ATLAS PATOGENÓW Z RODZAJU PHYTOPHTHORA W DRZEWOSTANACH DĘBOWYCH PŁYTY KROTOSZYŃSKIEJ

Tomasz Oszako, Miłosz Tkaczyk

ATLAS PATOGENÓW

Z RODZAJU PHYTOPHTHORA W DRZEWOSTANACH DĘBOWYCH

PŁYTY KROTOSZYŃSKIEJ

ATLAS PATOGENÓW Z RODZAJU PHYTOPHTHORA W DRZEWOSTANACH DĘBOWYCH PŁYTY KROTOSZYŃSKIEJ

Instytut Badawczy Leśnictwa Sękocin Stary, ul. Braci Leśnej 3 05-090 Raszyn,

tel. 22 7150 300, 22 7150 301, fax 22 7200 397 e-mail: ibl@ibles.waw.pl

INSTYTUT BADAWCZY LEŚNICTWA

Sękocin Stary, 2020

INSTYTUT BADAWCZY LEŚNICTWA

Tomasz Oszako, Miłosz Tkaczyk

Atlas patogenów z rodzaju Phytophthora w drzewostanach dębowych

Płyty Krotoszyńskiej

Sękocin Stary, 2020

Praca powstała podczas realizacji projektu pt.

"Evaluation of the health state of forests and an effect of phosphite treatments with the use of photovoltaic SLE UAV"

o akronimie HESOFF nr Life 11 ENV/PL/459

współfinansowanym przez Komisję Europejską oraz NFOŚiGW

Recenzenci:

Prof. dr hab. Zbigniew Sierota Dr hab.Tomasz Mokrzycki

Instytut Badawczy Leśnictwa

Sękocin Stary, ul. Braci Leśnej 3, 05-090 Raszyn

Copyright by Instytut Badawczy Leśnictwa, Sękocin Stary 2019 ISBN 978-83-62830-78-7

Ilustracje w pracy:

Ivan Milenković Miłosz Tkaczyk Ilustracje na okładce:

Magdalena Gawlak

Opracowanie i korekta: Joanna Szewczykiewicz Redaktor techniczny: Przemysław Szmit

WYDAWCA:

Instytut Badawczy Leśnictwa

Sękocin Stary, ul. Braci Leśnej 3, 05-090 Raszyn www.ibles.pl, Wydawnictwa_IBL@ibles.waw.pl

Skład, łamanie, druk i oprawa:

Proprint Usługi Poligraficzne

e-mail: biuro@proprint.biz.pl, tel. 22 350 77 93

WSTĘP... 7

ZJAWISKO ZAMIERANIA DRZEWOSTANÓW DĘBOWYCH... 7

ZNACZENIE LĘGNIOWCÓW W PROCESIE ZAMIERANIA DRZEW...15

METODY IZOLACJI...19

IZOLACJA PATOGENÓW METODĄ PUŁAPKOWANIA... 19

PODŁOŻA DO IZOLACJI GATUNKÓW PHYTOPHTHORA... 22

NOWE TECHNOLOGIE W OCHRONIE DRZEWOSTANÓW DĘBOWYCH NA PŁYCIE KROTOSZYŃSKIEJ... 23

OPISY GATUNKÓW... 27

GATUNKI WYIZOLOWANE TRADYCYJNYMI METODAMI... 27

Phytophthora quercina... 27

Phytophthora europaea... 30

Phytophthora cactorum... 33

Phytophthora plurivora... 36

GATUNKI, KTÓRYCH DNA ZNALEZIONO W RYZOSFERZE... 39

Phytophthora cinnamomi... 39

Phytophthora parasitica... 41

Phytophthora fragariae... 42

Phytophthora idaei... 43

Phytophthora pseudotsugae... 44

Phytophthora tentaculata... 46

Phytophthora alni... 47

SPIS LITERATURY... 49

Wstęp

Gatunki z rodzaju Phytophthora to obecnie jedne z najgroźniejszych patogenów roślinnych. Organizmy te należą do królestwa Chromista, typu Oomycota, klasy Oomycetes i są sprawcami chorób roślin w wielu częściach świata. W ciągu ostatnich lat odnotowano i opisano wiele nowych gatunków Phytophthora, co było związane z koniecznością poszerzenia wiedzy na temat fytooroz obecnych w wielu krajach Europy. Poznanie patogenów wywołujących choroby ma podstawowe znaczenie w ochronie sadzonek, upraw i drzewostanów leśnych (Brasier 1999). Na początku lat dziewięćdziesiątych XX wieku opisano nowe gatunki z rodzaju Phytophthora, takie jak: P. cinnamomi – sprawcę choroby dębów na Półwyspie Iberyjskim czy gatunek P. alni odpowiedzialny za śmiertelność olszy w europejskich ekosystemach nadrzecznych (Brasier 1999). W 2003 roku, po raz pierwszy w Europie zaobserwowano gatunek P. ramorum (Lane i in. 2003) – sprawcę zjawiska szybkiego zamierania drzewostanów dębowych (ang. Sudden Oak Death) na kontynencie Ameryki Północnej (Goheen i in. 2002).

Zjawisko zamierania drzewostanów dębowych

Dęby (Quercus) należą do jednych z ważniejszych i cenniejszych gatunków lasotwórczych w strefie umiarkowanej, tropikalnej oraz na półkuli północnej. Do tego rodzaju należy ponad 450 gatunków (Dęby 2006). Granice południowego zasięgu dębu przebiegają przez obszar Andów w Ekwadorze i południowo-wschodniej Azji, natomiast w Europie granica przebiega przez północne rejony norweskiego okręgu Hordaland. Najliczniej rodzaj ten reprezentowany jest na obszarze wschodniej Azji, w rejonie występowania monsunów (Mai 1995; Walther 1999). Jako istotny składnik ekosystemów leśnych dęby występują w zróżnicowanych gatunkowo lasach liściastych.

Drzewostany dębowe stanowią około 6% ogólnej powierzchni kraju (Ceitel 2006; Lasy w Polsce 2016).

O masowym zamieraniu drzewostanów dębowych donosiło w przeszłości wielu badaczy (Delatour 1983; Oszako 2000; omas i in. 2002; Denman i in. 2012;

Nageleisen i in. 2010; Sonesson i Drobyshev 2010). W Europie uszkodzenia i osłabienie drzew obserwuje się również w drzewostanach dębu burgundzkiego (Q. cerris L.), węgierskiego (Q. frainetto Ten.), ostrolistnego (Q. ilex L.), omszonego (Q. pubescens Willd.), korkowego (Q. suber L.) oraz innych gatunków: Q. dalechampii Ten., Q. faginea Lam., Q. polycarpa Schur i Q. pyrenaica Willd. (Delatour 1983; Brasier 1999; Oszako 2000;

Pierwsze poważne symptomy zamierania drzewostanów dębowych w Europie odnotowano ponad 100 lat temu, po długotrwałej suszy w 1911 roku. W Polsce zja- wisko to zaobserwowano w latach trzydziestych i czterdziestych ubiegłego wieku na obszarze Płyty Krotoszyńskiej (Filipiak i Zaradny 1991). Od drugiej połowy XX w.

do chwili obecnej obserwuje się na terenie całej Europy okresowe, wielkopowierzch- niowe zamieranie drzewostanów dębowych. Dotyczy to szczególnie starszych drzew, w wieku powyżej 100 lat. Doniesienia o tym zjawisku zanotowano również w Ameryce Północnej (Wargo 1993).

Syndrom zamierania dębów uważano za proces wieloczynnikowy, wynikający z interakcji pomiędzy czynnikami abiotycznymi i biotycznymi (Führer 1998; Oszako 2000; omas i in. 2002; Sonesson i Drobyshev 2010; Andersson i in. 2011). Każdy gatunek dębu posiada określone wymagania klimatyczne i specyfikę ekofizjologiczną, co w sytuacji obserwowanych zmian klimatu zwiększa podatność drzew na choroby wywoływane przez lokalnie występujące czynniki szkodotwórcze, różniące się w za- leżności od miejsca ich występowania (Dreyer i Aussenac 1996; Czech i in. 1998;

Führer 1998; omas i in. 2002). Długotrwałe oddziaływanie czynników, powodując fizjologiczny stres, z reguły zwiększa podatność drzew na infekcje ze strony patogenów. Zjawisko to w odniesieniu do dębów opisał Wargo (1993, 1996), wskazując, że może ono doprowadzić do zmian natury fizycznej, fizjologicznej oraz chemicznej, co z kolei prowadzi do zaburzeń w dopływie energii niezbędnej do uruchomienia procesów odpornościowych drzew. W sytuacji przedłużającego się stresu, możliwości obrony roślin przed szkodnikami są znikome, dotyczy to zarówno owadów, jak i grzybów czy lęgniowców. Infekcje systemów korzeniowych wywołane przez patogeny z rodzaju Phytophthora i w dalszej kolejności przez opieńki (Armillaria spp.) z reguły doprowadzają do masowego zamierania drzew (Brasier 1999; omas i in. 2002; Marçais i Bréda 2006). Owady ksylofagiczne jako szkodniki wtórne również aktywnie współuczestniczą w zamieraniu dębów (Kolk 1992;

Landmann 1994; Wargo 1996; Moraal i Hilszczański 2000; omas i in. 2002; Evans i in. 2004).

O złożoności tego procesu pisał Manion (1991), formułując tak zwany spiralny model choroby, obrazujący jednoczesne działanie wielu czynników: predysponują- cych, inicjujących i współuczestniczących. Gdy wystąpią one w określonym miejscu i czasie, dochodzi do zamierania pojedynczych drzew lub całych drzewostanów (Ryc. 1). Taki proces może trwać latami ze względu na różnorodność czynników biorących udział w procesach zamierania drzew na rozległych terenach (Houston 1987; Sierota 1995a, b; 2001).

