N A T A L I A B A L IC K A , T E R E S A W Ę G R Z Y N , E D Y T A T E IC H E R T
P R Z Y K Ł A D O B N IŻ E N IA T O K S Y C Z N O Ś C I P Y Ł U Z A W IE R A J Ą C E G O M E T A L E C IĘ Ż K IE
P R Z E Z B A K T E R IĘ G L E B O W Ą 1
K atedra M ikrobiologii Rolniczej Akadem ii Rolniczej w e W rocław iu
W S T Ę P
Drobnoustroje są zdolne do transform ow ania i zm ian y aktyw ności m e tali ciężkich obecnych w em isjach p rzem ysłow ych . M etabolity drobno ustrojow e w ydzielane pozakom órkow o w p ły w a ją pośrednio i bezpośred nio na ruchliwość zw iązków m etali w glebie. F un kcje życiow e drobno u strojów są związane ze zm ianą odczynu i potencjału o ksyd oredu k cyj- nego środowiska, co jest bardzo istotne dla połączeń m etali, ich w arto ściowości i aktyw ności biologicznej [1, 2, 5, 6 , 11, 12].
M etabolity drobnoustrojow e mogą być również pow odem w ielu in n ych zjaw isk zw iązanych bezpośrednio z oddziaływ aniem na związki m etali, jak: precypitacja, kom pleksow anie, interakcja jonow a, wiązanie z m aterią organiczną [6]. W a ż n y m elem entem dla ruchliwości m etali jest zjaw isko sorpcji o charakterze chem icznym i biologicznym , co pro w adzi najczęściej do okresowego unieruchom ienia m etali [7, 8].
T em atem niniejszej pracy było sprawdzenie m ożliw ości obniżania toksyczności pyłu przem ysłow ego o dużej zawartości m etali ciężkich przez w ybraną bakterię glebow ą oraz analiza m echanizm u tego zjaw iska.
M A T E R IA Ł I M E T O D Y K A
Ź ró d łem m etali b y ł p y ł em itow an y przez hutę żelazo-chrom u, zaw ie rający duże ilości m etali ciężkich: 12,0 Cu, 130,0 N i, 150,0 Pb, 8100 Fe,
9100 M n , 25 000 Cr, 50 000 M g ppm . Są to w artości zm ienne, zależne od natężenia em isji; liczby podają rząd wielkości. O dczyn pyłu jest al kaliczny, w ynosi około 1 0 ,0 .
Do badania zm ian y toksyczności p yłu został w y b ra n y szczep M y c o
bacterium 5a, w yizolow an y z g leb y zapylon ej przez hutę. Szczep ten obniżał odczyn pożyw ki hodow lanej do 5,5— 6,0, a w ięc zgodnie z zało żeniem o w p ływ ie odczynu na rozpuszczalność zw iązków m etali m ógł pow odow ać w zrost toksyczności pyłu [3].
F rakcję m etabolitów o odczynie k w aśn ym w ydzielano z k u ltu ry bak terii nam nożonej w pożyw ce m ineralnej o składzie: 10,0 g glu kozy, 2,0 g K N 0 3, 0,5 g K H 2P O 4, 0,5 g К 2Н Р 0 4, 0,5 g N aC l, ślad F e S 0 4. Po oddzie leniu kom órek przez w irow anie zagęszczano supernatant, a następnie rozdzielano na kationicie IR -1 20 i amonicie I R A -4 0 0 . K w a s y oddzielano od peptydów , cukrów i pozostałych substancji przez w y m y w a n ie z a m o nitu 4-p ro cen to w y m N H 4C O 3. U zyskan e w ten sposób sole kw asów prze puszczano ponownie przez kationit w celu uzyskania czystych kw asów . Rozdzielano je następnie na bibule W h atm a n 3 w układzie etanol: am o niak: woda, w stosunku 40 : 2 : 8 , dw ukrotnie po 24 godziny. C hrom ato gram w y w o ły w a n o 0,04-p ro cen to w y m roztw orem zieleni brom krezolo- w ej w 95-p ro cen to w y m etanolu, ftalanu aniliny oraz 1-p rocentow ym żelazocyjanku potasu z F eC l3 [10]. N astępujące kw asy zostały użyte jako standardy: octow y, cy tryn ow y, szczaw iow y, w in ow y, a lfa -k eto g lu taro - w y , bursztyn ow y, jabłk ow y, m asłow y, glu koron ow y, syry n g o w y , w a n ili- now y, benzoesow y, glu tam in ow y i asparaginow y.
