Wprowadzenie
Badania oznaczania zawartoœci alkoholu etylowego w p³ynach ustrojowych cz³owieka przeprowadzane s¹ przez policyjnych ekspertów kryminalistyki od 1957 ro-ku. Pierwsza pracownia, w której badano zarówno próbki krwi i moczu powsta³a w Zak³adzie Kryminalisty-ki KG MO. PróbKryminalisty-ki nadsy³ane by³y wówczas z obszaru ca³ej Polski, g³ównie jednak z terenu dzisiejszego wo-jewództwa mazowieckiego. Od pocz¹tku 1995 roku stopniowo na terenie ca³ego kraju powstawa³y w labo-ratoriach kryminalistycznych komend wojewódzkich Policji kolejne pracownie badañ p³ynów ustrojowych cz³owieka na zawartoœæ alkoholu etylowego. W chwili obecnej jest ich 13, w których w sumie wykonywanych jest œrednio oko³o 75 000 analiz rocznie. Liczba wyda-wanych w tym zakresie opinii w ci¹gu tych kilku lat utrzymuje siê stale na podobnym poziomie.
W praktyce, zarówno w Polsce, jak i w wielu innych krajach, spoœród kilkudziesiêciu znanych i opracowa-nych metod oznaczania stê¿enia alkoholu etylowego w materiale biologicznym, przyjê³y siê i znalaz³y najszer-sze zastosowanie trzy metody: metoda Widmarka (chemiczna – dwuchromianowa), enzymatyczna (ADH) oraz chromatografii gazowej z detekcj¹ p³omieniowo--jonizacyjn¹ (GC/FID). Metody te, w myœl Rozporz¹-dzenia Ministra Zdrowia i Opieki Spo³ecznej z dnia 6 maja 1983 roku w sprawie warunków i sposobu doko-nywania badañ na zawartoœæ alkoholu w organizmie, by³y traktowane równorzêdnie pod wzglêdem wiary-godnoœci otrzymanego wyniku. Zgodnie z zatwierdzo-nymi przez Zarz¹d G³ówny Polskiego Towarzystwa Medycyny S¹dowej i Kryminologii w dniu 26 listopada 2004 roku zaleceniami opracowanymi przez Instytut Ekspertyz S¹dowych (IES) w Krakowie (opublikowany-mi w „Prokuraturze i Prawie”, nr 4, kwiecieñ 2005 r.), stê¿enie alkoholu etylowego w p³ynach ustrojowych wyznacza siê metod¹ chromatografii gazowej oraz me-tod¹ enzymatyczn¹ ADH.
Zgodnie z wymienionymi zaleceniami IES przy za-stosowaniu metody chromatografii gazowej wskazane
jest wykorzystanie techniki analizy fazy nadpowierzch-niowej head-space. Jest to metoda standardowa, do-brze znana i opisana w literaturze fachowej i stosowa-na stosowa-najczêœciej przez laboratoria wykonuj¹ce tego typu badania na potrzeby organów œcigania lub wymiaru sprawiedliwoœci.
Wydzia³ Fizykochemii Centralnego Laboratorium Kryminalistycznego KGP uznaje tê metodê i stosuje j¹, odnosz¹c siê do ww. zaleceñ.
Oznaczanie jakoœciowe i iloœciowe alkoholu etylo-wego w materiale biologicznym wyznaczane jest meto-d¹ chromatografii gazowej head-space, zgodnie z Pro-cedur¹ badawcz¹ nr HJ-60/Pb-IV/3/08 „Oznaczanie zawartoœci alkoholu etylowego we krwi cz³owieka me-tod¹ chromatografii gazowej head-space” (ryc. 1). Aby wynik oznaczania alkoholu etylowego w próbce mate-ria³u biologicznego by³ wiarygodny i spe³nia³ kryteria dowodowe w procesie cywilnym lub karnym, wymaga-ne jest, aby pomiar zosta³ dokonany za pomoc¹ dwóch metod. Zgodnie z obowi¹zuj¹cymi zaleceniami do-puszczalne jest, aby w razie zastosowania jedynie chromatografii gazowej head-space (tak jest w przy-padku stosowanych procedur badawczych w policyj-nych laboratoriach kryminalistyczpolicyj-nych), badanie labo-ratoryjne zabezpieczonego materia³u by³o wykonane z dwóch oddzielnie pobranych do analizy próbek z mate-ria³u badawczego oraz aby oznaczenie by³o wykonane przy zastosowaniu kolumn o odmiennych w³aœciwo-œciach elucyjnych, np. takich kolumn, które ró¿ni¹ siê polarnoœci¹.
Metoda chromatografii gazowej z wykorzystaniem techniki analizy fazy nadpowierzchniowej (head-space analysis) zastosowana przy oznaczeniu zawartoœci al-koholu etylowego w p³ynach ustrojowych cz³owieka jest metod¹ z wyboru, o najwy¿szym stopniu swoisto-œci. O powszechnym zastosowaniu tej metody decydu-j¹ jej g³ówne zalety, m.in.: ³atwoœæ przygotowania pró-bek do analizy, potrzeba niewielkiej iloœci materia³u przeznaczonego do badañ, szybka mo¿liwoœæ wykry-cia i wykonania oznaczenia oczekiwanej substancji w trakcie jednego cyklu badawczego, mo¿liwoœæ wykona-Iwona Ostaszewska
Oznaczanie zawartości alkoholu etylowego
w płynach ustrojowych człowieka
metodą chromatografii gazowej head-space
– walidacja metody
nia du¿ej liczby prób w krótkim czasie, a tak¿e czu³oœæ pomiaru oraz du¿a selektywnoœæ w stosunku do etano-lu. Metoda ta jest ³atwa do automatyzacji, a odtwarzal-noœæ i powtarzalodtwarzal-noœæ wyniku jest zazwyczaj lepsza ni¿ przy bezpoœrednim, rêcznym nastrzyku. Do analizy stosuje siê specjalnie do tego przeznaczone naczynia szklane (naczynka chromatograficzne), szczelnie za-mykane membran¹ z gumy i aluminiowym kapslem.
