o wielkości 1–1000 mikrometrów (a wg niektórych autorów do 500 μm), w których substancja lecznicza jest inkorporowana (rozpuszczona lub zawieszona) w polimerowej matrycy (rycina 1) [2].
Niewątpliwą zaletą mikrosfer jest zdolność do przenoszenia różnorodnych, często nietrwałych sub‑
stancji, takich jak białka czy kwasy nukleinowe oraz, ze względu na małe rozmiary, możliwość podawania drogą parenteralną bez konieczności chirurgicznego usuwania po uwolnieniu leku. Pierwotnie mikrosfery były przeznaczone do podania pozajelitowego. Obec‑
nie, z uwagi na rosnące zainteresowanie, mają także zastosowanie w doustnych, dopoliczkowych czy do‑
nosowych postaciach leku. Mimo licznych zalet, takich jak biozgodność, wysoka biodostępność, czy przedłu‑
żony profil uwalniania substancji leczniczej, ich wadą jest nietrwałość. Dlatego, aby zapobiec zbyt szybkiej ucieczce substancji leczniczej z matrycy polimeru, przechowuje się je w postaci liofilizowanej [2, 3].
K
ontrolowane uwalnianie substancji leczniczej po‑lega na stopniowym uwalnianiu kolejnych por‑
cji leku w określonym czasie (dni, tygodni, a nawet miesięcy). Postacie leku o kontrolowanym uwalnia‑
niu przewyższają pod wieloma względami tradycyj‑
ne postacie leku. Z jednej strony chronią i stabilizują substancję leczniczą przed zbyt szybką inaktywa‑
cją in vivo, z drugiej – umożliwiają jej dostarczanie w kontrolowanych ilościach, co zapewnia utrzymanie optymalnego poziomu terapeutycznego. Dodatkowo, redukując potrzebę wielokrotnego dawkowania, po‑
prawiają komfort pacjenta i współpracę z lekarzem (tzw. compliance) [1].
Jedną z postaci leku o kontrolowanym uwalnia‑
niu substancji leczniczej są mikrosfery – cząstki Microspheres – novel carriers for controlled release drug delivery · Controlled release drug delivery is being developed to overcome many difficulties associated with conventional drug carriers such as: poor stability of therapeutics, frequent dosing, or ineffective patient compliance. Polymer microspheres represent excellent examples of controlled release drug delivery systems due to the ability to encapsulate different kinds of drugs, including DNA and proteins, high biocompatibility, bioavailability and sustained release profile. The release process from microspheres which may occur as drug diffusion from the polymer or degradation by erosion of the polymer matrix, mainly depends on the type of polymer and the method of preparation. This paper describes the properties of natural and synthetic polymers used as microspheres matrices and reviews the methods of production of microspheres. Furthermore, several commercial products based on polymeric microspheres available in Poland are described.
Keywords: Microspheres – novel carriers for controlled release drug delivery
© Farm Pol, 2009, 65(5): 378-386
Mikrosfery – nowoczesna postać leku do oczu o kontrolowanym uwalnianiu
Emilia Szymańska, Katarzyna Winnicka
Zakład Farmacji Stosowanej Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku
Adres do korespondencji: Katarzyna Winnicka, Zakład Farmacji Stosowanej Uniwersytetu Medycznego, ul. Mickiewicza 2c, 15‑222 Bialystok, tel. 085 748 56 15, faks 085 748 56 16, e‑mail: kwin@umwb.edu.pl
Rycina 1. Mikrosfery wykonane z kopolimeru kwasu mlekowego i glikolowego [3].
T e c h n o l o g i a p o s Ta c i l e k u
polimery wykorzystywane do otrzymywania mikrosfer
Rodzaj polimeru odgrywa istotną rolę w uzyskaniu odpowiedniego profilu uwalniania substancji leczni‑
czej. Mikrosfery są zbudowane z naturalnych lub syn‑
tetycznych polimerów, których modyfikacje chemiczne umożliwiają odpowiednio przyspieszenie lub opóźnie‑
nie uwalniania. Polimery wykorzystywane w produk‑
cji mikrosfer muszą spełniać określone wymagania.