W płynie pohodow lanym oznaczano rów nież ilość m agnezu rozpusz czalnego, co w skazyw ało na efekt obniżenia odczynu podłoża przez bak terie.
Z m ianę aktyw ności pyłu pod w p ły w e m bakterii określano w jej k u l turze p ły n n ej, inkubow anej w obecności 1, 3, 5, 7, 10 g pyłu na litr po żyw ki. Po upływ ie 3, 5, 7 dni inkubacji sprawdzano inokulum szczepu grzyba z rodzaju Pénicillium . Szczep ten został w yb ran y jako testow y dzięki sw ojej wrażliw ości na m etale ciężkie w podłożu [3]. Na podsta w ie intensyw ności jego wzrostu i ciężaru suchej m asy grzybni w niosko wano o aktyw ności m etali w kulturze bakterii.
Zaobserw ow ano, że pod w p ły w e m k ultury bakterii p ył zm ieniał struk turę, która z drobno pylistej staw ała się kłaczkowata. Zakładano, że z ja w isko to zależy od ilości, wieku kom órek i czasu kontaktu z pyłem . Po stw ierdzeniu, że n ajw yraźn iejsze skłaczenie w ystęp uje w obecności k o m órek m łodych, tylko takie k u ltu ry używ ano w dalszych doświadcze niach.
Do pożyw ki płynn ej o składzie jak w y żej i zaw ierającej 7 g na litr pyłu dodawano zawiesinę bakterii w ilości: 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 10 m l na 50 m l pożyw ki, co odpowiadało około 0,14, 0,28, 0,50, 0,85, 1,10, 1,42, 2,80 m g suchej m asy kom órek. Z jaw isk o skłaczania w ystępow ało prawie natychm iast. Dla określenia zm ian w toksyczności pyłu stosow a no stale testow y szczep Pénicillium .
Z jaw isk o skłaczania pyłu przez kulturę bakterii obserw ow ano tylko w obecności fosforanów zn ajdu jących się w pożyw ce; po ich usunięciu
nie zachodziła zm iana stru k tury p yłu. Poniew aż sugerow ało to udział fosforanów w ty m zjaw isku, oznaczano ich ilość w p łyn ie p oh od ow la- n y m i w osadzie oddzielonym z k u ltu ry przez sedym en tację. U żyto do tego celu m etod y z zastosow aniem chlorku cynaw ego [13].
Próbę zm ian y aktyw ności pyłu przez kulturę szczepu M yco b a cter iu m 5a przeprowadzono rów nież w glebie, w doświadczeniu m ik row azon o- w y m . W ty m celu do g leb y steryln ej w ilości 150 g (mada środnia) do daw ano: p ył w daw kach 5,0; 7,0; 10,0 g, ponadto po 1 g K H 2P 0 4 i K 2H P 0 4, 25 m l zaw iesiny k u ltu ry szczepu M yc o b a c teriu m 5a o pH 5,0 i zm ętnie niu 0,58, co odpowiadało około 14,7 m g suchej m asy kom órek. Do g le b y dodawano jednocześnie zawiesinę grzybni szczepu testow ego P én i
cillium. K on trolę stanow iła gleba bez dodatku pyłu i zainfekow ana ty l
ko przez szczep P énicillium . Po dziesięciu i trzydziestu dniach inkubacji oznaczano w zrost grzybni. G lebę z rozcieńczenia 1 0 -4 i 1 0 “ 6 w ysiew ano na pożyw kę stałą M a r t i n a [9], na której liczono kolonie grzyba.
W Y N I K I
Oprócz zm ian chem icznych i zw iązanej z nim i przysw ajalności m e tali z pyłu, m ogą drobnoustroje w p ływ ać na jego aktyw ność przez od działyw anie na strukturę; bardzo istotne bow iem znaczenie m a m ożli wość sorpcji i kum ulow ania pyłu na pow ierzchni kom órek. W sk u tek te go obniża się toksyczność p yłu ; taki efekt uzyskano ze szczepem M y c o bacterium 5a.
