Aktywność peptydaz w surowicy psów zdrowych i zatrutych CCl4

(1)

WIADOMOŚCI PARAZYTOLOGICZNE T. VII, NR 2, 1961

AKTYWNOSC PEPTYDAZ W SUROWICY PSOW ZDROWYCH I ZATRUTYCH CC1₄

ALEKSANDRA MALINOWSKA, ZENON TOMICKI

Zakład Chemii Fizjologicznej Wydz. Wet.

Klinika Chorób Wewnętrznych Wydz. Wet., Warszawa

W praktyce weterynaryjnej CCl-1 jest stosowany do odrobaczania

zwierząt. Srodek ten jest jednak nie tylko zabójczy dla pasożytów,

ale również cechuje się silnym działaniem toksycznym dla organizmu zywiciela. Zdarzające się niekiedy zatrucia zależą od ilości zastosowa- nego leku, jak również od ogólnego stanu zdrowia i kondycji zwierzę

cia. Przekroczenie dawki leczniczej tego środka powoduje powstanie

ciężkich uszkodzeń w narządach miąższowych, zwłaszcza w wątrobie,

nerkach i w mięśniu sercowym. Uszkodzenie miąższu wątroby wywołuje poważne zaburzenia, polegające przede wszystkim na rozchwianiu sto- sunków ilościowych w obrębie białek. To ostatnie zjawisko może mieć wpływ na aktywność enzymów proteolitycznych m. in. peptydaz. Pra- ca niniejsza jest właśnie próbą oznaczania aktywności peptydaz w surowicy psów po zatruciu CCl,, próbą ustalenia ewentualnej zależności.

Jak wiadomo, czynność hydrolityczna peptydaz została stwierdzona w tkankach i płynach ustrojowych różnych gatunków zwierząt. Po- szczególne enzymy tej grupy były utożsamiane na podstawie substra-- tów, które ulegały rozkładowi pod ich wpływem. Udoskonalanie metod syntezy i oczyszczania substratów oraz ilościowego oznaczania rozszcze- pionych peptydów doprowadziło do wyodrębnienia całego szeregu pep-·

tydaz i pozwoliło wyjaśnić mechanizm ich działania. Dalsze badania

wykazały zmiany natężenia ich aktywności, zależne od różnych czyn- ników, np. od wprowadzanych jonów Co, Mn, Zn [3]; aktywność zmie-

niała się również po wstrzyknięciu hormonów kory nadnercza [5], oraz w zależności od stanów czynnościowych narządów.

Już w 1914 r. Pfeiffer [9], a następnie Zamecnik [14] w doświad

czeniach przeprowadzanych na królikach stwierdzili, że po oparzeniach

występuje wzrost aktywności dwupeptydaz w moczu i limfie. Barber [2]

wykazał hyperpeptydazemię przy złamaniach kości, w procesach za-

(2)

122 ^A. ^MALI^N^OWSKA, ^Z.^TOMICKI

palnych stanach gorączkowych. W 1936 r. Steinbruck [11] wykazał

wzrost zawartości peptydaz w surowicy w ostrych i podostrych schorzeniach miąższu wątroby. Te spostrzeżenia zachęciły do podjęcia prób stosowania odczynu peptydaz w diagnostyce klinicznej. Badania Schier- gego [10], Weisbacha [13] i Ineishera [4] prowadzone u ludzi w przebiegu różnych schorzeń wątroby, wykazały największą aktywność peptydaz w ostrych stanach zapalnych, przebiegających z rozpadem ko- mórek.

Wzrost poziomu peptydaz w krwi w warunkach patologicznych po- iega niewątpliwie na tym, że enzymy wewnątrzkomórkowe przedostają się do krwi podczas rozpadu komórek. Abderhalden [1] po podaniu

zwierzętom doświadczalnym parenteralnie białka lub peptonu wykazał, że zawartość tych enzymów w krwi wzrasta w miarę istnienia potrzeby

rozkładu białka. Wzrost aktywności peptydaz zaobserwowano również

w gruźlicy, w stanach zapalnych płuc, kiedy następuje zwie;kszenie ilości

peptydaz w krwi.

