Jacek Józef PIETRZYK Przemko KWINTA Zofia MITKOWSKA Mateusz JAGŁA
Mirosław BIK-MULTANOWSKI
AnnaMADETKO-TALOWSKA
Tomasz TOMASIK
Ocena ekspresji genów u wcześniaków z leukomalacją okołokomorową przy zastosowaniu metody mikromacierzy
Katedra Pediatrii UJ CM Wydziału Lekarskiego Kierownik:
Prof, dr hab.med. JacekJózef Pietrzyk
Dodatkowe słowa kluczowe:
leukomalacjaokołokomorowa wcześniak
mikromacierze
Additional key words:
periventricular leukomalacia premature
microarrays
BadaniefinansowanezgrantuMechanizmów Finansowych Europejskiego Obszaru Gospodarczego (PL0226) oraz ześrodków Ministerstwa Nauki iSzkolnictwa Wyższego (E023/P01/2008/02/85)
Adres dokorespondencji:
30-663 Kraków, ul. Wielicka 265 Tel: 12 658 0256
Fax: 12 658 44 46
e-mail: klinchdz@cm-uj.krakow.pl
Wprowadzenie: Aktualnie jednym z najważniejszych problemów neonato- logii jest występowanie odległych na
stępstw wcześniactwa takich jak reti- nopatia wcześniaków, dysplazja oskrzelowo-płucna i leukomalacja oko
łokomorowa (PVL). Wprowadzenie do praktyki klinicznej techniki mikroma
cierzy umożliwia przeprowadzanie ba
dań, w których ocenić można ekspre
sję praktycznie całego genomu czło
wieka Cel: Porównanie ekspresji ge
nów w 1. miesiącu życia u dzieci uro
dzonych przedwcześnie (przed 32 ty
godniem ciąży) w grupach z rozpozna
niem i bez rozpoznania leukomalacji okołokomorowej. Metody: Prospek
tywnym badaniem kohortowym obję
to 111 noworodków urodzonych śred
nio w 27, 8 tyg. ciąży (SD: 2, 5), ze śred
nią masą ciała 1029g (SD: 290g). Ce
lem wykonania badania metodą mikro
macierzy od każdego dziecka pobiera
no 3 próbki krwi odpowiednio w 5., 14.
i 28. dobie życia. Z pobranych próbek krwi wyizolowane zostało całkowite mRNA (AMBION RiboPure Kit). Anali
za ekspresji genowej prowadzona była przy użyciu mikromacierzy GeneChip®
Humań Gene 1. 0ST produkcji Affyme- trix. Wyróżniono 2 kohorty dzieci: (A) z PVL (n=16) oraz (B) bez PVL (n=95).
Rozpoznanie PVL stawiane było na podstawie wyniku badania ultrasono- graficznego mózgu, wykonywanego począwszy od przyjęcia co 7 dni aż do ukończenia przez dziecko wieku 8 ty
godni. Wyniki: Co najmniej 2-krotną różnicę w ekspresji stwierdzono w 5. dobie życia w przypadku 6 genów, w 14. dobie życia w przypadku 21 genów, a w 28. dobie życia w przypadku 1 genu. Różnicę w ekspresji zawierają
cą się w przedziale od 1, 5 do 2, 0 stwier
dzono odpowiednio w przypadku 39, 66 oraz 30 genów. Jednakże, po zasto
sowaniu korekcji na testowanie wielu hipotez (poprawki Benjamini-Hochber- ga), wszystkie obserwowane różnice nie wykazały istotności statystycznej.
Stosując metodę GSEA nie stwierdzo
no, aby którykolwiek ze szlaków zawar
tych w bazach KEGG oraz Gene Onto-
Introduction: Currently, one of the major problems in neonatology are complications of prematurity such as retinopathy of prematurity, bronchop
ulmonary dysplasia and periventricular leukomalacia (PVL). Owing to the microarray technique, expression of all potential human and animal genes may be reliably evaluated. Aim: To compare whole genome expression in the first month of life in the groups of infants with and without PVL. Methods: 111 Very Low Birth Weight (VLBW) newborns (mean birthweight 1029g (SD: 290), mean gestational age 27. 8 weeks (SD: 2. 5) were prospectively evaluated. Blood samples were drawn from all the study participants on the 5th, 14th and 28th day of life (DOL).
QIAGEN kits were used to extract mRNA. The mRNA samples were evaluated for gene expression with the use of GeneChip® Human Promoter 1. 0R microarrays. The infants were di
vided into 2 groups: A) PVL (n=16) and 2) noPVL (n=95). Diagnosis of PVL was based on ultrasound evaluation of the brain. Repeated examinations were performed every 7 days up to 8 weeks postnatal age. Results: More than two
fold increase/decrease expression of 6 genes on 5th DOL, 21 genes on the 14th DOL and 1 gene on the 28th DOL was observed. The expression differ
ence between 1. 5 to 2. 0 fold change of 39, 66 and 30 genes was noted on the 5th, 14th and 28th DOL respectively.
However, after adjustment for multiple comparison using Benjamini- Hochberg procedure, none of the dif
ference was statistically significant.