Muszą być nietoksyczne, biodegradowalne, nie mogą działać kancerogennie, indukować odpowiedzi immu‑
nologicznej ani alergicznej, a produkty ich metaboli‑
zmu nie powinny kumulować się w organizmie. Proces degradacji matrycy polimeru może mieć charakter chemiczny (kiedy dochodzi do hydrolizy polimeru na oligo‑ i monomery) lub fizyczny (oparty na penetracji płynów i erozji matrycy). W produkcji mikrosfer możli‑
we jest także zastosowanie rozpuszczalnych w wodzie polimerów niebiodegradowalnych, pod warunkiem, że ich masa cząsteczkowa nie przekracza 69 000 Da (masy cząsteczki ludzkiej albuminy) [3,4,5].
Ze względu na pochodzenie, polimery wykorzy‑
stywane w produkcji mikrosfer można podzielić na naturalne (białkowe i węglowodanowe) i syntetycz‑
ne – niebiodegradowalne i ulegające biodegradacji (tabela 1).
Biorąc pod uwagę mechanizm degradacji fizycz‑
nej matrycy, polimery można również podzielić na ulegające erozji powierzchniowej (surface erosion) lub całkowitej (bulk erosion) [1]. Erozja powierzchnio‑
wa zachodzi, gdy przenikanie płynów ustrojowych do wnętrza matrycy przebiega wolniej niż degrada‑
cja hydrolityczna polimeru na granicy kontaktu ma‑
tryca/woda. Substancja czynna ulega uwolnieniu z powierzchni mikrosfery zgodnie z kinetyką zero‑
wego rzędu. Przykładem tak degradującego poli‑
meru są polibezwodniki [1, 5]. Do erozji całkowitej (jak w przypadku kopolimerów α‑hydroksykwasów) dochodzi, gdy cząsteczki wody przenikają do wnę‑
trza szybciej niż zachodzący proces erozji. W efek‑
cie uzyskuje się dwu‑, a niekiedy trójfazowy profil uwalniania, przy czym pierwsza faza (burst effect) charakteryzuje się niepożądanym, gwałtownym wy‑
rzutem substancji czynnej (sięgającym nawet 50%
dawki) [1].
W ostatnich latach uwaga naukowców skupiła się na wykorzystaniu naturalnych polimerów, których głównymi zaletami są niskie ceny, zgodność z róż‑
nymi grupami leków oraz minimalne zużycie roz‑
puszczalników organicznych podczas otrzymywania mikrosfer [6].
Polimery naturalne
Spośród naturalnych polimerów pochodze‑
nia białkowego wykorzystuje się albuminy [7], ko‑
lagen [8], żelatynę [3,9], a spośród pochodzenia
węglowodanowego – chitozan [9, 10], kwas hialuro‑
nowy [11] i alginiany [12].
Albuminy to nietoksyczne i nieimmunogenne biał‑
ka. Z uwagi na dostępność surowca oraz łatwość kontrolowania właściwości fizykochemicznych [7] są powszechnie wykorzystywane do otrzymywania mi‑
krosfer. Mikrosfery albuminowe o średnicy w zakresie 1–200 μm, charakteryzują się dwuetapową kinetyką uwalniania z początkowym, gwałtownym wyrzutem substancji czynnej [13]. Postacie leku z albuminą, dzię‑
ki zdolności kumulowania się w zmienionym choro‑
bowo stawie, mają zastosowanie w leczeniu stanów zapalnych. Do otrzymywania mikrosfer wykorzy‑
stywane są albuminy ludzkie lub wołowe, zwykle w połączeniach z innym polimerem w celu dodat‑
kowego zabezpieczenia przed ucieczką substancji czynnej [7].