Houston (1984) sugeruje, że stres może spowodować zamieranie drzew jedynie wtedy, kiedy jego intensywność i czas występowania są wystarczająco duże lub po- jawia się on w częstych nawrotach. W momencie, kiedy czynnik szkodotwórczy ustąpi, drzewa mogą powrócić do stanu pierwotnego (sprzed wystąpienia czynnika stresowego). Uszkodzone lub obumarłe pędy opadają, a na ich miejsce wyrastają nowe z pąków śpiących. Jeżeli natomiast osłabione drzewo zostanie dodatkowo zaatakowane przez organizmy patogeniczne, jego szanse na powrót do stanu pier- wotnego maleją. Stan drzewa (poprawa bądź pogorszenie) zależy od wielu czyn- ników, takich jak witalność drzewa, liczebności szkodników owadzich czy wirulencja patogenów, oraz od zaawansowania choroby. Całkowite zamieranie drzew następuje najczęściej dopiero wtedy, kiedy narażone są one na nadzwyczaj niekorzystne czynniki środowiskowe, np. ekstremalne susze (Houston 1984).

Ryc. 1. Model choroby spiralnej Maniona z trzema grupami czynników stresowych (źródło: Manion 1991)

Drzewa, które już obumarły, sprzyjają przetrwaniu populacji patogenów, jako że drewno w lesie stanowi także ich rezerwuar. Na wschodnim wybrzeżu Stanów Zjednoczonych czynnikami uruchamiającymi procesy chorobowe są:

żery owadów, brak lub nadmiar wilgoci oraz ekstremalne temperatury (Houston 1987). Houston zaproponował model zamierania drzew składający się z trzech etapów:

• etap pierwszy: zdrowe drzewa + stres → początek zamierania,

• etap drugi: uszkodzone drzewa + nowy stres → dalsze zamieranie,

• etap trzeci: uszkodzone drzewa + szkodniki wtórne → drzewa zasiedlone i martwe.

Sierota w książce „Choroby lasu” (2001) też proponuje różne modele. Dla drze- wostanów dębowych najgroźniejszymi czynnikami inicjującymi obumieranie drzew są: utrata ulistnienia (defoliacja), susza oraz uszkodzenia mrozowe (Delatour 1983; Houston 1987; Miller i in. 1989). Przyczyną utraty aparatu asymilacyjnego najczęściej są żery foliofagów (Nichols 1968; Doane i McManus 1981), przymrozki późne (Long 1914; Balch 1927; Hartman i in. 1991; Auclair i in. 1992; Andrzejczyk 2010) lub organizmy patogeniczne wywołujące antraknozę (Wargo i Montgomery 1983; McCracken 1985), mączniaka liści dębu czy opieńkową zgniliznę korzeni (Falck 1923; Georgevitch 1926; Delatour 1983). Susza może być zarówno czynni- kiem predysponującym (gdy jest długotrwała), jak i inicjującym (gdy jest krótka, ale ostra), zawsze jednak uznawana jest za ważny czynnik stresowy. O zjawiskach suszy w kontekście zamierania dębów na terenie Ameryki Północnej pisali między innymi Tainter i in. (1983, 1984), Houston (1987), a w Europie Falck (1918, 1924), Delatour (1983), Becker (1984) czy Hartmann i in. (1991). Często spotykanym zja- wiskiem są masowe gradacje foliofagów po długotrwałych okresach suszy (Miller i in. 1989). Okresowy niedobór wody doprowadza do zwiększenia zawartości cu- krów w liściach, co sprawia, że są one jeszcze bardziej atrakcyjne dla wielu owadów i grzybów. Ponadto, po okresie suszy osłabione dęby łatwiej ulegają szkodnikom, czego skutkiem jest szybkie namnażanie się owadów (Mattson i Haack 1987). Efekt wpływu suszy na uszkodzenia drzewostanów dębowych obserwuje się zwykle do- piero po upływie co najmniej jednego sezonu wegetacyjnego.

W sytuacji niedoboru wody istotną rolę odgrywa stan systemów korzeniowych.

Uszkodzenia korzeni (jako czynnik inicjujący) powodować mogą między innymi lęgniowce z rodzaju Phytophthora (Belbahri i in. 2006). W Niemczech za głównego sprawcę masowego zamierania drzewostanów dębowych uważa się gatunek P. quercina (Jung i in. 1999; Oszako i Woodward 2006). Ostatnio pojawiają się doniesienia o nowych gatunkach lęgniowców odpowiedzialnych za masowe zamieranie drzew w lasach.

Wiele gatunków grzybów czy lęgniowców występowało w drzewostanach dę- bowych zarówno dawniej, jak i obecnie, jednak ich szkodliwe oddziaływanie ujaw- niło się dopiero w specyficznych warunkach atmosferycznych. Za kluczowe uznaje się zmiany warunków wilgotnościowych gleb. W latach występowania nasilonych opadów atmosferycznych istnieją sprzyjające warunki do infekcji drobnych korzeni przez tzw. grzybopływki (zoospory), które dzięki wiciom posiadają zdolność prze- mieszczania się w wodzie (także kapilarnej zawartej pomiędzy cząstkami gleby).

Dzięki temu zarodniki są w stanie bardzo szybko przemieszczać się w glebie i in- fekować drobne korzenie drzew. Jeżeli w kolejnym sezonie wegetacyjnym warunki wilgotnościowe są sprzyjające dla rozwoju drzew, obumarłe korzenie za- stępowane są przez nowe. Tworzą się nowe układy mykoryzowe i symptomy cho- robowe w koronach drzew nie występują. Problem pojawia się, gdy po latach z dużą ilością opadów następują lata suche. Wówczas dęby pozbawione mykoryz nie są w stanie pobierać wystarczającej ilości wody z gleby, co może doprowadzić do masowego zamierania drzew (Oszako 2007). Na pozostałych, osłabionych dębach dochodzi do wzmożonego rozwoju populacji wtórnych szkodników owa- dzich, co w konsekwencji prowadzi do zamierania całych drzewostanów.

Ocieplenie klimatu sprzyja zwiększeniu zasięgu oraz zajmowaniu nowych nisz ekologicznych przez patogeny i szkodniki owadzie (między innymi na terenie Polski), które do tej pory obecne były jedynie w krajach Europy Południowej (Oszako i Orlikowski 2004). Zjawisko to potęguje dodatkowo otwarcie granic wraz z przystąpieniem Polski do Unii Europejskiej, co sprzyja rozprzestrzenianiu się pa- togenów wraz z handlem i transportem (Brasier 2008). Przykładem takiego swo- bodnego przepływu patogenów są doniesienia o występowaniu w Europie gatunku P. ramorum, który jest uznawany za sprawcę masowego zamierania drzewostanów dębowych w Ameryce Północnej (Orlikowski 2005; Orlikowski i in. 2005; Orlikowski i Szkuta 2005; Orlikowski i Wiejacha 2005).

Zmiany klimatu doprowadziły do odnotowania na kontynencie europejskim ekstremalnych wartości temperatury, mogących przyczyniać się do zamierania dębów (Hartmann i in. 1991; Auclair i in. 1992; Auclair 1993; Hartmann i Blank 1993). Patogenami, chętnie zasiedlającymi osłabione drzewa, są opieńki (Armillaria spp.) powodujące choroby systemów korzeniowych (Intini 1991; Luisi i in. 1991; Hartmann i Blank 1993; Łakomy 2001; Grodzki i Oszako 2006; Łakomy

2006; Oszako i Woodward 2006), grzyby z rodzaju Biscogniauxia będące spraw- cami raka na pniach drzew (Vannini 1987, 1991; Fenn i in. 1991) oraz grzyby po- wodujące zamieranie pędów dębowych (Balder 1991, 1993; Delatour i Morelet 1991; Hartmann i in. 1991; Przybył 1991). We Francji do zamierania drzewostanów dębowych przyczynia się grzyb Collybia fusipes (Bull. ex Fr.) Quel (Delatour i Guillaumin 1984, 1985). Udowodniono, że chociaż patogen ten rozwija się bardzo wolno, to nieuchronnie prowadzi do masowego obumierania grubych korzeni. W syndromie chorobowym dębów wiele czynników występujących równocześnie prowadzi w konsekwencji do zamierania poszczególnych drzew.

Uszkodzenia korzeni przez patogeny potęguje niekorzystny wpływ suszy, a szkodniki wtórne, takie jak np. opiętek dwupaskowy (Agrilus bilineatus), doprowadzają bezpośrednio do śmierci drzew. Opiętek ten uaktywnia się szczególnie po okresie długotrwałych susz lub po silnej defoliacji koron, dzięki czemu łatwiej zasiedla osłabione drzewa i prowadzi do ich masowego zamierania.

Kompleksowe zjawisko zamierania dębów poznano i opisano w Stanach Zjednoczonych (Dunbar i Stephens 1975, 1976; Cote i Allen 1980; Haack i Benjamin 1982; Haack i Blank 1991). Według niektórych badaczy amerykańskich (Wargo 1981a) zmniejszenie przyrostu na grubość tkanek przewodzących ułatwia skuteczne ataki ze strony opiętków. Zmniejszenie odporności drzew na ataki owadów może być związane z niedoborem wody w komórkach oraz małą grubością powstających warstw drewna.