Zaobserw ow ano, że po połączeniu k ultury bakterii z p yłem zm ieniał on sw oją strukturę z pylistej na kłaczkowatą (ryc. 1). Z ja w isk o to za chodziło jednak tylko w obecności fosforanów w podłożu. M echanizm tego zjaw iska przedstawia się prawdopodobnie następująco: kw aśny fo sforan z pożyw ki tw orzy trudno rozpuszczalne sole z m etalam i z pyłu i w tej postaci jest on sorbow any przez kom órki bakterii. D zięki tem u zawartość fosforu zm niejszała się w supernatancie, natom iast zw iększa ła się w osadzie, który składał się z m asy kom órek bakterii i zw iąza nego z nimi pyłu. Poziom fosforu w osadzie w zrastał p rzy podnoszeniu daw ki pyłu (ryc. 2). P om ięd zy liczbą kom órek bakterii a ilością fosforu istniała więc prosta zależność, co potw ierdziło założenie o sorpcji pyłu skom pleksow anego z fosforanam i.
P rzy zm ianie struktury pyłu zm ien iały się też jego w łaściw ości: tra cił on zdolność przyw ierania do szkła, która zaznaczyła się bardzo silnie w kontroli oraz w przypadku inkubowania z bakteriam i, które nie po w od ow ały zjaw iska skłaczania pyłu. Równocześnie ze zm ianą struktury pyłu spadała jego toksyczność m ierzona testem biologicznym Pénicillium (ryc. 3). Stopień skłaczania zależał od liczby kom órek bakterii; zaczy nając od 1,0 m l zaw iesiny, Zawierającej kom órki w ilości odpow iada jącej około 0,28 m g suchej m asy, zachodziła w yraźna zmiana struktury
Ryc. 1. O ddziaływanie szczepu M ycob a cteriu m 5a na strukturę pyłu w pożywce płynnej
1 — k on trola — zaw iesina p yłu w p o ż y w c e bez k o m ó re k b a k te r y jn y c h , 2 — zaw iesina p yłu w p o ż y w c e p łyn n ej p o d od a n iu k u ltu ry b a k terii
Fig. 1. Effect of M ycob a cteriu m 5a strain on the dust structure in the liquid m edium
1 — dust su spen sion in the m ediu m w ith ou t b a cteria l cells, 2 — dust su spension in the m ed iu m after in tr o d u ctio n o f b a cteria l cu ltu re
pyłu w ilości 7 g na litr pożyw ki. Stw ierdzono zależność tego zjaw iska od wieku k ultury bakterii, które najw yraźn iej w ystąpiło po trzech dniach inkubacji, a po siedmiu kłaczki zaczyn ały się rozpadać (ryc. 4). 3 -d n io - wa kultura bakterii, inkubowana bez pyłu i dodawana do pożyw ki z p y łem , również zm ieniała jego strukturę po kilku m inutach kontaktu. N a jw yra źn iejszy efekt dawała cała kultura, natom iast sam e kom órki działały słabiej. P łyn pohodow lany również w y k azy w a ł tendencję do tworzenia kłaczków , ale w m n iejszej ilości i m ało trw ałych.
Szczep M y co b a cter iu m 5a zakw aszał środowisko i zw iększał rozpusz czalność m etali mierzoną ilością rozpuszczalnego m agnezu. Ilość ta w zra stała w czasie inkubacji bakterii (ryc. 5), ale nie m iało to u jem nego w p ły w u na wzrost grzyba Pénicillium . P rzyczyną był prawdopodobnie fakt, że substancje o charakterze k w aśnym , produkow ane przez szczep bakterii, nie b yły zw iązkam i p okarm ow ym i pobieranym i przez kom ór ki grzyba, nie chelatow ały z m etalam i i nie przenikały do kom órek g r z y
-Sucha masa komórek Mycobacterium 5at mg Dry matter of the Mycobacterium 5a cells, mg
Ryc. 2. Zawartość fosforu w kom órkach bakterii szczepu M ycob a cteriu m 5a 1 — sucha m asa grzybni P é n i c i l l i u m , 2 — fo sfo r w osadzie, 3 — fo sfo r w supernatancie
Fig. 2. Phosphorus content in the culture of M ycob a cteriu m 5a
1 — dry m atter of P é n ic illiu m m y c eliu m , 2 — phosphorus in the sedim ent, 3 — phosphorus in the supernatant
Ryc. 3.