Gene set enrichemnent analysis based on KEGG and Gene Ontology path
ways did not revealed any significantly enriched pathway in the group of PVL children. Conclusion: There was no significant difference in genes expres
sion in the groups of infants with and without PVL
Przegląd Lekarski 2011 /68/ 11 1117
logy wykazywał istotnie zmniejszoną lub zwiększoną ekspresję w grupie dzieci z PVL zarówno w 5., jak i 14., i 28. dobie życia. Wnioski: W przeprowadzonym badaniu nie stwierdzono w pierwszym miesiącu życia istotnych różnic w ekspre
sji genów pomiędzy grupą dzieci z leukomalacją okołokomorową oraz bez PVL.
Wprowadzenie
Mimo znaczącego rozwoju opieki me dycznej nad dziećmi urodzonymi przed
wcześnieizwiększeniaichprzeżywalności, dużym problemem pozostają odległe na
stępstwa wcześniactwa, takiejak dysplazja oskrzelowo-płucna (BPD), retinopatia(ROP) czy leukomalacja okołokomorową (PVL - periventricular leukomalacia). Zmiany leu- komalacyjne dotyczą głównie istoty białej leżącej w okolicy górno-bocznych sklepień komór bocznych mózgu, w którejprzebie ga wiele ważnych szlaków nerwowych - włókna kojarzeniowe, drogi piramidowe, promienistość wzrokowaisłuchowa.Wystę puje ona najczęściej u dzieci urodzonych przedwcześnie, zwłaszcza przed32. tygo
dniem ciąży iw stanie ciężkim. Leukomala cja, niezależnie od postaci (jamista/ rozla na), jest następstwem przedewszystkim dwóch procesów -niedokrwienia i / lubnie dotlenienia oraz zakażenia i/lub stanu za
palnego [3, 14].
W okresie między24 a 32 tygodniem ciążyokołokomorową istota białaznajduje się w strefiegranicznego unaczynienia, gdyż tętniczki przeszywające nie docierajądo niej i brak jest również anastomoz. Powoduje to zmniejszonyprzepływkrwiw tym obszarze.
Ponadto niedojrzałe naczynia pozbawione są mięśnigładkich, co sprawia, żereakcja na zmieniające się ciśnieniekrwi jestzabu
rzona. Wahania ciśnienia, zarówno wokre
sie prenatalnym, jak równieżpo urodzeniu u noworodka, istotnie przyczyniają się do niedokrwieniaobszaru okołokomorowego.
Fluktuacje ciśnienia parcjalnegodwutlenku węglau wentylowanychwcześniaków pro wadzą także do obkurczenia naczyń, potę
gującniedokrwienie. Mechanizmy powyższe sprawiają że istotabiaław obszarze około- komorowym u wcześniaków jestnarażona na uraz niedokrwienny [13].
Obok niedokrwienia drugim ważnym czynnikiem sprawczym PVLjest proces za
palny w następstwie wewnątrzmacicznej infekcji u matki (zapaleniebłon płodowych- chorioamnionitis), zapalenia naczyń płodu oraz posocznicyu wcześniaka pourodze
niu. Produktybakteryjne przenikajądokrą
żeniapłodu łączącsię zespecyficznymi re
ceptoramibłonowymi, takimi jak CD14 i re
ceptory toll-like(TLR), napowierzchni ko mórekukładu odpornościowego krwi oraz mikrogleju. Zapoczątkowuje to kaskadę zmian wewnątrz komórek prowadzącą do syntezy cytokin prozapalnych (TNF-alfa,IL- 1 ii, IL-6) ichemokin oraz aktywacji czynni ka jądrowego NF-kB. Cytokinyprozapalne wywierają bezpośredni toksyczny wpływ na neurony oraz wrażliwe komórki prekursoro- we oligodendrocytów i prowadzą do astro- gliozy z uwolnieniem tlenku azotu, wolnych rodników tlenowych, neuroprzekażników pobudzających ośrodkowy układnerwowy i zaburzeniemfunkcji mitochondrióworazdo aktywacjikomórek mikrogleju.Rolacytokin jest jednak niejednoznaczna. Wykazano
Rycina1 Schemat badania.
Study schedule.
bowiem, żeniektóre z nich (np. TGFBiIL- 10) mają właściwości przeciwzapalne i mogą działać neuroprotekcyjnie. Wydaje się, że systemowa reakcja zapalna u płodu jest większymczynnikiem ryzyka reakcjiza
palnej w mózgu płodu/noworodka niżcho
rioamnionitis [12, 14].
Zarównouraz niedotlenieniowo-niedo- krwienny jak i stan zapalny uruchamiają mechanizmy prowadzącedośmierci komór
ki. Kluczową role wtym procesie odgrywa jąmitochondria odpowiedzialne m.in. za przemiany energetyczne i homeostazę wap niowąprodukującewolne rodnikiiuwalnia jące białka apoptotyczne. Wtórny uraz po
przedzony jest zaburzeniem oddychania tlenowego, akumulacjąwapnia, uwolnie
niem białek proapoptotycznych (jak cyto- chromu C i czynnikaindukującego apopto- zę).Mediatory te indukująśmierćkomórki za pośrednictwem szlaków zależnychi nie
zależnych odkaspaz [3].
Relacje między hipoksją- ischemiąa
zapaleniem sązłożone. Każde z nich z osob
na i razem uszkadzają mózg. Wcześniak eksponowany wokresie prenatalnym na chorioamnionitis,płodowy vasculitis, wyso kie stężenie cytokin prozapalnych w płynie owodniowym i we krwi płodu ma wysokie ryzyko uszkodzenia istoty białej mózgu, a w konsekwencji wystąpieniemózgowego po
rażeniadziecięcego.