Wspomniane wcześniej opieńki Armillaria spp. są ważnym biotycznym czyn- nikiem współuczestniczącym w zasiedlaniu drzew opanowanych przez szkodniki wtórne (Wargo 1977). Pod wpływem stresu wiele procesów fizjologicznych ulega zakłóceniu, jak na przykład przemieszczanie i magazynowanie asymilatów u drzew (Wargo 1981a; Mattson i Haack 1987). Rozwój opieńkowej zgnilizny korzeni uza- leżniony jest od stężenia glukozy w tkankach korzeni i obecności związków feno- lowych (np. kwasu galikowego), z natury będących inhibitorami wzrostu grzybni (Wargo 1972, 1981b). W sytuacji podwyższonej zawartości glukozy, uwolnione przez rośliny związki fenolowe stanowią dodatkowe źródło węgla, niezbędnego dla rozwoju grzybów (Wargo 1981b). Utrata liści (defoliacja) lub susza przyczyniają się z kolei do ograniczenia metabolizmu azotu w tkankach roślinnych, prowadząc do zwiększenia w nich zawartości aminokwasów. W korzeniach drzew po żerach owadów i częściowej defoliacji oraz u sadzonek poddanych działaniu suszy można odnotować zmiany w zawartości kwasów aminowych jak: alanina, asparagina,

leucyna itd. (Wargo 1972, 1984b; Parker 1979). Wymienione związki są źródłem obfitości azotu i dzięki niemu grzybnia opieńki utlenia związki fenolowe syntety- zowane w korzeniach, eliminując w ten sposób naturalne procesy obronne, chro- niące przed infekcjami grzybowymi (Weinhold i Garraway 1966; Wargo 1984a).

U osłabionych drzew nawet zupełnie zdrowe tkanki zostają w ten sposób skoloni- zowane przez grzyby (Wargo i Montgomery 1983). Naturalnym procesem obron- nym roślin jest produkcja enzymów (glukanazy i chitanazy), które mogą rozkładać ściany komórkowe strzępek opieniek, dzięki czemu dochodzi do istotnego zaha- mowania rozwoju patogenów (Wargo 1975, 1976). W sytuacji utraty liści (w efekcie suszy lub żerów szkodników pierwotnych) poważnie ograniczone zostają możli- wości dalszej syntezy tych enzymów. W zdrowych tkankach korzeni, pozostających w stałym kontakcie z rosnącymi epifitycznie ryzomorfami opieniek, stwierdzono enzymy lityczne rozpuszczające grzybnię (Redfern i Filip 1991). W ten sposób drzewa mogą samodzielnie hamować procesy infekcji, jednak w chwili, kiedy na nie oddziaływają zewnętrzne niekorzystne czynniki (stresory), to naturalne systemy obronne okazują się być niewystarczające.

W latach 70. i 80. nie prowadzono jeszcze badań nad występowaniem patoge- nów drobnych korzeni z rodzaju Phytophthora. Dopiero rozwój metod biologii molekularnej (pod koniec lat 90.) umożliwił wykrywanie tych organizmów w pró- bkach środowiskowych. Obecnie w Europie wiele prac sugeruje, że patogeniczne lęgniowce jako patogeny pierwotne uszkadzają systemy korzeniowe, umożliwiając ich zasiedlenie przez grzyby, a w szczególności przez patogeny wtórne, jakimi są opieńki (Czech i in. 1998; Jung i in. 2005; Jung i Burgess 2009). Analogiczne procesy interakcji pomiędzy grzybami i drzewami opisano w przypadku infekcji przez gatunek Neonectria coccinea, powodujący chorobę gałęzi w koronach buków (Ehrlich 1934;

Houston 1980). Te same współzależności stwierdzono, badając odporność dębów na grzyb Biscogniauxia atropunctata (Berk. & Ray) Cke. (Fenn i in. 1991), co po- twierdza tezę, że mechanizm odpornościowy powstały w procesie ewolucji uru- chamiany jest zawsze w sytuacji zagrożenia, niezależnie od rodzaju stresora.

Zatem na zamieranie drzew wpływ ma nie tylko stan fizjologiczny rośliny-gos- podarza, ale także ilość i jakość różnych czynników stresowych, jak i występujące pomiędzy nimi interakcje. Czynniki te mogą występować jednocześnie (teoria spiralna Maniona) lub oddziaływać na roślinę jeden po drugim (teoria choroby

łańcuchowej Koehlera). W celu zdiagnozowania czynników stresowych Houston i Valentine przyjęli następujące etapy badania procesu zamierania drzew (Houston i Valentine 1977; Houston 1979; Valentine i Houston 1984):

• rozpoznanie symptomów chorobowych,

• identyfikacja czynników o drugorzędnym znaczeniu,

• poznanie następstwa w czasie i przestrzeni występowania czynników stresowych.

Zjawisko zamierania drzew obserwuje się kilka lat po wystąpieniu czynników stresowych. Infekcje systemów korzeniowych drzew przez opieńki oraz zasiedlenie pni przez opiętki (czynniki współuczestniczące) mają miejsce nawet kilka lat po wystąpieniu dotkliwej suszy (Clinton i in. 1993) lub po występujących po sobie 2–3 okresach żerów owadów pierwotnych, doprowadzających do silnej defoliacji koron (Wargo 1981c). Wystąpienie zjawiska zamierania drzewostanów jest następ- stwem wielu czynników stresowych, co pozwala domniemywać, że zamierający drzewostan cierpiał wcześniej z powodu suszy. Zdarza się także, że drzewa pomimo wystąpienia czynników stresowych nie wykazują objawów zamierania. Do takiej sytuacji dochodzi zazwyczaj w drzewostanach rosnących w warunkach stałego nie- doboru składników pokarmowych lub wody, niezbędnych do prawidłowego roz- woju drzew. Podobne zjawisko ma miejsce w sytuacji, kiedy w drzewostanach często powtarzają się żery foliofagów, a w ich efekcie utrata części ulistnienia (de- foliacja). W drzewostanach często narażonych na stresy fizjologiczne do zamiera- nia drzew dochodzi stosunkowo rzadko. Natomiast w drzewostanach dębowych, w których dotychczas nie stwierdzano uszkadzania listowia, a więc teoretycznie bardziej odpornych na żery owadów pierwotnych, gdy już dojdzie do defoliacji koron, to często pociąga to za sobą śmiertelność wielu drzew (Houston i Valentine 1977; Hicks 1985; Sierota 1995). Wiedza o tym, czy dany drzewostan jest podatny na występowanie czynników stresowych, jest bardzo istotna przy ocenie ryzyka zamierania drzewostanów (Houston i Valentine 1977; Houston 1979; Valentine i Houston 1984). Mimo że podstawowym czynnikiem branym pod uwagę przy ocenie zagrożenia drzewostanu jest stres, to jednak nie jest on jedyną przyczyną zamierania drzew (Hicks i in. 1987). Reakcja roślin na stres uzależniona jest od czynników środowiskowych działających przed, w trakcie oraz po zakończeniu występowania czynnika stresowego. Zatem podatność drzew na czynniki szkod- liwe zależy między innymi od składu gatunkowego, wieku drzewostanu,

warunków środowiskowych, agresywności (wirulencji) i liczebności organizmów patogenicznych. Rola grzybów (np. opieniek) ma duży wpływ na funkcjonowanie całego ekosystemu. Grzyby opanowują i zabijają drzewa wcześniej osłabione, a następnie rozkładają martwą materię organiczną, uwalniając do gleby składniki pokarmowe, które są wykorzystywane przez inne drzewa.

Z przedstawionych badań wynika, że ryzyko obumierania dębów rośnie wraz z ich wiekiem, natomiast największe szkody powstają w drzewostanach jednoga- tunkowych, co w Polsce potwierdzają dane pochodzące z Płyty Krotoszyńskiej, gdzie dominującym gatunkiem lasotwórczym jest dąb szypułkowy Q. robur.

Znaczenie lęgniowców w procesie zamierania drzew

Pierwsze doniesienia pochodzące z lasów Filadelfii (Pensylwania, USA), zwią- zane z aktywnością patogenów z rodzaju Phytophthora, szacuje się na połowę XIX w. Patogeny te odnotowano również w innych częściach USA oraz Kanady. Jednak największego rozgłosu doczekała się choroba przez nie wywoływana, tzw. zaraza ziemniaczana, obserwowana wówczas na kontynencie europejskim, gdzie stała się przyczyną olbrzymiej klęski głodu. Prawie całkowitemu zniszczeniu uległy uprawy ziemniaków będących w tym czasie podstawowym źródłem pożywienia. Strach przed chorobą dodatkowo potęgowała niewiedza społeczeństwa o jej przyczynach oraz drogach rozprzestrzeniania się. Dopiero badania de Bary’ego (1876) udowodniły, że za zniszczenie plantacji ziemniaków odpowiedzialne są mi- kroorganizmy, a konkretnie gatunek Phytophthora infestans. W Irlandii w ciągu kilku lat patogen ten przyczynił się do śmierci (w wyniku głodowania i w następ- stwie różnych chorób) ponad 1,5 mln obywateli oraz spowodował masową emi-

grację ludności z terenów Wysp Brytyjskich do Stanów Zjednoczonych, aby uniknąć klęski głodu (Ristaino 2002).

Od tamtej pory opisano już ponad 120 gatunków z rodzaju Phytophthora, które odnotowane zostały w różnych strefach klimatycznych i które w większości są pa- togeniczne dla szerokiego spektrum roślin żywicielskich (Kroon i in. 2012).

Organizmy te odpowiedzialne są za wywoływanie trzech podstawowych objawów chorobowych, takich jak: występowanie plam na liściach, bulwach i cebulach oraz nekroz tkanek u podstawy pędów (Marcinkowska 2010). Choroba – fytooroza – w konsekwencji prowadzi do osłabienia i zamierania porażonych roślin.

Rozprzestrzenianie się gatunków Phytophthora jest ściśle powiązane z możliwo- ściami oddzielania się zarodników od konidioforów. Niektóre gatunki (np. P. cacto- rum, P. infestans, P. ramorum), u których taki proces łatwo zachodzi, są w stanie rozprzestrzeniać zarodniki drogą powietrzną, a co za tym idzie, porażać pędy, a do- piero później infekować systemy korzeniowe. Pozostałe gatunki, u których zarodniki pozostają przytwierdzone do trzonków (np. P. cambivora, P. cryptogea, P. plurivora), są w stanie infekować jedynie części podziemne roślin oraz podstawy pni czy łodyg.