Fig. 3.
D
Dawki pytu, g / l — Dust doses, g/t Pożywka z pyłem
Nutrient medium with dust
Hultura Mycobacterium 5a w pożywce z pytem
Mycobacterium 5a culture in the nutrient medium with dust W p ły w szczepu M ycob a cteriu m 5a na rozpuszczalność M g
płynnej
Effect of M ycob a cteriu m 5a strain on the solubility of M g in with dust
the
pożywce
110
-100
-o 9 0 ' ^ E- 80 - C 3 -o 7/7 -3 | o, E 60-1 ° so
l i
w--С C 3 p i 30 ' A 20 -10
-}
v\//I
J
70i
!
в J/ //□
3 7 10 3 7 1CDawki p yłu , g /l — Oust doses, g /l Pożywka z pyłem
N utrient medium with dust
И K ultura M ycobacterium 5a w pożyw ce z pyfem
LJ M ycobacterium 5a culture in the nutrient medium with dust
Ryc. 4. W p ły w szczepu M ycobacteriu m 5a na toksyczność pyłu zależnie od wieku komórki
1 — b e z p o ś re d n io p o w p row a d zen iu in ok u lu m , II — p o trzech d n iach in k u b a c ji. III — po sied m iu d n iach in k u b a c ji
Fig. 4. Effect of M ycobacterium 5a on the dust toxicity depending on its incubation tim e
I — after in tro d u ctio n o f the in ocu lu m , II — a fter 3 days o f in cu b a tion , III — a fter 7 days o f in cu b a tion
ba Pénicillium [4]. N ie udało się jednak oznaczyć m etabolitów o od czynie kw aśnym produkow anym przez M y co b a cter iu m 5a.
W y n ik próby obniżenia toksyczności pyłu przez szczep M y c o b a c te rium 5a w glebie był podobny jak w pożyw ce p łyn n ej, tzn. spadała jego toksyczność dla testow ego grzyba (ryc. 6 ). Z jaw isk o to było w y ra źn iej sze po dziesięciu dniach inkubacji niż po u pływ ie trzydziestu dni; po ty m okresie zanikanie toksyczności obniżyło się i było w idoczne tylko przy n ajw y ższej dawce pyłu (ryc. 7). N a leży jednak zaznaczyć, że u ży wano g leb y sterylizow anej, o obniżonej biologicznej konkurencyjności w stosunku do inkubow anej w niej kulturze M yco b a cter iu m 5a.
Podsum ow ując w yn ik i stwierdzono co następuje:
— Szczep bakterii M yc o b a c teriu m 5a zakw aszał środowisko hodow la ne i zw iększał rozpuszczalność m etali zaw artych w p yle; nie p rzyczy niło się to jednak do zwiększenia ich toksyczności dla testow ego szcze pu P énicillium , ponieważ kwaśne m etabolity b ak teryjn e nie stanow iły źródła pokarm u dla jego kom órek i nie pow odow ały niespecyficznego pobierania m etali.
Dawki p y łu, g /l — Dust doses, g / l
□
Pożywka z pyłemNutrient medium with dust
И Kultura Mycobacterium 5a w pożywce z pyłem
L j Mycobacterium 5a culture in the nutrient medium with dusi
Ryc. 5. W p ły w szczepu M ycobacteriu m 5a na toksyczność pyłu w pożywce płynnej; kontrolę bezwzględną stanowił wzrost grzybni w pożywce (100°/o)
Fig. 5. E ffect of M ycobacteriu m 5a on the dust toxicity in the liquid m edium ; as control (100% ) was used the growth of the m ycelium in the m edium
Ryc. 6. W p ły w pyłu na wzrost szczepu testowego Pénicillium w glebie К — gleba -i- P én icilliu m , 5a — gleba i M y co b a c te riu m -f- P én ic illiu m , lOg — gleba i- 10 g p y
łu -f- P én icilliu m , Ю -! 5a — gleba + 10 g p yłu M y co b a c te riu m -i- P én icilliu m Fig. 6. E ffect of the dust on the growth of Pénicillium strain in the soil К — soil -r P én icilliu m , 5a — soil -r M y co b a c te riu m Ь P én ic illiu m , Юд — soil f 10 g o f th e
Ryc. 7. W p ły w szczepu M y - cobacterium 5a na toksycz ność pyłu w glebie; kontrolę bezwzględną stanowił wzrost
grzybni w glebie Fig. 7. E ffect of M y co b a cte rium 5a on the dust toxicity in the soil; as control (100% ) was used the grow th o f the
m ycelium in the soil
Dawki pyłu, д/ l — Dust doses, g/L
120 100 O о " . ! § 80
§1
» !