Celem badania była ocena różnicw eks
presji genóww 1. miesiącu życia u dzieci urodzonych przedwcześnie przed 32tygo
dniem ciążyprzy zastosowaniu mikromacie- rzy w odniesieniu do rozwoju leukomalacji okołokomorowej, jednego z odległychpowi kłań wcześniactwa.
Materiał i metody
Badana populacja
Prospektywnym badaniem kohortowym objęto no
worodkiz bardzo małąurodzeniową masąciała hospita
lizowane w okresie od 1.09.2008 do 31. 12.2010roku na OddzialePatologii i Intensywnej TerapiiNoworodka, Kii-
Tabela I
Porównaniewybranych danych demograficznych i klinicznych pomiędzy dziećmibezi zleukomalacją okołokomorową.
Comparison of chosen demographic andclinical data in the PVL group and inthe no-PVL children.
1 - test t-studenta 2 - dokładnytest Fishera 3 - test U Manna-Whitneya PVL - leukomalacja okotokomorow
Tabela II
Lista genów, których ekspresjabyła co najmniej 2 krotnie większa lubco najmniej2 krotnie mniejsza w grupie dzieciz PVL w porównaniu do grupy kontrolnej.
List of up-regulated idown-regulated genes in PVLand non-PVL groups.
nikiChorób Dzieci, Polsko-Amerykańskiego Instytutu PediatriiWydziału Lekarskiego Uniwersytetu Jagielloń
skiegow Krakowie. Dobadaniawłączanebyły dzieci spełniające następujące kryteria:(1) wiek płodowy <32 tygodnia, (2) urodzeniowa masa ciała <1500g. Przyprzy
jęciu doszpitalau każdego zakwalifikowanego doba
dania dziecka zbierany byl szczegółowy wywiad doty czący okresu perinatalnego (masa urodzeniowa, wiek płodowy, stosunekmasy ciała do wieku płodowego, oce
na w skaliApgarpo 1 i 5 minucie)orazdotychczasowe go postępowania wszpitalu rejonowym (okresu stoso
waniawentylacji mechanicznej, leczeniasurfaktantem, tlenoterapii,rozpoznania przy wypisie z oddziału nowo
rodkowego).
Badanie uzyskało zgodę Komisji Bioetycznej Uni wersytetu Jagiellońskiego (KBET/27/B/2007).
Mikromacierze
Celemwykonania badania metodąmikromacierzy odkażdego dziecka pobierano 3próbkikrwi(0, 3 ml) odpowiedniow 5., 14. i 28.dobie życia.
Z pobranych próbekkrwi wyizolowane zostałocał kowite mRNAfAMBIONRiboPure Kit, LifeTechnologies, Carlsbad, USA). W celu weryfikacji jakości uzyskanych próbek ocenionostężenie RNA stosującspektrofotometr NanoDrop (NanoDrop ND-1000; Thermoscientific, Wal
tham,USA) oraz Bioanalyzer 2100 (Agilent, Santa Cla ra, USA). Analiza ekspresji genowejprowadzonabyła przy użyciu mikromacierzy GeneChip®Human Gene 1-OST produkcji Affymetrix (Affymetrix, SantaClara, USA). Mikromacierze te zawierały sondyreprezentują ce około 25000 genówczłowieka (skrining genomu).
Ocenę ekspresji wykonanozgodnie z zaleceniami ipro tokołem producenta (GeneChip Whole Transcriptsen
se TargetLabelingAssay Manual, Version4). Badanie prowadzone było przyużyciu systemu Targeted Geno typingSystem produkcjiAffymetrix.
Potwierdzenia uzyskanychwynikówdokonano z zastosowaniem techniki RT-PCR. W tym celu użyto 30 próbek cDNApozostałych po zakończeniu oznaczeń mi- kromacierzy. W celu weryfikacji 14 losowo wybranych genów użytometody z zastosowaniem oznaczeń Ta- gManGene Expression Assays(Life Technologies, Ap plied Biosystems).