Kolagen, składnik tkanki łącznej, który w organi‑
zmie uczestniczy w procesach koagulacji oraz goje‑
nia się ran [14], należy do grupy protein fibrylarnych, nierozpuszczalnych w wodzie i ulegających biodegra‑
dacji pod wpływem kolagenaz. Wykazano, że mikros‑
fery kolagenowe są dobrym nośnikiem dla białek [8].
Wadą kolagenu jest jednak mała wytrzymałość me‑
chaniczna oraz niewystarczająca stabilność struktu‑
ry mikrosfer, w czego wyniku może dochodzić do zbyt szybkiej ucieczki substancji czynnej z matrycy.
Typ polimeru Przykład
Naturalne polimery pochodzenia białkowego albumina
żelatyna kolagen pochodzenia
węglowodanowego
chitozan alginiany kwas hialuronowy
Półsyntetyczne i syntetyczne polimery Biodegradowalne poliestry polimery kwasu mlekowego (PLA)
polimery kwasu glikolowego (PGA)
kopolimery kwasu mlekowego i glikolowego (PLGA) polimery kwasu ε‑kapronowego (PCL)
polibezwodniki polimery kwasu sebacynowego, adypinowego, dodekanodienowego oraz ich kopolimery
polifosfoestry polifosforany polifosfoniany polifosforyny polifosfazeny polilizynofosfazen pochodne celulozy hydroksyetyloceluloza
karmeloza sodowa
poliamidy poliaminokwasy
Niebiodegradowalne pochodne celulozy etyloceluloza
octanoftalan celulozy acetylobursztynian celulozy polimery akrylowe poliakrylany
polimetakrylany (Eudragit)
Tabela 1. Polimery wykorzystywane do otrzymywania mikrosfer
zyskiwania, możemy podzielić na typ A – otrzymywany z kolagenu skóry wie‑
przowej oraz typ B – z kości zwierząt.
Materiał ten z uwagi na właściwości mukoadhezyjne jest wykorzystywany głównie do otoczkowania mikrosfer [9].
Wykazano, że podobnie jak chitozan, żelatyna w znacznym stopniu reduku‑
je gwałtowny wyrzut leku w pierwszej fazie uwalniania z mikrosfer poli‑ε‑
kaprolaktonowych. Właściwości im‑
munogenne żelatyny (podobnie jak innych polimerów białkowych) na ogół ograniczają jej wykorzystanie w mi‑
krosferach pozajelitowych [15].
Chitozan, otrzymywany poprzez deacetylację chityny różnych gatun‑
ków skorupiaków, jest drugim po celu‑
lozie najbardziej rozpowszechnionym polimerem węglowodanowym [9, 10].
Ten kationowy kopolimer jest zbu‑
dowany z połączonych wiązaniem β‑1,4‑glikozydowym reszt glukozami‑
ny i N‑acetylo‑glukozaminy. Z uwagi na korzystne właściwości mukoadhezyjne, pozwalające wydłużyć czas kontaktu substancji leczniczej z błoną śluzową, stanowi obiecujący materiał do syntezy mikrosfer doustnych, do oka czy dopoliczkowych [16]. Ponad‑
to, dzięki zdolnościom otwierania połączeń desmo‑
somalnych między komórkami, chitozan poprawia transport substancji czynnych przez błony biologicz‑
ne [17]. Tworzenie mikrosfer chitozanowych jest moż‑
liwe dzięki zdolności polimeru do formawania żelu w pH >6,5. Przez odpowiedni dobór stopnia deacety‑
lacji chitozanu oraz jego masy cząsteczkowej można wpływać na wielkość mikrosfer oraz czas uwalniania.
Dodatkowymi zaletami polimeru są nietoksyczność, biozgodność i nieimmunogenność [10].
Alginian to rozpuszczalny w wodzie polimer po‑
zyskiwany z brunatnych alg, który zbudowany jest z połączonych wiązaniem β‑1,4‑glikozydowym reszt kwasu α‑L‑guluronowego i β‑D‑mannuronowego.
