1
Biomarkery w badaniach środowiska południowego Bałtyku
Henryka Dąbrowska, Ilona Waszak
Morski Instytut Rybacki – Państwowy Instytut Badawczy email: henryka.dabrowska@mir.gdynia.pl
Wstęp
Biomarkery są stosowane od ponad 30-tu lat w badaniach środowiska morskiego.
Pomimo rozległej wiedzy w tym zakresie, biomarkery były rzadko stosowane jako narzędzie ekotoksykologiczne w zarządzaniu środowiskiem tj. użytkowaniu, ochronie i kształtowaniu środowiska, czy generalnie do oceny ryzyka środowiska lub jego komponentów. Monitoring środowiska zwykle obejmuje pomiary parametrów fizyko-chemicznych i zawartości określonych zanieczyszczeń. Dostarcza on informacji odnośnie stężenia mierzonych substancji chemicznych i czasowo-przestrzennych zmianach w poziomie zanieczyszczenia, nie wskazuje jednak czy i w jakim stopniu zanieczyszczenie środowiska ma szkodliwy wpływ na organizmy. Ryby i inne organizmy morskie są nieustannie narażone na kompleksowe mieszaniny znanych i nieznanych zanieczyszczeń o potencjalnie bardzo zróżnicowanym składzie i różnych mechanizmach toksyczności, których łączne oddziaływanie jest trudne do określenia jedynie na podstawie zawartości standardowo mierzonych związków chemicznych.
Mając to na uwadze oraz nadrzędny cel badań i monitoringu środowiska, którym jest ochrona i zrównoważony rozwój ekosystemów morskich, uwzględnienie biologicznego oddziaływania zanieczyszczeń w ocenie jakości środowiska staje się niezbędne. Zostało to podkreślone w Ramowej Dyrektywie w sprawie Strategii Morskiej i zaleceniach HELCOM.
Co to są biomarkery? Biomarkery są powszechnie określane jako zmiany w reakcji biologicznej będące wynikiem narażenia i/lub efektem szkodliwego oddziaływania zanieczyszczeń. Są to swoiste dowody na obecność i oddziaływanie substancji szkodliwych.
W szerszym znaczeniu, termin ten obejmuje zarówno akumulację zanieczyszczeń w tkankach (organizmach) jak i zmiany biologiczne, które mogą być mierzone na różnym poziomie organizacji biologicznej, od molekularnego do populacji i ekosystemu (Van der Oost i in., 2003). Jedną z kluczowych funkcji biomarkerów jest rola wczesnego ostrzegania o występowaniu szkodliwych zmian biologicznych. Z tego względu istotne znaczenie mają biomarkery mierzone na niższym poziomie organizacji biologicznej (biochemicznym, subkomórkowym, fizjologicznym), które poprzedzają w skali czasu zmiany na wyższym poziomie (populacji, ekosystemu).
1. Biomarkery w ocenie oddziaływania zanieczyszczeń na wybrane gatunki ryb i inne organizmy zasiedlające obszar południowego Bałtyku
Morze Bałtyckie jest pod silną presją antropogeniczną od wielu dziesięcioleci (HELCOM, 2010a). Wskazuje się, że jest jednym z najbardziej zanieczyszczonych akwenów w skali globalnej. Jest to związane z jego specyficzną geograficzną i hydrologiczną charakterystyką [olbrzymia powierzchnia zlewni (około 20 % kontynentu europejskiego)
2
zamieszkana przez około 90 mln i ograniczona wymiana wód z globalnym oceanem]. Morze Bałtyckie otrzymuje znaczące ilości zanieczyszczeń [biogenów i substancji niebezpiecznych wnoszonych z wodami rzek, odprowadzanych z przybrzeżnych aglomeracji komunalno- przemysłowych jak i deponowanych z atmosfery], które, wskutek ograniczonej retencji wód, kumulują się w jego ekosystemie.
Dominującymi ilościowo związkami chemicznymi na obszarze południowego Bałtyku są trwałe zanieczyszczenia organiczne (PCB, DDT i jego pochodne; HELCOM 2010b). Inne zanieczyszczenia takie jak PBDE, PFC i związki organiczne cyny, występują w znacznie mniejszych stężeniach (Falandysz i in., 2006; Filipkowska i in. 2015; Waszak i Dąbrowska, 2014). Istotne zagrożenie mogą stanowić dioksyny i związki dioksyno-podobne (PCDD/F;
DL-PCB), które zaliczane są do najbardziej toksycznych substancji. Generalnie, te zanieczyszczenia mogą powodować szereg różnorodnych zmian biologicznych począwszy od zaburzeń metabolicznych i zmian hormonalnych do wpływu na wzrost, reprodukcję i przeżywalność.