Proces izolacji alkoholu etylowego polega na czêœcio-wym odparowaniu w podwy¿szonej temperaturze lot-nych zwi¹zków z próby materia³u biologicznego do przestrzeni naczynia nad analizowanym materia³em. W technice tej analizie poddawana nie jest bezpoœrednio próbka krwi, lecz faza gazowa znajduj¹ca siê nad prób-k¹ umieszczon¹ w zamkniêtym naczyniu. Izolowanie prowadzone jest do momentu osi¹gniêcia stanu
równo-Procedura oznaczenia alkoholu metod¹ chromatografii gazowej head-space
Ryc. 1. Schemat analizy iloœciowej alkoholu etylowego we krwi metod¹ chromatografii head-space Fig. 1. Flowchart of quantitative analysis of ethyl alcohol in blood by means of head-space chromatography Ÿród³o (ryc. 1–4): autorka
wagi pomiêdzy stê¿eniem zwi¹zku w materiale biolo-gicznym oraz w fazie gazowej, która nastêpnie jest po-bierana poprzez membranê do analizy chromatogra-ficznej gazoszczeln¹ strzykawk¹. W zamkniêtym uk³a-dzie i ustalonej temperaturze stosunek stê¿eñ alkoho-lu we krwi do jego stê¿enia w powietrzu nad krwi¹ ma – zgodnie z prawem Henr’ego-Daltona – wartoœæ sta³¹. Do naczynka chromatograficznego o pojemnoœci 22 ml wprowadzany jest 1 ml roztworu tert-butanolu (2-metylo-2-propanol) o stê¿eniu objêtoœciowym 0,05‰, który pe³ni rolê wzorca wewnêtrznego, a na-stêpnie dodawane jest 0,1 ml próbki krwi. Naczynko chromatograficzne jest kapslowane i umieszczane w autosamplerze chromatografu gazowego. Poniewa¿ w oznaczeniach stosowany jest detektor p³omieniowo--jonizacyjny (FID), to wielkoœæ sygna³u analitycznego, tj. pole powierzchni pod pikiem lub jego wysokoœæ, jest proporcjonalna do stê¿enia alkoholu w próbce. Ze wzglêdu na fakt, ¿e chromatografia gazowa nie jest metod¹ absolutn¹, to aby wyznaczyæ stê¿enie alkoho-lu w badanej próbce, nale¿y wykonaæ kalibracjê, stosu-j¹c okreœlon¹ iloœæ próbek kontrolnych (roztworów wzorcowych), sporz¹dzonych z certyfikowanych mate-ria³ów odniesienia. Procedura przygotowania i analizy próbek kontrolnych jest analogiczna do przygotowania i analizy próbek krwi.
Organ procesowy d¹¿y do dok³adnego okreœlenia stê¿enia alkoholu etylowego we krwi badanego. Wynik takiego badania stanowi obiektywny materia³ dowodo-wy w procesie karnym i czêsto ma rozstrzygaj¹ce zna-czenie dla rozpatrywanych przez s¹d spraw. Wynik oznaczenia stê¿enia alkoholu etylowego we krwi jest podstaw¹ do niepodwa¿alnego ustalenia stanu trzeŸ-woœci badanego w chwili zdarzenia.
Zgodnie z polskim prawodawstwem stan po u¿yciu alkoholu zachodzi, gdy zawartoœæ alkoholu w organi-zmie wynosi lub prowadzi do stê¿enia we krwi, od 0,2‰ do 0,5‰ alkoholu, co odpowiada obecnoœci od 0,1 do 0,25 mg alkoholu w 1 dm3wydychanego powie-trza, a stan, w którym zawartoœæ alkoholu w organi-zmie wynosi lub prowadzi do stê¿enia we krwi powy-¿ej 0,5‰ alkoholu lub obecnoœci powypowy-¿ej 0,25 mg al-koholu w 1 dm3 wydychanego powietrza, okreœlany jest stanem nietrzeŸwoœci.
Rzetelny, pewny i obarczony jak najmniejszym b³ê-dem wynik wykonywanych badañ jest wa¿nym elemen-tem dowodowym w procesie karnym. Mimo szczegó³o-wego opisu wymagañ, procedur oraz instrukcji doty-cz¹cych m.in. systematycznej kalibracji aparatury ana-litycznej, a tak¿e sprzêtu pomocniczego, pobierania próbek do badañ, analizy próbek, zapewnienia jakoœci i kontroli jakoœci badañ, wieloletniego uczestnictwa w programach miêdzylaboratoryjnych badañ bieg³oœci, organizowanych przez uznane miêdzynarodowe
insty-tucje specjalistyczne oraz sporz¹dzania dokumentacji z badañ oraz wydawanej opinii, z punktu widzenia ana-lityka œcis³a realizacja tego celu nie zawsze siê udaje. Z teorii pomiaru potwierdzonej codzienn¹ praktyk¹ analityczn¹ wiadomo, ¿e wynik ka¿dego pomiaru mo¿e byæ obarczony b³êdem. Miêdzynarodowa Organizacja Standaryzacyjna (International Standards Organiza-tion) w normie PN-EN ISO/IEC 17025:2005 obliguje la-boratoria do przeprowadzenia walidacji metod badaw-czych oraz oszacowania niepewnoœci pomiaru. Dziêki przeprowadzonej walidacji z du¿ym prawdopodobieñ-stwem mo¿na powiedzieæ, ¿e proces analizy przebiega w sposób prawid³owy oraz ¿e daje precyzyjne i wiary-godne wyniki.
Pracownia badañ p³ynów ustrojowych na zawartoœæ alkoholu etylowego Wydzia³u Fizykochemii CLK KGP d¹¿y do wykonywania badañ na optymalnym poziomie jakoœciowym, tak aby uzyskiwane wyniki badañ by³y miarodajne, obiektywne i jak najbardziej rzetelne. Pra-cownia, w której oznaczany jest alkohol etylowy w p³y-nach ustrojowych cz³owieka, podlega kontroli audito-rów wewnêtrznych, a okresowo tak¿e auditoaudito-rów ze-wnêtrznych.
