SAKAGUCHI ^^), SUMIKI ^*), FREY en medewerkers " ) , PORGES '^),
•) T . CHRZASZCZ und D . TIUKOW, Biochem. Z. 204, 106, 1928; 207, 39, 1929; 218, 73, 1930; 222, 243, 1930; 229, 343, 1930; 242, 137, 1931; D . TIUKOW, Zentralbi. f Bakt, II, 83, 385, 1931; T . CHRZASZCZ, D . TIUKOW und M. ZAKOMORNY, Biochem. Z. 250, 254, 1932; T . CHRZASZCZ und M. ZAKOMORNY, Polish Agr. Forestal Ann 33, 180, 1934 ref in: Chem. Abstr. 29, 1133, 1935; T . CHRZASZCZ und E. PEYROS, Biochem. Z. 280, 325, 1935; T . CHRZASZCZ und M. ZAKOMORNY, Biochem. Z. 285, 340, 348, 1936; T . CHRZASZCZ and K. LEONHARD, Biochem. J. 30, 1947, 1936; T . CHRZASZCZ und R. ScHiLLAK, Biochem. Z. 288, 359, 1936; T . CHRZASZCZ und M . ZAKOMORNY, Biochem. Z.
291, 312, 1937.
^) V. SHAPOSHNIKOV and A. YA. MANTEUFEL, Trans. Sci. Chem.-Pharm. Inst. 5, 3, 25, 57, 1923 ref in: Chem. Abstr. 21, 3922, 1927.
' ) R. FALCK und F . H . VAN BEYMA THOE KINGMA, Ber. d. deutsch. chem. Gesellsch. 57, 915, 1924.
') R. FALCK, W . SCHOELLER und S. MICHAEL, Biochem. Z. 262, 280, 1933;
S. MICHAEL, Biochem. Z. 274, 397, 1934.
') S. J. KuSNETZOW, Biochem. Z. 157, 339, 1925; Zentralbi. f Bakt. II, 83, 37, 1931; Microbiology 1, 30, 1932 ref in: Buil. de l'Inst. Pasteur 33, 311, 1935.
•) F . PROWEDI, Rivista di Biol. An. 8, 16, 1926 ref in: Centralbl. f Bakt. II, 70, 461, 1927.
') M . S. FILOSOFOV, Nauchnuie Zapiski 4, 215, 1927 ref in: Chem. Abstr. 21,
3418, 1927; M . S. FILOSOFOV and V. E. MALINOVSKII, Nauchnuie Zapiski 5, 235, 1928
ref in: Chem. Abstr. 22, 1433, 1928.
») H . TAMIYA und T . HIDA, Acta Phytochimica 4, 343, 1928—1929. ») F . H . VAN BEYMA THOE KINGMA, Phytopathol. Z. 1, 453, 1929. ^°) R. SCHOBER, Jahrb. f. wissensch. Botanik 72, 1, 1930.
'^) A. I. VIRTANEN and L. PULKKI, Annales Academiae Scientiarum Fennicae, Serie A, 33, Nr. 3, 1930.
^^) K. SAKAGUCHI and K. NAKAO, J . Soc. Brew. Japan 25, 21, 1930; K. SAKAGUCHI, J. Agr. Chem. Soc. Japan 6, 317, 1930; 7, 748, 1931; 8, 172, 265, 489, 1932 ref in: Chem. Abstr. 26, 5322, 1932; 27, 1379, 1380, 1933.
" ) Y. SUMIKI, J . Agr. Chem. Soc. Japan 6, 23, 1930 ref in: Chem. Abstr. 24, 3812, 1930.
" ) A. FREY, Zeitschr. f angew. Chemie 44, 16, 1931; Archiv f Mikrob. 2, 272,
1931; 3, 158, 1932; A. FREY und H . POSCHENRIEDER, Archiv f Mikrob. 3, 409, 1932;
W . BRAUN und A. FREY, Biochem. Z. 285, 219, 1936.