Badania prowadzone w MIR-PIB obejmowały stornie (Platichthys flesus), dorsze (Gadus morhua) i małże (Mytilus trossulus). Obydwa gatunki ryb mają istotne znaczenie dla ekosystemu Bałtyku, przy czym stornia i małże są gatunkami indykatorowymi powszechnie używanymi w badaniach i monitoringu środowiska morskiego w Europie. Badania miały na celu określenie zmian biologicznych na poziomie subkomórkowym (pomiary biomarkerów) i całego organizmu (CF, HSI, GSI u ryb; CF u małży) na tle powszechnie występujących zanieczyszczeń organicznych (TZO; PCB, PBDE, OCP, WWA) i metali (Cu, Zn, Pb, Cd, Hg). Zostały przeprowadzone na kilku stanowiskach w obrębie Zatoki Gdańskiej i środkowego wybrzeża, w celu oszacowania narażenia i oddziaływania zanieczyszczeń w skali przestrzeni. Biomarkery mierzone u ryb obejmowały aktywność EROD w wątrobie (narażenie na AhR-aktywne substancje tj., dioksyny i związki dioksyno-podobne), uszkodzenie DNA (test kometowy; narażenie na czynniki genotoksyczne) oraz stężenie 1-hydropksypirenu w żółci (narażenie na WWA). Biomarkery analizowane u małży (AchE, GST, CAT, GR, SOD, LPO) stanowiły grupę niespecyficznych reakcji biologicznych związanych z narażeniem na różnorodne zanieczyszczenia z wyjątkiem AChE, który jest wskaźnikiem narażenia na substancje neurotoksyczne. Mierzone biomarkery są zalecane w badaniach i monitoringu środowiska morskiego (ICES, 2011).
Wyniki badań samic storni przeprowadzone w okresie zimowym (luty) wykazały, że wartości biomarkerów, aktywność EROD (410-633 pmol min-1mg białka-1), genotoksyczność (test kometowy; 10-16%), i 1-OH piren (57-200 ng ml-1 żółci), wielokrotnie przekraczały określone wartości podstawowe (BAC; ang. background assessment criterion) na wszystkich badanych stanowiskach. Na szczególną uwagę zasługuje wysoka aktywność EROD wskazująca na znaczące oddziaływanie zanieczyszczeń z grupy dioksyn i związków dioksyno-podobnych. Analiza statystyczna wykazała brak istotnych zależności pomiędzy aktywnością EROD a zawartością zanieczyszczeń mierzonych w mięśniach storni, natomiast istotną pozytywną zależność stwierdzono pomiędzy poziomem uszkodzenia DNA i zawartością ∑m-oPCB (Rys. 1A). Stężenia TZO w mięśniach storni (∑7PCB, ∑m-oPCB,
∑25PCB, o,p′-DDE, p,p′-DDE, o,p′-DDD, p,p′-DDD, p,p′-DDT) wykazywały trend malejący w miarę wzrostu odległości od Zatoki Gdańskiej (z wyjątkiem α-, β-, γ- HCH i heptachloru),
3
obserwowano również różnice w profilu PCB i DDT w skali przestrzeni. W odniesieniu do indeksów biologicznych (CF, HSI, GSI) stwierdzono istotną negatywną zależność pomiędzy GSI i stężeniami TZO (∑7PCB, ∑m-oPCB, ∑25PCB, ∑DDT, ∑OCP, ∑TZO) wyrażonymi w masie lipidów oraz pomiędzy CF i ∑m-oPCB, a także pozytywną zależność pomiędzy HSI i TZO (przykładem jest zależność HSI-∑7PCB przedstawiona na Rys.1 B). Te zależności wskazują na negatywny wpływ zanieczyszczeń na ogólny stan zdrowotny i kondycję storni.
Należy zaznaczyć, że jakkolwiek szkodliwy wpływ zanieczyszczeń miał miejsce na wszystkich badanych stanowiskach, stornie z Zatoki Gdańskiej wykazywały najsilniejsze zmiany biologiczne i największy ładunek zanieczyszczeń. W wyniku wieloczynnikowej analizy statystycznej (PCA) ta grupa ryb była wyraźnie oddzielona od pozostałych grup (Rys.
2 A). PCA, podobnie jak analiza jednoczynnikowa, wykazała istotne powiązania pomiędzy indeksami biologicznymi, biomarkerami i zawartością zanieczyszczeń u ryb (Rys. 2 B).
Mając na uwadze wysokie stężenia PCB można przypuszczać, że ich negatywne oddziaływanie może obejmować nie tylko mechanizm toksyczności związany z aktywacją receptora Ah.