W lutym 2009 roku auditorzy z Polskiego Centrum Akredytacji (PCA) ocenili m.in.:
a) obs³ugê i kontrolê pracy aparatury badawczej, b) kontrolê kalibracji i sprawdzeñ wyposa¿enia
po-miarowego,
c) dokumentacjê stosowanej metody analizy ozna-czania zawartoœci alkoholu etylowego we krwi cz³owieka,
d) dokumentacjê uczestnictwa w programach miê-dzylaboratoryjnych badañ bieg³oœci organizowa-nych przez uznane miêdzynarodowe instytucje specjalistyczne,
e) sposób zapisywania i kontroli raportowanych wy-ników analizy,
f) sposób i przebieg przeprowadzenia walidacji sto-sowanej metody,
g) raport z przeprowadzonej walidacji,
h) sposób dokumentowania przebiegu badañ oraz sporz¹dzane opinie.
Dnia 22 maja 2009 roku Wydzia³ Fizykochemii CLK KGP uzyska³ Certyfikat Akredytacyjny na zg³oszon¹ metodê oznaczania jakoœciowego i iloœciowego alko-holu etylowego we krwi cz³owieka metod¹ chromato-grafii gazowej head-space.
Wa¿ne jest, aby oprócz podania samego wyniku ba-dania mieæ œwiadomoœæ stopnia dok³adnoœci uzyskanych oznaczeñ oraz mieæ oszacowan¹ niepewnoœæ zastoso-wanej metody. W tym celu przeprowadzono ocenê ca³e-go postêpowania analityczneca³e-go, dziêki której przedsta-wiono dowody, ¿e wprowadzona do badañ metoda ozna-czania alkoholu etylowego we krwi cz³owieka metod¹
chromatografii gazowej head-space zgodnie z Procedu-r¹ badawcz¹ nr HJ-60/Pb-IV/3/08 jest stosowana w³aœci-wie. Ponadto udowodniono, ¿e w procesie przeprowa-dzanych analiz, który przebiega w sposób rzetelny i pra-wid³owy, otrzymuje siê wyniki badañ na oczekiwanym po-ziomie jakoœciowym, obarczone niepewnoœci¹ nie wiêk-sz¹, ni¿ za³o¿ono. W tym celu zosta³y wyznaczone i oce-nione nastêpuj¹ce parametry walidacyjne:
– wyznaczenie zakresu i liniowoœci metody
– wyznaczenie granic wykrywalnoœci i oznaczalnoœci – okreœlenie powtarzalnoœci
– wyznaczenie dok³adnoœci – okreœlenie odtwarzalnoœci
– wyznaczenie niepewnoœci metody badawczej.
Aparatura badawcza
Badania przeprowadzono z u¿yciem chromatografu gazowego Clarus 500 (model dwukana³owy – kana³y synchroniczne), wyposa¿onego w automatyczny podajnik próbek (autosampler) TurboMatrix HS-40 fir-my Perkin-Elmer oraz sterownik komputerowy z odpo-wiednim oprogramowaniem (ryc. 2). Rozdzia³ dokony-wany jest na dwóch kolumnach kapilarnych, ró¿ni¹-cych siê polarnoœci¹:
1. Bac 2 o d³ugoœci 10 m, œrednicy wewnêtrznej 0,18 mm i gruboœci filmu 0,63 μm.
2. Bac 3 o d³ugoœci 10 m, œrednicy wewnêtrznej 0,18 mm i gruboœci filmu 0,30 μm, w temperatu-rze 35oC.
Do wykrycia obecnoœci alkoholu etylowego w stru-mieniu gazu noœnego (helu) wykorzystywane s¹ detek-tory p³omieniowo-jonizacyjne (FID).
Wyposa¿enie pomiarowe (ryc. 3):
• pipeta pó³automatyczna, o numerze fabrycznym 1729898, pozwalaj¹ca na odmierzenie 0,1 ml; o wartoœci niepewnoœci max. 0,21%,
• pipeta pó³automatyczna, o numerze fabrycznym 1734278, pozwalaj¹ca na odmierzenie 1,0 ml; o wartoœci niepewnoœci max. 0,27%,
• dozownik pó³automatyczny o numerze fabrycznym 1602238, pozwalaj¹cy na odmierzenie 1,0 ml, o wartoœci niepewnoœci max. 0,27%,
• jednorazowe koñcówki do pipet lub do dozownika (zgodnie ze specyfikacj¹ techniczn¹ u¿ywanego wyposa¿enia pomiarowego),
• termohigrometr posiadaj¹cy aktualne œwiadectwo wzorcowania,
• naczynka chromatograficzne, zgodne z wymaga-niami specyfikacji technicznej u¿ytkowanego
chro-Ryc. 2. Chromatograf gazowy Clarus 500 z autosamplerem Turbo Matrix HS-40 Fig. 2. Clarus 500 gas chromatograph with Turbo Matrix HS-40 autosampler
matografu oraz gumowe korki i aluminiowe kapsle w niezbêdnej iloœci.
Do wyznaczenia precyzji objêtoœci pipet wykorzy-stano dane zawarte w za³¹czonych certyfikatach jako-œci, dostarczonych wraz z pipetami przez ich producen-ta, firmê Eppendorf (Niemcy):
Odczynniki
• standard wewnêtrzny w niezbêdnej iloœci – 0,05‰ wodny roztwór tert-butanolu,
• certyfikowany materia³ odniesienia – roztwór wod-ny alkoholu etylowego o okreœlowod-nych stê¿eniach zawartych w granicach od 0,1‰ do 5,0‰,
• próbki krwi zawieraj¹ce alkohol etylowy,
• gazy: hel, powietrze, wodór, o czystoœci minimum 99,9%
Wyposa¿enie pomocnicze
• statyw z otworami do umieszczenia odpowiedniej liczby naczynek chromatograficznych na stanowi-sku przygotowania próbek,
• przyrz¹d s³u¿¹cy do zamykania naczynek chroma-tograficznych – kapslownica oraz do ich otwierania – dekapslownica,
• œrodki ochrony osobistej (m.in. fartuchy ochronne, rêkawiczki jednorazowe, przy³bice stomatologiczne),
• œrodki dezynfekuj¹ce o w³aœciwoœciach bakterio-bójczych, grzybobójczych i wirusobójczych w nie-zbêdnej iloœci.