60
^ 40 20G
1
0 5 7 10Dawki pyłu, g /l — Dust doses, g /l Gleba z pyłem
Soil with dust
Kultura Mycobacterium 5a w glebie z pyłem Mycobacterium 5a culture in the soil with dust
— Z m iana stru ktury fizyczn ej pyłu dzięki skom pleksow aniu z fo sfo ranam i i sorpcji na kom órkach b ak teryjn ych przyczyniła się do unie ruchom ienia p yłu i stanow iła czynnik obniżający jego toksyczność. Stw ierdzono zależność p om iędzy liczbą kom órek i ilością p yłu, która m ogła być zaadsorbowana na ich pow ierzchni.
— Z ja w isk o zm ian y stru ktury pyłu było związane z w iek iem kom ó rek bakterii; zdolność tę w y k a zy w a ły kom órki m łode.
— W w arunkach g leb ow ych opisane zjaw isko przebiega podobnie, kom órki bakterii zachow ały zdolność do redukow ania toksyczności pyłu.
*
D iagn ostyka u ż y te g o szczepu bakterii została przeprow adzona p rzez doc. dr hab. Z o fię K rążek , za co autorki składają podziękow anie.
Ilo ść ko lo ni gr zy ba po 30 d n ia ch in ku ba cj i, % N um be r of fu ng i co lo ni es af te r 30 da ys of in cu b a ti o n , % Ilo ść ko lo ni gr zy ba po 10 d n ia ch in ku b a cj i, % N um be r of fu ng i co lo ni es of fe r 10 da ys of in cu ba ti on , %
L IT E R A T U R A
[1] B a b i c h H., S t o t z k y G. Physiochem ical factors of natural reservoirs effect the transform ation and exchange of heavy metals toxic to microbe. Environ. Biogeochem istry Ecol. Bull. (Stockholm) 1983 t. 35 s. 315— 325. [2] B a d u r a L. Rozważania nad stopniem zanieczyszczenia gleb em isjam i
przem ysłow ym i i w ynikającym i stąd im plikacjam i ekologicznym i. Post. M i krob. 1984 t. 23 nr 2 s. 31— 62.
[3] B a l i c k a N. , W ę g r z y n T., T e i c h e r t E., S t r o j e k Z. Biotransfor- m ation of some pollutants by soil bacteria. IX th M eetings of Soil Biology
and Soil Conservation, Sopron, 27— 30 August 1985 (w druku).
[4] C h m i e l o w s k i J., K ł a p c i ń s k a В. M echanizm pobierania m etali przez drobnoustroje. Post. M ikrob. 1984 t. 23 nr 2 s. 61— 90.
[5] E r h r i c h H. L. H ow microbes cope with heavy m etals, arsenic and anti m ony in their environm ent. Chapter 10. M icrobial life in extrem e environ m ent, ed. D. J. K usher, Acad. Press. London 1987.
[6] G a d d G. М ., G r i f f i t h s A . Y . M icroorganism s and heavy m etal toxicity. M icrobial Ecology 1978 No. 4 p. 303— 317.
[7] G r i f f i t h s A. Y. , H u g h e s M. A. , T h o m a s D. Som e aspects of m icro bial resistance to m etal pollution. Int. Sym p. M inerals and the Environ. Lon don 1974 Paper 24 p. 1— 8.
[8] L e s t e r N., P e r r y R., G a d d A . H. The influence of heavy metals on a m ixed bacterial population on sevage origin in the chemostait. W a te r R e search, Pergam on Press L T D , G reat Britain 1979 Vol. 13 p. 1055— 1063. [9] M a r t i n J. P. Use of acid rose bengal and streptom ycin in the plate. Soil
Sei. 1950 V ol. 69 p. 215— 233.