W ostatnich latach podjęto próby porównywania wyniku odczynu peptydaz z wynikami prób czynnościowych wątroby (Schierge, Jonder- ko). Badania te pozwalają określić przydatność odczynu w diagnostyce schorzel'1 wątroby.

Autorzy niniejszej pracy wywoływali uszkodzenie miąższu wątroby

u psów przez stosowanie dużych dawek CCl~, a następnie, gdy wystą

piły wyraźne objawy zatrucia, badali ilościowo aktywność· peptydaz w surowicy, wykonując równocześnie inne próby czynnościowe wątroby.

Otrzymane wyniki zostały porównane z wynikami uzyskanymi na podstawie badań przeprowadzonych u psów zdrowych.

Postępowanie

Aktywność peptydaz określano metodą ilościową, opracowaną przez G. Jonderko, używając peptonu Wittego (dla celów bakt.;. Zasada me- tody polega na tym, ż.e po zmieszaniu surowicy z peptonem w jednej porcji oznacza się RN *, drugą część poddaje sit~ inkubacji w termosta- cie, podczas której następuje hydroliza enzymatyczna peptydów bardziej

złożonych na produkty, które nie ulegną strąceniu podczas odbiałczania.

Azot zawarty w tych produktach zwiększa wartość RN w próbie inku- bowanej. Aktywność peptydaz określona została „przyrostem RN" i wy-

rażana jest w mg⁰/o tego przyrostu. Do ilościowego oznaczania RN sto- sowano oryginalną metodę Rappaporta-Eichhorna. Równolegle z ozna- czaniem aktywności peptydaz wykonywano inne odczyny, a mianowicie:

a) Odczyn Takata-Ary w modyfikacji Mancka i Sommera, podając

w wyniku graniczne stężenie sublimatu w mg⁰/o.

* RN °⁰ reszta azotowa.

(3)

PFPTYDAZY PRZY ZATRUCIACH cc1,

b) Próbę bromsulftaleinową (BSF) wg Moses, Crithfield Thomasa.

Podawano dożylnie 5 mg barwnika na kg ciężaru ciała, a następnie po- bierano próbki krwi po 5 i 45 min. Wynik przedstawiony jest w O/o zatrzymanej bromsulftaleiny. Jeżeli wartość bilirubiny w surowicy prze-

kraczała l mg⁰/o, odczytywano poprawione wartości ⁰/o barwnika z po-

działki wg Zieve, Hanson i Hilla.

c) Oznaczanie ilościowe bilirubiny metodą Van den Bergha.

d) Oznaczanie ilościowe białka refraktometrem Abbe'go w 17,5° C, z użyciem tabeli Reissa dla przeliczenia wartości współczynnika refrak- cji na gO/o białka.

e) Badanie frakcji białkowych metodą elektroforezy bibułowej (bu- for weronalowy o pH 8,6, sile jonowej 0,1 przy napięciu 160 V i natęże

niu 0,4 mA.iem szer. paska, czas rozdziału 12 godz., wymiar pasków

bibuły 30 cm X 3 cm).

Doświadczenia przeprowadzono na trzech grupach psów:

I grupa obejmowała 11 psów młodych (od 5 miesięcy do 2 lat) klinicznie zdrowych.

II grupa - 8 psów starych (6 - 12 lat) klinicznie zdrowych,

III grupa - 5 psów w różnym wieku zatrutych CC14 • Psom tym po- dano 1,5 ml CCl,/kg masy ^ciała.

Wszystkie psy przed doświadczeniem były zbadane klinicznie.

Badania własne i wyniki

Próby wykonywano bezpośrednio po pobraniu i odwirowaniu krwi.

Uzyskane wyniki przyrostu RN w mgO/o, którym określano aktywność

peptydaz, po opracowaniu statystycznym zostały podane w tabeli 1.

