Laboratorium Laserowej Spektroskopii
Molekularnej PŁ
Mikroskop (gr. μικρός mikros - "mały" i σκοπέω skopeo - "patrzę, obserwuję") – jest urządzeniem służącym do obserwacji małych obiektów, zwykle
niewidocznych gołym okiem.
Pierwsze mikroskopy były mikroskopami optycznymi, w których do oświetlania
obserwowanych obiektów wykorzystywano światło dzienne. Za twórców tego rodzaju
mikroskopów uważa się Holendrów: Zachariasza Janssena i jego ojca Hansa Janssena . Pierwsze konstrukcje wykonali oni około roku 1590. Ze względu na słabe powiększenie (10 razy)
mikroskopy nie zdobyły wtedy uznania jako narzędzie badawcze.
mikroskop Carl Zeiss 1879
Przełomu dokonał wynalazca i przedsiębiorca Antonie van Leeuwenhoek, który udoskonalił konstrukcję mikroskopu, a następnie rozwinął produkcję tych urządzeń w XVII wieku. Leeuwenhoek jako pierwszy obserwował żywe komórki –pierwotniaki, erytrocyty itp.
Wykorzystanie mikroskopu przyczyniło się do ogromnego postępu w biologii.
Naukowcy mogli badać, co dzieje się we wnętrzu żywych organizmów. Powstały nowe dziedziny nauki, cytologia oraz mikrobiologia. Dzięki wykorzystaniu mikroskopu możliwy był ogromny postęp w leczeniu chorób zakaźnych. W roku 1882 Robert Koch odkrył z pomocą mikroskopu bakterie gruźlicy.
Mikroskop wykorzystano do obserwacji podziału chromosomów w jądrze komórkowym. W roku 1910 Thomas Hunt Morgan udowodnił, że chromosomy są nośnikami genów dając początek genetyce. W technologii materiałowej mikroskopy wykorzystywano do obserwacji struktur metali albo innych materiałów. W ten sposób możliwe stało się opracowanie doskonalszych stopów metali wykorzystywanych w przemyśle.
Kolejnym przełomem stało się wykorzystanie w mikroskopie elektronów. W roku 1931 pierwszy mikroskop elektronowy skonstruowali Ernst Ruska i Maks Knoll w Berlinie. Możliwa stała się obserwacja najmniejszych struktur organelli komórkowych.
W technologii wykorzystanie mikroskopów elektronowych stało się podstawą rewolucji krzemowej. Bez technik sprawdzania jakości wykonywanych w półprzewodnikach struktur nie udałoby się dokonać tak ogromnego postępu w tej dziedzinie.
W roku 1982 mikroskopia uczyniła pierwszy krok w kierunku świata atomów.
Pracujący w Zurychu naukowcy Gerd Binnig oraz Heinrich Rohrer skonstruowali mikroskop STM- skaningowy mikroskop tunelowy. Pozwolił on na obserwację struktur złożonych z pojedynczych atomów. Późniejsze prace doprowadziły do budowy szeregu odmian tego mikroskopu pozwalających na badanie różnych właściwości materii w skali nanometra. Niezwykłą cechą mikroskopu STM była jego zdolność nie tylko do obserwacji atomów, ale również manipulacji nimi.
Obecnie badacze przewidują, że postęp w mikroskopii przyczyni się znacznie do rozwoju nanotechnologii, która może znaleźć zastosowanie w prawie każdej dziedzinie życia.
Mikroskop jest zbudowany z:
okularu, który służy do powiększenia obrazu tworzonego przez obiektyw mikroskopu, tubusa, który służy do formowania
powiększonego obrazu pośredniego, śruby makrometrycznej, która służy do wstępnej regulacji odległości, śruby mikrometrycznej, która służy do ustalenia ostrości, rewolweru, który umożliwia prostą zmianę obiektywu, obiektywów, które zbierają światło wychodzące z przedmiotu i tworzą jego powiększony obraz pośredni, kondensora, który koncentruje światło formując z niego stożek, lusterka, które służy do naświetlania badanego obiektu;
Mikroskopia konfokalna jest odmianą mikroskopii świetlnej
charakteryzująca się zwiększonym kontrastem, a zatem i rozdzielczością.
W zwykłej mikroskopii (szerokiego pola, w tym mikroskopie fluorescencyjnym) próbka jest oświetlana przez źródło światła w całości.
W odpowiedzi na to, albo odbija światło, albo fluoryzuje, przy czym sygnały te są zbierane przez obiektyw. Obiektyw zbiera sygnał nie tylko z miejsca ogniskowania, ale z całego przekroju próbki. Powoduje to, że tło wobec sygnału z miejsca ogniskowania jest dość wysokie, co zmniejsza kontrast. Zastosowanie przesłony z małym otworem przed detektorem (na przykład kamerą CCD), odcina sygnał dochodzący spoza płaszczyzny ogniskowania, co znacznie powiększa kontrast i jakość uzyskanego obrazu.