Dla wyznaczenia powtarzalnoœci pomiarów za moc¹ aparatu wykorzystano dane z kilkudziesiêciu po-miarów dla tego samego stê¿enia roztworu wzorcowe-go, sporz¹dzonego z certyfikowanego materia³u odnie-sienia. B³¹d stê¿enia alkoholu w roztworach wzorco-wych odczytano ze œwiadectw certyfikowanych mate-ria³ów odniesienia, wystawionych dla ka¿dego pozio-mu stê¿enia roztworu wzorcowego przez producenta, firmê Cerilliant, dostarczonych przez dostawcê, firmê
LGC Standards (USA) oraz Merck KgaA (Darmstadt, Niemcy) i przedstawiono w tabeli 4, w rozdziale doty-cz¹cym oszacowania niepewnoœci.
Przebieg badań
Wyznaczenie zakresu pomiarowego od 0,10‰ do 5,0‰ i liniowości metody
Liniowoœæ jest to przedzia³ zawartoœci analitu, dla którego sygna³ wyjœciowy urz¹dzenia pomiarowego jest proporcjonalny do tej zawartoœci w okreœlonym
za-Ryc. 3. Wyposa¿enie stanowiska przeznaczonego do przygotowania próbek do analizy metod¹ chromatografii head-space Fig. 3. Workstation for preparation of samples to head-space chromatography analysis
kresie, zgodnie z wyznaczonym równaniem matema-tycznym:
y = ax + b
gdzie:
y – zmienna zale¿na (sygna³ wyjœciowy urz¹dzenia po-miarowego),
x – zmienna niezale¿na (zawartoœæ oznaczanego analitu), b – wyraz wolny (oznacza punkt przeciêcia siê krzywej ze
wspó³rzêdn¹ y),
a – wspó³czynnik kierunkowej prostej (mówi o nachyleniu prostej wzglêdem wspó³rzêdnych x i y).
Zakres liniowy najczêœciej jest wyznaczany z u¿y-ciem krzywej kalibracyjnej urz¹dzenia pomiarowego. W tym celu przeprowadzono pomiary dla roztworów wzorcowych ró¿ni¹cych siê miêdzy sob¹ stê¿eniem analitu na piêciu poziomach stê¿eñ, tj. 0,10‰; 0,20‰; 0,50‰; 2,0‰ i 5,0‰. Wykonano po trzy niezale¿ne oznaczenia i na tej podstawie z piêciu punktów kalibra-cji zosta³a wykreœlona dla ka¿dej kolumny krzywa kali-bracji.
Parametry krzywych kalibracji:
kolumna A: y = 0,6088x-0,0288; r2 = 0,999868 kolumna B: y = 0,5898x-0,0398; r2 = 0,999853
Zale¿noœæ miêdzy zmiennymi charakteryzuje wspó³-czynnik korelacji r. Je¿eli jego wartoœæ jest równa co najmniej 0,99, mo¿na mówiæ o liniowoœci metody (w zakresie stê¿eñ, dla których sporz¹dzono roztwory wzorcowe w celu wyznaczenia krzywej kalibracyjnej).
Uzyskane wysokie wartoœci wspó³czynnika r œwiad-cz¹ o prawid³owym skorelowaniu wielkoœci, a tak¿e o li-niowoœci wskazañ detektora FID w badanym zakresie stê¿eñ dla obu kolumn.
Zakres pomiarowy jest to przedzia³ stê¿eñ analizo-wanej substancji (pomiêdzy najni¿szym i najwy¿szym stê¿eniem), w którym mo¿na osi¹gn¹æ akceptowaln¹ dok³adnoœæ i precyzjê. W badaniach wykorzystano cer-tyfikowany materia³ odniesienia (roztwory wodne eta-nolu firmy Merck oraz Cerilliant w zakresie stê¿eñ od 0,1‰ do 5,0‰).
Granica wykrywalności i oznaczalności
Granica wykrywalnoœci (limit of detection – LOD) – jest to najmniejsza iloœæ lub najmniejsze stê¿enie substancji chemicznej, mo¿liwe do wykrycia za pomo-c¹ danej metody analitycznej z okreœlonym prawdopo-dobieñstwem. Wartoœæ granicy wykrywalnoœci jest œci-œle zwi¹zana z poziomem szumów stosowanego
urz¹-dzenia analitycznego, przyjmuje siê, ¿e wartoœæ LOD to trzykrotnoœæ poziomu szumów.
Mo¿na j¹ równie¿ wyznaczyæ na podstawie odchyle-nia standardowego zbioru sygna³ów i wspó³czynnika nachylenia krzywej kalibracyjnej, korzystaj¹c z zale¿-noœci:
gdzie:
a – wspó³czynnik kierunkowy krzywej kalibracyjnej, s – odchylenie standardowe.