Jak wynika z powyższych danych, otrzymano różnice w średnich

arytmetycznych poszczególnych grup. Między grupą psów młodych zdrowych a starych zdrowych różnica ta jest niewielka. Psy stare mają

TABELJA 1

Porównanie wyników „przyrostu RN" w grupach psów zdrowych psów zatrutych CC14

Grupy psów

Psy zdrowe i młode I

Psy zdrowe stare

\ _arytmSrednia _ety_cz,_._Od_chylcn1. _e I _, I, ^przyrostu ^I^st^andardowe

RN w mg'/, :ii i o

I I

40,70

44,38

±8,11~

/ i

Psy zatrute !

' CCl4 61,60

±9,16"':

±5,92/i

i

Wi;'ldomości Par;•1zyto\01-;iczne, z. 2

Odchylenie , Różnica

~tandardowe I między śred.

roznicy _śred_. między I ^arytm^e~ycz.

arytmet. x, _ x, Sx-y .

:l:4,21 3,68

±4,77 17,22

Test znamien-

ności różnicy między średnimi

arytmetycznymi t,

0,894

3,587

2

(4)

124 A. MALINOWSKA, Z. TOMICKI

wartość przyrostu RN nieco wyższą. Z obliczeń statystycznych wynika,

że nie jest to różnica istotna. Rozpatrywano także wyraźną różnicę między wynikami u psów zdrowych starych i psów zatrutych. Psy zatrute mają przyrost RN znacznie wyższy. Wyniki tych dwu grup różnią się od siebie istotnie pod względem średniej wartości.

Następnie średnie wartości przyrostu RN zostały porównane ze

średnimi wynikami pozostałych prób, dla poszczególnych grup psów w tabeli 2.

TABELlA 2

Zestawienie średnich wartości przyrostu RN, poziomu białka i jego frakcji oraz prób czynnościowych wątroby dla grup psów zdrowych i zatrutych CCl.

Grupy psów:

Przyrost RN w mgO/o Próba BSF po 5 min.

Próba BSF po 45 min.

Odczyn T-Ary mg"/n HgCb Bilirubina w mg⁰io RN w mg⁰io

Białko g"lo Albuminy

wartości względne m⁰/o

Globuliny

wartości względne

w%

I

Psy zdrowe młode1 Psy zdrowe stare, Psy zatrute CC!,

- - I ,

40,70 21,27 4,50 100

29,6 7,6 50,4

6,0 8,3 11,2 12,9 11,0

44,38 21,19 4,00 100

25,9 7,1 46,6

6,0 9,6 11,3 12,8 14,1

61,60 63,60 17,32 80--60 0,125-1,7

72,7 6,8 38,8

5,2 13,0 11,7 13,2 16,1

Wartości otrzymane dla grupy psów młodych niewiele odbiegają od warto~ci uzyskanych dla grupy psów starych. Istnieją wyraźne różnice

w stosunku do grupy psów zatrutych. U psów zatrutych poza zwięk

szonym przyrostem RN, a więc większą aktywnością peptydaz, stwier- dza się podwyższenie poziomu bilirubiny w surowicy od 0,125 do 1,7 mgO/o, również poziom RN jest wyraźnie większy. Ulega obniżeniu ogól- na ilość białka, z jednoczesnym przesunięciem procentowego składu

frakcji. Przy zmniejszeniu ilości albumin otrzymano przewagę globulin, szczególnie frakcji alfa₂ i gamma. Tego rodzaju zachowanie się białka

jest charakterystyczne dla uszkodzeń miąższu wątroby. Jeśli wątroba

produkuje mniej albumin, wówczas globuliny ulegają łatwiejszemu wy-

trącaniu przez sole metali ciężkich. Dlatego w grupie psów zatrutych odczyn Takata-Ary daje wynik dodatni przy niższych stężeniach sublimatu (80 - 60 mgO/o) niż u psów zdrowych. Uszkodzenie miąższu wą

troby powoduje zmiany w zdolności oczyszczania krwi z bromsulftale-

(5)

PEPTYDAZY PRZY ZATRUCIACH CCl4 125

iny. Miarą tej zdolności jest ocena znikania barwnika z krwi. W grupie III obserwuje się wyższy procent zatrzymania bromsulftaleiny po 5 i 45 min. Przedstawione wykresy obrazują zachowanie się krzywej retencji barwnika na podstawie średnich wyników każdej grupy.