Ponadto, zarodniki Phytophthora zaopatrzone są w wici, co umożliwia im aktywne rozprzestrzenianie się w środowisku wodnym (cieki wodne), także w wodzie kapilar- nej zawartej pomiędzy cząsteczkami gleby. Stosowanie wody pobieranej z naturalnych zbiorników (jezior czy rzek) do podlewania roślin, przyczynia się do rozprzestrzenia- nia patogenów w szkółkach (Orlikowski i in. 2012).

Systematyka organizmów z rodzaju Phytophthora zmieniała się na przełomie ostatnich lat wraz z rozwojem wiedzy na ich temat. Początkowo lęgniowce Oomy- cota, Oomycetes należały do królestwa grzybów, następnie uznano je za organizmy grzybopodobne i zaliczono do królestwa Chromista (Margulis i in. 1989). Inni ba- dacze zaliczyli te organizmy do królestwa Stramenopile (Adl i in. 2005) i zaklasyfikowali w obrębie grupy Heterokonta w jednej z sześciu podgrup Chro- malveolata – jądrowce Eukaryota (Beakes i in. 2012). Ściany komórkowe organiz- mów z rodzaju Phytophthora różnią się od grzybów tym, że nie posiadają chityny, a celulozę, tak jak rośliny, a w błonach znajduje się cholesterol (u grzybów ergo- sterol). Grzyby są zatem bliżej spokrewnione ze zwierzętami (owadami), natomiast lęgniowce z glonami (brunatnicami). Prawdopodobnie w procesie ewolucji utraciły one chloroplasty i możliwość samoodżywiania (fotosynetezy), stając się patoge- nami m.in. roślin. Lęgniowce charakteryzują się silnie rozgałęzioną plechą, która miejscami może wytwarzać ssawki, natomiast w starszych strzępkach mogą się tworzyć grubościenne zarodniki przetrwalnikowe – chlamydospory. Trzonki za- rodnionośne posiadają nieograniczone możliwości wzrostu oraz są słabo i niere- gularnie rozgałęzione. Na ich zakończeniach wytwarzają się zarodnie mogące przyjmować różne kształty – od okrągłych po lekko spłaszczone bocznie (jajowate).

Dodatkową cechą pomagającą w diagnostyce gatunków jest obecność lub brak cha- rakterystycznych brodawek na wierzchołkowych częściach zarodni. We wnętrzu zarodni produkowane są zarodniki pływkowe – zoospory, które wydostają się na skutek pękania jej ścian lub poprzez otwarcie wieczka (Marcinkowska 2010). Za- rodniki posiadają dwie wici o nierównej długości, obie ulegają redukcji w momen-

cie osadzenia się zarodnika na powierzchni rośliny. Jedna z wici (rzęskowa) jest szorstka, na jej powierzchni znajdują się liczne włoski zwane mastygonemami.

Druga z wici jest gładka, tzw. biczykowata. Lęgnie – oogonia (zawierające żeńskie gamety) mają kształt kulisty, plemnie natomiast (jedno- lub dwukomórkowe) przy- twierdzają się do trzonka lęgni na dwa sposoby: parageniczny (przylęgniowy) lub amfigeniczny (okołolęgniowy). Powstałe w lęgniach zarodniki – oospory mogą je wypełniać symetrycznie (oospory plerotyczne) lub niesymetrycznie (oospory aplerotyczne). U gatunków jednoplechowych (homotalicznych) oospory tworzą się w kulturach tego samego izolatu, a u gatunków różnoplechowych (heterotalicznych) dopiero po zetknięciu się dwóch izolatów o przeciwnych typach kojarzeniowych umownie nazwanych A1 i A2 (Marcinkowska 2010).

Gatunki z rodzaju Phytophthora stanowią bardzo poważne zagrożenie dla wielu roślin w różnych fazach rozwoju. Gatunki, takie jak P. nicotianae i P. palmivora, porażają drzewa owocowe, natomiast P. citrophthora, P. cactorum, P. syringae czy P. hibernalis odpowiedzialne są za zasiedlanie i infekcje opadłych owoców (Cacciola i Magnano Di San Lio 2008). W połowie XX w. po raz pierwszy opisano brązową zgniliznę cytrusów na Florydzie. Sprawcą okazały się patogen z rodzaju Phytophthora, które wskutek infekcji niszczyły od 30% do nawet 90% zbiorów owoców cytrusowych (Knorr 1956). Na fytoorozy podatnych jest również wiele gatunków roślin uprawnych. Wspomniane wcześniej uprawy ziemniaków oraz pomidorów infekuje gatunek P. infestans, natomiast inne rośliny psiankowate – P. capsici, soję infekują gatunki P. sojae, P. sansomeana, P. macrochlamydospora, a kauczukowiec brazylijski Hevea brasiliensis – P. botryosa i P. meadii, kakaowiec właściwy heobroma cacao L. – P. megakarya, truskawkę Fragaria x ananasa – P. fragariae, chinowiec Cinchona officinalis – P. quininea, pospolitą jabłoń domową Malus domestica – P. rosacearum (Kroon i in. 2012).

W ciągu dwóch dekad wielu badaczy odnotowało obecność patogenów z rodzaju Phytophthora również w drzewostanach. Patogeny te infekują wiele gatunków waż- nych z punktu widzenia gospodarki leśnej. Do drzew najczęściej infekowanych przez patogeny należą: dęby (Jung i in. 1996; Jung i in. 1999; Jung i in. 2002; Vettraino i in.

2002; Oszako i Orlikowski 2005a; Oszako i in. 2007), buki (Jung i in. 2005; Hartmann i in. 2006; Orlikowski i in. 2006; Munda i in. 2007; Jung i Burgess 2009; Stępniewska i Dłuszyński 2010) oraz olsze (Brasier 1995; Gibbs 1995; Černý i in. 2003; Brasier i in.

2004; Jung i Blaschke 2004; Černý i in. 2008; Černý i Strnadová 2010). Za głównych

sprawców uszkodzeń drzew w drzewostanach dębowych uważa się między innymi takie gatunki jak:P. ramorum, P. quercina, P. psychrophila, P. europaea, P. uliginosa (Jung i in. 1999; Werres i in. 2001; Jung i in. 2002; Rizzo i in. 2005). W zamieraniu drzewostanów bukowych udział biorą takie gatunki jak: P. plurivora, P. cactorum, P. cambivora i P. pseudosyringae (Jung i in. 2005).

W polskich lasach drzewostany dębowe najczęściej uszkadzane są przez gatunek wyspecjalizowany w infekowaniu i niszczeniu drobnych korzeni dębów – P. quercina, gatunki bardzo rozpowszechnione (szczególnie w szkółkach), jak P. plurivora, P. cactorum i P. cambivora, chociaż znajdywane są także i inne obce, inwazyjne patogeny, np. P. cinnamomi lub nowo odkryte gatunki, jak P. gallica czy P. gonapodyides, P. lacustris i P. bilorbang, których patogeniczność jest jeszcze mało poznana, a które licznie występują w ekosystemach nadrzecznych (Oszako i Orlikowski 2005a; Stępniewska i in. 2008). Drzewostany bukowe są infekowane

przez między innymi te same gatunki, co dęby: P. plurivora, P. cambivora i P. cactorum (Orlikowski i in. 2006; Stępniewska i Dłuszyński 2010), drzewostany

olszowe przez gatunki wyspecjalizowane w ich uszkadzaniu – P. alni, P. multiformis i P. uniformis oraz wymienione powyżej rozpowszechnione gatunki: P. plurivora, P. cambivora, P. gonapodyides, P. lacustris, a także P. hungarica i P. polonica oraz P. gallica, P. sylvatica i P. taxon Oaksoil (Oszako i Orlikowski 2005b; Belbahri i in.

2006). Natomiast w drzewostanach jesionowych stwierdzono wymienione powyżej gatunki: P. plurivora, P. cactorum, P. hungarica oraz P. megasperma (Orlikowski i in.

2004; Pacia i in. 2017). Poza tym, w drzewostanach świerkowych odnotowano obecność gatunku P. citrophthora (Oszako i Orlikowski 2004).

Metody izolacji

Izolacja patogenów metodą pułapkowania

Próbki gleby (ok. 0,5 kg) należy umieścić w wysterylizowanych pojemnikach i zalać wodą destylowaną do wysokości 2 cm nad poziomem gleby. Na powierzchni wody trzeba ułożyć liście dębu szypułkowego (Q. robur) i/lub buka zwyczajnego (F. sylvatica) oraz różaneczników (Rhododendron spp.), zgodnie z metodyką zaproponowaną przez Jung (1998) i Jung i in. (1996) (Fot. 1). Po upływie 3–7 dni na liściach powinny zacząć pojawiać się ciemne, nekrotyczne plamy. Pojawienie się ich świadczy o infekcjach tkanek przez zarodniki pływkowe, tzw. zoospory, które przyczepiają się do powierzchni liści, a następnie otorbiają i zaczynają wnikać do tkanki. Fragmenty liści z widocznymi przebarwieniami należy pociąć na kawałki (5 ^× 5 mm) (Fot. 2) i wyłożyć na pożywkę selektywną PARPH (opis w dalszej części rozdziału). Tak przygotowane liście należy inkubować w ciemności i w temperaturze 20°C przez 24–48 godzin. Po upływie tego czasu pojawiające się strzępki grzybni należy przenieść na pożywki wielowarzywne typu V8 (opis w dalszej części rozdziału).

Fot. 1. Liście z widocznymi nekrozami tkanek wywołanymi przez patogeny z rodzajuPhytophthora

Identyfikację uzyskanych izolatów patogenów można wykonać na podstawie morfologii struktur płciowych, charakterystycznych dla poszczególnych gatunków lęgni (oogonium) i plemni (antheridium), jak i struktur bezpłciowych zarodni (sporangium), posiłkując się wynikami badań Erwin i Ribeiro (1996), Brasier i in.

