Platelia ™ VZV IgG
1 płytka - 48 72684
TEST IMMUNOENZYMATYCZNY DO WYKRYWANIA PRZECIWCIAŁ KLASY IgG PRZECIWKO WIRUSOWI VARICELLA-ZOSTER W LUDZKIEJ SUROWICY
2014/12
SPIS TREŚCI
1. ZASTOSOWANIE 2. ZNACZENIE KLINICZNE 3. ZASADA TESTU
4. SKŁAD ZESTAWU
5. PRZECHOWYWANIE I TRWAŁOŚĆ ODCZYNNIKÓW 6. ZALECENIA I OSTRZEŻENIA
7. PRÓBKI 8. PROCEDURA
9. SCHEMAT PROCEDURY TESTU 10. WALIDACJA TESTU
11. INTERPRETACJA WYNIKÓW 12. OGRANICZENIA METODY 13. SWOISTOŚĆ ANALITYCZNA
14. CZUŁOŚĆ I SWOISTOŚĆ DIAGNOSTYCZNA 15. PRECYZJA
16. NAJCZĘSTSZE PROBLEMY 17. LITERATURA
1. ZASTOSOWANIE
TEST IMMUNOENZYMATYCZNY DO WYKRYWANIA PRZECIWCIAŁ KLASY IgG PRZECIWKO WIRUSOWI VARICELLA-ZOSTER W LUDZKIEJ SUROWICY
2. ZNACZENIE KLINICZNE
Wirus ospy wietrznej-półpaśca (VZV) jest czynnikiem etiologicznym ospy wietrznej (varicella) i półpaśca (zoster). Wirus należy do rodziny herpeswirusów. Zakażenie przenosi się przez kontakt bezpośredni. Ospa wietrzna jest wysoce zakaźną chorobą wieku dziecięcego, będącą wynikiem zakażenia pierwotnego wirusem VZV. Zakażenie kobiety w ciąży może spowodować wady rozwojowe u dziecka; jeśli występuje w końcowym okresie ciąży, może prowadzić do śmierci noworodka. Półpasiec najczęściej występuje u dorosłych i jest wynikiem reaktywacji wirusa, pozostającego w stanie latencji w zwojach czuciowych osób, które przebyły ospę wietrzną. Objawem jest bardzo bolesna wysypka pęcherzykowa, występująca wzdłuż przebiegu zajętych nerwów. Metody serologiczne pozwalają określić stopień uodpornienia i podatność na zakażenie (zwłaszcza pacjentów podlegających immunosupresji) oraz umożliwiają pre- i postnatalną diagnostykę zakażeń wewnątrzmacicznych.
3. ZASADA TESTU
Test Platelia™ VZV IgG jest oparty na immunoenzymatycznej technice ELISA. Częściowo oczyszczony i zinaktywowany antygen wirusa VZV jest związany z fazą stałą (paski po 8 studzienek). Podczas inkubacji z rozcieńczoną ludzką surowicą, z antygenem wiążą się swoiste immunoglobuliny. Po inkubacji, nie swoiste immunoglobuliny i białka surowicy zostają usunięte podczas płukania. Następnie dodawany jest koniugat, zawierający przeciwciała monoklonalne przeciwko ludzkim IgG, znakowane peroksydazą. Nadmiar
koniugatu jest usuwany podczas płukania. Wykrycie kompleksu immunologicznego następuje przez dodanie roztworu substratu dla peroksydazy / chromogenu, wywołującego reakcję barwną. Natężenie niebieskiej barwy jest proporcjonalne do stężenia swoistych przeciwciał w badane próbce. Po zatrzymaniu reakcji enzymatycznej przez dodanie roztworu kwasu siarkowego, barwa studzienek zmienia się na żółtą. Gęstość optyczną odczytuje się spektrofotometrycznie. Uzyskana wartość OD jest proporcjonalna do ilości
przeciwciał IgG anty-VZV.
4. SKŁAD ZESTAWU
- Odczynniki wystarczają na 48 oznaczeń.