Parametry BezPVL (n=95) PVL (n=16) P
Urodzeniowa masa ciała,g (x±SD) 1044 ±287 942 ±304 0,24' Wiek płodowy (tyg.) (x±SD) 27, 9 ±2, 5 27, 1 ±2, 1 0, 191
Płeć żeńska 46 4 0, 12
Poród drogami natury 37 9 0,32
Ciąża mnoga 21 2 0,382
Sterydyprenatalnie 42 4 0,242
Noworodek za mały do wieku płodowego 9 6 0,012
Skala Apgarw 5min. (Mediana; 25-75percentyl) 6(5-7) 6 (4-7) 0,33
Krwawienie dokomorowe lll-IVsjopnia 12 7 0,022
Wskaźnik pęcherzykowo-wlośniczkowy w momencie
przyjęcia do oddziału intensywnej terapii 0, 32± 0,4 0,23 ± 0, 1 0,381 Tlenoterapia (dni) (Mediana;25-75percentyl) 35 (14-72) 70 (32-75) 0,033
Doba życia
Nazwa skrócona
genu
Gen Zmiana
ekspresji P
Skorygowana wartośćp (poprawka Benjamini-Hochberga)
5
H19
H19, imprintedmaternally expressedtranscript (non-proteincoding)
2.379317 0. 00028 0. 712867
ALAS2 aminolevulinate,delta-, synthase2 2.240488 0.006875 0. 712867
HBB hemoglobin, beta 2.214804 0. 00728 0.712867
EIF1AY eukaryotictranslation initiation
factor 1A, Y-linked 2.098999 0. 196552 0. 762479 TMEM176A transmembrane protein 176A -2.040799 0. 00127 0.712867
HBZ hemoglobin, zeta 2.015423 0. 008616 0.712867
14
EIF1AY eukaryotic translationinitiation
factor 1A, Y-linked 2.862219 0. 072602 0.850778 ALAS2 aminolevulinate,delta-,synthase2 2.830931 0. 000592 0.246217 CA1 carbonic anhydraseI 2.809706 0. 003005 0.491421 GYPA glycophorin A (MNS blood group) 2.777047 0. 002085 0. 43297
SLC4A1
solute carrierfamily 4,anion exchanger, member1 (erythrocyte
membrane proteinband 3, Diego bloodgroup)
2.768947 0.001449 0.393144
AHSP erythroid associated factor 2.664464 0.000474 0.225214 CLIC2 chlorideintracellular channel 2 2. 480826 7.36E-05 0.221903 SELENBP1 selenium binding protein1 2. 455676 0.000508 0. 225214
HBB hemoglobin, beta 2. 439381 0.001907 0.415908
HBM hemoglobin, mu 2.371555 0.000542 0. 236937
EPB42
erythrocyte membrane
protein band4.2 2.341967 0. 000387 0. 221903
IFIT1L
interferon-induced protein with
tetratricopeptide repeats 1B 2.269881 0. 005335 0.596613
FECH ferrochelatase (protoporphyria) 2.25045 0. 000243 0. 221903
GYPB
glycophorin E; glycophorin B
(MNS bloodgroup) 2. 163922 0. 000403 0. 221903
HBZ hemoglobin, zeta 2. 147074 0. 013953 0.789063
TM EM56 transmembrane protein 56 2. 125199 4. 58E-05 0. 221903 RUNDC3A RUN domain containing 3A 2. 087844 0. 000255 0.221903
MYL4
myosin, lightchain 4, alkali;
atrial, embryonic 2.032522 0. 000316 0. 221903
ABCG2
ATP-bindingcassette,sub-family G
(WHITE), member 2 2.037955 8. 97E-05 0.221903
BPGM 2,3-bisphosphoglycerate mutase 2.03081 0.000184 0.221903 SLC25A39 solute carrier family 25, member 39 2.030756 0. 000158 0.221903
28 EIF1AY
eukaryotic translation
initiation factor 1A, Y-linked 2.0399 0. 192429 0.516687
Przegląd Lekarski 2011 /68/ 11 1119
Punktykońcowe
Głównympunktemkońcowym badania było wystę powanieleukomalacji okołokomorowej.
RozpoznaniePVLstawiane było na podstawie wy
niku badaniaUSG mózgu, wykonywanego począwszy od przyjęcia co 7dni aż do ukończenia przezdziecko wieku 8 tygodni. BadanieUSG wykonywał posiadający odpowiednie kwalifikacje licencjonowany ultrasonogra- fista, który nie był informowany o wynikach badań bio
chemicznych i molekularnych.Badanieprowadzono apa
ratemEnVisor firmy Philips z użyciem głowicyprzezna czonej dobadań noworodków (częstotliwość 12MHz).
Badanie obejmowałoocenęmózgu w typowych projek
cjach czołowych i strzałkowych. Badanie umożliwiało rozpoznaniejedynie form jamistych PVL.
Ocena statystyczna
Zmienne jakościowe porównywanozużyciem dwu
stronnego testu Fishera. Zmienne ilości ocenianow za leżności od charakteru ichrozkładu testem t-Studenta lub testemU Manna-Whitneya.
Dane uzyskane w czasie oznaczenia mikromacie- rzy wpierwszejkolejności poddanezostały przygotowa niustosując pakiet statystyczny R/Bioconductoraro- ma.affymetrix[1, 4]. Dane przekształcono (znormalizo wano) stosując metodę RMA (Robust Multiarray Avera
ge) [6]. Ocenę jakości uzyskanych danychprzeprowa dzono stosujączłożonemetody analizy: Relative Log Expression (RLE) oraz Normalized Unsealed Standard Error(NUSE). Wszystkie uzyskane daneprzeszły pozy tywnie test jakości.
Ocenęróżnic w ekspresji genów pomiędzybada
nymigrupamiwykonano stosując moderated t-tests [9]
będący elementem pakietu statystycznego limma[10].
Celem korekcjiuzyskanych wynikówzwiązanej z testo
waniem wielu hipotez w badaniachmikromacierzowych zastosowano proceduręBenjamini-Hochbergaiwyliczo
nowartość spodziewanego odsetka wyników fałszywie dodatnich (FDR - false discovery rate) [2].
Kolejnym krokiem oceny uzyskanych danych było przeprowadzenie analizyścieżek dla danych mikroma cierzowych metodą GSEA(gene set enrichment analy
sis). GSEAjest metodą komputerową, któraocenia czy a priorizdefinowany zbiór genów należących do okre ślonych szlaków/ścieżek biologicznych wykazuje zróż nicowaną ekspresję w badanych grupach.