Podstawy obrazowania konfokalnego zostały opatentowane przez Marvina Minsky'ego w 1961.
• Promień lasera pada na lustro dichroiczne o selektywnym odbiciu fal świetlnych
• Wiązka przechodzi przez lustra skanujące, które dzięki minimalnym ruchom obrotowym mogą nią kierować
• Obiektyw skupia wiązkę w jednym punkcie, która wzbudza wyznakowany barwnikiem preparat co powoduje emisję dłuższej fali świetlnej
• Wiązka powraca tą samą drogą przez lustra skanujące i dichroiczne, po czym natrafia na przesłonę z niewielkim otworem
• Wreszcie wiązka dociera do detektora.
Taki sygnał zostaje zamieniony przez przetworniki analogowo-cyfrowe na postać cyfrową i przeanalizowany przez komputer.
Zasada działania mikroskopu konfokalnego
http://www.microscopyu.com/articles/confocal/confocalintr obasics.html
Mikroskopia konfokalna ma wiele zalet w porównaniu z konwencjonalną mikroskopią optyczną. Cechują ją wysoki kontrast i rozdzielczość. Światło, które jest wzbudzane w punktach leżących poza ogniskiem jest eliminowane przez system pinholi i nie bierze udziału w tworzeniu obrazu. Wynikiem tego jest
obraz niezawierający składowych pochodzących z płaszczyzn innych niż ogniskowa. Dzięki temu rozdzielczość i kontrast w tym mikroskopie są lepsze
niż w zwykłym mikroskopie fluorescencyjnym.
http://www.microscopyu.com/articles/confocal/confocalintr obasics.html
Porównanie skanowania szerokopasmowego i punktowego w mikroskopii konwencjonalnej i konfokalnej
porównanie obrazów nabłonka skrzydła motyla barwionego jodkiem propidyny
Probe Ex (nm) Em (nm) MW Notes
Hydroxycoumarin 325 386 331 Succinimidyl
ester
Aminocoumarin 350 445 330 Succinimidyl
ester
Methoxycoumarin 360 410 317 Succinimidyl
ester
Cascade Blue (375);401 423 596 Hydrazide
Pacific Blue 403 455 406 Maleimide
Pacific Orange 403 551
Lucifer yellow 425 528
NBD 466 539 294 NBD-X
R-Phycoerythrin (PE) 480;565 578 240 k PE-Cy5 conjugates 480;565;650 670
aka Cychrome, R670, Tri-Color, Quantum Red Znaczniki
http://www.mitr.p.lodz.pl/raman http://www.witec.de
Zamiast wykrywać sumaryczną intensywność światła z danego punktu próbki, sygnał rozkłada się na widmo za pomocą
spektrometru
Można uzyskiwać różne widma: absorpcji, transmisji, odbiciowe, fluorescencji, fotoluminescencji, Ramana, itp.
Technika Ramana znakomicie współgra z mikroskopią konfokalną ze względu na wysoką specyficzność wykrycia struktur chemicznych, brak konieczności skomplikowanego przygotowana próbek, w odpowiednich warunkach – dobrą jakość sygnału
ZALETY MIKROSKOPII KONFOKALNEJ:
Zastosowanie pinhola przed detektorem (na przykład kamerą CCD), odcina sygnał dochodzący spoza płaszczyzny ogniskowania, co znacznie powiększa kontrast i jakość uzyskanego obrazu – ostrość i barwność.
Możliwość rekonstrukcji obrazu 3D i 4D.
Pozwala na rejestrowanie obrazów cienkich warstw preparatu, czyli przekrojów optycznych badanych obiektów. Z tego powodu jest on często stosowany do rejestracji serii przekrojów optycznych na różnych głębokościach preparatu.
Eliminuje problem poświaty wynikającej z warstw preparatu leżących poza płaszczyzną ostrości.
Oferuje lepszą rozdzielczość niż tradycyjna mikroskopia optyczna.
Możliwość wizualizacji żywych preparatów.
WADY MIKROSKOPII KONFOKALNEJ :
Wpływ czynników otoczenia.
Blaknięcie.
Fototoksyczność.
Nadal gorsza rozdzielczość niż w mikroskopie elektronowym.
Wysoka cena.
http://www.microscopyu.com/articles/confocal/confocalintr obasics.html
Przykłady zastosowań:
1. Analiza tkanek gruczołu
piersiowego ex-vivo
http://www.mitr.p.lodz.pl/raman http://www.witec.de
2. Analiza komórek skóry in-vivo
skóra sucha skóra nawilżona
http://www.horiba.com
3. Widma komórek bakterii
widok kolonii bakterii
widmo Ramana pojedynczej komórki bakterii
http://www.horiba.com
4. Analizy farmaceutyczne
kofeina
kwas acetylosalicylowy paracetamol- N-(4-
hydroksyfenylo)acetamid
widma Ramana składników tabletki
http://www.horiba.com
5. Analiza polimerów
http://www.witec.de
Laboratorium Laserowej Spektroskopii
Molekularnej PŁ
Lasery impulsowe znalazły szerokie zastosowanie w spektroskopii rozdzielczej w czasie.