Granica oznaczalnoœci (limit of quantification – LOQ) – jest to najmniejsza iloœæ lub najmniejsze stê¿e-nie substancji, mo¿liwe do iloœciowego oznaczenia za pomoc¹ danej metody analitycznej z za³o¿on¹ dok³ad-noœci¹ i precyzj¹. Jej wartoœæ jest zawsze wielokrotno-œci¹ wyznaczonej wartoœci granicy wykrywalnoœci (LOD). Zazwyczaj przyjmuje siê zale¿noœæ:
LOQ = 3 x LOD
Powtarzalność
Powtarzalnoœæ jest parametrem wyra¿aj¹cym pre-cyzjê oznaczeñ wykonanych w krótkim odstêpie czasu, przez tego samego analityka i w tych samych warun-kach. Powtarzalnoœæ zosta³a wyznaczona poprzez ob-liczenie odchylenia standardowego dla ka¿dego pozio-mu stê¿enia alkoholu etylowego w zakresie kalibracji od 0,10‰ do 5,0‰ w oparciu o wyniki 55 nastêpuj¹-cych po sobie pomiarów wykonanych w krótkich prze-dzia³ach czasu, za pomoc¹ instrumentu chromatograf gazowy head-space Clarus 500 firmy Perkin-Elmer, od-dzielnie dla ka¿dej z kolumn A i B, jako wartoœci wzglêdnego odchylenia standardowego dla nastêpuj¹-cych szeœciu poziomów stê¿eñ: 0,10‰; 0,20‰; 0,50‰; 1,0‰; 2,0‰ i 5,0‰;
Uzyskane wyniki pomiarów jak i obliczone wartoœci œrednie (xœr) dla ka¿dej serii, wartoœci odchyleñ stan-dardowych (S), wartoœci wzglêdnych odchyleñ standar-dowych (RSD) oraz odchylenia standardowe œredniej (⎯s ) przedstawiono w tabelach 1 i 2.
Odtwarzalnoœæ – sprawdzono poprzez analizê pró-bek kontrolnych o stê¿eniach 0,2‰ oraz 0,5‰ w 30 se-riach w ró¿ne dni. Uzyskane wyniki pomiarów jak i ob-liczone wartoœci œrednie (xœr) dla ka¿dego stê¿enia, wartoœci odchyleñ standardowych (S), wartoœci wzglêd-nych odchyleñ standardowych (RSD) oraz odchylenia standardowe œredniej (⎯s ) przedstawiono w tabeli 3.
Dok³adnoœæ i poprawnoœæ – jest definiowana jako zgodnoœæ pomiêdzy uzyskanym wynikiem (pojedyn-czego) pomiaru z wartoœci¹ rzeczywist¹ (oczekiwan¹).
a s LOD=3,3*
Poprawnoœæ to stopieñ zgodnoœci wy-niku oznaczenia (jako œredniej obli-czonej na podstawie serii pomiarów) z wartoœci¹ oczekiwan¹. Zatem po-prawnoœæ jest parametrem okreœlaj¹-cym zgodnoœæ wyników uzyskiwa-nych za pomoc¹ danej metodyki ana-litycznej z wynikami rzeczywistymi (oczekiwanymi). Dok³adnoœæ stanowi po³¹czenie poprawnoœci i precyzji, poniewa¿ im bardziej poprawne i pre-cyzyjne bêd¹ wyniki otrzymane z za-stosowaniem danej metodyki anali-tycznej, tym bardziej dok³adny bêdzie wynik pojedynczego oznaczenia.
Dok³adnoœæ zosta³a okreœlona tymi samymi 30 se-riami, jakimi obliczona zosta³a odtwarzalnoœæ:
Dla stê¿enia 0,2‰
Wartoœæ rzeczywista (znana wartoœæ sk³adnika w próbce standardu I-rzêdowego): 0,200‰
Odchylenie wartoœci rzeczywistej (œrednia wartoœæ minus wartoœæ rzeczywista): 0,001‰
Dok³adnoœæ (100 x œrednia/rzeczywista wartoœæ): 100%
Dla stê¿enia 0,5‰
Wartoœæ rzeczywista (znana wartoœæ sk³adnika w próbce standardu I-rzêdowego): 0,500‰
Odchylenie wartoœci rzeczywistej (œrednia wartoœæ minus wartoœæ rzeczywista): 0,001‰
Dok³adnoœæ (100 x œrednia/rzeczywista wartoœæ): 100%
Ślepa próba
Na 10 chromatogramach wykonanych z próbek wo-dy na kolumnie A oraz kolumnie B nie stwierdzono obecnoœci pików chromatograficznych przy czasach retencji odpowiadaj¹cych alkoholowi etylowemu i stan-dardowi wewnêtrznemu.
Tabela 1 Wartoœci uzyskane dla stê¿eñ wzorców od 0,10‰ do 0,50‰ (kolumna A i B)
Values obtained for standard concentrations from 0,10% to 0,50% (columns A and B)
Tabela 3 Wartoœci uzyskane dla stê¿eñ wzorców od 0,20‰ do 0,50‰ (kolumna A i B) Values obtained for standard concentrations from 0,20% to 0,50% (columns A and B)
Tabela 2 Wartoœci uzyskane dla stê¿eñ wzorców od 1,0‰ do 5,0‰ kolumna A i B)
Values obtained for standard concentrations from 1,0 % to 5,0% (columns A and B)
Oszacowanie niepewności pomiaru
Niepewnoœæ jest podstawow¹ w³aœciwoœci¹ ka¿de-go pomiaru. Wyznaczaj¹c niepewnoœæ pomiaru, zwiêk-szamy jego miarodajnoœæ. Na podstawie oszacowanej wartoœci niepewnoœci mo¿na okreœliæ przydatnoœæ da-nej metody analityczda-nej. Okreœlenie rozszerzoda-nej nie-pewnoœci badanej metody analitycznej pozwala mówiæ o jakoœci wyników osi¹ganych za pomoc¹ danej meto-dy. Niepewnoœæ jest parametrem zwi¹zanym z wyni-kiem pomiaru, który okreœla przedzia³ wokó³ wartoœci œredniej, w którym mo¿e znaleŸæ siê wartoœæ oczekiwa-na. Niepewnoœæ pomiaru jest sk³adow¹ niepewnoœci wszystkich pojedynczych etapów postêpowania anali-tycznego.