Metodata umożliwia wykrycie bardziej subtelnych zmian ekspresji,dotyczącychcałej ścieżki [11].W oce
nianejpracy jako predefiniowane grupy genów użyto ze stawów zebranych w encyklopediach: KEGG (Kyoto Encyclopedia ofGenesand Genomes; www.genome.jp/
kegg) oraz baziedanych Gene Ontology (www.geneci- tology.org). Spośród dostępnych ścieżek do testowania zakwalifikowano tylkote, które składały się z conajmniej 15 i nie więcej niż500genów. Różnicę ekspresji prede finiowanych szlaków uznano zaistotną statystycznie, jeżeli wartość FDR była mniejsza niż 10%.
Ostatnimelementemanalizystatystycznej było porównanie wyników ekspresjiuzyskanychmetodą mi- kromacierzy z wynikami ekspresji uzyskanymi metodą RT-PCR. Porównania tego dokonano testem chi kwa drat.
Wyniki
Prospektywnymbadaniemkohortowym objęto120 noworodków. Badanie ukończy
ło 111 spośród 120 włączonych dzieci (ryci
na 1). Badaniem objęto dzieci ze średnią urodzeniową masąciała 1029g (SD: 290) i średnim wiekiem płodowym 27, 8 tyg. (SD:
2, 5). Dużaczęść badanej grupy to dzieci urodzone nagle. Jedynie 46 (41%) matek otrzymały steroidy prenatalnie, 46 (41%) dzieci urodzonych było drogami natury. Aż 105 (95%) noworodków wymagało wenty
lacjimechanicznej lub nieinwazyjnego wspo magania oddechu w ciągu pierwszych 3 dni życia, a 67 dzieci (60%)otrzymałosurfak- tant.
Na podstawie wyników badania USG
Tabela III
Lista szlaków wybranych do analizy metodą GSEA.
Listof selected KEGG and Gene Ontology pathways.
BazaDanych KEGG ABCTRANSPORTERS ANTIGENPROCESSING ANOPRESENTATION
APOPTOSIS ARACHIDONIC AGIO METABOLISM BASAL TRANSCRIPTION FACTORS BASEEXCISIONREPAIR CELL ADHESION MOLECULES CAMS
CELL CYCLE CHEMOKINE SIGNALING PATHWAY COMPLEMENTAND COAGULATION CASCADES CYTOKINE CYTOKINE RECEPTOR INTERACTION
ONA REPLICATION DRUG METABOLISM CYTOCHROME PASO
GLUTATHIONE METABOLISM JAK STAT SIGNALING PATHWAY LEUKOCYTE TRANSENDOTHELIALMIGRATION
MAPK SIGNALINGPATHWAY MISMATCHREPAIR MTOR SIGNALING PATHWAY NEUROTROPHINSIGNALING PATHWAY
OXIDATIVE PHOSPHORYLATION P53 SIGNALINGPATHWAY
RNA DEGRADATION RNAPOLYMERASE TGFBETA SIGNALING PATHWAY
TIGHT JUNCTION TOLL LIKE RECEPTOR SIGNALING PATHWAY
UBIQUITINME0IATED PROTEOLYSIS VEGF SIGNALING PATHWAY
WNT SIGNALINGPATHWAY
BazaDanych GO ACTIVATION OF NFKAPPAS TRANSCRIPTION FACTOR
ACTIVE TRANSMEMBRANE TRANSPORTER ACTIVITY ACUTEINFLAMMATORY RESPONSE
ANGIOGENESIS ANTI APOPTOSIS ANTIOXIDANTACTIVITY APOPTOTIC NUCLEAR CHANGES
APOPTOTIC PROGRAM ATP DEPENDENT DNA HELICASE ACTIVITY
ATP DEPENDENT HELICASE ACTIVITY ATP DEPENDENT RNA HELICASE ACTIVITY CALCIUM ION TRANSMEMBRANETRANSPORTERACTIVITY
CALMODULIN BINDING CELL CELL AOHESION CELL CELL SIGNALING CELL CYCLE ARREST CELL CYCLECHECKPOINT
CELL CYCLE CELL CYCLE PROCESS CELL PROLIFERATION CELL RECOGNITION CELL STRUCTUREDISASSEMBLYDURING APOPTOSIS CELL SURFACE RECEPTOR LINKED SIGNAL TRANSDUCTION
CELLULAR RESPIRATION CELLULAR RESPONSETO STRESS
CHAPERONEBINDING CHEMOKINE ACTIVITY CHROMATIN MODIFICATION CYTOKINE At CHEMOKINE MEDIATEOSIGNALINGPATHWAY
CYTOKINEBINDING DAMAGEO ONA BINDING
ONA BINDING DNA DAMAGE CHECKPOINT DNA DAMAGERESPOt ESIGNAL TRANSDUCTION DNA DAMAGE RESPONSESIGNAL T 4NSDUCTION BY P53 CLASS MEDIATOR ONA DAMAGERESPONSESIGNAL TRANSDI.TION RESULTING IN INDUCTIONOFAPOPTOSIS
DNA FRAGMENTATIONDURING APOPTOSIS OOUBLE STR-'' BREAKREPAIR DOUBLE STR JED DNA BINDING OOUBLESTRANDED RNA BINDING GPROTEINCO’ ZD RECEPTOR ACTIVITY GPROTEINC UPLEO RECEPTOR BINDING G PROTEINCOUPLEDRECEPTORPROTEINSIGNALINGPATHWAY