(2004), Jung i Burgess (2009) lub metodami biologii molekularnej. Aby przygoto- wać preparat do obserwacji mikroskopowej, należy postępować zgodnie z poniższą procedurą (Jung i Burgess 2009):

Produkcja struktur płciowych

1 przeniesienie fragmentu grzybni na podłoże typu V8 agar i inkubowanie kultury w ciemności w temperaturze 20–25°C 2 inkubowanie kultur w temperaturze 20°C w ciemności

3 obserwacja kultury co tydzień w celu poszukiwania struktur płciowych*

* Jeżeli struktury płciowe nie powstają po 3-4 tygodniach inkubacji w ciemności, należy przeprowadzić parowanie z testującymi testerami typu A1 i A2 w celu ustalenia, czy otrzymane izolaty są heterotaliczne czy sterylne Fot 2. Przeszczepianie na podłoże selektywne PARPNH-agar fragmentów liści (stosowanych jako

pułapki roślinne) zainfekowanych przez patogeny z rodzaju Phytophthora

Kolejnym sposobem identyfikacji patogenów jest wykonanie analiz DNA.

W tym celu fragmenty strzępek należy przeszczepić na podłoża płynne typu V8 i pozostawić do inkubacji w ciemności przez 7 dni w temperaturze 23°C. Kolejnym krokiem będzie rozdrobnienie i maceracja grzybni w ciekłym azocie i wyekstra- howanie DNA. Następnie należy przygotować mieszaniny PCR zgodnie z poniższą recepturą (Drenth i in. 2006).

10 x buffer 2,5 µl starter 2,0 µl

MgCL₂ 1,7 µl Polimeraza Taq 0,2 µl

dNTP 2,0 µl DNA 2,0 µl

A2 starter 2,0 µl H²O 12,6 µl

Produkcja struktur bezpłciowych

1 przeniesienie fragmentu grzybni na podłoże typu V8 agar i inkubowanie kultury w ciemności w temperaturze 20–25°C

2 kiedy pojawi się młoda grzybnia, należy wyciąć fragmenty agaru (o średnicy 5–10 mm) z obrzeża kolonii i umieść w pustej szalce Petriego

szalki zalać niesterylnym roztworem ekstraktu glebowego, aby całkowicie pokryć wszystkie fragmenty agaru

4 umieścić szalki Petriego pod lampkami w temperaturze pokojowej (20–25°C) i wymienić niejałowy ekstrakt na wodę destylowaną po 6 godzinach

wymienić ponownie wodę destylowaną po 12 godzinach oraz sprawdzić fragmenty agaru w celu poszukiwania pierwszych dojrzałych zarodni

jeśli zarodnie nie utworzyły się w ciągu 24 godzin, pozostawić szalki na kolejne 24 godziny

jeśli po tym czasie zarodniki nadal się nie wytworzą, należy usu- nąć wodę destylowaną, dodać podobną ilość świeżej wody desty- lowanej i ponownie inkubować szalki do momentu wytworzenia zarodni

3

5

7 6

Reakcję PCR należy przeprowadzić według następującego protokołu: 3 min wstępnej denaturacji DNA w 94°C, 35 cykli amplifikacji (30 sekund w temperatu- rze 55°C, 60 sekund w temperaturze 72°C) i 5 min w 72°C końcowego wydłużania.

Po tak przeprowadzonej reakcji PCR kolejnym krokiem będzie oczyszczenie pro- duktu PCR przy użyciu zestawu np. Clean-up (A&A Biotechnology), zgodnie z protokołem dołączonym przez producenta. Ostatnim etapem identyfikacji jest sekwencjonowanie odcinków DNA. Uzyskane w ten sposób sekwencje porównuje się ze wzorcami deponowanymi w międzynarodowej bazie danych GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Podłoża do izolacji gatunków Phytophthora

PARPNH

Dodać do jednego litra agaru V8 (patrz poniżej):

Agar V8 CaCO³

Stanowi dobre podłoże wzrostowe dla większości gatunków i umożliwiające powstawanie zarodni, lecz niewystarczająco przezierne, aby prowadzić obserwację zarodników płciowych (oospor).

Wszystkie składniki: sok V8 (200 ml), 800 ml wody destylowanej, CaCO³ (2 g) i agar (17 g/l), należy wymieszać i umieścić w autoklawie na 30 minut.

Ryfampicyna* 10,0 mg/l Ampicylina* 200,0 mg/l

Nystatyna* 50,0 mg/l

PCNB** 25,0 mg/l

Hymeksazol** 50,0 mg/l

* Dodatki dodawać oddzielnie pod wyciągiem laminarnym, cały czas mieszając podłoże po wyjałowieniu i schłodzeniu do temperatury 50°C. Ampicylinę i ryfampicynę rozpuścić w 70% etanolu, a PCNB – w 95%

etanolu. Wszystkie roztwory podstawowe środków grzybobójczych i antybiotyków powinny być przygotowane z zachowaniem zasad aseptyki w jałowych plastikowych fiolkach, w porcjach, na objętość 1 litra.

** Hymeksazol dodawany jest w celu zahamowania wzrostu gatunków Pythium. PCNB jest stosowane w celu zahamowania wzrostu grzybów glebowych. Jako alternatywę substancji czynnej można zastosować Terraclor (PCNB 75% WP).

Nowe technologie w ochronie drzewostanów dębowych na Płycie Krotoszyńskiej

Zjawisko zamierania dębów w Polsce znane jest od ponad 80 lat, jednak naj- dotkliwsze straty wystąpiły w latach 80. XX wieku. Ucierpiały przede wszystkim dęby szypułkowe, które płytko korzenią się w glebie i wytwarzają mniejszą biomasę korzeni. Symptomy chorobowe dotyczyły zarówno koron drzew, jak i ich pni (Fot. 3 i 4). Widoczne było drobnienie liści, zamieranie pędów i w konsekwencji przerzedzenie koron oraz na pniach rozwój pędów wtórnych, tzw. wilków. Wiosną i jesienią zauważyć można było wysięki soków w postaci wilgotnych i brunatnych plam. Po gołożerach wywołanych przez owady młode liście są szczególnie wrażliwe

na infekcje przez mączniaka dębu Erysiphe alphitoides. Prawdopodobnie zarodnikowanie grzyba zbiega się w czasie z rozwojem nowych, młodych, wrażliwych liści. Początkowo widoczne są tylko pojedyncze białe skupiska grzybni, stopniowo rozszerzające się na całą powierzchnię liścia. Niejednokrotnie grzyb poraża wszystkie liście w ko- ronach drzew, które w konsekwencji zwijają się i przedwcześnie opadają.

Fot. 3. Na pniu drzewa wysączające się spod kory soki widoczne z daleka w for- mie ciemnych przebarwień

Fot. 4. Wysączające się spod kory soki stanowią pożywkę dla mikroorganizmów (bakterii, grzybów) oraz przywabiają owady

Na skutek podtopienia drzewostanu (wiosenne roztopy czy długotrwałe opady) drobne korzenie tworzące związki mykoryzowe i pobierające wodę z solami mine- ralnymi z gleby obumierają z powodu niedotlenienia. Natomiast są to nadzwyczaj korzystne warunki dla rozwoju patogenicznych lęgniowców. Wystarczy ulewny deszcz, aby patogeny z rodzaju Phytophthora mogły aktywnie przemieszczać się w wodzie pomiędzy cząsteczkami gleby w poszukiwaniu najdrobniejszych korzeni.

Po przyczepieniu się do ich powierzchni wciągają wici, otorbiają się i rozpoczynają proces infekcji. Porażone obumarłe korzonki szybko gniją, a patogeny pozostają w szczątkach roślinnych w glebie, oczekując na kolejne sprzyjające warunki pogodowe, aby znów móc zaatakować. Niekorzystną dla nich suszę mogą przetrwać zarówno jako formy przetrwalnikowe, tzw. chlamydospory, jak i grubościenne zarodniki, tzw. oospory. Te ostatnie powstają podczas rozmnażania płciowego w wyniku wymiany materiału genetycznego pomiędzy organami żeńskimi, tzw.

lęgniami, i męskimi – plemniami. Lęgniowce, jako organizmy, których cykl biologiczny ściśle związany jest ze środowiskiem wodnym, szybko namnażają się w sytuacji podtopienia drzewostanu, podczas gdy grzyby mykoryzowe w takich warunkach obumierają. Procesy te przebiegają bardzo dynamicznie w warstwie gleby mineralnej do 25 cm głębokości. Uszkodzone korzenie pobierają mniej wody, a usychające pędy dostarczają mniej asymilatów do korzeni.

Zjawisko zamierania drzewostanów dębowych badano w ramach projektu Life+

„Ocena wpływu nawozów fosforynowych na stan zdrowotny lasu zobrazowany za pomocą fotowoltaicznego bezzałogowego statku powietrznego”, o akronimie HESOFF, w ramach którego zaproponowano zastosowanie fosforynów jako substan- cji wzmacniających odporność roślin. Fosforyny są komponentem niektórych nawo- zów stosowanych w rolnictwie i ogrodnictwie. W obecności jonów PO^3- r oślina jest w stanie rozpoznać patogena i przeciwdziałać rozwojowi infekcji. Sygnał ostrzegawczy wysyłany jest do sąsiednich komórek, które mają czas na reakcję.

W projekcie HESOFF eksperymentalnie zastosowano włoski nawóz Kalex oparty na fosforynie potasu. Nawozy fosforynowe dostarczono drzewom dolistnie podczas oprysku z powietrza oraz poprzez oprysk pni drzew. Zaletą oprysku z powietrza jest duża wydajność zabiegu i drobnokroplistość, co zmniejsza zjawisko fitotoksyczności.