GiORDANi ^), ANGELETTI ^), CORBELLINI ^), SACCHETTI en E M I LIANI *), ITTO ^), HARDTL *), HOROWITZWLASSOWA en N O R O -TELNOW ' ) , L u z *), DOELGER en PRESCOTT *), SCHWARTZ en L A N G " ) , ZUBKOVA-GITLER en ZATZ " ) , Q U I L I C O en medewerkers ^*),
C A H N " ) , BONNET en JACQUOT " ) , WASSILJEW ^^), BOLCATO " ) , W E L L S , M O Y E R en M A Y i'), KIRSANOWA ^*), O W E N " ) , NAKAZAWA ^ ) , BAETSLÉ ^^), C H E F T E L - R E D E L ^^) en van T O M L I N S O N ^^), die allen
*) M . GioRDANi, Angew. Chemie 45,. 666, 1932; 47, 371, 1934; Chimica e Industria 17, 77, 1935 ref in: Ann. d. Ferment. 1, 120, 1935 en Chem. Abstr. 29, 5217, 1935.
') A. ANGELETTI e D . PONTE, Ann. chim. applicata 23, 315, 1933; A. ANGELETTI,
Atti accad. sci. Torino, Classe sci. fis. mat. nat. 67, 272, 1932; Ann. Schiapparelli 7, 72, 1933 ref in: Chem. Abstr. 27, 5370, 5774, 1933; 28, 2840, 1934.
*) A. CORBELLINI e O. CANONICI, Giom. chim. ind. applicata 14, 355, 1932 ref. in: Chem. Abstr. 27, 2247, 1933.
*) M . SACCHETTI e E. EMILIANI, L'Industria Saccarifera Italiana 25, No. 2, 1933. ') Y. ITTO, J . Agr. Chem. Soc. Japan 9, 552, 1933 ref in: Chem. Abstr. 27, 5141, 1933.
•) H . HARDTL, Biochem. Z. 267, 6, 1933; 268, 104, 1934.
') L. M. HOROWITZ-WLASSOWA und N . W . NOROTELNOW, Zentralbi. f Bakt. II, 91, 468, 1934—1935.
«) G. Luz, Annales Mycologici 32, 67, 1934.
») W . P. DOELGER and S. C. PRESCOTT, Ind. and Eng. Chem. 26, 1142, 1934.
" ) W . SCHWARTZ und H . LANG, Archiv f Mikrob. 5, 387, 1934.
" ) S. R. ZUBKOVA-GITLER and R. M . ZATZ vgl.: Chem. Abstr. 28, 7512, 1934; 29, 3103, 1935.
" ) A. QUILICO e A. D i CAPUA, Giorn. chim. ind. applicata 14, 289, 1932 ref in: Chem. Abstr. 26, 5987, 1932; Ann. chim. applicata 24, 355, 1934 ref in: Biol. Abstr. 11, 1240, 1937; A. QUILICO e L. PANIZZI, Chimica e Industria 19, 629, 1937 ref in: Chem. Abstr. 32, 2281, 1938.
" ) F . J. CAHN, Ind. and Eng. Chem. 27, 201, 1935.
" ) R. BONNET et R. JACQUOT, C . r. d. l'Acad. d. Sc. 200, 1968, 1935; 201, 1213,
1935.
" ) G. M. WASSILJEW, Biochem. Z. 278, 226, 1935; Archiv f Mikrob. 6, 250, 1935. " ) V. BOLCATO, Giorn. chim. ind. applicata 16, 552, 1932; L'Industria Saccarifera Italiana 28, 12, 454, 1935; Ann. chim. applicata 25, 423, 515, 1935 ref in: Chem. Abstr. 29, 2198, 1935; 30, 745, 1835, 3461, 1936.
" ) P. A. WELLS, A . J . MOYER and O. E. MAY, Journ. Amer. Chem. Soc. 58, 555, 1936.
" ) V. A. KIRSANOWA, Biokhimiya 1, 425, 1936 ref in: Chem. Abstr. 31, 3090, 1937.
" ) W M . OWEN, Facts about sugar 31, 298, 1936 ref in: Chem. Abstr. 30, 7902, 1936.
«») R. NAKAZAWA, Y . TAKEDA and M. NAKANO, J. Agr. Chem. Soc. Japan 13,52,1937 ref in: Chem. Abstr. 31, 2736, 1937.
" ) R. BAETSLÉ, Natuurwetenschappelijk Tijdschrift 19, 5, 1937.