Badania przeprowadzone na małżach obejmowały te same stanowiska, z których pobrano stornie do badań przedstawionych powyżej, przy czym małże zostały pobrane z obszaru referencyjnego i ulokowane w sadzach, które rozmieszczono na wyznaczonych stanowiskach. Wyniki badań małży wykazały, że spośród mierzonych biomarkerów istotne różnice pomiędzy stanowiskami wykazały jedynie GR i SOD w gruczole trawiennym i GST w skrzelach małży. Zintegrowany indeks reakcji biomarkerów (IBR), który jest zagregowanym miernikiem oddziaływania zanieczyszczeń opartym na pomiarach indywidualnych biomarkerów (Beliaeff i, Burgeot, 2002), wskazywał na bardziej nasilone oddziaływanie na jednym ze stanowisk w Zatoce Gdańskiej. Generalnie, wartości IBR nie korespondowały z wartościami BIQ tj., współczynnikiem biologicznego oddziaływania zanieczyszczeń zakumulowanych w małżach (Dabrowska i in. 2013). Ten brak zgodności wskazuje na istnienie różnic w biologicznym oddziaływaniu zanieczyszczeń pomiędzy stanowiskami, które mogły być spowodowane obecnością innych nie mierzonych zanieczyszczeń lub interakcją pomiędzy czynnikami abiotycznymi i biologicznymi, włącznie z inhibicją reakcji biomarkerów.
2. Problemy i wyzwania
Panuje powszechna opinia, że biomarkery są efektywnym narzędziem w badaniach ekotoksykologii środowiska, które pozwala m.in. ujawnić toksyczność kompleksowych mieszanin zanieczyszczeń. Jednakże prawidłowa interpretacja uzyskanych wyników wymaga wiedzy odnośnie czynników modyfikujących reakcje biomarkerów. Dotyczy to naturalnych abiotycznych czynników takich jak temperatura i zasolenie, a także biologicznych czynników takich jak wiek, płeć i studium dojrzałości. Wpływ tych parametrów jest dobrze poznany w odniesieniu do aktywności EROD, znacznie mniej w przypadku uszkodzenia DNA.
4 3. Rysunki
Rys. 1. Zależność pomiędzy poziomem uszkodzenia DNA i zawartością ∑m-oPCB w lipidach mięśni storni (A), oraz pomiędzy HSI i zawartością∑7PCB w lipidach mięśni storni (B).
Rys. 2. Wieloczynnikowa analiza statystyczna (PCA). (A) różnice przestrzenne w oddziaływaniu zanieczyszczeń na ryby [GoG - stornie z Zatoki Gdańskiej, WŁ – z łowiska władysławowskiego, UŁ – z łowiska ustecko-łebskiego]; (B) powiązania pomiędzy indeksami biologicznymi, biomarkerami i zawartością zanieczyszczeń (Dąbrowska i in. 2014).
Literatura
Beliaeff B, Burgeot T. 2002. Integrated biomarker response (IBR): a useful tool for ecological risk assessment. Environ. Toxicol. Chem., 21, 1316-1322.
Dabrowska H, Kopko O, Góra A, Waszak I, Walkusz-Miotk J. 2014. DNA damage, EROD activity, condition indices, and their linkages with contaminants in female flounder (Platichthys flesus) from the southern Baltic Sea. Sci. Tot. Environ., 496, 488-498.
A B
B A
5
Dabrowska H, Kopko O, Turja R, Lehtonen KK, Góra A, Polak-Juszczak L, Warzocha J, Kholodkevich S. 2013. Sediment contaminants and contaminant levels and biomarkers in caged mussels (Mytilus trossulus) in the southern Baltic Sea. Mar. Environ. Res., 84, 1-9.
Falandysz J, Taniyasu S, Gulkowska A, Yamashita N, Schulte-Oehlmann U. 2006. Is fish a major source of fluorinated surfactants and repellents in humans living on the Baltic coast? Environ. Sci. Technol. 40, 748–751.
Filipkowska A, Kowalewska G, Pavoni B. 2014. Organotin compounds in surface sediments of the southern Baltic coastal zone: a study on the main factors for their accumulation and degradation. Environ. Sci. Pollut. Res., 21, 2077-2087.
HELCOM, 2010a. Ecosystem Health of the Baltic Sea 2003–2007: HELCOM Initial Holistic Assessment. Balt. Sea Environ. Proc. No. 122.
HELCOM, 2010b. Hazardous substances in the Baltic Sea – An integrated thematic assessment of hazardous substances in the Baltic Sea. Balt. Sea Environ. Proc. No. 120B.
ICES, 2011. Report of the Study Group on Integrated Monitoring of Contaminants and Biological Effects (SGIMC), 14–18 March 2011, Copenhagen, Denmark; 2011. p. 30.
[ICES CM 2011/ACOM].
Van der Oost R, Beyer J, Vermeulen NPE. 2003. Fish bioaccumulation and biomarkers in environmental risk assessment: a review. Environ. Toxicol. Pharmacol., 13, 57–149.
Waszak I, Dabrowska H, Komar-Szymczak K. 2014. Comparison of common persistent organic pollutants (POPs) in flounder (Platichthys flesus) from the Vistula (Poland) and Douro (Portugal) River estuaries. Mar. Poll. Bull. 81, 225-233.