W przypadku pni preparat dostaje się do systemów przewodzących drzew przez żywe tkanki pomiędzy spękaniami kory. Zabieg może być stosowany selektywnie, co zmniejsza koszty jego zastosowania. Opryskowi podlegają tylko te drzewa, które ro- kują, że wyzdrowieją. Prowadzone badania z użyciem spektrofotometrów oraz pomiary teledetekcyjne za pomocą kamery wielospektralnej Quercus 6 miały na celu opracowanie metody wczesnego wykrywania symptomów chorobowych, widocznych jako zmiany

w przebiegu sygnatur spektralnych w zakresach promieniowania widzialnego oraz podczerwieni. Poznanie wczesnych etapów rozwoju choroby stwarza możliwość pre- cyzyjnej ochrony drzew i ograniczenia strat ekonomicznych związanych z zamiera- niem drzew i deprecjacją surowca drzewnego. Wyniki uzyskane podczas realizacji projektu zaprezentowane zostały w lipcu 2015 roku i wrześniu 2018 roku w IBL na międzynarodowej konferencji z udziałem leśników, biologów, fitopatologów i entomologów. Infekcje korzeni przez patogeny z rodzaju Phytophthora prowadzą do zmian w organizmie roślinnym na wielu poziomach: morfologicznym, fizjologicznym i genetycznym. Badania genetyczne były bardzo ważnym elementem projektu, jako że dostarczały informacji o obecności DNA patogenów w ryzosferze badanych dębów.

Zainfekowane drobne korzenie giną i zostają oddzielone od korzeni matecznych (powstaje rana, która zabliźnia się, Fot. 5), w związku z tym bardzo trudno

jest wówczas wyizolować patogeny z systemów korzeniowych. Gatunki z rodzaju Phytophthora, szczególnie P. quercina, pozostają jednak w ryzosferze przez wiele lat. Ich obecność może zostać wykryta za pomocą metod biologii molekularnej. Wyekstrahowane DNA zostaje namnożone w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), a następnie charakterystyczne jego odcinki, tzw. ITS, są analizowane, aby zidentyfikować gatunek patogenu.

Fot. 5. Uszkodzony system korzeniowy, widoczne nieliczne drobne korzenie długości do 2 mm (u góry) i odcinki zupełnie ich pozbawione oraz blizny po infekcjach (u dołu)

Dodatkowym celem projektu HESOFF było poszukiwanie skutecznej ochrony biologicznej drobnych korzeni dębów za pomocą antagonistycznych bakterii hamujących rozwój patogenów z rodzaju Phytophthora. Ze wszystkich 180 szczegółowo badanych drzew pobrano próbki liści z wierzchołkowych, dobrze oświetlonych części koron oraz tyle samo próbek gleby wokół pni (z głębokości ok. 25 cm). Co roku wykonywano analizy na zawartość azotu, fosforu, potasu, wapnia i magnezu, tworząc unikalną bazę danych. Umożliwiła ona poznanie nie tylko wpływu zabiegu, ale i naturalnych procesów zachodzących w drzewostanach dębowych, np. zakwaszania siedliska. Pomiary krzywych spektralnych liści dębów wykonywane spektrofotometrem w terenie pozwalały prześledzić poprawę stanu fizjologicznego drzew (po zabiegu). Jednak to analiza drobnych korzeni i ich jakości miała podstawowe znaczenie w ocenie efektów zabiegu.

Dęby potraktowane fosforynami posiadały więcej drobnych korzeni niż dęby kontrolne. Więcej informacji zawarto w specjalnie przygotowanym filmie pt. Nowe technologie w ochronie drzewostanów dębowych na Płycie Krotoszyńskiej (HESOFF), dostępnym w mediach społecznościowych (YouTube).

Opisy gatunków

Liczba gatunków należących do rodzaju Phytophthora przekroczyła już 120 i pro- gnozuje się, że drugie tyle zostanie wykryte w kolejnej dekadzie. Z tego powodu w niniejszej pracy ograniczono się do przedstawienia gatunków, które zaobserwowano w latach 2013–2018 w drzewostanach dębowych na terenie Płyty Krotoszyńskiej.

Gatunki wyizolowane tradycyjnymi metodami Phytophthora quercina

Phytophthora quercina T. Jung – gatunek ten po raz pierwszy wyizolowany został w drzewostanach dębowych w Niemczech, we Włoszech i na Węgrzech z martwych, drobnych korzeni (o średnicy do 2 mm) poprzez bezpośrednie wykładanie ich na podłoża selektywne typu PARPNH (Jung i in. 1999) oraz z gleby ryzosferowej metodą pułapek roślinnych, z zastosowaniem młodych liści dębów. Zastosowanie innych organizmów roślinnych, np. jabłek, okazało się nieskuteczne.

Morfologia

Gatunek jest homotaliczny, to znaczy, że lęgnie i plemnie powstają na strzępkach tej samej plechy.

Zarodnie (sporangia), na podłożach stałych produkowane są w małych ilościach, natomiast po przeszczepieniu na podłoża płynne ich liczba znacznie wzrasta. Zarodnie z wyraźną brodawką lub rzadziej z dwoma brodawkami (o grubości 2–6 μm), charakteryzują się dużą zmiennością wielkości (zakres średnich 36–49,2 μm długość; 23,3–33,7 μm szerokość) i kształtu – od kulistych przez jajowate po bananowate czy zniekształcone (Fot. 6 i 7). Zdarzają się zarodnie z zakrzywionym wierzchołkiem (średnie występują u około 1/3 populacji) oraz z przemieszczeniem brodawki z wierzchołka na stronę boczną.

Zarodniki (zoospory) uwalniane są przez wieczko o wymiarach 4,2–9,6 μm (Jung i in. 1999).

Lęgnie (oogonia) (Fot. 8) wytwarzają się stosunkowo łatwo na sztucznych podłożach, można je również zaobserwować w martwych, drobnych korzeniach pod mikroskopem. Kształt lęgni jest bardzo zróżnicowany, od kulistych poprzez jajowate i eliptyczne po wydłużone. Na podłożu typu MEA rozmiar lęgni waha się od 19 do 45 μm. Ściany lęgni są gładkie, a ich grubość waha się od 0,5 do 2,1 μm (Jung i in. 1999).

Zygota (oospora), jest w kształcie kulista lub jajowata, a jej rozmiar waha się od 17,9 do 38 μm, grubość ścianki od 0,8 do 5 μm (Jung i in. 1999).

Plemnie (antheridia) są bezbarwne, kuliste lub o kształcie nieregularnym, o rozmiarach od 8,3 do 26,6 μm. Plemnie zawsze ustawiają się okołolęgniowo, zwykle zlokalizowane są w pobliżu nasady lęgni (Jung i in. 1999).

Patogeniczność

Fot. 6. Zarodnia (sporangium) P. quercina z wyraźną brodawką

Według Jung i in. (1999) patogen ten jest ściśle związany z dębami i powoduje silne uszkodzenie korzeni, rzadziej infekuje szyję korzeniową. Analiza obumarłych, drobnych korzeni pod mikroskopem świetlnym wykazała, że pod ich korą czasami stwierdzić można niepodzielone strzępki oraz niekiedy nawet grubościenne, kuliste lub jajowate lęgnie. Objawy widoczne na części nadziemnej ograniczają się do występowania nekrotycznych plam na liściach. U młodych sadzonek patogen P. quercina wywołuje silną zgniliznę korzeni doprowadzającą do więdnięcia liści.

Z badań przeprowadzonych przez Jung i in. (1999) wynika, że gatunek P. quercina jest najbardziej chorobotwórczym w stosunku do dębów.

Fot. 7. Zarodnie (sporangia) P. quercina o zmiennej wielkości wypełnione zarodnikami

Fot. 8. Lęgnie (oogonia) P. quercina o gładkich ścianach, plemnie ustawione okołolęgniowo

Phytophthora europaea

Phytophthora europaea E. M. Hansen & T. Jung, sp. nov. – gatunek po raz pierwszy wyizolowany został z drzewostanów dębowych środkowej Europy.

Morfologia

Gatunek homotaliczny.

Zarodnie (sporangia), nie posiadają brodawek i są najczęściej kształtu eliptycznego. Charakterystyczną cechą zarodni jest ich zwężanie się ku pod- stawie, często sporangiofory w miejscu zetknięcia się z zarodnią są rozszerzone.

Średnie wymiary zarodni wynoszą 46 ± 10,7 μm długości i 32 ± 5,4 μm szerokości. Sporangiofory zarodni są bardzo zróżnicowane, zdarzają się osobniki z zarodnią zagnieżdżoną, ale również i sympodialną (Jung i in. 2002).

Fot. 9. Zarodnie (sporangium) P. europaea bez brodawki kształtu eliptycznego zwęża się ku pod- stawie

Fot. 10. Pusta zarodnia P. europaea i wyrastająca z niej kolejna

Lęgnie są kuliste, zazwyczaj wykazują zwężenie i zakrzywienie u podstawy.

Średnie ich wymiary wynoszą około 33,4 ± 6 μm (Jung i in. 2002) (Fot. 11 i 12).

Plemnie (antheridia) są bezbarwne, kuliste lub w kształcie nieregularnym o rozmiarach ok. 12,2 ± 2 μm do 9 ± 1,7 μm długości. Plemnie zawsze ustawiają się okołolęgniowo, zwykle zlokalizowane są w pobliżu trzonka lęgni (Jung i in.

2002).

Patogeniczność

P. europaea wyizolowano z gleb leśnych w północno-wschodniej Francji i pół- nocnych Niemczech, w dojrzałych drzewostanach dębowych. Gatunek ten później znajdowano również w pobliżu brzóz i jesionów rosnących w lasach mieszanych (Hansen i Delatour 1999). Wydaje się, że aktywność patogenu jest związana z se- zonowym wahaniem poziomu wód gruntowych. We Francji gatunek ten był izo- lowany we wszystkich porach roku na wilgotnych siedliskach (Hansen i Delatour 1999). Według Jung i in. (2002) gatunek nie jest szczególnie agresywny. Wywołuje niewielkie uszkodzenia u sadzonek dębów, natomiast jest agresywny względem owoców jabłoni.

Fot. 11. Lęgnia (oogonium) P. europaea z plemnią ustawioną okołolęgniowo

Fot. 12. Lęgnia (oogonium) P. europaea, kulista zwężająca się u podstawy

Phytophthora cactorum

Phytophthora cactorum Lebert & Cohn sp. nov. należy do gatunków homota- licznych.