Ze względu na rozdzielczość czasową metody, zależną od długości trwania impulsu, spektroskopię dzielimy na:
nanosekundową (10
-9s)
pikosekundową (10
-12s)
femtosekundową (10
-15s)
Do najczęściej stosowanych metod spektroskopowych rozdzielczych w czasie należą:
Techniki badające zanik fluorescencji
Techniki typu wiązka pompująca-wiązka sondująca (pump-probe)
Metody nieliniowej wymuszonej spektroskopii Ramana
Echo fotonowe
Dudnienia kwantowe (quantum beats)
Techniki spektroskopii laserowej rozdzielczej w czasie
dostarczają informacji o dynamice różnych procesów takich jak:
Relaksacja reorientacyjna
Solwatacja nadmiarowego elektronu
Dynamika różnych reakcji np. izomeryzacja cis- trans;
przeniesienie protonu w stanie wzbudzonym, przeniesienie elektronu, zmiany konfirmacyjne
Rozfazowanie wibracyjne T2 w podstawowym stanie elektronowym
Relaksacja wibracyjna T1 w podstawowym i wzbudzonym stanie elektronowym
Wibracyjna predysocjacja
Schemat ilustrujący metodę wiązki pompującej -sondującej próbka
wiązka sondująca
laser detektor
wiązka pompująca
c t x
t- opóźnienie wiązki sondującej względem pompującejx- różnica dróg optycznych c-prędkość światła
sygnał uzyskiwany w spektroskopii absorpcyjnej metodą wiązki pompującej-sondującej
Częstość wiązki pompującej lub sondującej można zmieniać w szerokich granicach za pomocą przestrajalnych źródeł światła, takich jak:
Generatory parametryczne (OPG)
Oscylatory parametryczne (OPO)
Wzmacniacze parametryczne (OPA)
Źródła białego kontinuum (WC-
emitujące niemonochromatyczne promieniowanie w szerokim zakresie
)laser wiązka sondująca próbka detektor
wiązka pompująca OPO
Metody generowania krótkich impulsów:
Q - switching
synchronizacja modów
aktywna: modulowanie długości rezonatora L
przez wprowadzenie w drgania jednego ze zwierciadeł, zastosowanie przetwornika optoakustycznego
pasywne: nasycające się absorbenty, autosynchronizacja, modulowanie
współczynnika wzmocnienia ośrodka aktywnego
periodyczne zmiany współczynnika
załamania ośrodka przez zmianę gęstości wywołane fala dźwiękową
przetwornik optoakustyczny
metoda nasycających się absorbentów
WZMOCNIENIE
Kryształ Ti
+3:Al
2O
3527 nm YLF pompowanie powodujące inwersję obsadzeń
Tsunami 800 nm
Jeżeli impuls przechodzi przez ośrodek nieliniowy, w którym utrzymywana jest inwersja obsadzeń (przez pompowanie z innego źródła) to impuls przechodząc przez ośrodek wywołuje emisję wymuszoną.
W rezultacie wychodzący impuls zostaje wzmocniony.
wzmacniacz regeneratywny
(wielokrotne przejście światła po tej samej drodze w rezonatorze).
M1 M2
/4 PC1 PC2
ośrodek aktywny (Ti
+3:Al
2O
3)
Merlin (YLF)
250 ns, Q-switch
P
thin layer polarizer
Tsunami-stretcher
Input
Output
Analiza fotouczulaczy
MgPcS4-H2O, c=1x10-5M ZnPcS4-H2O, c=1x10-5M
MITR
Analiza wodnych roztworów elektrolitów
LOA MITR
Dynamika femtosekundowa DPPC
MBI - Berlin MITR
porównania próbek DPPC „wet” i „dry”
LABORATORIUM LASEROWEJ SPEKTROSKOPII MOLEKULARNEJ
Politechnika Łódzka Międzyresortowy Instytut Techniki Radiacyjnej 93-590 Łódź Wróblewskiego 15 tel:(48-42) 6313175, 6313162, 6313188 fax:(48-42) 6840043 http://www.mitr.p.lodz.pl/raman
Dr Beata Brożek-Płuska Politechnika Łódzka
Międzyresortowy Instytut Techniki Radiacyjnej 93-590 Łódź
Wróblewskiego 15 tel:(48-42) 6313162, 6313188
fax:(48-42) 6840043
e-mail: brozek@mitr.p.lodz.pl
Lasery światłowodowe.
Zasada działania światłowodu.
Zasada działania mikroskopu konfokalnego.