Źród³em niepewnoœci w trakcie badania próbki krwi za pomoc¹ niniejszej procedury s¹ m.in.:
a) niepewnoœæ zwi¹zana z etapem kalibracji chro-matografu gazowego (ukal), na któr¹ sk³adaj¹ siê: • powtarzalnoœæ odczytu wartoœci sygna³u Ri za-równo dla próbek wzorcowych – na podstawie
których wykreœlono krzyw¹ kalibracyjn¹, jak i badanych próbek krwi (ukrz),
• sposób przygotowania próbek wzorcowych (uprzSTD),
• niepewnoœæ zwi¹zana z wyznaczeniem wartoœci odniesienia dla próbek wzorcowych (uSTD) – z danych producenta certyfikowanych materia³ów odniesienia,
b) standardowa niepewnoœæ zwi¹zana z przygoto-waniem próbek krwi (upr).
Wp³yw poszczególnych Ÿróde³ niepewnoœci przed-stawiono, stosuj¹c diagram Ishikawy (ryc. 4).
Pominiêto niepewnoœæ wyznaczenia sta³ej Hen-ry’ego dla alkoholu oraz niepewnoœæ wyznaczenia ob-jêtoœci naczynek chromatograficznych, ze wzglêdu na niewielki ich wk³ad w sumaryczny bud¿et niepewnoœci. Bior¹c pod uwagê wszystkie sk³adowe przedstawione w diagramie Ishikawy, wzglêdn¹ niepewnoœæ wyzna-czenia stê¿enia alkoholu w próbce krwi mo¿na zapisaæ nastêpuj¹co:
Ryc. 4. Wp³yw poszczególnych parametrów na wartoœæ niepewnoœci oznaczenia alkoholu etylowego we krwi cz³owieka przedstawiono, stosuj¹c diagram Ishikawy
Fig. 4. Effect of specific parameters on value of uncertainty in determination of ethyl alcohol in human blood are presented on Ishikawa diagram UprzSTD
i
Na niepewnoœæ metody wyznaczenia stê¿enia alko-holu metod¹ chromatografii gazowej head-space wp³y-waj¹ przedstawione poni¿ej zmienne. Aby oszacowaæ niepewnoœæ wyznaczenia stê¿enia alkoholu metod¹ chromatografii gazowej, nale¿y przedstawiæ funkcjê wi¹¿¹c¹ zmienne ze stê¿eniem alkoholu w próbce krwi: c0
gdzie:
c0 – stê¿enie alkoholu etylowego w próbce krwi odczytane z krzywej kalibracyjnej [‰],
Rs – pole powierzchni piku etanolu w nieznanej próbce, RSTD – pole powierzchni piku standardu wewnêtrznego t-butanolu w nieznanej próbce,
ciSTD – stê¿enie i-tego wzorca alkoholu,
VSTD – objêtoœæ dodawanego i-tego wzorca alkoholu etylowego na etapie kalibracji, zawsze 100 μl,
VISSTD – objêtoœæ dodawanego standardu wewnêtrznego na etapie kalibracji, zawsze 1000 μl,
Ri – stosunek powierzchni wzorca alkoholu etylowego do powierzchni piku standardu wewnêtrznego,
V0 – objêtoœæ krwi pobrana do badañ zawsze 100 μl, V0STD – objêtoœæ standardu wewnêtrznego dodawana do próbki krwi, zawsze 1000 μl,
a nastêpnie obliczyæ zgodnie z prawem propagacji b³êdu wartoœæ rozszerzonej niepewnoœci wed³ug wzo-ru:
gdzie:
Xi – kolejne zmienne,
c0 – stê¿enie alkoholu uzyskane z badañ, k – wspó³czynnik rozszerzenia.
Do wyznaczenia niepewnoœci objêtoœci VSTD, VISSTD, V0, V0STDuwzglêdniono dane zawarte w
cer-2 2 2 0 kal pr C
u
u
u
=
+
)
,
,
,
,
,
,
,
(
0 0 0 STD STD IS STD STD i i STD SR
R
c
V
V
V
V
R
f
c
=
2 2 2 2 STD krz przSTD kalu
u
u
u
=
+
+
∑
−⎟⎟⎠
⎞
⎜⎜⎝
⎛
=
n i i i cX
X
c
kc
U
1 2 0 0 0δ
δ
δ
Tabela 4 Zestawienie danych zawartych w certyfikatach CRM oraz obliczonych na podstawie danych z certyfikatów CRMComparison of data comprised in CRM certificates and calculated basing on data from CRM certificates
*W przypadku firmy Merck nie podano na jakim poziomie ufnoœci zosta³a oznaczona wartoœæ stê¿enia, wiêc niepewnoœæ standardow¹ obliczono ze wzoru:
‰
0231
,
0
3
‰
99
,
1
-‰
03
,
2
4=
=
STD cu
tyfikatach jakoœci, do³¹czonych przez producenta pi-pet, firmê Eppendorf (Niemcy) (tab. 4).
W obliczeniach uwzglêdniono iloœæ odmierzeñ prze-prowadzanych ka¿d¹ z pipet.
W celu wyznaczenia niepewnoœci etapu kalibracji sporz¹dzono krzyw¹ kalibracyjn¹ dla stê¿eñ 0,10‰, 0,20‰, 0,50‰, 2,0‰ i 5,0‰.
Dla ka¿dego ze stê¿eñ zarejestrowano po cztery se-rie wyników dla ka¿dej z kolumn. Przygotowano prób-kê krwi o stê¿eniu oczekiwanym alkoholu etylowego na poziomie oko³o 0,5‰, dla której zarejestrowano po piêæ wyników na ka¿dej z kolumn A i B.
Niepewnoœæ standardow¹ zwi¹zan¹ z przeprowa-dzeniem kalibracji i zastosowaniem metody regresji li-niowej obliczono z poni¿szego wzoru:
gdzie:
sCR– resztkowe odchylenie standardowe,
p – liczba pomiarów (powtórzeñ) wykonanych dla badanej próbki krwi, (p = 5),
n – liczba punktów kalibracyjnych,
cpr – œrednie stê¿enie alkoholu w próbce wzorcowej od-czytane za pomoc¹ wyznaczonej krzywej kalibracyjnej,
cœr – œrednia ze wszystkich wartoœci stê¿eñ roztworów wzorcowych, dla których wykonano pomiar w celu sporz¹dze-nia krzywej wzorcowej,
QCRРwartoϾ opisana wzorem:
a – wspó³czynnik nachylenia wyznaczonej krzywej kalibra-cji,
b – wartoœæ odciêtej z wyznaczonej krzywej kalibracji.