Psy zatrute poddano sekcji. Stwierdzono zmiany charakterystyczne dla zatrucia CC1₄^: nieżyt błony śluzowej przewodu pokarmowego oraz

rozległe zmiany w wątrobie, dające obraz tzw. wątroby muszkatułowej.

Wyniki sekcji potwierdzono badaniem histopatologicznym. Preparaty z wątroby barwiono hematoksyliną i eozyną oraz Sudanem III. U wszyst- kich psów zatrutych stwierdzono zwyradniające nacieczenie tłuszczowe wątroby (ryc. 1 i 2).

%

100

90 \

\

80 \

70 \ '

60

l l 3

50 40

30 20

70

1 } 3 :\

:\ l\

:\

\\

- - - I grupa

···•• li grupa

- - - I l i qrupa

o---5~-,o':"""-:-· _ _ 2_._o _ _ _ J„OL....__ _ _ 4..1...o_..._..--1~

45 · 50 mln.

Krzywe retencji barwnika po 5 i 45 minutach na podstawie wyników średnich

dla każdej grupy. Wartości bromsulftaleiny są wyrażone w procentach. Górna krzywa przedstawia ilość zatrzymanego barwnika u psów zatrutych CCl1 (III grupa). Dwie dolne linie ^dotyczągrup psów zdrowych: ^młodych(I grupa) i starych (Il grupa). U psów zatrutych procent zatrzymanego barwnika jest wyraźnie wyższy

(6)

126 A. MALINOWSKA, Z. TOMICKI

Ryc. 1. Obraz mikroskopowy psa zatrutego CC14• Miejsca ciemniej zabarwione

odpowiadają komórkom, które uległy zwyradniającemu nacieczeniu tłuszczowemu.

Barw. Sudanem III. Pow. lOOX

Ryc. 2. Fragment ryc. 1. W komórkach wąitroby widoczne ciemne miejsca odpo-

wiadające kuleczkom tłuszczu. Jasne miejsca odpowiadają sterydom podwójnie za-

łamującym światło. Barw. Sudanem III. Pow. 600X

(7)

PEPTY')AZY PRZY ZATRUCIACH CCl; 127

-·-·-- -- - --·- - - - - --------

Podsumowanie wyników i wnioski

Na podstawie uzyskanych wyników badań stwierdzono, że aktywność

peptydaz w surowicy psów wykazuje nieznaczne różnice w zależności

od wieku. Dla psów młodych średnia arytmetyczna przyrostu RN w mg⁰/u wynosi 40,70, a dla psów starych - 44,38. Wyraźny wzrost

aktywności peptydaz obserwuje się u psów zatrutych CC1_{4 ,} gdy nastą

piło poważne uszkodzenie komórek miąższu wątroby. Wartość średnia

dla tej grupy wynosi 61,60 mgO/o. Dla grupy psów młodych odchylenie standardowe wynosi ±8,11, dla psów starych ±9,16. Odczyn Takata- Ary, próba BSF, poziom bilirubiny i białka dały dla psów zdrowych wyniki w granicach normy. U psów zatrutych CC1₄ hyperpeptydazemii towarzyszy przesunięcie w obrębie frakcji białkowych, polegające na

obniżeniu poziomu albumin, z równoczesnym zwiększeniem frakcji al- fu2- i gamma-globulin. Otrzymano dodatni wynik próby Takata-Ary przy niższych stężeniach sublimatu, zwiększenie poziomu bilirubiny oraz ograniczenie działalności mechanizmów oczyszczających krew z brom- rnlftaleiny, co daje podwyższone wartości procent BSF po 5 min. 63,6 po 45 min. 17,32, podczas gdy u psów zdrowych uzyskiwano wyniki znacznie niższe. Badania nasze potwierdzają koncepcje, że zwiększenie aktywności peptydaz związane jest z uszkodzeniem miąższu wątroby.