- Przed użyciem przenieść odczynniki do temperatury pokojowej.
MT PLATE MIKROPŁYTKA. (gotowa do użycia) 3 x 2 paski po 8 studzienek opłaszczonych wirusem Varicella-Zoster.
Użycie: Opakowanie otworzyć po przeciwnej stronie niż kod (ZG + nr serii), potrzebny do identyfikacji płytki, i wyjąć potrzebną ilość pasków. Pozostałe paski zamknąć szczelnie w oryginalnej torebce z pochłaniaczem wilgoci, usuwając powietrze przed zamknięciem.
CONTROL + KONTROLA DODATNIA (gotowa do użycia) 1 x 1.6 ml
Zawartość: Ludzka surowica, zawierająca przeciwciała IgG anty-VZV,
rozcieńczona w 0.01 M buforze fosforanowym + 1% BSA + 0.09% azydek sodu.
Barwa: proporcjonalna do względnego miana przeciwciał.
CONJ KONIUGAT. (gotowy do użycia) 1 x 10 ml
Przeciwciała monoklonalne anty-IgG, znakowane peroksydazą chrzanową, w buforze fosforanowym + 0.05% fenol i 0.02% Bronidox.
CONTROL CUT OFF KONTROLA DODATNIA CUT-OFF. (gotowa do użycia) 1 x 2.0 ml Zawartość: Ludzka surowica, zawierająca przeciwciała IgG anty-VZV,
rozcieńczona w 0.01 M buforze fosforanowym + 1% BSA + 0.09% azydek sodu.
Barwa: proporcjonalna do względnego miana przeciwciał
CONTROL IgG - KONTROLA UJEMNA (PF93910). (gotowa do użycia) 1 x 1.6 ml IgG-WYMIENNA POMIĘDZY SERIAMI
Zawartość: Ludzka surowica nie zawierająca przeciwciał IgG anty-VZV,
rozcieńczona w 0.01 M buforze fosforanowym + 1% BSA + 0.09% azydek sodu.
WASH BUF BUFOR DO PŁUKANIA (10 x stężony) (PF93603). 1 x 100 ml WYMIENNY POMIĘDZY SERIAMI
Skład: Sól zbuforowana fosforanem + 0.5% Brij Przygotowanie: Rozcieńczyć potrzebną ilość w stosunku 1:10 wodą destylowaną. W przypadku krystalizacji, przed rozcieńczeniem rozpuścić osad w temp. 37°C.
SAMP DIL ROZCIEŃCZALNIK PRÓBEK (PF93601). (stężony 50x) 1 x 100 ml WYMIENNY POMIĘDZY SERIAMI
Zawartość: Roztwór białek + 0.05% fenol i 0.02% Bronidox. Przygotowanie:
Rozcieńczyć potrzebną ilość w stosunku 1:50 buforem do płukania.
SUBS TMB SUBSTRAT (PF93619). (gotowy do użycia) 15 ml WYMIENNY POMIĘDZY SERIAMI
Zawartość: Czterometylobenzydyna (0.26mg/ml) i 0.01% nadtlenek wodoru, stabilizowana w 0.05 M buforze cytrynianowym (pH 3.8).
H2SO4 0.3 M Roztwór zatrzymujący (PF93602). (gotowy do użycia) 1 x 16 ml WYMIENNY POMIĘDZY SERIAMI
H2SO4 0.3 M kwas siarkowy FOLIA ADHEZYJNA (2)
TOREBKA POLIETYLENOWA (1)
INNE NIEZBĘDNE MATERIAŁY I SPRZĘT
• Cieplarka na 37°C
• Czytnik mikropłytek (długość fali 450 lub 450/620 nm; odczyt liniowy co najmniej do OD = 2000).
• Płuczka mikropłytek, pobierająca objętość 225-375 µl.
• Jałowa woda destylowana lub dejonizowana
• Szkło laboratoryjne: cylindry miarowe, próbówki, itp.
• Pipety pobierające 10 µl, 100 µl i 1000 µl.
