246
Mechanizmy dzia³ania cytostatyków stosowanych w neurologii
Mechanism of action of cytostatic drugs used in neurology
1Zak³ad Neurologii Doœwiadczalnej i Klinicznej Uniwersytetu Medycznego w £odzi
2Klinika Neurologii i Epileptologii Uniwersytetu Medycznego w £odzi
Adres do korespondencji: Klinika Neurologii i Epileptologii Uniwersytetu Medycznego w £odzi, ul. ¯eromskiego 113, 90-549 £ódŸ, tel.: 042 639 35 91
Praca finansowana z grantu Polpharmy (nr 15/IV/2005)
M
Maarrcciin
n JJaa³³o
ossiiñ
ñsskkii
11,,22,, K
Kaam
miill K
Kaarro
ollcczzaakk
11,, A
An
nd
drrzzeejj G
G³³¹¹b
biiñ
ñsskkii
11,,22S
Sttrreesszzcczzeen
niiee
Celem niniejszej pracy jest przedstawienie molekularnych mechanizmów dzia³ania cytostatyków stosowanych w próbach terapii niektórych chorób neurologicznych, g³ównie stwardnienia rozsianego (SM). Od wielu lat w terapii tego schorzenia próbuje siê wykorzystywaæ takie cytostatyki, jak mitoksantron, cyklofosfamid, meto-treksat i kladrybina. W chwili obecnej jedynym lekiem z tej grupy zatwierdzonym przez FDA do leczenia po-stêpuj¹cego SM jest mitoksantron. Pozosta³e cytostatyki wci¹¿ poddawane s¹ badaniom, a g³ówny problem we wprowadzeniu ich do terapii neurologicznej stanowi¹ liczne efekty uboczne. Leki te wykorzystywane s¹ g³ównie w onkologii i hematologii, gdzie stosowanie tego typu leków jest bardziej uzasadnione. W chwili obec-nej prowadzone s¹ liczne badania zmierzaj¹ce do lepszego poznania mechanizmów dzia³ania cytostatyków na poziomach komórkowym i subkomórkowym. Przyjmuje siê, ¿e mitoksantron indukuje apoptozê, co zmniejsza pulê komórek zapalnych zdolnych do wywo³ywania demielinizacji w obrêbie oœrodkowego uk³adu nerwowego (OUN). Na poziomie molekularnym mechanizm jego dzia³ania polega na uszkodzeniu genomu tych komórek poprzez hamowanie aktywnoœci topoizomerazy II (TOPII) lub bezpoœrednie wbudowywanie siê w strukturê ich DNA. Cyklofosfamid jest cytostatykiem dzia³aj¹cym w g³ównej mierze na komórki dziel¹-ce siê, w których alkiluje on DNA, co indukuje zaburzenia replikacji oraz apoptozê tych komórek. Dzia³anie lecznicze metotreksatu wynika ze zdolnoœci do hamowania aktywnoœci reduktazy dehydrofolianowej. W ten sposób zaburzony zostaje metabolizm zasad azotowych prowadz¹cy do zaburzeñ replikacji i bloku fazy S cy-klu komórkowego leukocytów. Kladrybina dzia³a jako antagonista procesu transkrypcji. Dok³adne poznanie mechanizmów dzia³ania prezentowanych leków mo¿e doprowadziæ do zmniejszenia nasilenia ich efektów ubocznych oraz do zwiêkszenia ich potencja³u leczniczego, równie¿ w terapii neurologicznej.
S
S££OOWWAA KKLLUUCCZZOOWWEE:: ccyyttoossttaattyykkii,, mmiittookkssaannttrroonn,, ccyykkllooffoossffaammiidd,, mmeettoottrreekkssaatt,, kkllaaddrryybbiinnaa,, ssttwwaarrddnniieenniiee rroozzssiiaannee
S
Su
um
mm
maarryy
The aim of this review is the presentation of molecular mechanisms of action of cytostatic drugs used in the therapy of neurological disorders, mostly of multiple sclerosis (MS). From many years cytostatics like antrone, cyclophosphamide, cladribine and methotrexate were used in the MS clinical trials. So far only mitox-antrone has been approved by FDA for the treatment of progressive MS. The other cytostatics are still studied in clinical trials, the main problem with their approval for human therapy are their numerous side effects. So far those drugs are mostly used in oncology and haematology where the usage of this type of drugs is better justified. Now there are many studies leading to better understanding of mechanisms of action of cytostatics at the cellular and subcellular level. Mitoxantrone induces apoptosis and reduce the population of inflammatory
R Reecceeiivveedd:: 09.04.2008 A Acccceepptteedd:: 17.04.2008 P Puubblliisshheedd:: 30.04.2008
INNE ZAGADNIENIA
247
M
MIITTOOKKSSAANNTTRROONN
W
latach 60. wyizolowano z grzybni Streptomy-ces peucetius pierwsze antybiotyki antracykli-nowe: doksorubicynê i daunorubicynê(1).Obec-nie leki z tej grupy z du¿ym powodzeObec-niem stosowane s¹ w terapii wielu typów nowotworów. Syntetyczn¹ pochod-n¹ antracyklin jest mitoksantron (MTX) bêd¹cy efektem poszukiwañ, jakie prowadzono w celu uzyskania œrodka równie skutecznego cytostatycznie co klasyczne antracy-kliny, ale charakteryzuj¹cego siê mniejsz¹ kardiotoksycz-noœci¹. Mitoksantron sta³ siê szczególnie przydatny w te-rapii ró¿nego typu bia³aczek. Od pewnego czasu jego wp³yw na leukocyty znajduje zastosowanie w immuno-moduluj¹cym leczeniu stwardnienia rozsianego(2).
Dzia³anie MTX sprowadza siê do indukcji apoptozy (programmed cell death, PCD) limfocytów, co zmniej-sza pulê autoreaktywnych komórek zdolnych do wywo-³ywania demielinizacji w obrêbie oœrodkowego uk³adu nerwowego (OUN). Jednak podobnie jak w przypadku innych zwi¹zków antracyklinowych dok³adny moleku-larny mechanizm prowadz¹cy do efektu terapeutyczne-go nie jest do koñca wyjaœniony. Uwa¿a siê, ¿e MTX powoduje uszkodzenia genomu poprzez hamowanie aktywnoœci topoizomerazy II (TOPII) lub bezpoœrednie wbudowywanie siê w strukturê DNA. Mówi siê równie¿ o mo¿liwoœci zaburzania równowagi redox i generowa-niu reaktywnych form tlenu w komórce.