Ulegające rozpadowi komórki wątroby wyzwalają dwu- i wielopepty- dazy (Jonderko). Dotychczas nie ustalono, czy hyperpeptydazemię wy-

wołuje tylko uszkodzenie komórek wątrobowych, czy też inne uszko- dzone mechanizmy ustrojowe. W przypadkach ostrych zatruć CC1₄ zba- danie aktywności peptydaz wydaje się równie przydatne, jak pozostałe

próby stosowane w diagnostyce klinicznej. Aby próba ta mogła być

stosowana na szerszą skalę, należałoby jednak zbadać, jaka jest aktyw-

ność peptydaz w zależności od innych stanów patologicznych wątroby

w różnych schorzeniach psów.

Otrzymano 13 I 1961 Adres autorów:

Warszawa, Grochowska 272

LITERATURA

1. Ab der ha 1 de n R.: Klinische Enzymologie, Stuttgart 1958.

2. Bar ber V. T., Ster n K.: Peptidase in human serum. - Proc. Soc. Exper.

Biol. Med., 67 : 421, 1948.

3. Fr ut o n J.: On the protcolitic enzymes of animal tissues. - J. Biol. Chem., 166: 721, 1946.

4. F 1 eis her G. A., But H. R.: Peptidases in human serum. - J. Clin. Invest ..

7, 32 : 674. 1953.

, 5. Ho 1 ma n H. R., White A., Fr ut o n J. S.: Relatio of adrenal cortex to serum peptidase activity. - Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 65: 196, 1947.

(8)

128 A. MALINOWSKA, Z. TOMICKI

6. Jo n derko G.: Prosta metoda ilościowa dla oznaczania aktywności peptydaz surowicy krwi. - Pol. Arch. Med. Wewn., 1, 1959.

7. Jo n derko G.: Wartość rozpoznawcza reakcji peptydc1z w surowicy krwi w przebiegu chorób wątroby. - Pol. Tyg. Lek., 39, 1957.

8. Mos es C., Cr i t h fi e 1 d F. H.: Bromsulftalein cxcretion test. -- .J. Lab.

Clin. Med., 33 : 448, 1948.

9. P f e i ff e r H.: Uber das Auftreten peptolytischer Ferm ente in Serum vcr- bruhter Kaninchen. - Munch. Med. Wschr., 61: 1099, 1914.

10. Sc hi erg e M.: Die proteolitische Wirkung des Blutscrums bei Leberschaden und andcren Krankheitenzustanden. - Dtsch. Ges. Z. Med., 47 : 71, 1952. 11. Stein br ii ck P.: Untersuchungen iiber die Ausscheidung polypeptidspalten-

der Fermente im Harn des gesunden und kranken Organismus. - Ferrnent- forschung. 14: 121, 1936.

12. Tom icki Z., N ag ó r ski F.: Białka, lipoproteidy i glikoproteidy u psów zdrowych i chorych. --· Med. W et., 1960 (in litt.).

13. We is bach H. G.: Leberfunktiondiagnostic in besonderem Hinblick auf die Sen.improteasreaktion nach Schierge. - Z. Ges. Inn. Med. u. Grenz., 6, 9, 1954.

14. Z am e cni k P. C., Stephens o n M. L.: Peptidasp activity of lymph and serum after bourns. -- J. Biol. Chem., 158 : 135, 194:'i.

ACTIVITY OF PEPTIDASES IN THE SERA OF HEALTHY DOGS AND OF DOGS POISONED WITH CCl4

A. MALINOWSKA, Z. TOMICKI

The author investigated the activity of peptidases libc>rated by liver cells 'Nhich suffered severe lesions; they made at the same time other diagnostic tests, sueh as : brom-sulfophtalic test, determination of the generał protein level and evaluation of the percentagc of its fractions, as well as the Takata-Ara reaction test in 24 dogs. Above dogs were divided into threc groups : young healthy dogs, old healthy one~ and dogs poisoned with the parasiticide prepar- ation - CCl,. The peptidases activity, expressed by the augmentation of the nitrogen remainder (RN) in young healthy dogs averages 40.70 mg. per cent, ir. old healthy dogs - 44.38 mg. per cent. In poisoned dogs this augmentation is much higher and amounts to 61.60 mg. per cent.