Alginian występuje w postaci soli magnezowych, barowych lub sodowych. Układ reszt kwasowych w polimerze oraz jego masa cząsteczkowa wa‑
runkują właściwości fizyczne alginianów. Synteza mikrosfer alginianowych jest prosta, stosunkowo szybka i nie wymaga zastosowania agresywnych warunków, co umożliwia zamknięcie w matrycy substancji nietrwałych, jak białka czy kwasy nukle‑
inowe [17]. Zaletami alginianu są nietoksyczność, silne właściwości mukoadhezyjne oraz biozgod‑
ność. Wadami natomiast – niestabilna struktu‑
ra oraz porowatość uzyskanych mikrosfer, czego skutkiem są duże straty substancji leczniczej. Po‑
dejmuje się liczne próby modyfikacji chemicznej
cuchów akrylowych uzyskano zwiększenie hydro‑
fobowości i poprawę wytrzymałości polimeru [12], a kompleksowanie z przeciwnie naładowanym elek‑
trolitem (np. chitozanem) zmniejszyło straty sub‑
stancji czynnej [17].
Kwas hialuronowy – glikozoaminoglikan stano‑
wiący składnik macierzy międzykomórkowej, pełni ważną rolę w procesie gojenia ran. Szybka degradacja polimeru ogranicza jego zastosowanie w postaciach leku o przedłużonym uwalnianiu. Można jednak temu zapobiec przez modyfikację chemiczną cząsteczki hialuronianu [13] lub połączenie z innym polimerem i tworzenie mikrosfer dwuwarstwowych [11].
Polimery naturalne, ze względu na łatwość pozy‑
skiwania i modyfikacji chemicznych poprawiających właściwości fizykochemiczne, biodegradowalność oraz stosunkowo niskie koszty uzyskania, cieszą się dużym zainteresowaniem w technologii otrzymywa‑
nia mikrosfer [7]. Poważny problem stanowi jednak oczyszczanie oraz trudności w sterylizacji wykona‑
nych mikrosfer, co kwestionuje ich zastosowanie pa‑
renteralne.
Polimery syntetyczne
Syntetyczne polimery biodegradowalne charakte‑
ryzują się wysokim stopniem czystości oraz – w po‑
równaniu z polimerami naturalnymi – łatwiejszym procesem otrzymywania mikrosfer [7,18].
Poliestry to grupa polimerów, do której zalicza się estry kwasu ε‑kaprolaktonowego (PCL), mlekowe‑
go (PLA), glikolowego (PGA) oraz ich kopolimery (np.
kopolimer kwasu mlekowego i glikolowego – PLGA).
Dzięki dobrym właściwościom mukoadhezyjnym, bio‑
zgodności i biodegradowalności [1, 15, 18], należą do najlepiej poznanych i – mimo wysokich kosztów – najbardziej rozpowszechnionych polimerów wyko‑
rzystywanych do produkcji mikrosfer. W środowisku wodnym na skutek hydrolizy poliestry rozpadają się do nietoksycznych α‑hydroksykwasów, ulegających dalszym przemianom w cyklu kwasu cytrynowego do CO2 i H2O. Wadą tych polimerów, na skutek erozji objętościowej matrycy, jest dwu‑, a niekiedy nawet trójfazowa kinetyka uwalniania substancji czynnej.
Stopień degradacji można kontrolować przez zmianę proporcji poszczególnych monomerów w kopolimerze (PLA:PGA), modyfikację masy cząsteczkowej lub ste‑
reochemię [5]. Z uwagi na hydrofobową powierzchnię, mikrosfery poliestrowe są szybko wychwytywane przez układ siateczkowo‑śródbłonkowy, co skra‑
ca czas przebywania substancji czynnej w układzie krążenia [19]. W porównaniu z PLA, PGA czy PLGA, mikrosfery z kwasu poli‑ε‑kaprolaktonowego charak‑
teryzują się wolniejszym procesem degradacji [20].