Morfologia

Zarodnie (wyposażone w wyraźną brodawkę) charakteryzują się dość dużą zmiennością kształtu – od eliptycznych przez jajowate po kuliste (Fot. 13 i 14).

Wymiary zarodni wynoszą średnio około 31,4 ± 4,8 μm długości i 26,4 ± 4 μm szerokości. Trzonki, z których wyrastają zarodnie (tj. trzonki konidialne), są zwykle proste lub tworzą luźne grupy z rozgałęzieniem sympodialnym (Oudemans i Coffey 1991).

Lęgnie (oogonia) posiadają gładkie ściany, zwykle bezbarwne (Fot. 15 i 16).

Przeciętne wymiary lęgni wynoszą około 32,9 ± 2,5 μm, natomiast przeciętna gru- bość ścianki to około 2 μm (Oudemans i Coffey 1991).

Zygota (oospora) ma kształt kulisty lub zbliżony do kulistego o średnich wy- miarach 27,7 ± 2,5 μm (Oudemans i Coffey 1991).

Plemnie są zaliczane do okołolęgniowych (najczęściej występujące w węźle strzępek) o kształcie kulistym. Średnie wymiary plemni to około 15 μm długości na 13 μm szerokości (Waterhouse 1963) (Fot. 16).

Patogeniczność

Patogen P. cactorum może wywoływać zgnilizny korzeni oraz żółto-brunatne przebarwienia kory znajdującej się poniżej poziomu gruntu. Infekcje szyj korzeniowych mogą powstawać na skutek odniesionych ran i uszkodzeń mechanicznych miejsca infekcji. Ponadto gatunek ten, jak wszystkie pozostałe organizmy z rodzaju Phytophthora, odpowiedzialny jest za obumieranie systemów korzeniowych. Po obumarciu zainfekowanych tkanek, „grzybnia” ulega zanikowi, a patogen pozostaje w nich w postaci zarodników – oospor. Zaatakowane drzewa wykształcają mniejszą ilość liści oraz znacznie mniejsze owoce, a wiosną na liściach pojawiają się przebarwienia. Objawy te mają bezpośredni związek z zakażeniem podziemnej części roślin żywicielskich, co może być ważnym objawem w wykrywaniu choroby. Gatunek ten charakteryzuje się bardzo szerokim zakresem roślin żywicielskich (Erwin i Ribeiro 1996).

Fot. 13. Owalna zarodnia (sporangium) P. cactorum, z wyraźną brodawką i rozgałęzieniem sympodialnym sporangioforu

Fot. 14. Zarodnia (sporangium) P. cactorum, (po prawej pusta), wyrastająca z długich trzonków konidialnych

Fot. 15. Lęgnia (oogonium) P. cactorum o gładkiej bezbarwnej ścianie

Fot. 16. Lęgnia (oogonium) P. cactorum z bezbarwną kulistą, jednokomórkową plemnią

Phytophthora plurivora

W Europie patogen P. plurivora T. Jung & T.I. Burgess (wcześniej opisany jako P. citricola) został po raz pierwszy wyizolowany w lasach naturalnych. Kolejne doniesienia informowały również o obecności tego gatunku w drzewostanach gospodarczych. Patogen ten ma szerokie spektrum roślin gospodarzy, a cechą charakterystyczną związaną z jego detekcją jest silne przerzedzenie koron, drobne i często żółkniejące liście, rozległe uszkodzenia drobnych korzeni (zgnilizny) oraz zgnilizna podstawy pni. Obecnie z kompleksu P. citricola, na podstawie poznanych unikalnych cech morfologicznych i fizjologicznych, a także dzięki analizom filogenetycznym wyodrębniono kilka gatunków: P. plurivora, P. multivora, P. pini, P. capensis oraz P. citricola sensu stricto. Patogen P. plurivora należy do gatunków homotalicznych.

Morfologia

Zarodnie (sporangia) gatunku P. plurivora wykształcają półbrodawkę (semi- papillar), rzadziej zdarzają się dwu– lub trzybrodawkowe zarodnie (Fot. 17 i 18).

Kształt zarodni jest bardzo zróżnicowany, część zarodni przyjmuje kształt cytryny lub owalny, jajowaty, czasami niekształtny. Zarodnie posiadają nietypowe cechy, takie jak boczne umocowanie sporangioforu, wyraźnie zakrzywione wierzchołki czy rozszerzenie sporangioforu u podstawy zarodni. Wymiary zarodni wynoszą około 47,4 ± 7,7 μm długości i 33,5 ± 5,1 μm szerokości (Jung i Burgess 2009).

Lęgnie charakteryzują się gładkimi ścianami (Fot. 19 i 20). Najczęściej przyj- mują kształt kulisty, rzadziej lekko spłaszczonej kuli. Średnio wymiary wynoszą 28,5 ± 3,3 μm, choć zdarzają się też lekko wydłużone (Jung i Burgess 2009).

Zygoty (oospory) są zwykle kuliste, ale zdarzają się też zarodniki o podłużnych kształtach. Grubość ścianki wynosi średnio 1,45 ± 0,3 μm (Jung i Burgess 2009).

Kształt plemni bywa zróżnicowany: okrągły, buławkowaty lub nieregularny.

Plemnie najczęściej przytwierdzają się okołolęgniowo, jednak rzadko trafiają się również izolaty z plemnią przylęgniową (Jung i Burgess 2009).

Patogeniczność

Gatunek P. plurivora jest organizmem patogennym wobec licznych drzew, w tym jodły pospolitej (Abies alba), olszy czarnej (Alnus glutinosa), olszy szarej (Alnus incana), klonu zwyczajnego (Acer platanoides), klonu jaworu (Acer pseudoplatanus),

klonu cukrowego (Acer saccharum), kasztanowca białego (Aesculus hippocastanum), brzozy brodawkowatej (Betula pendula), buka zwyczajnego (Fagus sylvatica), jesionu wyniosłego (Fraxinus excelsior), dębu szypułkowego (Quercus robur), dębu bezszypułkowego (Quercus petraea) i wielu innych (Jung i Burgess 2009). Gatunek był z powodzeniem izolowany zarówno z korzeni, gleby ryzosferowej, podstawy pni, jak i pędów niektórych roślin żywicielskich (Jung i Burgess 2009).

Fot. 17. Dwubrodawkowa zarodnia (sporangium) P. plurivora

Fot. 18. Zarodnia (sporangium) P. plurivora z widoczną półbrodawką

Fot. 19. Gładkościenna lęgnia (oogonium) P. plurivora z okrągłymi oosporami wewnątrz

Fot. 20. Lęgnia (oogonium) P. plurivora i przyczepiona do niej okrągła plemnia

Gatunki, których DNA znaleziono w ryzosferze Phytophthora cinnamomi

Gatunek P. cinnamomi Rands został po raz pierwszy opisany jako czynnik wywołujący raka na cynamonowcu Burmana w Birmie przez Rands (1922). Od tego czasu okazało się, że jest poważnym patogenem wywołującym zgniliznę korzeni wielu roślin. Już na początku lat 90. XX w. liczbę roślin stanowiących jego potencjalnych gospodarzy szacowano na ponad 1000 rodzajów i gatunków.

Morfologia

Gatunek heterotaliczny.

Patogen P. cinnamomi zaliczamy do gatunków, których zarodnie nie wytwa- rzają brodawek. Zarodnie mogą przyjmować kształt owalny, elipsy lub wydłużonej elipsy. Wymiary zarodni wynoszą około 75 μm długości i 40 μm szerokości (Erwin i Ribeiro 1996).

Lęgnie (oogonia) są okrągłe, często ze zwężającą się podstawą, gładko- ścienne. Średnica lęgni waha się w przedziale od 21 do 58 μm (średnio 40 μm).

Zarodniki (oospory) są okrągłe, ich wielkość mieści się w zakresie od 19 do 54 μm (średnio 20 μm), gdy gatunek hodowany jest na agarowym podłożu z marchwi, natomiast 33 μm, gdy na pożywce warzywnej V8 i 34 μm na pożywce agarowej z mąki kukurydzianej.

Plemnie (antheridia) ułożone są okołolęgniowo. Ich wymiary przyjmują śred- nie wartości 19 ^×17 μm. Niektóre są dwukomórkowe.

Patogeniczność

Zwykle po wystąpieniu zgnilizny korzeni, liście roślin zaczynają się przebar- wiać, więdnąć oraz szybko zamierać (w zależności od tego, jak bardzo porażone są systemy korzeniowe). Czasami zainfekowane rośliny nagle zamierają, natomiast innym razem mogą przeżyć przez kilka lat, szczególnie w chłodniejszym, wilgot- nym klimacie. Choroba często w pierwszej fazie jest bezobjawowa. Rośliny takie są głównym źródłem rozprzestrzeniania się patogenu P. cinnamomi na obszarach

wcześniej wolnych od jego obecności, co stanowi poważny problem w ochronie roślin, zwłaszcza w dobie bardzo rozwiniętego handlu materiałem roślinnym oraz w wielogatunkowych uprawach w szkółkach roślin ozdobnych.

Ochrona przed patogenem P. cinnamomi jest trudna zarówno ze względu na szeroki zakres roślin żywicielskich, jak i zdolność tego patogenu do przetrwania w organizmie roślinnym bez wywoływania objawów porażenia. W roślinie najczę- ściej maskuje się w systemach korzeniowych w formie przetrwalnikowej (chlamy- dospor).

Gatunek ten był już wcześniej izolowany na terenie Europy z gleby ryzosferowej dębów oraz na innych kontynentach, szczególnie w Australii, gdzie powoduje wiel- koobszarowe zamieranie eukaliptusów i wielu innych gatunków roślin, także w warstwie runa lasu (Tainter i in. 1987).