Otrzymane wyniki cz¹stkowe zestawiono w tabeli 5. Wspó³czynnik kierunkowy oraz odciêt¹ krzywej kalibra-cyjnej obliczono, stosuj¹c metodê najmniejszych kwa-dratów.
B³¹d stê¿enia alkoholu w jego roztworach wzorco-wych odczytano ze œwiadectw certyfikowanych materia-³ów odniesienia, wystawionych przez producenta, firmê Cerilliant, dostarczanych przez dostawcê, firmê LGC Standards (USA) oraz œwiadectw CRM, wystawionych przez firmê Merck KgaA (Darmstadt, Niemcy). Œrednie stê¿enie oraz œredni¹ niepewnoœæ standardow¹ dla wy-ników z kolumny A i B uzyskano, posi³kuj¹c siê poni¿-szymi wzorami i otrzymano nastêpuj¹ce wyniki:
Zbiorcze wyniki przedstawiono w tabelach 6 i 7. Nastêpnie porównano obliczon¹ wartoœæ niepewno-œci z odchyleniem standardowym, uzyskanym dla œred-niej z próbek kontrolnych o stê¿eniu 0,50‰ alkoholu etylowego.
Do obliczeñ œredniej brano pod uwagê wyniki po-miêdzy kolejnymi kalibracjami wykonanymi po bada-niach walidacyjnych (wyniki zestawiono w tabeli 8).
Omówienie wyników
1. Dla próbki o stê¿eniu 0,5‰ alkoholu etylowego niepewnoœæ standardowa wynosi 0,02‰, niepew-noœæ rozszerzona (przy wspó³czynniku rozsze-rzenia k = 2) wynosi 0,04‰.
2. Najwiêkszy wk³ad do bud¿etu niepewnoœci (86%) wnosi wyznaczenie krzywej kalibracyjnej i odczy-tanie z niej wartoœci stê¿enia oraz czystoœæ certy-fikowanego materia³u odniesienia (13%). Wk³ad obu tych czynników jest zrozumia³y, gdy¿ zawar-toœæ alkoholu w badanych próbkach, a tak¿e we wzorcach jest niewielka. Wk³ad pozosta³ych czynników: przygotowania roztworów wzorco-wych oraz próbek krwi jest równy 1%.
3. Certyfikowany materia³ odniesienia c4STD (firmy
Merck) o stê¿eniu 2,0‰ odbiega zdecydowanie
Tabela 5 Wyniki cz¹stkowe do obliczeñ ukrzdla kolumn A i B Partial results for calculation of Ukrzfor columns A and B
°° °
=
+
+
=
0
,
499
1
1
1
*
1
*
2 2 2 2 0 krzB krzA krzB krzAu
u
u
c
u
c
c
prB prA °° °=
+
=
0
,
017
1
1
1
2 2 krzB krzAu
u
u
krz∑
= − n i œr i c c 1 2 ) ( CR œr pr CR krzQ
c
c
n
p
a
s
u
2)
(
1
1
−
+
+
=
,jakoœci¹ od pozosta³ych (firmy Cerilliant), gdy¿ je-go wk³ad w uSTDjest najwiêkszy.
4. Odchylenie standardowe obliczone na podstawie próbek kontrolnych pozostaje w zgodzie z pewnoœci¹ obliczon¹ na podstawie bud¿etu nie-pewnoœci.
5. Proces walidacji wraz z oszacowaniem bud¿etu niepewnoœci przedstawionej procedury analitycz-nej w pe³ni potwierdzi³ jej przydatnoœæ do zamie-rzonego zastosowania.
6. Wykonywanie badañ na optymalnym poziomie ja-koœciowym, tak aby uzyskiwane wyniki badañ by-³y jak najbardziej rzetelne, wiarygodne oraz obar-czone jak najmniejsz¹ niepewnoœci¹, a tak¿e sta-le rosn¹ce wymagania odnoœnie do wysokich standardów pracy laboratorium, powoduj¹, ¿e walidacja jest niezwykle wa¿nym i nieuniknionym elementem potwierdzaj¹cym prawid³owe funkcjo-nowanie ka¿dej pracowni, w której przeprowa-dzane s¹ badania p³ynów ustrojowych na zawar-toœæ alkoholu etylowego.
BIBLIOGRAFIA
1. „EA-04/16 Wytyczne EA dotycz¹ce wyra¿ania niepew-noœci w badaniach iloœciowych”, grudzieñ 2003 r.
2. „EURACHEM CITAC Guide Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement” – QUAM:2000.P1.
Tabela 6 Zmienne wp³ywaj¹ce na niepewnoœæ wyznaczenia
stê¿enia alkoholu etylowego metod¹ chromatografii gazowej head-space Variables influencing uncertainty of determining
ethyl alcohol concentrations by means of head-space gas chromatography
Tabela 7 Udzia³ % Ÿróde³ niepewnoœci wchodz¹cych w sk³ad
bud¿etu niepewnoœci
Percentages of sources of uncertainty comprised in uncertainty budget
Tabela 8 Porównanie wartoœci niepewnoœci uzyskanej w wyniku oszacowania z wynikami rzeczywistymi
3. Guba³a W.: Toksykologia alkoholu – wybrane zagadnienia, Wyd. IES, Kraków 1997.
4. Materia³y z warsztatów „Metrologia chemiczna”, zorga-nizowanych w ramach targów EuroLab – XI Miêdzynarodowe Targi Analityki i Technik Pomiarowych” – 5.03.2009 r.