Najczêœciej za g³ówny mechanizm proapoptotyczny MTX uznaje siê indukcjê podwójnych pêkniêæ (DSB) DNA w wyniku zablokowania TOPII. Enzym ten wystêpuje w komórkach eukariotycznych w dwóch izoformach: α (wykrywanej g³ównie na terenie macierzy j¹drowej) iβ (o lokalizacji j¹derkowej). Pierwsza z izoform bierze udzia³ w procesach transkrypcji, ulega podwy¿szonej ekspresji podczas podzia³u mitotycznego i uwa¿ana jest za marker proliferacji. Druga izoforma TOPII uczest-niczy g³ównie w transkrypcji rRNA, a podczas mitozy jest eliminowana z j¹dra do cytozolu. Jej podwy¿szon¹ ekspresjê obserwuje siê w komórkach stransformowa-nych nowotworowo. Wed³ug najbardziej rozpowszech-nionych koncepcji MTX wykorzystuje naturaln¹ cechê topoizomerazy do generowania przejœciowych DSB ko-niecznych dla utrzymania prawid³owej topologii DNA
podczas licznych procesów wymagaj¹cych jego prze-strzennej reorganizacji. MTX zapobiega religacji nici polinukleotydowych, prowadz¹c do ich pêkniêæ. Uszko-dzenia te okazuj¹ siê w zdecydowanej wiêkszoœci na ty-le rozty-leg³e, ¿e komórka w³¹cza szlak apoptozy(3).
Specy-ficznym markerem obecnoœci podwójnych pêkniêæ nici DNA jest histon H2AX fosforylowany na Ser139 przez kinazê ATM. W komórkach traktowanych MTX obser-wuje siê w fazie G1 cyklu komórkowego pik fosforylacji histonu H2AX. Aktywacja H2AX poprzedza aktywacjê kaspazy 3 i zanika w miarê postêpu procesu apoptozy(4).
Wydaje siê, ¿e wa¿niejsz¹ rolê w generowaniu DSB przez MTX odgrywa topoizomeraza IIβ. Wyciszenie ekspre-sji topoizomerazy IIβ technik¹ siRNA znosi apoptozê indukowan¹ MTX. Podobnego efektu nie uzyskuje siê po zniesieniu ekspresji topoizomerazy IIα(5).
W wielu pracach MTX opisywany jest jako klasyczny czynnik interkaluj¹cy, który tworzy addukty z cz¹steczka-mi DNA. Efektywnoœæ formowania adduktów wzrasta wraz ze zwiêkszaj¹cym siê stê¿eniem MTX. Czynnikiem niezbêdnym dla stabilizacji oddzia³ywañ MTX – DNA, a tym samym mog¹cym poprawiaæ efektywnoœæ MTX jako cytostatyka, okazuje siê byæ formaldehyd. W warun-kach in vitro ani sam MTX, ani te¿ sam formaldehyd nie s¹ w stanie indukowaæ wewn¹trzniciowych skrzy¿owañ DNA(6). Powstaj¹ce addukty s¹ zwi¹zane z N-7 guaniny
i charakteryzuj¹ siê pewn¹ labilnoœci¹. Badania spektro-metryczne sugeruj¹, ¿e wi¹zanie nastêpuje tylko z jedn¹ nici¹ DNA i jest ono mniej stabilne termicznie ni¿ analo-giczne addukty doksorubicyna – DNA(7).
Oddzia³ywanie DNA i MTX zmienia przestrzenn¹ or-ganizacjê ³añcuchów polinukleotydowych, doprowadza-j¹c do bloku transkrypcji (uniemo¿liwione jest przesuwa-nie siê polimerazy RNA, a tak¿e egzonukleazy λ). Blok ten jest zale¿y od stê¿eñ MTX i formaldehydu i wywo-³ywany g³ównie w sekwencjach CpG i CpA(8). Ta pewna
preferencja do wywo³ywania bloku transkrypcyjnego w regionach bogatych w cytozynê nasunê³a hipotezê o powi¹zaniu dzia³ania MTX z metylacj¹ DNA. Okaza-³o siê, ¿e zmetylowanie cytozyny CG w sekwencji CCGG (CC*GG) prowadzi do zwiêkszenia zahamowania trans-krypcji w porównaniu z sekwencj¹ niezmetylowanych. Blok nie by³ indukowany, gdy metylowany DNA pod-dawano dzia³aniu samego MTX. Konieczny by³
egzo-cells capable to initiate demyelination in the central nervous system (CNS). At the molecular level mitoxantrone damages genome of inflammatory cells by inhibition of activity of topoisomerase II (TOP II) or direct interac-tion with DNA structure. Cyclophosphamide is a cytostatic acting mainly on dividing cells, in which it alkylates DNA and interferes with replication and cell apoptosis. Methotrexate inhibits activity of dehydrofolate reduc-tase what leads to disturbance of replication and blocks phase S of the cell cycle in leukocytes. Cladribine is an antagonist of transcription. The detailed analysis of these mechanisms may lead to diminishing of the level of their side effects and to increase of their therapeutic potential, also in neurological therapy.
K
248
genny aktywator w postaci formaldehydu. Równie¿ sa-ma metylacja nie by³a w stanie zatrzysa-maæ polimerazy RNA. Na intensywnoœæ zatrzymania reakcji transkryp-cji oraz na intensywnoœæ formowania adduktów MTX – DNA nie mia³a natomiast wp³ywu metylacja cytozy-ny CC w sekwencji CCGG (C*CGG). Tak wiêc jedynie bardzo specyficzna metylacja cytozyn w DNA prowadzi do wzmo¿enia tworzenia nowych wi¹zañ miêdzy DNA a MTX zaktywowanym przez formaldehyd. Bior¹c pod uwagê, ¿e stopieñ metylacji DNA mo¿e podlegaæ fluktu-acjom w komórkach w pewnych stanach patologicznych, nie bez znaczenia pozostaje zwi¹zek miêdzy cytosta-tycznym dzia³aniem MTX a chemicznymi modyfika-cjami zasad azotowych(9). Warto przy okazji wspomnieæ
o mo¿liwoœci stosowania innych kombinacji zwi¹zków chemicznych mog¹cych podnosiæ efektywnoœæ trucizn TOPII. Ostatnie badania dowiod³y, ¿e po³¹czenie inku-bacji komórek linii HCT116 w inhibitorze TOPII (etopo-zydzie) i blokerze bia³ek Hsp90 (geldanamycynie) nasila liczbê uszkodzeñ DNA oraz zwiêksza odsetek komórek z symptomami apoptozy w porównaniu z komórkami traktowanymi pojedynczymi inhibitorami. Dzieje siê tak, poniewa¿ geldanamycyna uwalnia TOPII z komplek-sów z Hsp90, przyczyniaj¹c siê do zwiêkszenia liczby aktywnych kompleksów TOPII – DNA. Przy jednocze-snej obecnoœci etopozydu lub innego inhibitora TOPII mo¿na indukowaæ wiêksz¹ liczbê DSB i PCD(10). Inne
z kolei czynniki s¹ w stanie obni¿yæ cytotoksycznoœæ MTX, ale bez oddzia³ywania na poziom uszkodzeñ DNA, co sugeruje, ¿e za procesy prowadz¹ce do œmier-ci komórki odpowiadaj¹ czynniki po³o¿one downstream w stosunku do formowania kompleksów TOPII – DNA. Niejasne wci¹¿ pozostaje, czy indukowana MTX apop-toza jest prost¹ konsekwencj¹ zablokowania enzymu TOPII, czy te¿ takie wydarzenia, jak blok p34cdc2 lub niew³aœciwa rekombinacja DNA bêd¹ce raczej wtórny-mi efektawtórny-mi dzia³ania MTX, staj¹ siê przyczyn¹ inicja-cji szlaku PCD.