"*) R. I. CHEFTEL-REDEL, Contribution a 1'Étude de la Fermentation citrique. Alen-9on 1937.
32
in een of meer publicaties aandacht aan het probleem der citroenzuurvorming door schimmels hebben besteed.
Voorts zij gewezen op de zeer uitgebreide patentliteratuur ' ) , waaruit afdoende blijkt, dat in vrijwel alle landen de technische citroenzuurfabricatie groote belangstelling geniet.
§ 4. O V E R Z I C H T DER VROEGERE O N D E R Z O E K I N G E N , W E L K E BE-O BE-O G E N E E N I N Z I C H T T E VERSCHAFFEN I N H E T C H E M I S M E D E R C I T R O E N Z U U R V O R M I N G .
Terwijl in de voorafgaande paragraaf de literatuur over de vor-ming van citroenzuur door schimmels min of meer in vogelvlucht is overzien, zal hieronder een kort overzicht worden gegeven van de voorstellingen, welke in den loop der tijden betreffende het chemisme van de vorming van het citroenzuur zijn ontwikkeld.
Wij zagen reeds, dat M A Z E en PERRIER de citroenzuurvorming eng verbonden achtten met den opbouw en de afbraak van assimila-tieproducten. Deze voorstelling steunde vóór alles op de waar-neming, dat schimmelsoorten ook ten koste van andere
C-ver-1) I. BAKONYI, Hong. P. 117.222 (1937); K. BERNHAUER, Fr. P. 707.614 (1930); D. R. P. 587.819 (1933); B. BLEYER, D . R . P . 434.729 (1926); F . J. CAHN, Fr. P. 675.236 en 675.237 (1929); Can. P. 306.081 (1930); E. P. 345.368 (1930); Can. P. 310.133 (1931); Am. P. 1.809.797 en 1.812.136 (1931); Am. P. 2.047.669 (1936);
CHAUNCEY CHEMICAL CORP., Fr. P. 819.279 (1937); R. FALCK, D . R . P. 473.727
(1924); D . R. P. 426.926 (1926); A. FERNBACH et J. L. YUILL, Fr. P. 610.121 en 610.122 (1926); A. FERNBACH, J. L. YUILL and ROWNTREE AND Co., L T D . , E. P. 266.414 en 266.415 (1925); Am. P. 1.691.965 en 1.691.966 (1928); A. FERN-BACH, J. L. YUILL, B . G . M C L E L L A N und ROWNTREE AND C O . , L T D . , D . R . P. 551.930 en 558.436 (1925); M. S. FILOSOFOV, RUSS. P. 17.805 (1927); Russ. P. 19.622 (1931); A. FREY, D . R . P. 567.071 (1930); H. HAEHN, D . R . P. 544.589 (1927); F. KANHAUSER, Am. P. 1.799.001 (1930); W . KLAPPROTH, D . R . P. 619.977 (1935); S. P. KOSTYTSCHEW, RUSS. P. 16.661 (1930); C. H . LILLY, Am. P. 1.936.983 (1934); MONTAN- UND INDUSTRIALWERKE VORMALS JOH. DAY. STARCK, Prag, Am. P. 1.679.186 (1926); E. P. 302.338 (1927); Fr. P. 650.072 (1928); D. R. P. 461.356 (1928); D . R. P. 578.820 (1933); J. NUSSBAUM, Fr. P. 801.273 (1936); A. M. PEAKE and T H E DISTILLERS COMPANY LTD., E . P. 287.604 (1926); Am. P. 1.788.739 (1931); O. P. PROTOD'YAKONOW, RUSS. P. 38.129 (1934); SCHERING-KAHLBAUM A. G., D . R. P. 541.545 (1927); E. I. SOTNIKOW, Russ. P. 43.649 (1935); J. Szücs, Oostr. P. 101.009 (1925); Can. P. 251.180 (1925); Am. P. 1.679.186 (1928); D. R. P. 461.356 (1928); C. WEHMER, E . P. 5.620 (1893); Fr.P. 228.554 (1893); D. R. P. 72.957 (1894); Am. P. 515.033 (1894); D. R. P. 91.891 (1897); B. ZAHORSKI, Am. P. 1.066.358 (1913); J. ZENDER, Am. P. 2.072.919 (1936); Fr. P. 803.630 (1936); E. P. 462.350 (1937); voor de beschrijving van een gedeelte dezer patenten vgl.: Chemical Abstracts en Zentralbi. f. Bakt. II, 80 t / m 90 en A.