[10] O p i e ń s k a - B l a u t h J., K r a c z k o w s k i H., В г z u s z к i e w i с z H. Z a rys chrom atografii cienkow arstw ow ej. P W R iL , W arszaw a 1971.
[11] S t e r r i t t R. М. , L e s t e r J. N. Interactions of heavy m etals w ith bacte ria. Sei. Total Environ. 1980 Vol. 14 p. 5— 17.
[12] T y l e r G. H eavy m etals in soil biology and biochem istry, w : Soil B ioche m istry, ed E. A . P O U L , J. W . L A D D , M . D E K K E R , N ew Y ork , Basel 1981 V o l. 5 p. 317— 414.
[13] Z g i r s k i A . Pol. Tyg. Lek. 1965 t. 5 s. 171. W : Ćwiczenia z biochemii, red. W . Leyko, rozdz.: Oznaczanie fosforu nieorganicznego w surowicy krw i m e todą chlorku cynawego.
H. БАЛИЦКА, Т. ВЕНГЖИН, Э . ТЕЙХЕРТ СНИЖ ЕНИЕ ТОКСИЧНОСТИ ПРОМЫ ШЛЕННЫХ ПЫЛЕЙ П ОД ВЛИЯНИЕМ ПОЧВЕННЫ Х БАКТЕРИЙ Кафедра агромикробиологии Сельскохозяйственной академии во Вроцлаве Р е зю м е Рассматривается способность почвенных бактерий снижать токсичность промышлен ных пылей содержащих большие количества тяжелых металлов, а также механизм этого явления. Такой способностью отличается штамм Mycobacterium 5а, который изолировали 4
из загрязненной указанными пылями почвы. Снижение токсичности пылей в питательной среде и в почве определяли на основании интенсивности роста штамма Pénicillium с высокой восприимчивостью к металлам. Штамм Mycobacterium 5а снижал pH почвы до 5,5-6,0, в свя зи с чем повышалась растворимость тяжелых металлов, токсичность которых при этом не повышалась. Причина этого заключалась в том, что кислые бактерийные метаболиты не усваивались клетками гриба и таким образом не вводили в них металлов, даже в случае их комплексования. Бактерийные культуры Mycobacterium 5а изменяли пылеватую структуру на хлопье видную. Это явление наблюдалось только при наличии фосфатов в среде. Комплекс фос фатов с металлами абсорбировался клетками бактерий, вследствие чего снижалась токсич ность пылей. Молодые бактерийные культуры (3-даевные) были более эффективными, чем старшие (7-10-дневные), а число клеток показывало связь с количеством пылей. Штамм Mycobacterium 5а удерживал свою способность снижать токсичность пылей в условиях почвенной среды. Н . B A L IC K A , Т . W Ę G R Z Y N , E. T E IC H E R T R E D U C T IO N OF T O X IC IT Y OF IN D U S T R IA L D U S T S U N D E R TH E SO IL B A C T E R IA E FFE C T
Departm ent of Agricultural M icrobiology, Agricultural University of W rocław
S u m m a r y
The ability of soil bacteria to reduce the toxicity of industrial dusts con taining great amounts of heavy metals, is presented and analyzed in the psper. It was M ycobacteriu m 5a strain isolated from soil contaminated with industrial dusts, which distinguished itself with such an ability. The toxicity reduction, of dusts in the nutrient m edium and soil was determined on the basis of the growth intensity of a Pénicillium strain highly susceptible to metals. The M ycobacterium 5a strain lowered the pH value of soil to 5.5— 6.0 and thus increased the solubility of heavy metals without any increase of their toxicity. This was caused p r o b a b l y by the fact that acid m etabolites of bacteria were not taken up by the fungus cells and thus did not introduce the metals with them, even in case of their com plexation.
Bacterial cultures of M ycobacteriu m 5a strain changed the dusty structure into flaky one. This phenomenon was observed only at the presence of phosphates in the m edium . The com plex of phosphates with metals was absorbed by the bacterial cells, in consequence of which the toxicity of dusts decreased. The young (3-day) cultures appeared to be more effective than older (7— 10-day) ones, while the num ber of cells was related to the amount of dusts.
The M ycobacteriu m 5a strain m aintained its ability to reduce the toxicity of industrial dusts under soil m edium conditions.
P r o /, dr Natalia Balicka
K atedra M ik robiologii R oln iczej A R