Prawdopodobnie równie¿ wtórnym efektem jest akty-wacja czynnika NF-κB przez MTX. Aktyakty-wacja taka jest zale¿na od stê¿enia dawki MTX i wymaga obecnoœci funkcjonalnego enzymu TOPII (brak aktywacji NF-κB w linii mutantów pozbawionych TOPII). Równie¿ jedy-nie w linii dzikiej MTX powoduje degradacjê kaspazy 3. Co ciekawe, czynnik NF-κB podlega aktywacji zarówno w komórkach dzikich, jak i zmutowanych (pod wzglê-dem struktury i funkcji TOPII) po stymulacji cytokin¹ TNF-α. Okazuje siê, ¿e uszkodzenia DNA generowane przez TOPII po inkubacji w MTX s¹ bezpoœrednio po-wi¹zane z aktywacj¹ NF-κB, czego dowodz¹ badania z zastosowaniem ICRF-187 – inhibitora TOPII niewpro-wadzaj¹cego DSB. ICRF-187 znacznie s³abiej aktywu-je NF-κB i nie indukuaktywu-je apoptozy, a preinkubacja ko-mórek w ICRF-187, poprzedzaj¹ca inkubacjê w MTX, znosi proapoptotyczny i aktywuj¹cy NF-κB efekt MTX. Wydaje siê, ¿e ICRF-187 chroni degradacjê IκB, nie
po-zwalaj¹c na oddysocjowanie NF-κB. Nie wiadomo jed-nak, która z izoform TOPII jest zaanga¿owana w opisa-ne tutaj procesy aktywacji NF-κB i w jaki sposób sygna³ o uszkodzeniu DNA (sygna³ „mitoksantronowy”) zaczy-na wspó³dzia³aæ ze szlakiem NF-κB(3). Campbell w swojej
pracy(11)podkreœla rolê MTX jako czynnika nie tyle
hamu-j¹cego aktywnoœæ TOPII, ile bezpoœrednio wbudowuj¹ce-go siê w strukturê DNA. A zdolnoœæ klinicznie stosowa-nych inhibitorów TOPII do w³¹czania siê w cz¹steczkê DNA ma wed³ug niego korelowaæ z indukcj¹ takich czyn-ników, jak np. NF-κB. Proces wi¹zania NF-κB z DNA mo¿e spowalniaæ obecnoœæ reaktywnych form tlenu. W komórkach bia³aczkowych (HL60) dzia³anie MTX prowadzi do intranukleosomalnej fragmentacji DNA i apoptozy. Towarzyszy temu wzmo¿ona ekspresja genu c-jun, dodatkowo stymulowana estrami forbolu (akty-watory kinazy bia³kowej C), ale niehamowana stauro-sporyn¹ (inhibitor PKC). Niezgodnoœæ ta sugeruje, ¿e c-jun oraz PKC nie s¹ jedynymi i bezpoœrednimi regula-torami intranukleosomalnej fragmentacji DNA i apopto-zy indukowanej MTX(12). Co wiêcej, w pewnych
przypad-kach œmieræ komórki inicjowana chemioterapeutykami – w tym MTX – mo¿e siê odbywaæ bez zaanga¿owania c-jun(13). Procesom tym towarzyszy równie¿ spadek
ak-tywnoœci bia³ek Bcl-2 i c-Myc(12). Badania maj¹ce na
ce-lu okreœlenie, czy komórki znajduj¹ce siê w konkretnej fazie cyklu komórkowego s¹ bardziej podatne na dzia-³anie MTX, dowiod³y, ¿e najbardziej wra¿liw¹ jest sub-populacja komórek replikuj¹cych w fazie S(14).
Nie bez znaczenia dla pro- lub antypoptotycznego dzia-³ania MTX pozostaje typ badanej linii komórkowej oraz obecnoœæ specyficznych izoform kinazy bia³kowej C. W komórkach U937 nadekspresja PKC podnosi sto-pieñ prze¿ywalnoœci komórek po inkubacji w MTX. Nie zmienia siê przy tym poziom TOPII, ale znacznie spa-da jej aktywnoœæ katalityczna, co objawia siê w postaci zmniejszonej iloœci DSB. Zahamowanie TOPII jest wy-nikiem jej hiperfosforylacji przez ulegaj¹c¹ nadekspre-sji PKC. Reakcja ta jest charakterystyczna dla TOPII β. Tak wiêc nie mo¿na wykluczyæ, ¿e nadekspresja pewnych specyficznych izoform PKC mo¿e wyciszaæ proapopto-tyczny sygna³ generowany po uszkodzeniu genomu le-kami cytotoksycznymi, przyczyniaj¹c siê w ten sposób do wzmo¿enia odpornoœci komórek na cytostatyki(15). Na
komórkach innej linii bia³aczkowej wykazano, ¿e inicja-cja apoptozy przez MTX jest poprzedzona zmianami konformacyjnymi bia³ka mitochondrialnego Bax. Po inkubacji komórek w MTX bia³ko Bax wbudowuje siê w b³onê mitochondrialn¹ i staje siê jej integralnym ele-mentem. Poniewa¿ podanie inhibitora kaspaz nie wp³y-wa³o na omawiane zmiany struktury bia³ka Bax, wydaje siê, ¿e reakcje te s¹ niezale¿ne od kaspaz lub poprze-dzaj¹ w czasie ich aktywacjê. Podobnie do Bax po za-dzia³aniu MTX zachowuje siê inne bia³ko proapopto-tyczne – Bak. Konformacyjne przemiany Bax i Bak prawdopodobnie maj¹ wp³yw na modulowanie
oddzia-249
³ywañ bia³ko – bia³ko istotnych dla integracji sygna³uo uszkodzeniu genomu i uruchomieniu apoptozy. Opi-sane wy¿ej procesy s¹ niezale¿ne od bia³ka p53(16).
Wykryto pewne procesy komórkowe czy cechy komórek mog¹ce znacznie zmniejszaæ efektywnoœæ cytostatycz-nego dzia³ania MTX. Jedn¹ z takich cech jest obecnoœæ cytokeratyny w komórkach. Okazuje siê, ¿e cytokeraty-na jest cz¹steczk¹ (prawdopodobnie jedn¹ z wielu) pe³-ni¹c¹ rolê cytoprotekcyjn¹ wzglêdem komórek nara¿o-nych na MTX(17). Równie¿ adhezja komórek linii U937
do fibronektyny za poœrednictwem integryny β hamuje inicjacjê DSB przez MTX. Wi¹¿e siê to z jednoczesnym spadkiem aktywnoœci enzymatycznej TOPII oraz ze zmniejszeniem iloœci enzymu ekstrahowanego z komó-rek roztworami soli. Za ubytek w liczbie DSB zale¿-nych od MTX odpowiadaæ mo¿e zmiana w lokalizacji gromadzenia leku w komórce, a tak¿e zaburzenia w je-go wi¹zaniu siê z DNA(18).