• Pojemnik na materiał zakaźny i zanieczyszczone odpady
• 5% Podchloryn sodu (wybielacz)
• Rękawiczki jednorazowe
• Timer
• Bibuła
5. PRZECHOWYWANIE I TRWAŁOŚĆ ODCZYNNIKÓW
Odczynniki należy przechowywać w temp. 2-8°C. Data ważności jest wydrukowana na każdym odczynniku i na opakowaniu zewnętrznym.
Po otwarciu odczynniki mają określona trwałość:
ODCZYNNIK WARUNKI PRZECHOWYWANIA
Mikropłytka 5 tygodni w temp. 2-8°C w torebce polietylenowej Surowice wzorcowe 5 tygodni w temp. 2-8°C
Koniugat 5 tygodni w temp. 2-8°C
Substrat Zgodnie z datą ważności w temp. 2-8°C, 1 tydzień w temp. 15-30°C, w ciemności Rozcieńczalnik próbek Gotowy do użycia, 2 tygodnie w temp. 2-8°C
Bufor do płukania 2 tygodnie w temp. 2-8°C, 5 dni w temp. 15-30°C Roztwór zatrzymujący Zgodnie z datą ważności w temp. 2-8°C
6. ZALECENIA I OSTRZEŻENIA
ODCZYNNIKI WYŁĄCZNIE DO DIAGNOSTYKI IN VITRO
Zestaw zawiera materiał pochodzenia ludzkiego, przebadany technikami zatwierdzonymi przez FDA i określony jako ujemny pod względem antygenu HBs i przeciwciał anty-HIV-1, anty-HIV-2 i anty-HCV.
Ponieważ nie ma metod absolutnie wykluczających obecność czynników zakaźnych, odczynniki pochodzące z materiału ludzkiego powinny być traktowane jako materiał potencjalnie zakaźny.
Higiena i bezpieczeństwo pracy
1. Nie pipetować ustami. Podczas pracy z odczynnikami i próbkami należy używać okularów ochronnych i rękawiczek jednorazowych, a po pracy dokładnie umyć ręce.
2. Następujące odczynniki zawierają niskie stężenie związków szkodliwych lub drażniących:
a) bufor do płukania zawiera detergenty b) koniugat zawiera fenol
c) substrat ma odczyn kwaśny
d) surowice wzorcowe zawierają 0.09% azydek sodu, który może reagować z miedzią i ołowiem w kanalizacji, tworząc wysoce wybuchowe azydki metali. Po wylaniu do zlewu spłukać dużą ilością wody.
3. Sprzęt wielokrotnego użytku należy wysterylizować po użyciu. Zaleca się autoklawowanie przez co najmniej godzinę w temp. 121°C; materiały jednorazowe należy autoklawować lub spalać.
4. Kwas siarkowy w roztworze zatrzymującym i kwas solny używany do płukania szkła laboratoryjnego są związkami żrącymi i wymagają ostrożnego obchodzenia się. W przypadku kontaktu ze skórą lub z oczami, przemyć dużą ilością wody.
5. Do neutralizacji kwasów i dekontaminacji innych płynnych odpadów używać podchlorynu sodu w
końcowym stężeniu (po zmieszaniu z odpadem) 1.0%. 30-minutowa ekspozycja na 1% podchloryn sodu jest wystarczająca dla efektywnej dekontaminacji.
6. Rozlany materiał zakaźny zebrać szybko bibułą, a zanieczyszczoną powierzchnię przemyć 1.0%
roztworem podchlorynu i osuszyć, przed kontynuacją pracy. W przypadku rozlania kwasu należy dokładnie wytrzeć powierzchnię przed zmyciem podchlorynem sodu. Materiał używany do czyszczenia, w tym rękawiczki, wyrzucić do pojemnika na skażone odpady. Nie autoklawować roztworów
zawierających podchloryn sodu.