5. Metodyka oznaczania jakoœciowego i iloœciowego alkoholu etylowego w p³ynach ustrojowych cz³owieka metod¹ chromatografii gazowej head-space, nr HJ/W-60/IV/08, wyd. 23.12.2008 r.
6. Niepewnoœæ pomiaru raz jeszcze. Ró¿ne podejœcia do szacowania niepewnoœci – Raport techniczny nr 1/2007 – EUROLAB, marzec 2007.
7. Norma PN-EN ISO/IEC 17025:2005 + Ap1:2007 – Ogólne wymagania dotycz¹ce kompetencji laboratoriów ba-dawczych.
8. Ocena i kontrola jakoœci wyników pomiarów analitycz-nych, P. Konieczka i J. Namieœnik [red.], Wyd. WNiT, War-szawa 2007.
9. Podrêcznik obliczania niepewnoœci pomiaru w laborato-riach œrodowiskowych, Biuletyn Informacyjny Klubu POLLAB 2/51/2008, wersja 3, styczeñ 2008 r.
10. Rozporz¹dzenie Ministra Zdrowia i Opieki Spo³ecznej z dnia 6 maja 1983 roku w sprawie warunków i sposobu do-konywania badañ na zawartoœæ alkoholu w organizmie, DzU z 1983 roku, nr 25, poz. 117.
11. Rödel W., Wölm G.: Chromatografia gazowa, Wydaw. Nauk. PWN, Warszawa 1992.
12. Taylor J.R.: Wstêp do analizy b³êdu pomiarowego, Wydaw. Nauk. PWN, Warszawa 1995.
13. Ustawa z dnia 26 paŸdziernika 1982 roku o wychowa-niu w trzeŸwoœci i przeciwdzia³awychowa-niu alkoholizmowi, tekst jedn. DzU z 2002 roku, nr 147, poz. 1231 z póŸn. zm.
14. Ustawa z dnia 20 czerwca 1997 roku Prawo o ruchu drogowym, tekst jedn. DzU z 2003 roku, nr 58, poz. 515 z póŸn. zm.
15. Zasady przeprowadzania pomiarów stê¿enia alkoholu oraz opiniowania w sprawach trzeŸwoœci. Zalecenia opraco-wane przez Instytut Ekspertyz S¹dowych zatwierdzone przez Zarz¹d G³ówny Polskiego Towarzystwa Medycyny S¹dowej i Kryminologii w dniu 26 listopada 2004 roku, „Prokuratura i Prawo” 2005, nr 4.
16. Zuba D.: Niepewnoœæ pomiarowa wyznaczania stê¿e-nia alkoholu we krwi, „Z Zagadnieñ Nauk S¹dowych” 2003, nr LIV.
Streszczenie:
Oznaczanie jakoœciowe i iloœciowe alkoholu etylowego w ma-teriale biologicznym wyznaczane jest metod¹ chromatografii ga-zowej head-space w Wydziale Fizykochemii CLK KGP, zgodnie z Procedur¹ badawcz¹ nr HJ-60/Pb-IV/3/08 „Oznaczanie za-wartoœci alkoholu etylowego we krwi cz³owieka metod¹ chroma-tografii gazowej head-space”. Ww. metoda jest metod¹ z wybo-ru, o najwy¿szym stopniu swoistoœci. O szerokim zastosowaniu tej metody decyduj¹ jej g³ówne zalety, m.in.: ³atwoœæ
przygoto-wania próbek do analizy, potrzeba niewielkiej iloœci materia³u przeznaczonego do badañ, szybka mo¿liwoœæ wykrycia i wyko-nania oznaczenia oczekiwanej substancji w trakcie jednego cy-klu badawczego, mo¿liwoœæ wykonania du¿ej liczby prób w krót-kim czasie, a tak¿e czu³oœæ pomiaru oraz du¿a selektywnoœæ w stosunku do etanolu.
Pracownia badañ p³ynów ustrojowych na zawartoœæ alkoho-lu etylowego Wydzia³u Fizykochemii CLK KGP d¹¿y do przeprowadzania badañ na optymalnym poziomie jakoœciowym, tak aby uzyskiwane wyniki badañ by³y miarodajne, obiektywne i jak najbardziej rzetelne. Dziêki przeprowadzonej walidacji z du¿ym prawdopodobieñstwem mo¿na powiedzieæ, ¿e proces analizy przebiega w sposób prawid³owy oraz ¿e daje precyzyjne i wiarygodne wyniki.
S³owa kluczowe:metoda chromatografii gazowej head-spa-ce, walidacja, liniowoœæ, granica wykrywalnoœci i oznaczalnoœci, powtarzalnoœæ, odtwarzalnoœæ, niepewnoœæ pomiaru, bud¿et niepewnoœci.
Summary
Qualitative and quantitative determination of ethyl alcohol in body fluids is performed by means of head-space gas chroma-tography in Physics and Chemistry Department of the Central Forensic Laboratory of Polish Police in conformity to Analytical procedure no. HJ-60/Pb-IV/3/08 “Determination of ethyl alco-hol in human blood by means of head-space gas chromatogra-phy”. The aforementioned method was deliberately selected for its highest specificity. The widespread use of this method is con-ditioned by its main advantages, such as: easy preparation of samples for analysis, small quantities of test material required, detection and determination can be completed within one analy-tical cycle, large number of tests can be completed in a short ti-me, measurements of high sensitivity and selectivity to ethanol. The team of “alcohol in blood” determination in the Physics and Chemistry Department of the Central Forensic Laboratory of Polish Police is aiming at achieving an optimal qualitative le-vel of analyses, so that the results were relevant, impartial and reliable. Upon the completion of the validation one might state with a greater certainty that the process of analysis is performed correctly and provides accurate and reliable results.
Keywords:head-space gas chromatography method, valida-tion, linearity, detection and determinability limit, repeatability, reproducibility, measurement uncertainty, uncertainty budget.
Autorka sk³ada podziêkowania p. Wiktorowi Dmitrukowi za okazan¹ pomoc i cenne wskazówki w trakcie przeprowadzania badañ walidacyjnych.