MTX wp³ywa tak¿e na wzajemny stosunek w komórce mediatorów proapoptotycznych – ceramidu i antyapo-ptotycznych – diacyloglicerolu. MTX indukuje produk-cjê ceramidu prawdopodobnie na poziomie enzymu sfingomielinazy (podobnie jak to robi daunorubicyna). Jednoczeœnie MTX mo¿e uruchamiaæ syntezê DAG. Obie reakcje obserwuje siê przy stê¿eniach MTX stoso-wanych klinicznie. Preinkubacja komórek w inhibitorze fosfolipazy C – D609 – prowadzi do spadku w poziomie DAG i wzrostu stê¿enia ceramidu. Co ciekawe, wspom-niana preinkubacja zwiêksza liczbê cz¹steczek cerami-du i efektywnie incerami-dukuje œmieræ komórki, gdy stosuje siê nastêpnie stê¿enia MTX nieefektywne klinicznie. Rola DAG jako negatywnego regulatora w apoptozie indu-kowanej chemioterapeutykami pozostaje nadal niejasna. Opisane wyniki wydaj¹ siê wskazywaæ na rolê pewnej równowagi miêdzy cz¹steczkami ¿ycia (DAG) a cz¹-steczkami œmierci (ceramid) w œmierci komórki, a wiêc i w efektywnoœci dzia³ania cytostatyków.
Mitoksantron podajemy pacjentom we wlewach kroplo-wych w iloœci 12 mg/m2powierzchni cia³a, a¿ do
osi¹g-niêcia dawki ¿yciowej 140 mg. Ze wzglêdu na du¿¹ kar-diotoksycznoœæ konieczne jest monitorowanie funkcji serca (ECHO serca, EKG). Spadek frakcji wyrzutowej o 10% w stosunku do wyjœciowej stanowi przeciwwska-zanie do podawania mitoksantronu.
C
CYYKKLLOOFFOOSSFFAAMMIIDD
Leukopenia jest jednym z charakterystycznych objawów obserwowanych po podaniu cyklofosfamidu (CTX). Podskórna iniekcja CTX powoduje 80-90% spadek licz-by leukocytów. Najwiêkszy spadek liczlicz-by leukocytów obserwowano w 4 i 11 dniu stosowania tego leku(19).
Pomimo istnienia znacznych ró¿nic w liczbie bia³ych krwinek pomiêdzy osobnikami kontrolnymi a leczonymi CTX trudno jest dopatrzeæ siê zró¿nicowania w sk³adzie cytokin prozapalnych wydzielanych w obu tych grupach.
Sugestia taka wynika z badañ prowadzonych na my-szach, u których badano wp³yw CTX na przebieg infek-cji S. pneumoniae. Zarówno u myszy z normaln¹ liczb¹ leukocytów, jak i u myszy z leukopeni¹ zaobserwowano podobne poziomy wydzielania IL-1β, IL-6, MIP-2, MIP-1α i MCP-1 (stê¿enia chemokin badano w homo-genatach p³uc). Jednoczeœnie w tych eksperymentach uda³o siê wykazaæ brak wp³ywu CTX na strukturê i prze-puszczalnoœæ œródb³onka naczyñ krwionoœnych i znacz-ny spadek produkcji tlenku azotu u myszy z leukopeni¹. Jednak najwa¿niejsz¹ konkluzj¹ prezentowanych do-œwiadczeñ jest silna redukcja liczby leukocytów, a co za tym idzie mo¿liwoœæ nara¿enia organizmu na wiêk-sze ryzyko infekcji podczas terapii CTX. Autorzy dobit-nie wykazali to w obrazach histopatologicznych p³uc myszy, którym przed infekcj¹ bakteryjn¹ podawano CTX, i u myszy infekowanych S. pneumoniae bez uprzedniego podania CTX. U tych pierwszych wystêpowa³y znaczne zw³óknienia tkanki, uszkodzenie epitelium, destrukcja pêcherzyków p³ucnych, a tak¿e zahamowanie wydzie-lania surfaktantu(20). W pierwszej kolejnoœci swe
dzia³a-nie immunosupresyjne CTX kieruje na granulocyty, a nastêpnie na limfocyty. Maksimum neutropenii (spa-dek liczby neutrofili o ok. 80%) obserwowano w 4. dniu eksperymentu(21). Po podaniu CTX wystêpuje tak¿e
ob-ni¿enie stê¿enia nitrotyrozyny, tlenków azotu i aktywno-œci makrofagowej mieloperoksydazy oraz spadek liczby samych makrofagów. Wspomniane procesy zaobserwo-wano po zastosowaniu CTX u myszy wyposa¿onych w sprawny enzym syntetazê tlenku azotu (NOS). U zwie-rz¹t zmutowanych i pozbawionych syntetazy NO za-obserwowano jedynie redukcjê poziomu nitrotyrozyny. Sugeruje to, ¿e CTX mo¿e bezpoœrednio uszkadzaæ syntetazê NO lub jeden z jej kofaktorów. Powa¿n¹ tego konsekwencj¹ by³o zahamowanie zabijania Mycoplas-ma u myszy NOS+/+ (22). Powy¿sze dane dowodz¹, ¿e
immunosupresja wywo³ywana przez CTX mo¿e jedno-czeœnie prowadziæ do nara¿enia organizmu na infekcje bakteryjne. Te okresowe leukopenie zwiêkszaj¹ce ryzy-ko zaka¿eñ oportunistycznych s¹ powa¿nym skutkiem ubocznym stosowania CTX. Interesuj¹ce w tym aspek-cie s¹ badania np. polisacharydów izolowanych z korze-ni Angelica sinensis, które wywieraj¹ efekt immunosty-muluj¹cy i przyœpieszaj¹cy wyjœcie ze stanu leukopenii, pozwalaj¹c na skrócenie okresów przerw w podawaniu leku i zwiêkszenie efektywnoœci chemioterapii. Wielo-cukry A. sinensis oddzia³uj¹ na komórki antagonistycz-nie do CTX: zwiêkszaj¹ liczbê proliferuj¹cych komórek, wzmagaj¹ angiogenezê (oba procesy zale¿ne od daw-ki). Jednoczeœnie nastêpuje wyjœcie z CTX-zale¿nej leu-kopenii o dwa dni szybciej ni¿ w grupie kontrolnej. Po-lisacharydy A. sinensis nie wywieraj¹ ¿adnego wp³ywu na ekspresjê genów c-Myc, DOC i EGF, podczas gdy CTX j¹ obni¿a. Spoœród genów, których ekspresja jest bloko-wana przez CTX, jedynie na gen VEGF polisacharydy A. sinensis dzia³aj¹ indukuj¹co w sposób doœæ silny(19).