Phytophthora parasitica

Do 1963 roku, tj. do momentu określenia czynnika etiologicznego zgorzeli siewek rącznika pospolitego (Ricinus communis L.), na całym świecie funkcjonowała nazwa gatunkowa P. parasitica Dastur (1913), ponieważ gatunek P. nicotianae został wcześniej w niedokładny sposób opisany przez Breda de Haan (1983). Dopiero Ashby (1928) zauważył, że sporządzone przez Breda de Haan (1983) rysunki paragenicznej* plemni są błędne, gdyż wiadomo było wówczas, że plemnie Phytophthora wyizolowane z tytoniu są amfigeniczne.** Oznaczało to, że założona przez Breda de Haan wodna hodowla zakażonych korzeni została zanieczyszczona gatunkami Pythium, nie będąc zatem czystą hodowlą Phytophthora. Ashby (1928) zaproponował zatem zastąpienie nazwy P. nicotianae oraz to, żeby wszystkie szczepy tego chorobotwórczego mikroorganizmu izolowane z tytoniu i innych gatunków roślin gospodarzy określić zbiorczo nazwą P. parasitica Dastur (1913), z czym później zgodził się Meurs (1934).

Morfologia

Większość izolatów jest heterotaliczna, choć część z nich w tej samej hodowli może tworzyć lęgnie i zygoty, jeśli inokulum zostaje przeniesione ze starej hodowli.

Izolaty uzyskane przez Schubert i Leahy (1989) z barwinka, Catharanthus roseus, były homotaliczne. Zygoty stwierdzono w tkankach walca osiowego zakażonych korzeni drzewa pomarańczowego Washington Navel w Tulare County w Kalifornii (Lutz i Menge 1991). Plemnie są amfigeniczne** o kształcie sferycznym lub owalnym, a lęgnie są gładkie i sferyczne o średnicy od 15 do 64 μm (średnio 26,8 μm). G. Hall (1993) podaje natomiast wartości 26 ± 3,2 μm. Zygoty są aplerotyczne***; Dastur (1913) podaje zakres od 13 do 24 μm. Często spotykane są średnice w zakresie od 13 do 35 μm (średnio 22,6 μm).

Patogeniczność

Różne izolaty P. nicotianae wywołują choroby korzeni licznych zbóż. Niektóre izolaty są chorobotwórcze wyłącznie dla pojedynczego organizmu gospodarza, np. gatunek P. parasitica var. nicotianae dla tytoniu (Apple 1957, 1962; Lucas 1965, 1975). W niektórych przypadkach występuje śniedź tkanek liści lub owoców, czego przykładem może być gnicie owoców cytrusowych (Fawcett 1915, 1936; Koltz 1978).

Patogen ten ma długą historię pasożytowania w glebie i zakażonych tkankach, co jest prawdopodobnie wynikiem obfitego wytwarzania chlamydosporów. Kröber (1980) podaje czas przeżycia sięgający okresów 4– i 6-letnich w glebie. W owocach papryki P. nicotianae przeżywały w zakażonych nasionach ponad rok.

* przylęgniowej

Phytophthora fragariae

Po raz pierwszy patogen ten został zaobserwowany na truskawkach przez Alcocka (1929) w Szkocji, jednak organizm wywołujący symptomy chorobowe nie został opisany jako gatunek P. fragariae aż do roku 1940, kiedy to Hickman (1951) zaczął prowadzić badania nad rozpoznaniem i oznaczeniem organizmów wywołujących chorobę pleśnienia liści truskawek. Po tym czasie powstały liczne raporty na temat zgnilizny korzeni we wszystkich krajach uprawiających truskawki. Wygląda na to, że patogen ma ograniczoną liczbę żywicieli, ponieważ występuje w naturze tylko na truskawkach wyhodowanych z hybrydyzacji Fragaria chiloensis (L.) Duch. i Fragaria virginiana Duch. i Loganberry (L.H.

Bailey). Pomimo tego patogen ten również obserwowany był na innych plantacjach oraz w drzewostanach, jednak jego rola w uszkodzeniach korzeni nie została do końca przebadana.

Morfologia

Zarodnie są wytwarzane przez większość izolatów w ciągu 24 do 48 godzin, gdy fragmenty hodowli na podłożu typu V8 inkubuje się w wodzie (nie sterylnym eks- trakcie glebowym).

Zarodnie nie wykształcają brodawek nie są rozgałęzione i rozwijają się wewnętrz- nie (z jednej pustej zarodni wyrasta następna). Zarodnie są przeważnie duże, od 32 do 90 μm ^× 22 do 52 μm, a stosunek długości do grubości wynosi około 1,8 ± 0,2 (Ho i Jong 1990), średnio od 1,5 do 1,8. Zazwyczaj zarodnie przyjmują kształt jajowaty wydłużony z tendencją do zwężania się.

Patogen P. fragariae jest gatunkiem homotalicznym, który produkuje obficie or- gany płciowe w tkankach gospodarza, ale rzadko na sztucznych podłożach hodowla- nych (Ho i Jong 1990).

Lęgnie są okrągłe i często zwężają się w kształcie lejka. Jednokomórkowe plemnie w przeważającej mierze ułożone są okołolęgniowo, chociaż czasem powstają też plem- nie przylęgniowe. Oospory są kuliste, o średnicy około 34 μm.

Patogeniczność

Choroba wywoływana przez gatunek P. fragariae (głównie zgnilizna korzeni i pleśnienie liści) uważana jest obecnie za najważniejszą chorobę truskawek na świecie.

W Nowej Zelandii to właśnie ona głównie powoduje straty produkcji truskawek na zainfekowanych poletkach, całkowita utrata plonów zwykle występuje rok po posa- dzeniu.

Phytophthora idaei

Patogen Phytophthora idaei został po raz pierwszy wyizolowany (i opisany jako nowy gatunek) z gnijącej maliny (Rubus idaeus) w Wielkiej Brytanii (Kenney i Duncan 1995). Gdy zakażenie obejmuje tylko 5–20% korzeni (niektórych odmian malin), objawy choroby na częściach nadziemnych nie są w ogóle widoczne. Ze względu na brak specyficznych objawów rozpoznawanych gołym okiem często dochodzi do zakażeń poprzez nieświadome przenoszenie zainfekowanych roślin z miejsca na miejsce.

Morfologia

Zarodnie tworzą się w optymalnej temperaturze 20°C i wytwarzają brodawki, a kształtem najczęściej przypominają one jajowate twory (49 ^× 36 μm). W więk- szości przypadków kiełkowanie następuje z powstałych zoospor. Bezpośrednie kiełkowanie z zarodni jest rzadkie. Sporangiofory są proste i charakteryzują się ła- godnym wzrostem sympodialnym.

Lęgnie (oogonia) (26 ^× 38 μm) tworzą się na tym samym osobniku (gatunek homotaliczny). Ich powierzchnia jest gładka, sferyczna. Plemnie najczęściej uło- żone są przylęgniowo.

Phytophthora pseudotsugae

Patogen Phytophthora pseudotsugae został po raz pierwszy wyizolowany wraz z kilkoma innymi gatunkami Phytophthora ze zgniłych korzeni daglezji zielonej Pseudotsuga menziesii [(Mirb.) Franco] w szkółkach leśnych. Jednak zidentyfiko- wany jako gatunek Phytophthora został dopiero przez Pratt i in. (1976). Później zauważono, że wywołuje gnicie korzeni daglezji zielonej (Hansen i in. 1979).

Jako nowy gatunek Phytophthora opisany został przez Hamm i Hansen (1983).

Morfologia

Zarodnie (sporangia) są kuliste do jajowatych, czasem odwrotnie stożkowate lub bańkowate oraz wyraźnie pokryte brodawkami. Sporangia rzadko powstają na podłożach stałych, choć tworzą się w koloniach hodowanych na bulionie z grochu, następnie przepłukanych i inkubowanych w wodzie destylowanej, lub wyciągu z gleby, w temperaturze 10°C lub 20°C. Sporangia, które powstają w temperaturze 10°C w ciągu 1–2 dni posiadają średnie wymiary 49 ^× 39 μm (zakres 42–51 ^× 32–43 μm), natomiast te, które wyrosły w temperaturze 20°C są mniejsze i ich średnie wymiary wynoszą 39 ^× 32 μm (zakres 34–45 ^× 28–35 μm). Stosunek długości do szerokości wynosi średnio 1,23:1 (zakres 1,18–1,27:1) dla obu temperatur 10°C i 20°C.

Sporangia utrzymują się na prostych, długich (29–632 μm) sporangioforach. Jedne izolaty wytwarzają sporangia interkalarne, natomiast inne – nie. Patogen P. pseudotsugae wytwarza organy płciowe w pojedynczej (homotalicznej) hodowli na agarze kukurydzianym, agarze z fasoli półksiężycowatej, bulionie z grochu i agaru z soku warzywnego V8. Przeciętna średnica lęgni (oogonium) na agarze z sokiem wa- rzywnym V8 i na agarze z fasoli półksiężycowatej wynosi 35 μm, a na agarze kukury- dzianym i bulionie z grochu – 31 μm. Na agarze z soku V8 średnica waha się w zakresie 24–45 μm, przy średnich wartościach dla poszczególnych izolatów w zakresie 32–40 μm. Lęgnie są kuliste i gładkościenne (grubości około 1,2 μm) i znajdują się na końcach szypułek o średnicy 20–120 μm, poszerzających się do 5,8 μm w miejscu przyczepienia. Plemnie są bezbarwne (hialinowe) i zwykle kuliste lub pałkowate. Wymiary ich wahają się w zakresie 6–21 ^× 10–24 μm (średnio 11 ^× 15 μm). Plemnie są głównie parageniczne, choć zdarzają się i amfigeniczne. Zarodniki (oospory) są pigmentowane, kuliste, gładkościenne i aplerotyczne, choć prawie całkowicie wypełniają lęgnie (oogonia). Na agarze z soku warzywnego V8 średnica zarodników (oospor) waha się w zakresie 27–33 μm, średnio 24 μm. Hamm i Hansen (1983) zauważyli, że większość oospor była niezapłodniona.