7. W celu zapoznania sie z zaleceniami dotyczacymi zagrozen i srodkow ostroznosci zwiazanych z niektorymi substancjami chemicznymi zawartymi w niniejszym zestawie nalezy skorzystac z piktogramow wskazujacych rodzaj zagrozenia znajdujacych sie na etykietach i w informacjach zamieszczonych na koncu instrukcji obslugi. karta charakterystyki jest dostepna na stronie internetowej www.bio-rad.com.
Uzyskanie prawidłowego wyniku zależy od przestrzegania zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej:
1 Przed użyciem przenieść próbki i odczynniki do temperatury pokojowej (18-30°C). Po użyciu od razu schować odpowiednie odczynniki do lodówki. Ważne jest zachowanie podczas pracy odpowiedniej temperatury; nie może ona spadać poniżej 35°C i przekraczać 39°C. Potrzebne do testu paski wyjąć z opakowania i co najmniej 1/2 godziny trzymać w temp. pokojowej.
2 Nie używać odczynników po upływie terminu przydatności, unikając zanieczyszczenia mikrobiologicznego.
3 Nie zmieniać opisanej procedury ani nie używać odczynników innych producentów i z innych serii, o ile odczynnik nie jest oznaczony jako stosowany zamiennie. Nie skracać zalecanego czasu inkubacji.
4 Używać szkła dokładnie umytego, przepłukanego 2M kwasem solnym, wodą destylowaną lub wysokiej jakości wodą dejonizowaną, i wysuszonego, lub, co jest wskazane, materiałów jednorazowych.
5 Podczas przechowywania ani na etapach inkubacji nie eksponować odczynników na światło lub pary podchlorynu.
6 Nie dopuszczać do wysuszenia mikropłytki na kolejnych etapach procedury.
7 Unikać krzyżowego zanieczyszczenia odczynników; do każdego używać innej pipety.
8 Uważnie nanosić koniugat, nie dotykając końcówką krawędzi płytki i nie doprowadzać do przelania się zawartości studzienki.
9 Test immunoenzymatyczny może czasem wykazywać „efekt brzeżny”, który należy zminimalizować zwiększając wilgotność podczas inkubacji. Płytka podczas inkubacji w temp. 37°C musi być nakryta pokrywką i umieszczona w statywie lub na platformie w łaźni wodnej, albo inkubowana w cieplarce.
Alternatywnie, oznaczenie można wykonywać automatycznie i wówczas płytka jest inkubowana w aparacie. Nie używać inkubatorów CO2.
10 Przed odczytem dokładnie osuszyć spód mikropłytki i sprawdzić, czy w studzienkach nie ma pęcherzyków powietrza.
11 Dla próbek silnie zhemolizowanych, niecałkowicie odwłóknionych lub zanieczyszczonych mikrobiologicznie można uzyskać błędne wyniki.
12 Stosowanie tego zestawu z urządzeniami automatycznymi produkcji innej niż Bio-Rad, musi być uzasadnione przez użytkownika.
13 Należy zapoznać się z instrukcją obsługi używanej aparatury:
- instalacja i szczegóły wyposażenia
- zasada działania, instrukcja, ostrzeżenia i zagrożenia - specyfikacje producenta i charakterystyka aparatu - serwis i konserwacja.
7. PRÓBKI
Próbki krwi należy pobrać zgodnie z rutynową procedurą, z wkłucia dożylnego. Z próbkami postępować przestrzegając zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej. Jeśli test będzie wykonany w ciągu 4 dni, próbki można przechować w temp. +2-8°C. Jeśli test będzie wykonany później, lub próbki będą transportowane, należy je zamrozić w temp. -20°C lub niższej. Próbki można zamrozić i rozmrozić najwyżej 3 razy. Po rozmrożeniu próbki należy dokładnie wymieszać przed oznaczeniem. Inaktywacja termiczna i
zanieczyszczenie mikrobiologiczne może powodować błędne wyniki. Należy unikać próbek silnie lipemicznych, żółtaczkowych i zanieczyszczonych.
Do testu nie nadaje się osocze.
8. PROCEDURA
- Przygotować potrzebną liczbę pasków.