250
CTX jest cytostatykiem dzia³aj¹cym w g³ówniej mierze na komórki dziel¹ce siê. Po 24-godz. inkubacji obser-wuje siê znaczny spadek odsetka komórek dziel¹cych siê w ró¿nych liniach komórkowych hodowanych in vitro(23).
Prowadz¹c do alkilacji, DNA indukuje zaburzenia re-plikacji oraz apoptozê. W sposób dobitny wykazano efekt proapoptotyczny CTX podczas badañ teratoge-nezy na zarodkach mysich. Konsekwencj¹ zastosowa-nia CTX by³y znaczne zaburzezastosowa-nia w rozwoju czaszki. Na poziomie molekularnym dzia³anie CTX na komórki mózgu sprowadza³o siê do indukcji licznych apoptoz, zaburzeñ wi¹zania czynnika NF-κB z DNA oraz uak-tywnienia kaspazy 3 i 8. W w¹trobie CTX równie¿ ini-cjowa³ apoptozê, ale jedynie w sposób przejœciowy, a kas-pazy w¹trobowe nie osi¹ga³y tak wysokiego poziomu aktywnoœci, jak kaspazy mózgowe. Nie obserwowano równie¿ nieprawid³owoœci w morfogenezie w¹troby oraz zaburzeñ oddzia³ywania NF-κB z DNA. W obu bada-nych organach zarodkowych wzrasta³ odsetek komórek wykazuj¹cych objawy apoptozy po traktowaniu CTX poprzedzonym podaniem salicylanu sodu – inhibitora wi¹zania NF-κB z DNA. Przytoczone dane sugeruj¹, ¿e NF-κB mo¿e byæ negatywnym regulatorem œmierci ko-mórki i kontrolowaæ teratogenezê indukowan¹ CTX(24).
Przy okazji dzia³ania teratogennego CTX warto wspo-mnieæ, ¿e cytostatyk ten oprócz dzia³ania terapeutycz-nego mo¿e równie¿ w pewnych warunkach wykazywaæ dzia³anie kancerogenne i przyczyniaæ siê do powstawa-nia raka pêcherza moczowego i bia³aczki. Wi¹¿e siê to z wp³ywem akroleiny (metabolit cyklofosfamidu – patrz ni¿ej) na materia³ genetyczny komórek, a czynnikiem chroni¹cym tkanki przed tak wywo³an¹ transformacj¹ nowotworow¹ jest enzym alkilotransferaza(25).
Sam CTX nie powoduje bezpoœrednio efektu lecznicze-go, kancerogennego ani immunosupresyjnelecznicze-go, lecz jest substancj¹ prekursorow¹, metabolizowan¹ w organizmie do w³aœciwych zwi¹zków cytostatycznych. Hydroksyla-cja wêgla w pierœcieniu CTX prowadzi do powstania 4-hydroksycyklofosfamidu pozostaj¹cego w równowa-dze ze swoj¹ form¹ tautomeryczn¹ – aldofosfamidem. Spontaniczna reakcja prowadzi nastêpnie do uwolnie-nia z aldofosfamidu akroleiny, która ma zdolnoœæ alki-lowania DNA. Poszczególne metabolity szlaku mog¹ byæ przekszta³cane przez odpowiednie enzymy do zwi¹z-ków nieaktywnych biologicznie (np. aldofosfamid mo-¿e byæ zredukowany do nieaktywnego alkoholu przez reduktazê aldehydow¹). CFX ulega biotransformacji w organizmie w dwóch szlakach metabolicznych. Pro-duktami pierwszego szlaku s¹ akroleina i kwas musztar-dowy, natomiast produktami drugiego szlaku s¹ 3-de-chloroetylocyklofosfamid (nieaktywny biologicznie), chloroacetoaldehyd (który mo¿e byæ odpowiedzialny za neuro-, kardio- i urotoksycznoœæ CFX) oraz oksazofo-ryny(26). Drugi z tych szlaków stanowi jedynie 10%
meta-bolizmu CFX(27). Obecnie dysponujemy licznymi
dany-mi dotycz¹cydany-mi przedany-mian w organizdany-mie samego CTX.
S³abo poznane s¹ natomiast szlaki biochemicznych transformacji jego metabolitów. Oprócz akroleiny i kwa-su musztardowego istnieje szereg innych zwi¹zków bê-d¹cych pochodnymi CTX. Jednak s¹ one stosunkowo ma³o stabilne. Ogólnie przyjêty pogl¹d, udokumento-wany danymi eksperymentalnymi, g³osi, ¿e w 24 godzi-ny po podaniu CTX jego metabolity s¹ ca³kowicie usu-wane z organizmu z moczem(26).
G³ównym miejscem biotransformacji CTX jest w¹tro-ba. U myszy HRN pozbawionych aktywnoœci w¹trobo-wego cytochromu P-450 obserwowano wzrost stê¿enia CTX w osoczu. Zaburzona by³a równie¿ synteza jego pierwszorzêdowych pochodnych. Przy dawkach CTX przekraczaj¹cych 100 mg/kg nie obserwowano ró¿nic w poziomie indukowanej CTX granulocytopenii u my-szy dzikich i mutantów HRN. Przy ni¿my-szych stê¿eniach (poni¿ej 70 mg/kg) wystêpowa³a 45% granulocytopenia w szpiku myszy z funkcjonalnym cytochromem P-450(27).
Wœród izoform cytochromu P-450 odpowiedzialnych za pierwsze etapy w¹trobowego metabolizmu CTX (4-hydroksylacja) wymienia siê CYP2C9 i CYP3A4(28,29),
a tak¿e CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8(29). Wydaje siê, ¿e
w³¹czenie poszczególnych izoform cytochromu mo¿e byæ zale¿ne od stê¿enia podanego CTX(28). Jednak
wczeœniejsze eksperymenty zdaj¹ siê sugerowaæ mo¿li-woœæ aktywowania CTX przez enzymy niepochodz¹ce z hepatocytów. W liniach komórek niewywodz¹cych siê z w¹troby (m.in. komórki HeLa) obserwowano spadek liczby mitoz, a w linii BSC-1 zmiany morfologii komó-rek (powiêkszone, niekiedy pyknotyczne j¹dra, zmiany w cytoplazmie). Autorzy tych badañ nie wykluczyli rów-nie¿ mo¿liwoœci obecnoœci w mediach hodowlanych pewnych kofaktorów enzymatycznych mog¹cych wp³y-waæ na metabolizm CTX(23).