Polibezwodniki to biozgodne polimery hydro‑
fobowe, wrażliwe na działanie wody. Stosunko‑
wo szybko ulegają biodegradacji na drodze erozji Niewątpliwą zaletą
mikrosfer jest zdolność do przenoszenia różnorodnych, często nietrwałych substancji, takich jak białka czy kwasy nukleinowe oraz, ze względu na małe rozmiary, możliwość podawania drogą parenteralną bez konieczności chirurgicznego usuwania po uwolnieniu leku. Pierwotnie mikrosfery były przeznaczone do podania pozajelitowego.
Obecnie, z uwagi na rosnące zainteresowanie, mają także zastosowanie w doustnych, dopoliczkowych czy donosowych postaciach leku.
T e c h n o l o g i a p o s Ta c i l e k u
Syntetyczne polimery biodegradowalne
charakteryzują się wysokim stopniem czystości oraz – w porównaniu z polimerami naturalnymi – łatwiejszym procesem otrzymywania mikrosfer.
powierzchniowej, zapewniającej korzystną kinety‑
kę uwalniania substancji leczniczej [21]. Odpowiedni dobór rodzaju i ilościowego stosunku monomerów alifatycznych (np. reszty kwasu sebacynowego, adypi‑
nowego, dodekanodienowego), ulegających szybsze‑
mu rozpadowi do degradujących wolniej monomerów aromatycznych (np. karboksyfenoksypropanu), po‑
zwala wydłużyć czas rozpadu mikrosfery do tygodni, a nawet miesięcy [5]. Rozmieszczenie leku w obrębie mikrosfery jest uwarunkowane hydrofobowością sub‑
stancji leczniczych: rozpuszczalne w wodzie umiejsca‑
wiają się na powierzchni, natomiast nierozpuszczalne są inkorporowane do wnętrza matrycy [21].
Polifosfazeny są zbudowane z monomerów, w których do centralnie umieszczonego połączenia azotu z fosforem przyłączone są boczne łańcuchy reszt aminokwasów i ich pochodnych. Są biozgodne i biodegradowalne, wykorzystywane głównie jako no‑
śniki białek (np. insuliny) i substancji o małej masie cząsteczkowej [22].
Polifosfoestry, wśród których wyróżnia się poli‑
fosforany, polifosfoniany i polifosforyny, należą do polimerów, których szkielet monomeru składa się es‑
trowego połączenia kwasu fosforowego (V) z wbudo‑
wanymi podstawnikami. Z uwagi na podobieństwo w budowie do kwasów nukleinowych oraz rozpad w organizmie do nietoksycznych metabolitów na sku‑
tek hydrolizy wiązania estrowego, polimery te cechu‑
je biozgodność i biodegradowalność. Polifosfoestry hydrofilowe znajdują potencjalne zastosowanie w te‑
rapii genowej, natomiast hydrofobowe mogą być wy‑
korzystywane jako nośniki dla małocząsteczkowych leków czy białek. W ostatnich latach w badaniach przedklinicznych i klinicznych wykazano skuteczność przeciwnowotworową mikrosfer polilaktydoetylofos‑
fonianowych z paklitakselem (preparat Paclimer®), co daje nadzieję na nieobciążoną działaniami niepożąda‑
nymi terapię nowotworów płuc i jajnika [23].
Poliaminokwasy (polimery lizyny, alaniny czy kwa‑
su asparaginowego) należą do związków biozgodnych, odznaczających się korzystnymi właściwościami adhe‑
zyjnymi. Są wykorzystywane w badaniach jako nośniki substancji drobnocząsteczkowych i protein. Wyka‑
zano, że modyfikacja powierzchni poliestrów przez przyłączenie poliaminokwasów zwiększa właściwości hydrofilowe mikrosfer, zapobiegając tym samym zbyt szybkiemu wychwytowi przez układ siateczkowo‑
‑śródbłonkowy [24]. Właściwości antygenowe oraz słabe możliwości kontroli uwalniania substancji czyn‑
nej ograniczają jednak wykorzystanie tych polimerów w produkcji mikrosfer [15].