bindingen als glucose, citroenzuur als stofwisselingsproduct af-scheiden. Nadat echter was vastgesteld, dat de omzetting van glucose in citroenzuur tot een hoog rendement (50—60%) kan plaats vinden, verhieven zich weer meer stemmen ten gunste van de aanvankelijk door W E H M E R geuite zienswijze, dat het citroenzuur een product van een onvolledige oxydatie van het substraat is. Hieraan dient evenwel direct te worden toegevoegd, dat de op-vatting van M A Z E en PERRIER, in den een of anderen gewijzigden vorm, steeds weer in de literatuur boven komt. In dit verband moet de aandacht worden gevestigd op de denkbeelden van KOSTYTSCHEW ^), terwijl uit den lateren tijd het werk van SCHOBER (I.e.) en dat van Luz (I.e.) kan worden genoemd.
Stelt men zich op het standpunt, dat de omzetting van suiker in citroenzuur moet worden beschouwd als een onvolledige oxydatie van de suiker door de schimmels, dan zijn er nog een aantal prin-cipieel verschillende wegen, volgens welke men zich het citroen-zuur uit de suiker ontstaan kan denken, mogelijk. O m het overzicht te vergemakkelijken zijn hieronder de in de literatuur naar voren gebrachte hypothesen op grond van de daaraan ten grondslag liggende gedachten in een aantal groepen onderverdeeld.
I. M e n kan zich voorstellen, dat de suiker in eerste instantie volgens den uit het schema der alcoholische gisting bekenden afbraakweg wordt gesplitst in brokstukken, welke daarna weer met de medewerking der zuurstof op de een of andere wijze aan elkaar worden gekoppeld. O p deze manier komt men gemakkelijk tot een verbinding met een vertakte C-keten en schakelt op een suggestieve wijze de verbindingen met minder dan 6 C-atomen, waaruit citroenzuurproductie is waargenomen, in het reactie-schema in. Zoo veronderstelde VON EULER ^) reeds in 1909, dat citroenzuur ontstaat door koppeling van 3 mol. aceetaldehyd, welke uit de glucose zouden zijn gevormd:
•) S. KOSTYTSCHEW, Pflanzenatmung. Berlin, 1924, p. 139—140; Lehrbuch der Pflanzenphysiologie. Berlin, 1926, Band I, p. 411 en vlg.; S. KOSTYTSCHEW u n d W .
TSCHESNOKOW, Planta 4, 181, 1927.
*) H. VON EULER, Grundlagen und Ergebnisse der Pflanzenchemie. Braunschweig, 1909, Band III, p. 182.
34
H C H ^ C H O
CH2. C O O H
OCHCH3 + 6 0 ^ C O H . C O O H + 2 H^O
HCH2CHO CHa. C O O H
Door BERNHAUER en SCHÖN (I.e.) is er later de aandacht op ge-vestigd, dat men zich analoog een condensatie van 3 mol. pyro-druivenzuur of van 3 mol. methylglyoxaal kan voorstellen.