Je¿eli chodzi o wp³yw CTX na komórki uk³adu immu-nologicznego, to oprócz postêpuj¹cej leukopenii obser-wuje siê spadek produkcji czynnika zahamowania migra-cji makrofagów (MIF) przez limfocyty, które zdo³a³y jeszcze pozostaæ w kr¹¿eniu. Znacznie spada równie¿ tempo proliferacji limfocytów w odpowiedzi na mitogeny. Ponadto silniejszej redukcji ulega³y podzia³y limfocy-tów w odpowiedzi na antygeny. Ten ostatni efekt obser-wowano równie¿ w œledzionie i wêz³ach limfatycz-nych(30). Podobne zjawiska, takie jak indukowana przez
CTX leukopenia i spadek liczby komórek proliferuj¹-cych w odpowiedzi na mitogeny, obserwowano w po-pulacji limfocytów B. We krwi obwodowej pacjentów leczonych przez d³ugi czas niskimi dawkami CTX znaj-dowano wiêkszy odsetek limfocytów B o zwiêkszonych rozmiarach w porównaniu do pacjentów nie poddawa-nych takiej chemioterapii. Te stosunkowo du¿e komórki nie powiêksza³y ju¿ wiêcej swojej objêtoœci po aktywa-cji. Nie nastêpowa³a równie¿ ekspresja powierzchnio-wych markerów aktywacji. Byæ mo¿e tego typu zmiana morfologiczna jest specyficznym objawem reakcji na dzia³anie czynnika alkiluj¹cego. Na podstawie tych
wy-251
ników mo¿na uznaæ CTX za czynnik hamuj¹cyprolife-racjê i aktywacjê limfocytów B. Ponadto CTX ma rów-nie¿ w³aœciwoœæ blokowania ich ró¿nicowania, czego dowodzi supresja produkcji Ig po otrzymaniu sygna³u ró¿nicowania od limfocytów T(31).
M
MEETTOOTTRREEKKSSAATT
Metotreksat wprowadzono w latach 40. XX wieku do terapii ostrych bia³aczek dzieciêcych. Jego dzia³anie lecz-nicze wi¹¿e siê z efektem antyproliferacyjnym wzglêdem leukocytów, który wynika z kolei ze zdolnoœci do hamo-wania aktywnoœci reduktazy dehydrofolianowej. W ten sposób zaburzony zostaje metabolizm zasad azoto-wych, prowadz¹cy do zaburzeñ replikacji i bloku fazy S cyklu komórkowego. Obecnie metotreksat z powodze-niem bywa stosowany w leczeniu ³uszczycy, ³uszczyco-wego zapalenia stawów, zespo³u przeszczep przeciwko gospodarzowi, choroby Crohna, reumatoidalnego za-palenia stawów i innych chorób o pod³o¿u autoimmu-nologicznym. Podstaw¹ do tego jest nie tylko jego efekt cytostatyczny, ale równie¿ zdolnoœæ do ingerowania bezpoœrednio w procesy zapalne(32). Na przyk³adzie linii
komórek Jurkat (a tak¿e innych linii komórkowych) zbadano wp³yw metotreksatu na aktywacjê NF-κB dukowan¹ TNF. Zaobserwowano blok degradacji i in-hibicjê fosforylacji cz¹steczek IκBα, co prowadzi³o do zniesienia aktywnoœci kinazowej tego bia³ka. Konse-kwencj¹ tego by³o hamowanie aktywacji NF-κB (sty-mulowanej TNF i innymi moleku³ami prozapalnymi) oraz zale¿nych od NF-κB genów. Prawdopodobnie czyn-nikiem odpowiedzialnym za uruchomienie powy¿szych procesów jest adenozyna, której wzmo¿one wydziela-nie przez komórki obserwuje siê po podaniu metotrek-satu(33). Dwudniowa inkubacja fibroblastów i komórek
endotelium z metotreksatem prowadzi do wzrostu udzia-³u adenozyny w puli uwalnianych z tych komórek zasad azotowych – dla fibroblastów jest to wzrost z 24 do 42%, dla nab³onka z 4 do 31%. Interesuj¹ca jest obserwacja dramatycznego spadku adherencji aktywowanych neu-trofili do fibroblastów charakteryzuj¹cych siê wzmo¿o-n¹ sekrecj¹ adenozyny stymulowawzmo¿o-n¹ metotreksatem, co mo¿e t³umaczyæ przeciwzapalne dzia³anie omawiane-go terapeutyku(34). Uwalnianie adenozyny przez
syno-wiocyty i komórki nab³onka traktowane metotreksatem odpowiada równie¿ za hamowanie ekspresji receptora NURR1, odgrywaj¹cego istotn¹ rolê w integracji szla-ków biochemicznych odpowiedzialnych za wzbudzenie odpowiedzi zapalnej(32).
U chorych na reumatoidalne zapalenie stawów leczo-nych metotreksatem obserwowano spadek liczby limfo-cytów CD4+ produkuj¹cych TNF-α, wzrost odsetka
komórek produkuj¹cych IL-10, nieznaczne podniesie-nie produkcji IL-4 i brak zmian w syntezie IFN-γ w po-równaniu z komórkami kontrolnymi (35). O s³abym wp³ywie metotreksatu na wydzielanie IFN-γ œwiadczy
równie¿ praca Hildnera i wsp.(36)Jej autorzy równie¿
potwierdzaj¹, ¿e jedn¹ z g³ównym podstaw terapeutycz-nego dzia³ania metotreksatu w chorobach autoimmuno-logicznych jest inhibicja wydzielania TNF, a koñcowy efekt przeciwzapalny zale¿y od fazy aktywacji limfocy-tów wystawionych na dzia³anie metotreksatu.
Na zwierzêcym modelu reumatoidalnego zapalenia sta-wów wykazano selektywne niszczenie przez metotreksat limfocytów CD8+i hamowanie aktywacji makrofagów.
W ³uszczycy natomiast zauwa¿ono zniesienie w³aœciwo-œci chemotaktycznych neutrofili(37). W badaniach ex vivo
i in vitro z u¿yciem metotreksatu opisano wzmo¿on¹ produkcjê TIMP-1 (tissue inhibitor of metalloproteina-ses-1) i Il-6 przez jednoj¹drowe leukocyty pobrane od chorych na reumatoidalne zapalenie stawów i od zdro-wych ochotników(38).
K
KLLAADDRRYYBBIINNAA
Dzia³anie terapeutyczne kladrybiny (2-chlorodeoksyade-nozyna) zale¿y od wewn¹trzkomórkowych przemian bio-chemicznych do odpowiednich fosforanów (CldAMP, CldATP). Produktem pierwszej reakcji na drodze akty-wacji kladrybiny jest adenozynomonofosforan CdA (CldAMP), a za katalizator tej reakcji s³u¿y kinaza de-oksyguanozyny (enzym mitochondrialny). Wykazano, i¿ cz¹steczka ta (CldAMP) znajduje siê w komórkach eu-kariotycznych w sekwencji promotorowej i obni¿a trans-krypcyjn¹ syntezê RNA przez polimerazê II (pol II). Po³¹czenie czynnika transkrypcyjnego II D (TFIID) z re-gionem TATA hamuje aktywnoœæ transkrypcyjn¹ pol II. Aktywnoœæ regulatorowa TFIID wymaga obecnoœci in-nych bia³ek regulatorowych, takich jak: TFIIA, TFIIB, TBIIF i TBIIH. Tworz¹ one wspólnie kompleks, który jest rozpoznawany przez RNA pol II. TFIID zawiera bia³ko wi¹¿¹ce TATA-box (TBP) oraz czynniki zwi¹za-ne z TBP (TAFs). Kolejnymi pochodnymi s¹ 5’-difos-foran CdA i adenozynotrifos5’-difos-foran CdA (CldATP)(39).