GENE SILENCING HISTONEMODIFICATION INNATE IMMUNE RESPONSE INTERLEUKIN 1 SECRETION INTERLEUKIN 2 PRODUCTION INTERLEUKIN8 BIOSYNTHETIC PROCESS
INTERLEUKIN BINDING INTERLEUKIN RECEPTOR ACTIVITY
JAK STAT CASCADE MAP KINASEACTIVITY NEGATIVE REGULATIONOF ANGIOGENESIS
NEGATIVEREGULATION OFAPOPTOSIS NEGATIVEREGULATIONOFCELL CYCLE NEGATIVE REGULATIONOFCELL PROLIFERATION NEGATIVE REGULATION OF PROGRAMMED CELLDEATH
NEGATIVE REGULATION OF SIGNALTRANSDUCTION NEGATIVEREGULATION OF TRANSCRIPTION NEGATIVE REGULATION OF TRANSCRIPTION ONA OEPENOENT NEGATIVE REGULATION OF TRANSCRIPTION FACTORACTIVITY
NF KAPPAB 6INOING POSITIVE REGULATIONOF ANGIOGENESIS
POSITIVEREGULATIONOFCELL CYCLE POSITIVEREGULATION OFCYTOKINE PRODUCTION
POSITIVEREGULATIONOF CYTOKINE SECRETION POSITIVE REGULATION OFI KAPPAB KINASENF KAPPAB CASCADE
POSITIVE REGULATIONOF SIGNALTRANSOUCTION POSITIVE REGULATIONOFTRANSCRIPTION
PROTEIN POLYUBIOUITINATION REGULATIONOF ANGIOGENESIS
REGULATIONOF APOPTOSIS REGULATION OF CELL CYCLE REGULATIONOFCELL DIFFERENTIATION
REGULATIONOFCELL PROLIFERATION REGULATIONOF CYCLIN OEPENOENT PROTEINKINASE ACTIVITY REGULATION OF GPROTEIN COUPLEDRECEPTORPROTEINSIGNALING ATHWY
REGULATION OF GENE EXPRESSION REGULATIONOF GENE EXPRESSION EPIGENETIC REGULATION OFGENE SPECIFIC TRANSCRIPTION REGULATIONOFIKAPPAB KINASENF KAPPABCASCADE
REGULATIONOF JAKSTAT CASCAOE REGULATIONOF MAP KINASE ACTIVITY REGULATIONOF PROGRAMMEDCELL 0ЕАТН
REGULATIONOF SIGNALTRANSDUCTION REGULATIONOFTRANSCRIPTION REGULATIONOFTRANSCRIPTION FACTORACTIVITY REGULATION OF TRANSFORMING GROWTH FACTOR BETA RECEPTOR SIGNALING PATHWY
RESPONSETO DNA DAMAGESTIMULUS RESPONSETOHYPOXIA RESPONSE TO OXIDATIVE STRESS
SIGNALTRANSDUCTION TRANSCRIPTION TRANSCRIPTION INITIATION
UBIQUITINBINDING UBIQUITINCYCLE
TabelaIV
Wyniki analizy ekspresji metodąGSEA.
Gene set enrichment analysis.
GO -GeneOntology; FDR- FalseDiscoveryRate 5
—
Odpowiedźnastres oksydacyjny (Response to oxydative stress;
GOnumber:0006979)
r
0.004175 3.7%
5 Zmiany w jądrze komórkowym wiodące do apoptozy
(Apoptotic nuclear change; GO number: 0030262). 0.00616 9. 1%
14 Szlak hamującyaktywacjęczynników transkrypcyjnych (Negative
<0.001 6.6%
regulation of transcription factor activity; GOnumber:0043433).
mózgu (wykonywanych co 7 dni) u 16 (14%) dzieci rozpoznano PVL.
Porównanie wybranych danych demo
graficznych iklinicznych pomiędzy grupami dzieci bezi z PVL przedstawionow tabeli I.
Niestwierdzono istotnych różnic co do uro- dzeniowej masyciała, wieku płodowego i płci. Stwierdzono natomiast, żew grupie dzieciz PVLodsetek noworodków za ma łych w stosunku do wiekupłodowego był istotnie większy niż w grupie kontrolnej.
Również liczba dzieci ze stwierdzonym krwawieniem śródczaszkowym (III i IV stop nia) była większa w grupie dzieci z PVL.
Conajmniej 2-krotnąróżnicęwekspre sjistwierdzono w 5. dobie życia w przypad ku 6genów, w 14. dobie życia wprzypadku 21 genów,a w 28. dobieżycia w przypadku 1genu (tabela II). Różnicęwekspresji za
wierającą się w przedziale od 1, 5 do 2, 0 stwierdzono odpowiednio w przypadku 39, 66oraz 30 genów. Jednakże po zastoso waniu korekcji na testowanie wielu hipotez (poprawki Benjamini-Hochberga),wszystkie obserwowaneróżnicenie wykazywały istot nościstatystycznej.
Stosując metodę GSEA niestwierdzo no, aby którykolwiek ze szlaków zawartych w bazachKEGGoraz Gene Ontology wy kazywał istotnie zmniejszonąlub zwiększo ną ekspresjęwgrupiedziecizPVL, zarów
no w5., jak i 14.,i 28. dobie życia.