I n een meer algemeene belangstelling ^) mogen zich in de latere jaren de inzichten van CHRZASZCZ en van BERNHAUER verheugen. O p grond van de feiten, dat in schimmelcultures het ontstaan van aceetaldehyd is aangetoond door afvangen met natriumsulfiet of met dimedon ^) en dat verschillende schimmelsoorten in staat zijn onder anaërobe voorwaarden alcohol te produceeren, achten
CHRZASZCZ en T I U K O W ^) het waarschijnlijk, dat de suiker na phos-phoryleering overgaat in methylglyoxaal, dat vervolgens over pyrodruivenzuur *) en aceetaldehyd wordt omgezet in aethyl-alcohol. Hierop sluiten zich volgens de genoemde onderzoekers de processen aan, waarbij de zuurstof medewerkt. Zij denken zich het reactieschema dezer ,,tweede" phase dan als volgt: uitaethyl-alcohol ontstaat azijnzuur door oxydatie, hieruit barnsteenzuur door dehydrogenatie van 2 mol. azijnzuur, vervolgens fumaarzuur door dehydrogenatie van barnsteenzuur, voorts 1.appelzuur door hydratatie van fumaarzuur en ten slotte citroenzuur uit 1 mol. azijnzuur en 1 mol. appelzuur door dehydrogenatie,
Dit reactieschema achten CHRZASZCZ en T I U K O W bewezen op grond van uiteenloopende observaties, waarvan de belangrijkste hieronder zijn vermeld:
a. door eigen waarnemingen meenen zij te hebben aangetoond, dat zgn. ,,fertige Pilzdecken" (vergelijk Hoofdstuk I I ) van een
^) N . N . IWANOFF and E. S. ZWETKOFF, Ann. Rev. of Biochem. 2, 251, 1933; C. NEUBERG und E. SIMON, Erg. der Enzymf 2, 133, 1933.
^) C. NEUBERG und C. COHEN, Biochem. Z. 122, 204,1921; T . NAGAYAMA, Biochem.
Z. 116, 303, 1921; K. BERNHAUER und K. SCHÖN, Biochem. Z. 202, 164, 1928.
") T . CHRZASZCZ und D . TIUKOW, Biochem. Z. 229, 343, 1930.
*) Onder bepaalde voorwaarden heeft HIDA met behulp van ,,fertigen Pilzdecken" van Aspergillus niger pyrodruivenzuurvorming waargenomen. Vgl.: T . HIDA, T h e Journal of the Shanghai Science Institute, Section IV, 1, 201, 1935.
PenictlHum-soort in staat zijn uit acetaten kleine hoeveelheden barnsteenzuur, fumaarzuur, oxaalzuur, 1.appelzuur en citroen-zuur t e vormen;
b. volgens onderzoekingen van BUTKEWITSCH en FEDOROFF ^) is Rhizopus nigricans in staat barnsteenzuur, fumaarzuur en oxaal-zuur uit azijnoxaal-zuur te produceeren;
c. STENT, SUBRAMANIAM en W A L K E R *) hebben vorming van 1.appelzuur door Aspergillus niger uit Ca-succinaat waar-genomen;
d. volgens CHALLENGER en K L E I N *) is Aspergillus niger in staat appelzuur uit fumaarzuur te vormen.
D e onder a vermelde waarneming van CHRZASZCZ en T I U K O W werd in 1931 aangevuld door een onderzoek van BERNHAUER en SIEBENAUGER (I.e.), die eveneens met behulp van de ,,Methode der fertigen Pilzdecken" meenen te hebben aangetoond, dat een groot aantal Aspergillus niger-stammen geringe hoeveelheden citroen-zuur vormen in media, waarin als eenige C-bron acetaten voor-komen, terwijl zij tevens aangeven, dat ook uit de Ca-zouten van fumaarzuur, appelzuur en glycolzuur kleine hoeveelheden citroen-zuur kunnen worden gevormd.
O p grond van de genoemde onderzoekingen is n u azijnzuur het centrale doorgangsproduct voor de citroenzuurvorming ge-worden. Hieruit zouden d a n allereerst door een serie dehydro-genatie-reacties achtereenvolgens barnsteenzuur, fumaarzuur en appelzuur worden gevormd. Citroenzuur zou n u aldus kunnen ontstaan:
a. uit appelzuur en azijnzuur volgens CHRZASZCZ en T I U K O W ; b. uit barnsteenzuur en azijnzuur over tricarballylzuur als tusschenproduct;
c. uit fumaarzuur en azijnzuur over aconietzuur als tusschen-product (vgl. over de omzetting van aconietzuur in citroenzuur BERNHAUER en BÖCKL (I.e.));
») W L . S. BUTKEWITSCH und M. W . FEDOROFF, Biochem. Z. 206,440,1929; 207, 302,
1929; 219, 87, 103, 1930; M . W . FEDOROFF, Microbiology 1, 378, 1932 ref in: Bull.de l'Inst. Pasteur 33, 318, 1935.
' ) H . B. STEMT, V. SUBRAMANIAM and T . K. WALKER, Journ. Chem. Soc. 1897, 2485. 1929.