- Przygotować bufor do płukania rozcieńczając stężony bufor 10x (100 ml + 900 ml wody).
Rozcieńczyć próbki 1:101 dodając 10 µl surowicy do 1 ml rozcieńczalnika. Do studzienek nanieść po 100 µl rozcieńczonych próbek (zaleca się oznaczenie w duplikacie). Do kolejnych studzienek nanieść po 100 µl NIEROZCIEŃCZONYCH surowic wzorcowych: co najmniej 1 kontrolę ujemną, 2 kontrole cut-off i 1 kontrolę dodatnią. Jedną studzienkę pozostawić na ślepą próbę, jaką jest 100 µl mieszaniny substratu. Studzienki zakryć folią adhezyjną i inkubować przez 45 minut w temp. 37°C. Przepłukać 4 razy przez 30 sekund (300 µl) i dodać do każdej studzienki 100 µl koniugatu (z wyjątkiem ślepej próby). Zakryć szczelnie mikropłytkę folią adhezyjną i inkubować przez 45 minut w temp. 37°C. Ponownie przepłukać 4 razy jak poprzednio.
Następnie do każdej studzienki dodać 100 µl substratu. Po 15 minutach inkubacji w temp. pokojowej zatrzymać reakcję enzymatyczną przez dodanie do każdej studzienki 100 µl roztworu zatrzymującego.
Odczytać wartość absorbancji (OD) przy długości fali 450 nm lub 450/620 nm w czasie 30 minut po zatrzymaniu reakcji.
9. Schemat procedury testu Platelia™ VZV IgG
ETAP1 Do studzienek nanieść po 100 µl rozcieńczonych próbek/ nierozcieńczonych kontroli Inkubować przez 45 minut w temp. 37°C
Przepłukać 4 razy przez 30 sekund (300 µl)
ETAP 2 Do każdej studzienki nanieść 100 µl koniugatu (oprócz ślepej próby) Inkubować przez 45 minut w temp. 37°C
Przepłukać 4 razy przez 30 sekund (300 µl)
ETAP 3 Do każdej studzienki nanieść 100 µl substratu Inkubować przez 15 minut w temp. pokojowej
ETAP 4 Do każdej studzienki nanieść 100 µl roztworu zatrzymującego Odczytać absorbancję przy 450 nm w czasie 30 minut
10. WALIDACJA TESTU
Od odczytanych wartości OD odjąć wartość OD dla ślepej próby (≤ 150). Żadna z wartości OD kontroli cut- off, oznaczonej w tryplikacie, nie może odbiegać od średniej o 25%. Wartość, która odbiega o ponad 25%, należy pominąć i obliczyćśrednią dla dwóch pozostałych. Aby wyniki testu były ważne, muszą być
spełnione odpowiednie kryteria - uzyskanie wartości gęstości optycznej:
OD kontroli dodatniej ≥ 1.5 x OD kontroli cut-off. OD kontroli ujemnej / OD kontroli cut-off < 0.6 OD kontroli cut-off ≥ 0.2 przy 450 nm i ≥ 0.16 przy 450/620 nm
Jeśli nie spełnione są kryteria kontroli jakości, test należy powtórzyć.
11. INTERPRETACJA WYNIKÓW
WYNIKI JAKOŚCIOWE Jeśli absorbancja próbki jest wyższa niż absorbancja kontroli cut-off, próbka jest dodatnia pod względem swoistych przeciwciał IgG. Obliczyć iloraz wartości OD próbki i OD kontroli cut-off (INDEX). Wynik dodatni: iloraz > 1.2 Wynik wątpliwy: ± 20% wartości cut-off Wynik ujemny: iloraz < 0.8 W przypadku wyników wątpliwych zaleca się powtórzenie testu. Jeśli wynik kolejnego testu jest wątpliwy, należy pobrać i oznaczyć nową próbkę.
12. OGRANICZENIA METODY
Dla próbek pobranych w ostrej fazie zakażenia, gdy występują jedynie przeciwciała klasy IgM, można uzyskać wyniki ujemne. Przeciwciała klasy IgM anty-VZV można wykryć w teście Platelia™ VZV IgM.