Różnorodne pochodne celulozy to polimery ła‑
two dostępne, nietoksyczne powszechnie wyko‑
rzystywane w preparatyce farmaceutycznej. Mają zastosowanie przede wszystkim, w połączeniach z in‑
nymi polimerami, do otrzymywania mikrosfer doust‑
nych. Biodegradowalne półsyntetyczne pochodne
o charakterze hydrofilowym, takie jak hypromeloza czy karmeloza sodowa poprawiają biodostępność doustnych leków o charakterze lipofilowym, a dzię‑
ki zdolności formowania lepkiego żelu w kontakcie z wodą, spowalniają dyfuzję i zabezpieczają przed zbyt szybką ucieczką substancji leczniczej z matrycy [25]. Ze względu na korzystne właściwości mukoadhe‑
zyjne, mogą być także wykorzystane do otrzymywa‑
nia mikrosfer przeznaczonych do nosa i oka. Z uwagi na powolne pęcznienie w płynie łzowym, mogą jed‑
nak powodować zaczopowanie kanalików łzowych [26]. Hydrofobowe, nierozpuszczalne i nieulegające biodegradacji pochodne celulozy, jak etyloceluloza, nadają się natomiast do uzyskiwania mikrosfer flota‑
cyjnych, które mogą być wykorzystane do eradykacji Helicobacter pylori [27]. Rozpuszczalne w środowi‑
sku zasadowym pochodne celulozy (octanoftalan czy acetylobursztynian celulozy) chronią przed zbyt szybkim uwalnianiem substancji czynnej w żołądku, umożliwiając tym samym uzyskanie mikrosfer doje‑
litowych [28].
Wśród syntetycznych polimerów niebiodegrado‑
walnych na uwagę zasługują również pochodne kwa‑
su akrylowego. Polimery akrylowe to nietoksyczne polimery ulegające żelowaniu pod wpływem zobo‑
jętniania. Są wykorzystywane głównie do otrzymy‑
wania doustnych mikrosfer mukoadhezyjnych [29].
Ich zastosowanie niesie jednak ze sobą ryzyko ku‑
mulacji w organizmie [30]. Najogólniej polimery te można podzielić na rozpuszczalne w środowisku kwa‑
śnym (kopolimery kwasu metakrylowego – Eudragit E) lub w środowisku zasadowym (poliestry kwasu metakrylowego – Eudragit L i S). Powlekanie Eudra‑
gitem LS (kopolimer kwasu metakrylowego i meta‑
krylanu metylu) zostało wykorzystane do ochrony zamkniętego w chitozanowych mikrosferach białka przed działaniem soku żołądkowego [31]. W celu po‑
dania acyklowiru na gałkę oczną wykorzystano nato‑
miast sferyczne mikrosfery eudragitowe, zawierające czwartorzędowe grupy amoniowe [32].
Metody otrzymywania mikrosfer
O wyborze metody otrzymywania decyduje przede wszystkim przeznaczenie i wielkość mikrosfer, które chcemy uzyskać oraz właściwości fizykochemiczne zamykanej substancji leczniczej [1, 18].
Mikrosfery są oddzielane z mieszaniny reakcyjnej poprzez dekantację, filtra‑
cję lub wirowanie, a następnie prze‑
mywane w celu usunięcia pozostałości rozpuszczalnika, surfaktantów, czy in‑
nych dodatków. Tak oczyszczone, są następnie poddawane procesowi su‑
szenia na powietrzu, w suszarce czy liofilizatorze [13]. Metody otrzymy‑
wania mikrosfer można podzielić na
emulsyjne [29, 30], z wykorzystaniem ekstruzji [2], koacerwacji [7,10], topliwej dyspersji [2], z użyciem czynnika sieciującego [10] czy suszenia rozpyłowego [4]. Przy sporządzaniu mikrosfer często łączy się kil‑
ka rodzajów metod [1, 2, 33].