36
d. door condensatie van 1 mol. glycolzuur — door oxydatie van azijnzuur ontstaan ^) — met 1 mol. appelzuur ^);
e. uit azijnzuur over glycolzuur, gevolgd door condensatie van 3 mol. glycolzuur, waarbij appelzuur als tusschenproduct o p -treedt.
W a t hier ook van zij, vast staat, dat in latere jaren aan het azijn-zuur een groote plaats is ingeruimd bij de verklaring van het reactieschema der citroenzuurvorming uit suiker. M e n achtte het te meer waarschijnlijk, dat azijnzuur de moederstof van het citroenzuur is, toen BERNHAUER en SIEBENAUGER (I.e.) in h u n reeds geciteerde publicatie de aandacht vestigden op de citroenzuur-vorming door Aspergillus niger in media, waarin als eenige C-bron alcohol voorkwam. Ongeveer tegelijkertijd constateerden CHRZASZCZ, T I U K O W en ZAKOMORNY (I.e.) citroenzuurproductie — met vorming van azijnzuur, fumaarzuur en appelzuur — door een Pemci/üum-soort uit alcohol, terwijl BERNHAUER en BÖCKL (I.e.) in een nader onderzoek vaststelden, dat een groot aantal Aspergillus niger-stammen het vermogen bezitten citroenzuur uit alcohol te vormen. Indien nu nog wordt vermeld, dat BERNHAUER en T H E L E N (I.e.) konden aantoonen, dat Aspergillus niger-cultures aceetal-dehyd produceeren — door een wijziging in de methodiek (vgl. BERNHAUER en SCHÖN (I.e.)) kon het rendement van 1,2% tot 6 0 % der theorie worden opgevoerd, waardoor de citroenzuurvorming ge-heel werd stopgezet — dan is het begrijpelijk, dat BERNHAUER zich in 1932 als volgt uitliet: ,,Unsere jetzigen Ergebnisse über die Alde-hydabfangung sowie die Ergebnisse über die Umwandlung von Alkohol sowie Essigsaure in Citronensaure sowie andere Sauren berechtigen immer mehr zur Annahme, dasz auch hei der
Saure-bildung durch Pilze aus Zucker der Weg über die durch das Neuberg-sche AbbauNeuberg-schema gekennzeichneten Stuf en führen durf te".
O p deze zienswijze is echter ook weer ernstige critiek uitge-oefend. BUTKEWITSCH, MENZSCHINSKAJA en TROFIMOVA (I.e.) hebben in een aantal publicaties aan de argumenten voor de theorie, dat
^) Vgl.: F. CHALLENGER, V. SUBRAMANIAM and T . K.WALKER, Journ. Chem. Soc. 200, 3044, 1927 en de latere onderzoekingen van K. BERNHAUER und Z. SCHEUER, Biochem. Z. 253, 11, 1932 over de vorming van glycol- en glyoxylzuur uit acetaten.
'') Vgl.: E. BAUR, Naturwissenschaften 1, 474, 1913; Ber. d. deutsch. chem.
citroenzuur uit suiker ontstaat over de tusschentrappen aceetal-dehyd, aethylalcohol en azijnzuur, alle kracht ontnomen. Allereerst hebben de genoemde onderzoekers er de aandacht op gevestigd, dat BERNHAUER en T H E L E N (I.e.) juist met die stammen van
Asper-gillus niger, welke een geprononceerd vermogen tot
citroenzuur-vorming uit suiker bezitten, in het geheel geen of slechts betrekke-lijk geringe hoeveelheden aceetaldehyd verkregen en omgekeerd, zoodat er totaal geen evenredigheid, en in de meeste gevallen zelfs een omgekeerde verhouding, bestaat tusschen het aceetaldehyd- en het citroenzuurvormend vermogen der onderzochte stammen.
Voorts is zoowel door BUTKEWITSCH en MELNIKOVA (I.e.) als door JOHNSON, K N I G H T en WALKER (I.e.) aangetoond, dat de citroen-zuurvorming door Aspergillus niger niet wordt geremd door toe-voeging aan het medium van zoodanige concentraties van mono-joodazijnzuur, welke de alcoholische vergisting door dit organisme geheel stopzetten.