Jed-na z prac sugeruje, ¿e kladrybiJed-na dzia³a jako antagonista procesu transkrypcji. Wynika to z wbudowywania siê cz¹steczek CdA w strukturê DNA, zw³aszcza w regio-nach promotorów genów. Takie zmiany struktury pierw-szorzêdowej DNA prowadz¹ do obni¿enia zdolnoœci wi¹zania z DNA bia³ek TBP (TATA binding proteins). Efektem tego jest niemo¿noœæ rozpoznania przez TBP promotorów genów i uniemo¿liwienie oddysocjowania oraz zwi¹zania z normalnymi sekwencjami TATA. Ka¿-da z tych mo¿liwoœci prowadzi do redukcji poziomu mRNA, co jest szczególnie szkodliwe dla bia³ek o krót-kim czasie ¿ycia, niezbêdnych dla prawid³owego funkcjo-nowania komórki(40). Kladrybina znalaz³a zastosowanie
w hematologii w leczeniu bia³aczki w³ochatokomórko-wej oraz w reumatologii w leczeniu reumatoidalnego zapalenia stawów. W neurologii próbuje siê j¹ wykorzy-stywaæ w leczeniu stwardnienia rozsianego.
252
PIŒMIENNICTWO: BIBLIOGRAPHY: 1
1.. Minotti G., Menna P., Salvatorelli E. i wsp.: Anthracy-clines: molecular advances and pharmacologic develop-ments in antitumor activity and cardiotoxicity. Pharma-col. Rev. 2004; 56: 185-229.
2
2.. Goodin D.S., Arnason B.G., Coyle P.K. i wsp.; Thera-peutics and Technology Assessment Subcommittee of the American Academy of Neurology: The use of mitox-antrone (Novmitox-antrone) for the treatment of multiple sclero-sis: report of the Therapeutics and Technology Assessment Subcommittee of the American Academy of Neurology. Neurology 2003; 61: 1332-1338.
3
3.. Boland M.P., Fitzgerald K.A., O’Neill L.A.: Topoiso-merase II is required for mitoxantrone to signal nuclear
factor κB activation in HL60 cells. J. Biol. Chem. 2000;
275: 25231-25238. 4
4.. Halicka H.D., Smolewski P., Darzynkiewicz Z. i wsp.: Arsenic trioxide arrests cells early in mitosis leading to apoptosis. Cell Cycle 2002; 1: 201-209.
5
5.. Chikamori M., Fukushima K.: A new hexose transporter from Cryptococcus neoformans: molecular cloning and structural and functional characterization. Fungal Genet. Biol. 2005; 42: 646-655.
6
6.. Parker B.S., Cullinane C., Phillips D.R.: Formation of DNA adducts by formaldehyde-activated mitoxantrone. Nucleic Acids Res. 1999; 27: 2918-2923.
7
7.. Parker B.S., Buley T., Evison B.J. i wsp.: A molecular understanding of mitoxantrone-DNA adduct formation: effect of cytosine methylation and flanking sequences. J. Biol. Chem. 2004; 279: 18814-18823.
8
8.. Parker B.S., Cutts S.M., Cullinane C., Phillips D.R.: Formaldehyde activation of mitoxantrone yields CpG and CpA specific DNA adducts. Nucleic Acids Res. 2000; 28: 982-990.
9
9.. Parker B.S., Cutts S.M., Phillips D.R.: Cytosine methy-lation enhances mitoxantrone-DNA adduct formation at CpG dinucleotides. J. Biol. Chem. 2001; 276: 15953--15960.
1
100.. Barker C.R., Hamlett J., Pennington S.R. i wsp.: The topoi-somerase II-Hsp90 complex: a new chemotherapeutic tar-get? Int. J. Cancer 2006; 118: 2685-2693.
1
111.. Campbell K.J., O’Shea J.M., Perkins N.D.: Differential
regulation of NF-κB activation and function by topoiso-merase II inhibitors. BMC Cancer 2006; 6: 101. 1
122.. Bhalla K., Ibrado A.M., Tourkina E. i wsp.: High-dose
mitoxantrone induces programmed cell death or apopto-sis in human myeloid leukemia cells. Blood 1993; 82: 3133-3140.
1
133.. Bullock G., Ray S., Reed J. i wsp.: Evidence against a direct role for the induction of c-jun expression in the mediation of drug-induced apoptosis in human acute leukemia cells. Clin. Cancer Res. 1995; 1: 559-564.
1
144.. Gorczyca W., Gong J., Ardelt B. i wsp.: The cell cycle relat-ed differences in susceptibility of HL-60 cells to apoptosis induced by various antitumor agents. Cancer Res. 1993; 53: 3186-3192.
1
155.. Plo I., Hernandez H., Kohlhagen G. i wsp.:
Overexpres-sion of the atypical protein kinase C reduces topoiso-merase II catalytic activity, cleavable complexes forma-tion, and drug-induced cytotoxicity in monocytic U937 leukemia cells. J. Biol. Chem. 2002; 277: 31407-31415. 1
166.. Bellosillo B., Villamor N., López-Guillermo A. i wsp.:
Spontaneous and drug-induced apoptosis is mediated by conformational changes of Bax and Bak in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Blood 2002; 100: 1810-1816. 1
177.. Anderson J.M., Heindl L.M., Bauman P.A. i wsp.:
Cytok-eratin expression results in a drug-resistant phenotype to
six different chemotherapeutic agents. Clin. Cancer Res. 1996; 2: 97-105.
1
188.. Hazlehurst L.A., Valkov N., Wisner L. i wsp.: Reduction
in drug-induced DNA double-strand breaks associated
with β1 integrin-mediated adhesion correlates with drug
resistance in U937 cells. Blood 2001; 98: 1897-1903. 1
199.. Hui M.K., Wu W.K., Shin V.Y. i wsp.: Polysaccharides
from the root of Angelica sinensis protect bone marrow and gastrointestinal tissues against the cytotoxicity of cyclophosphamide in mice. Int. J. Med. Sci. 2006; 3: 1-6. 2
200.. Wang E., Simard M., Ouellet N. i wsp.: Pathogenesis of
pneumococcal pneumonia in cyclophosphamide-induced leukopenia in mice. Infect. Immun. 2002; 70: 4226-4238. 2
211.. Zuluaga A.F., Salazar B.E., Rodriguez C.A. i wsp.:
Neu-tropenia induced in outbred mice by a simplified low-dose cyclophosphamide regimen: characterization and applica-bility to diverse experimental models of infectious diseases. BMC Infect. Dis. 2006; 6: 55.