Alternatywnie, w drugiej próbce pobranej 8-14 dni później można równolegle oznaczyć wzrost miana przeciwciał IgG. Wyniki testu należy interpretować w kontekście danych klinicznych, historii choroby pacjenta i wyników innych testów laboratoryjnych.
13. SWOISTOŚĆ ANALITYCZNA
Na wynik testu nie wpływają przeciwciała IgG przeciwko innym wirusom: różyczki, Epsteina Barr, herpes simplex, świnki i odry.
14. CZUŁOŚĆ I SWOISTOŚĆ DIAGNOSTYCZNA
W badaniu klinicznym, prowadzonym w laboratorium szpitalnym, oznaczono 47 próbek, stosując równolegle inną komercyjną metodę immunoenzymatyczną. Próbki, dla których uzyskano wyniki niezgodne, testowano referencyjną metodą IFA. Wyniki przedstawia tabela:
+
Platelia™ VZV IgG -
METODA REFERENCYJNA + -
29 0
3 15
Czułość testu Platelia™ VZV IgG określono na 90.63%, a swoistość na 100%.
15. PRECYZJA
Powtarzalność wewnątrz-testowa dla odczynników 3 serii Cut-off n=21 Seria 029 Seria 030 Seria 031
D.O. 0.451 0.457 0.362
CV% 10 7 5
Powtarzalność pomiędzy-testowa dla odczynników różnych serii INDEX
Próbka Seria 029 Seria 030 Seria 031 Średnia CV%
1 0.3 0.4 0.3 0.3 23
2 1.5 1.0 1.7 1.7 10
3 3.0 3.0 3.3 3.1 5
16. NAJCZĘSTSZE PROBLEMY
17. LITERATURA
1. E.H. Wasmuth and W.J. Miller: J. Med. Virology 32: 189 (1990).
2. M.L. Landry, S.D. Cohen, D. Mayo, C. Fong, W. Andiman: J. Clin. Microbiology 25: 832 (1987).
3. P. Larussa, S. Steinberg, et al. J. Clin. Microbiology 25: 2059 (1987).
PROBLEM MOŻLIWA PRZYCZYNA DZIAŁANIE
Nieważny test (wszystkie próbki ujemne)
Jeden lub więcej odczynników nie dodany lub dodany w niewłaściwej kolejności
Sprawdzić procedurę. Sprawdzić nie używane roztwory. Powtórzyć test.
Nieaktywna mikropłytka Sprawdzić kod na opakowaniu płytki (patrz p.4 instrukcji)
Sprawdzić wilgotność nie używanej płytki (pochłaniacz wilgoci – żel silikonowy musi być jasno-żółty).
Powtórzyć test.
Nieważny test (wszystkie próbki dodatnie)
Zanieczyszczenie substratu Wziąć nową porcję substratu.
Niedostateczne płukanie
studzienek Sprawdzić pracę płuczki.
Niska precyzja
Niedokładne płukanie studzienek Sprawdzić pracę płuczki.
Niedokładna aspiracja ze
studzienek Sprawdzić pracę płuczki.
Błąd pipetowania Zmienić ustawienie pipety Zbyt wolne dodawanie
odczynników
Unikać wysuszenia płytki po etapie płukania. Od razu dodawać odczynniki.
Obecność pęcherzyków powietrza
Unikać powstawania pęcherzyków podczas pipetowania.
Zanieczyszczenie na drodze optycznej
Sprawdzić czystość źródła światła i detektora. Wytrzeć spód płytki miękkim materiałem.
Powstanie niewłaściwej barwy
Nieprawidłowy czas lub temperatura inkubacji
Sprawdzić ustawienie termostatu i monitorowanie czasu.
Zastosować się do instrukcji.
Dodana nieodpowiednia ilość
substratu Zmienić ustawienie pipety
Bio-Rad
3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0)1 47 95 60 00
Fax : +33 (0)1 47 41 91 33
www.bio-rad.com 2014/12