In een zeer recent onderzoek is voorts door TOMLINSON (I.e.) bewezen, dat er voor een twaalftal verschillende Aspergillus- en PeniciZ/ium-soorten geenerlei correlatie bestond tusschen het ci-troenzuurvormend en het zymatisch vermogen dier schimmels. Ook dit resultaat spreekt zeker niet ten gunste van de voorstelling, dat citroenzuur uit producten der anaërobe suikerstofwisseling wordt opgebouwd.
Ook zijn ernstige bezwaren aangevoerd tegen de methode, vol-gens welke eenerzijds CHRZASZCZ, anderzijds BERNHAUER citroen-zuurvorming door schimmels uit alcohol en acetaten meenen te hebben aangetoond. Door KLUYVER en PERQUIN ^) is in 1933 ernstige critiek uitgeoefend op deze zoogenaamde ,,Methode der fertigen Pilzdecken", een critiek, waarop in het volgende hoofdstuk uit-voerig zal worden teruggekomen.
Blijkbaar onafhankelijk hiervan laten BUTKEWITSCH en mede-werkers ongeveer een jaar later zich als volgt uit over de door CHRZASZCZ en BERNHAUER gedane proefnemingen, welke de citroenzuurproductie uit alcohol en acetaten zouden bewijzen: ,,Die betreffenden Versuche sind aber weder für das neue Schema der Citronensaurebildung, noch für eine Entstehung der Citronen-saure aus EssigCitronen-saure und Athylalkohol überzeugend. Alle diese
38
Versuche wurden ohne entsprechende Kontrolle der Pilzdecken u n d ohne Prüfung ihrer Gewichtsverluste wahrend der Versuche ausgeführt, und bei den kleinen Mengen, in denen sich Citronen-saure bei den Versuchen nachweisen liess, wurde die Möglichkeit nicht ausgeschlossen, dasz nicht die Stoffe der Versuchslösungen, sondern die der Pilzdecken als Material zur Bildung der Citronen-saure dienen konnten. Diese Möglichkeit ware nur dann ausge-schlossen, wenn festgestellt ware, dasz die Menge der sich wahrend das Versuchs anhaufenden Citronensaure den Gewichtsverlust der Pilzdecke übersteigt. Eine derartige Kontrolle fehlte in diesen Versuchen u n d die Quelle der nachgewiesenen Citronensaure bleibt also unsicher". D e genoemde auteurs schrijven dan verder: ,,In der gleichen Hinsicht scheinen uns auch andere ahnliche Versuche bedenklich, denn es ist nicht immer klar, ob die gebil-deten Stoffe nicht einfach aus der Pilzdecke stammen u n d demnach nicht aus der Versuchslösung gebildet worden sind". Wij zullen zien, dat deze uitspraak zich nauw aansluit bij de reeds ge-citeerde, in 1933 gepubliceerde meening.
Intusschen is het de verdienste van BUTKEWITSCH en mede-werkers in proefnemingen, welke tenvoUe analoog zijn aan die van CHRZASZCZ en BERNHAUER, experimenteel aannemelijk te hebben gemaakt, dat het geproduceerde citroenzuur niet wordt gevormd uit het in de media aanwezige acetaat, maar uit stoffen, welke voorkomen in de voor de proefnemingen gebruikte schimmel-dekken en welke bij afbraak glucose en fructose leveren. Deze stoffen, welke (berekend als glucose) 20-40% van het gewicht der gebruikte schimmeldekken uitmaken, gaan in oplossing, waar-mede een totale gewichtsvermindering der dekken tot 5 0 % ge-paard gaat. D e invloed van het acetaat zou zijn terug te voeren tot een beschuttende werking op het citroenzuur, dat uit de in oplossing gegane, pEHLiNG-oplossing reduceerende stoffen is ontstaan.
Deze door BUTKEWITSCH en medewerkers naar voren gebrachte feiten, worden nu geensdeels weerlegd door de resultaten der door CHRZASZCZ en ZAKOMORNY ^) verrichte proefnemingen,
aan-gaande de omzetting van Ca-acetaat, appelzuur en Na-malaat in citroenzuur met behulp van bepaalde hoeveelheden