Metody emulsyjne
Metody emulsyjne należą do najczęstszych sposo‑
bów otrzymywania mikrosfer w skali laboratoryjnej.
Można je podzielić na metody polegające na odparo‑
waniu rozpuszczalnika, jego ekstrakcji, rozcieńcze‑
niu czy na polimeryzacji powstałej emulsji [29,34].
W metodach tych wodny roztwór polimeru i zamyka‑
nej substancji czynnej zostaje połączony z fazą orga‑
niczną za pomocą odpowiedniego surfaktantu w celu utworzenia emulsji olej w wodzie (w przypadku sub‑
stancji o charakterze hydrofobowym) lub woda w ole‑
ju (dla substancji hydrofilowych) (rycina 2).
Obie fazy emulsji należy dobrać pod względem jakościowym w taki sposób, by w niewielkim stopniu miały do siebie powinowactwo. W przypadku polime‑
rów wrażliwych na działanie wody (np. polibezwodni‑
ków) można pominąć udział fazy wodnej, zawieszając organiczny roztwór polimeru w fazie olejowej [29].
Niekiedy niezbędne jest przygotowanie emulsji wie‑
lokrotnych, zwłaszcza gdy substancja lecznicza nie rozpuszcza się w roztworze polimeru [30]. Do otrzy‑
mania emulsji można wykorzystać homogenizator lub ultradźwięki. Proces formowania mikrosfer za‑
chodzi podczas eliminacji rozpuszczalnika na drodze
przez dodanie czynnika sieciującego. Wadą tych me‑
tod są trudności w ujednoliceniu procesu produk‑
cyjnego i przeniesieniu go ze skali laboratoryjnej na skalę przemysłową. Ponadto obecność rozpuszczal‑
ników organicznych czy oddziaływań rozpuszczal‑
nik‑faza wodna może przyczynić się do inaktywacji substancji czynnej. Problemem jest także pozbycie się w całości rozpuszczalnika z powierzchni mikros‑
fer [1, 3, 7, 30].
Jedną z odmian metody emulsyjnej jest technika ekstrakcji z wykorzystaniem gazu, najczęściej dwu‑
tlenku węgla w stanie nadkrytycznym (SC CO2), opar‑
ta na zasadzie współwytrącania za pomocą tego gazu substancji leczniczej i polimeru z roztworu. Gaz w sta‑
nie nadkrytycznym nie miesza się z większością sub‑
stancji, jego ciężar właściwy jest charakterystyczny dla cieczy, a zdolności penetracji – typowe dla gazu.
Proces ten przeprowadza się w określonej temperatu‑
rze i nadciśnieniu w specjalnej komorze ekstrakcyjnej, na której dno ze stałą prędkością doprowadzany jest SC CO2. Mikrosfery są formowane podczas likwidacji nadciśnienia, co w efekcie prowadzi do rozprężenia gazu. Przestaje on wówczas być rozpuszczalnikiem dla polimeru, który ulega wytrąceniu [30]. Zaletą tej metody jest brak pozostałości rozpuszczalników. Jed‑
nak ma ona zastosowanie tylko gdy cząsteczki poli‑
meru i leku tworzą homogenny roztwór [35].
Metoda ekstruzji
W metodzie ekstruzji mikrosfery tworzone są przez przeciskanie (przez odpowiedniej średnicy wylot, np. igłę) wodnego roztworu polimeru z za‑
wieszoną w nim substancją leczniczą wprost do na‑
czynia z cieczą utwardzającą lub sieciującą. Metoda ta, z uwagi na łagodne warunki procesu (brak lot‑
nych rozpuszczalników, działania wysokiej tempera‑
tury), umożliwia zamykanie wrażliwych substancji, takich jak kwasy nukleinowe czy białka [1, 2]. Wadą są stosunkowo duże (>500 μm) rozmiary uzyskiwanych mikrocząstek, ograniczone średnicą zastosowanej końcówki wylotu. Przy zmniejszaniu średnicy wzrasta siła potrzebna do przeciskania roztworu przez wylot, co zwiększa ryzyko zaczopowania igły przez polimer oraz rozkładu substancji czynnej. Zmniejszenie roz‑
miaru mikrosfer można uzyskać przez pobudzenie akustyczne końcówki wylotu. W zależności od często‑
tliwości wibracji i szybkości przepływu cieczy, krople ulegają rozbiciu na mniejsze mikrokropelki [1].