Przeprowadzono zatemdodatkowąana- lizę, ograniczającliczbę poddanychocenie szlaków jedynie do co do których istnieją na podstawiepiśmiennictwa podejrzenia, że mogąbyćwłączone w patofizjologię odle głych następstwwcześniactwa(tabela III).
Napodstawietejanalizy stwierdzono,że w 5. dobie życia dzieci,u których rozpozna
no PVL charakteryzowały się zwiększoną ekspresją genów należącychdo szlaku od
powiedzina stres oksydacyjny(Response tooxydative stress; GOnumber: 0006979) oraz szlakuzmian w jądrze komórkowym wiodących do apoptozy (Apoptotic nuclear change; GOnumber. 0030262). W14. do
bie życia jedynym szlakiem o zwiększonej aktywności udzieci z PVL okazałsię szlak hamującyaktywacjęczynników transkryp cyjnych (Negativeregulation oftranscription factor activity; GO number: 0043433). \N 28 dobieżycia, aktywnośćżadnego zeszlaków nie była zwiększonalubzmniejszonau dzie
cizPVL. Podsumowanie powyższychana
liz zawarto w tabeli IV.
Oceniając wiarygodność uzyskanych danych mikromacierzowych, wynikiporów
nano z analizą metodąRT-PCR,nie stwier
dzając istotnych różnic pomiędzy obiema metodami (p=0, 073).
Dyskusja
Postęp w opiece medycznejnad dzieć mi urodzonymi przedwcześniezobowiązuje do analizyprzyczyni patomechanizmu od
ległychnastępstwwcześniactwa, do których należądysplazja oskrzelowo-płucna, retino- patia oraz leukomalacja. Podjęto próbęwy łonienia grupgenów odpowiedzialnych za wystąpienietego powikłania. Wykorzystano w tym celu metodę mikromacierzy (microar- ray), którejwprowadzeniedo praktykiklinicz nej było niezwykleistotnymwydarzeniem warunkującym postęp genetyki. Typowymi zastosowaniami microarray są: porównania ekspresji wielu genów w chorobachkomplek sowych, ocena profilów ekspresjigenów w zależności od fazychoroby, jednoczasowa ocena wariantówpolimorficznych wielu ge
nów. Microarray opiera się na syntezie in- situkrótkichsekwencji nukleotydów (oligo- nukleotydów)na miniaturowej szklanej płyt ce(chip).Na płytce GeneChip badany gen lub badana potencjalnie ulegająca ekspresji sekwencja reprezentowana jest przez 11- 20 unikatowycholigomerów, akażdy znich zawiera 25 parzasad.Największą zaletą tej metodyjest ocena ekspresji bardzo dużej liczby czynnikówgenetycznych (a z użyciem odpowiedniego oprogramowania ocena eks presji praktycznie wszystkichgenów człowie
ka) wpróbce krwio bardzomałej objętości, cojest szczególnieistotne u wcześniaków.
Jak dotej pory nie ma wielu doniesień na tematzastosowania tej metody do anali
zy zmian patofizjologicznych w przebiegu procesuprowadzącego do uszkodzeniaisto ty białej niedojrzałego mózgu.
Hipoteza mówiącao tym,że u podłoża zmianleukomalacyjnych może leżećsyste mowa odpowiedź zapalna płodu i uwolnie
nie cytokin, jest wciąż przedmiotem badań [8, 12, 14].Zwiększona w 5.dobie ekspresja genów należących do szlaku odpowiedzi na stresoksydacyjny ubadanych noworodków zPVL mogłaby o tym świadczyć. Jednak brakinformacji natemat chorioamnionitis u matki niepozwala na sformułowaniejedno znacznych wniosków. Ponadto pierwsze próbkikrwi były pobieranew 5. dobie życia, tak więc współistnienieinfekcji u noworodka utrudniało interpretację otrzymanych wyni ków.
W tym samym punkcie czasowym wy kazano takżezwiększoną ekspresjęszlaku zmian prowadzących do apoptozy, która odgrywa istotną rolęw uszkodzeniu około- komorowejistoty białej. Natomiast w ^.do
bie jedynym szlakiem, który wykazywał zwiększoną aktywność u noworodków z PVL, okazałsięszlak hamujący aktywację
czynników transkrypcyjnych.
Należy jednakpodkreślić, że leukoma- lację stwierdzono u 16dzieci, natomiastgru pa bez PVL była znacznie liczniejsza (95 dzieci) i dlatego interpretacjawyników była utrudniona. W analizie wykorzystano prze- ciemączkowe badanie ultrasonograficzne mózgu, na podstawie którego stawianoroz poznanie PVL. Jestto jedyniemetoda prze
siewowaidlategow diagnostyce wziętopod uwagę tylko formy jamiste leukomalacji.
Dotychczasowe własne doświadczenia z zastosowaniem mikromacierzy do oceny ekspresji genów u wcześniaków obejmowa ły dzieciz dysplazjąoskrzelowo-płucnąire- tinopatią. W grupie 27 dzieci z dysplazją stwierdzono istotną różnicew ekspresji 251 genów w porównaniu do 25 noworodków z grupy kontrolnej. Różnice te manifestowa ły się najwyraźniej w 5. dobie życia,aczęść z genów była zaangażowana w szlak me tabolizmu lipidów. Natomiast w przypadku 20dzieci z retinopatią w porównaniu z ko hortą 32dzieci bezstwierdzonej retinopatii wykazano istotnąróżnicę wekspresji 752 ge
nów, zwłaszcza w 14.dobie życia (529 ge
nów). Analiza ontologiitychgenów wykaza ła, że sąone zaangażowane w procesy wzro
stu komórek orazich metabolizmu [8].