2
222.. Hickman-Davis J.M., Lindsey J.R., Matalon S.:
Cyclo-phosphamide decreases nitrotyrosine formation and inhibits nitric oxide production by alveolar macrophages in mycoplasmosis. Infect. Immun. 2001; 69: 6401-6410. 2
233.. Ginsberg A.H., Monte W.T., Johnson K.P.: Effect of
cyclo-phosphamide in vitro and on vaccinia virus replication in tissue culture. J. Virol. 1977; 21: 277-283.
2
244.. Torchinsky A., Lishanski L., Wolstein O. i wsp.: NF-κB
DNA-binding activity in embryos responding to a terato-gen, cyclophosphamide. BMC Dev. Biol. 2002; 2: 2. 2
255.. Cai Y., Wu M.H., Ludeman S.M. i wsp.: Role of O6
-alkyl-guanine-DNA alkyltransferase in protecting against cyclo-phosphamide-induced toxicity and mutagenicity. Cancer Res. 1999; 59: 3059-3063.
2
266.. Joqueviel C., Gilard V., Martino R. i wsp.: Urinary stabili-ty of carboxycyclophosphamide and carboxyifosfamide, two major metabolites of the anticancer drugs cyclophos-phamide and ifosfamide. Cancer Chemother. Pharmacol. 1997; 40: 391-399.
2
277.. Pass G.J., Carrie D., Boylan M. i wsp.: Role of hepatic
cytochrome p450s in the pharmacokinetics and toxicity of cyclophosphamide: studies with the hepatic cyto-chrome p450 reductase null mouse. Cancer Res. 2005; 65: 4211-4217.
2
288.. Ren S., Yang J.S., Kalhorn T.F., Slattery J.T.: Oxidation of cyclophosphamide to 4-hydroxycyclophosphamide and deschloroethylcyclophosphamide in human liver micro-somes. Cancer Res. 1997; 57: 4229-4235.
2
299.. Chang T.K., Weber G.F., Crespi C.L., Waxman D.J.:
Dif-ferential activation of cyclophosphamide and ifosphamide by cytochromes P-450 2B and 3A in human liver micro-somes. Cancer Res. 1993; 53: 5629-5637.
3
300.. Balow J.E., Hurley D.L., Fauci A.S.: Cyclophosphamide
suppression of established cell-mediated immunity. Quan-titative vs. qualitative changes in lymphocyte populations. J. Clin. Invest. 1975; 56: 65-70.
3
311.. Zhu L.P., Cupps T.R., Whalen G., Fauci A.S.: Selective
effects of cyclophosphamide therapy on activation, prolif-eration, and differentiation of human B cells. J. Clin. Invest. 1987; 79: 1082-1090.
3
322.. Ralph J.A., McEvoy A.N., Kane D. i wsp.: Modulation of
orphan nuclear receptor NURR1 expression by methotrex-ate in human inflammatory joint disease involves adeno-sine A2A receptor-mediated responses. J. Immunol. 2005; 175: 555-565.
3
333.. Majumdar S., Aggarwal B.B.: Methotrexate suppresses
NF-κB activation through inhibition of IκBα
phosphoryla-tion and degradaphosphoryla-tion. J. Immunol. 2001; 167: 2911-2920. 3
344.. Cronstein B.N., Eberle M.A., Gruber H.E., Levin R.I.:
253
adenosine release from connective tissue cells. Proc. Natl Acad. Sci. USA 1991; 88: 2441-2445.
3
355.. Rudwaleit M., Yin Z., Siegert S. i wsp.: Response to metho-trexate in early rheumatoid arthritis is associated with
a decrease of T cell derived tumour necrosis factor α,
increase of interleukin 10, and predicted by the initial concentration of interleukin 4. Ann. Rheum. Dis. 2000; 59: 311-314.
3
366.. Hildner K., Finotto S., Becker C. i wsp.: Tumour necrosis
factor (TNF) production by T cell receptor-primed T lym-phocytes is a target for low dose methotrexate in rheuma-toid arthritis. Clin. Exp. Immunol. 1999; 118: 137-146. 3
377.. Weinstein G.D., Jeffes E., McCullough J.L.: Cytotoxic
and immunologic effects of methotrexate in psoriasis. J. Invest. Dermatol. 1990; 95 (5 supl.): 49S-52S.
3
388.. Seitz M., Dayer J.M.: Enhanced production of tissue
inhibitor of metalloproteinases by peripheral blood mono-nuclear cells of rheumatoid arthritis patients responding to methotrexate treatment. Rheumatology (Oxford) 2000; 39: 637-645.
3
399.. Albertioni F., Lindemalm S., Eriksson S. i wsp.:
Rela-tionship between cladribine (CdA) plasma, intracellular CdA-5’-triphosphate (CdATP) concentration, deoxycytidine kinase (dCK), and chemotherapeutic activity in chronic lymphocytic leukemia (CLL). Adv. Exp. Med. Biol. 1998; 431: 693-697.
4
400.. Hartman W.R., Hentosh P.: The antileukemia drug
2-chloro--2’-deoxyadenosine: an intrinsic transcriptional antago-nist. Mol. Pharmacol. 2004; 65: 227-234.
IIn
nffo
orrm
maaccjjaa d
dllaa aau
utto
orró
ów
w!!
Chc¹c zapewniæ naszemu czasopismu „Aktualnoœci Neurologiczne” wy¿sz¹ indeksacjê MNiSW i Index Copernicus,
zwracamy siê do autorów o dope³nienie poni¿szych warunków podczas przygotowywania pracy do publikacji:
– Publikacjê nale¿y opatrzyæ afiliacj¹ z podan¹ nazw¹ oœrodka i jego pe³nym adresem oraz numerem telefonu.
– Praca oryginalna powinna byæ poprzedzona ssttrreesszzcczzeenniieemm zawieraj¹cym oodd 220000 ddoo 225500 ss³³óóww, a pogl¹dowa i kazuistyczna – 115500--220000. Streszczeniu pracy oryginalnej nale¿y nadaæ budowê strukturaln¹:
wstêp, materia³ i metoda, wyniki, wnioski.
– Liczba ss³³óóww kklluucczzoowwyycchh nie mo¿e byæ mniejsza ni¿ 55. S³owa kluczowe nie powinny byæ powtórzeniem tytu³u. Najlepiej stosowaæ s³owa kluczowe z katalogu MeSH.
– PPrraaccaa oorryyggiinnaallnnaa winna zawieraæ elementy: wstêp, materia³ i metoda, wyniki, omówienie, wnioski, piœmiennictwo. – PPiiœœmmiieennnniiccttwwoo powinno byæ u³o¿one w kkoolleejjnnooœœccii ccyyttoowwaanniiaa.