Z kolei autorzyjapońscy [7] wykorzy
stali technikęmikromacierzy doanalizy eks presji mRNAw krwi pępowinowej. Ekspre sję genów porównaliu trzech noworodków z jamistą postacią PVL zdiagnozowaną na podstawie badania ultrasonograficznego i MRI oraz pięciu z grupy kontrolnej. Wyka
zali zwiększonąekspresję 15 genów, z któ
rych5 było białkami rybosomalnymi.Z ko lei 4 były potencjalnie związane z odpowie- dziąimmunologicznąi reakcjązapalną ale ichrola niejest do dzisiaj jasna. Natomiast 3 spośród7 genów o zmniejszonejekspre sji były także powiązane z reakcjązapalną.
I stąd poszukiwanie mechanizmów prowa dzących do uszkodzenia istoty białej wciąż są uzasadnione, a nowetechniki genetycz nestwarzają noweperspektywy. Wykrycie zmian w ekspresji poszczególnych genów pomaga wytypować potencjalne cele do profilaktyki czy terapii.
Więcej doniesień dotyczy polimorfi- zmówcytokin zaangażowanych wprocesy patologiczne, alejedynie pojedynczych czynników[5].
Mikromacierze mająwielezastosowań.
Są jedną z najbardziej zaawansowanych metodbadania ekspresji genów. Mogąone służyć do analiz poszczególnychszlaków metabolicznych a także szlaków przekazy wania sygnałóww komórce. Na poziomie molekularnym pozwalają na wykrywanie różnic w funkcjonowaniu tkanek inarządów isą wydajnymoraz szybkim narzędziem analizy zmian ekspresji tysięcy genów jed nocześnie.
Wnioski
W przeprowadzonym badaniu nie stwierdzono w pierwszymmiesiącu życia istotnych różnicwekspresji genów pomię dzy grupądziecizleukomalacją okołoko- morowąoraz bezniej.
Piśmiennictwo
1.Bengtsson H., WirapatiP., Speed T. P.:A single-
Przegląd Lekarski 2011 /68/11 1121
arraypreprocessing method for estimatingfull-reso- lution raw copy numbers from all Affymetrix genotyping arrays includingGenomeWideSNP5 &
6. Bioinformatics 2009, 25, 2149.
2. BenjaminiY.,Hochberg Y.: Controllingthe falsedis
covery rate: apractical and powerful approach to multiple testing. J.R. Stat. Soc.B. 1995, 57, 289.
3. Bueter W., Dammann 0., Leviton A.: Endoplasmic reticulum stress,inflammation, andperinatal brain damage. Pediatr.Res. 2009, 66, 487.
4. Gentleman R. C., CareyV. J.,BatesD. M. et al.:
Bioconductor: open software development for com putational biology and bioinformatics. Genome Biol 2004, 5, R80.
5. Harding D.R., Dhamrait S., Whitelaw A. etal.: Does interleukin-6genotype influence cerebral injuryor developmental progress afterpreterm birth.
Pediatrics2004,114, 941.
6. Irizarry R. A., HobbsB., Collin F. et al.: Exploration, normalization,and summariesof highdensityoligo-
nudeotidearray probe level data. Biostatistics 2003, 4, 249.
7. Okumura A., YamamotoT., Kidokoro H. et al.:Al teredgeneexpression in umbilical cord mononuclear cells in preterm infants with periventricular leukomalacia. Early Hym.Dev. 2010, 86, 665.
8. Pietrzyk J.J., Kwinta P., Bik-MultanowskiM.i wsp.:
Zastosowanie mikromacierzy dooceny ekspresji genów u wcześniaków -nowa strategia poszukiwania genetycznego podłoża odległych powikłań wcześniactwa - badaniawstępne. Przegl.Lek.2011, 68, 44.
9. SmythG. K.: Linear modelsand empiricalbayes methods for assessingdifferentialexpression in microarray experiments. Stat.Appl.Genet. Mol. Biol.
2004, 3,Article3.
10. Smyth G.K.: Limma:Linear Modelsfor Microarray Data. In: Gentelman R., Carey V., Dudoit S. et al.
(eds) Bioinformatics andComputional Biology Solu tions using R and Bioconductor. Springer, New York
2005.
11. Subramanian A.,Tamayo P.,Mootha V. K.et al.:
Gene set enrichment analysis:a knowledge-based approachforinterpretinggenome-wideexpression profiles Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1995, 102, 15545.
12. Thomas W., Speer C. P.:Chorioamnionitis:impor
tant riskfactoror innocentbystanderfor neonatal outcome? Neonatology 2011,99, 177.
13. Volpe J. J.: Neurobiology of periventricular leukomalaciainthe premature infant. Pediatr.Res.
2001, 50, 553.
14. Volpe J. J.:Postnatalsepsis, necrotizing enterocolits, and the critical roleof systemicinflammation in white matter injury in premature infants. J. Pediatr. 2008, 153,160.