Metoda koacerwacji
W metodzie koacerwacji wykorzystuje się zjawi‑
sko rozdziału faz pod wpływem zmiany temperatu‑
ry, stężenia, pH, czy dodatku soli, prowadzących do wydzielenia polimeru w postaci kropelek otaczają‑
cych substancję czynną. Koacerwacja może zacho‑
dzić w środowisku wodnym lub bezwodnym, przy Zewnętrzna faza wodna
Emulsyfikacja w/o
Emulsyfikacja w/o/w
Polimer w fazie organicznej + surfaktant
Zewnętrzna faza wodna + stabilizator emulsji
Przemycie Wysuszenie Usunięcie rozpuszczalnika z powierzchni mikrosfer poprzez ekstrakcję/odparowanie
Rycina 2. Schemat otrzymywania mikrosfer metodą emulsyjną typu w/o/w [wg 30, zmodyfik.]
T e c h n o l o g i a p o s Ta c i l e k u
czym zamykane substancje nie mogą rozpuszczać się w rozpuszczalniku, w którym przeprowadza się ten proces [7]. Może on mieć charakter komplekso‑
wy, gdy przebiega z udziałem dwóch lub więcej rodza‑
jów polimeru, np. chitozanu i alginianu, wytrącanych z roztworu pod wpływem soli chlorku potasu i wap‑
nia [10].
Metoda topliwej dyspersji
W procesie topliwej dyspersji polimer zosta‑
je zmieszany z płynną lub stałą substancją czynną (o wielkości cząstek poniżej 50 μm), a następnie ca‑
łość rozprasza się w cieczy, która nie rozpuszcza sub‑
stancji leczniczej, ani polimeru (np. olej silikonowy).
Układ ogrzewa się przy ciągłym mieszaniu do tem‑
peratury o 5°C wyższej od temperatury topnienia polimeru. Po uzyskaniu stabilnej emulsji mieszani‑
nę schładza się do zestalenia polimeru, a otrzyma‑
ne mikrosfery, których wielkość można kontrolować szybkością obrotów mieszadła, oddziela się z miesza‑
niny, przemywa i suszy. Ta nieskomplikowana metoda ma zastosowanie zwłaszcza w przypadku polimerów wrażliwych na działanie wody (np. polibezwodników).
Problemem jest wpływ temperatury na zamykaną substancję leczniczą, można go jednak wyeliminować przez dobór polimeru o odpowiednio niskiej tempe‑
raturze topnienia [2].
Metoda sieciowania
Mikrosfery zbudowane z naturalnych polimerów (jak chitozan, alginian czy albumina) można otrzy‑
mać na drodze sieciowania (inaczej żelowania czy po‑
limeryzacji). Proces może mieć charakter sieciowania
zewnętrznego, kiedy czynnik żelujący zostaje do‑
dany w końcowym etapie eksperymentu, lub we‑
wnętrznego, w którym użyte są nierozpuszczalne mikrokryształy soli (np. CaCO3) uwalniające czynnik sieciujący (Ca2+) dopiero podczas zmiany pH z 7 na 6,5 [36]. W porównaniu z pierwszą metodą, żelowa‑
nie wewnętrzne zapewnia lepszą ochronę zamyka‑
nej substancji czynnej, zmniejsza ilość potrzebnego do uformowania twardych mikrosfer czynnika sie‑
ciującego, a przy tym ogranicza agregację powsta‑
łych mikrocząstek. Metoda ta może jednak zwiększać ucieczkę leku z mikrosfer w chwili otrzymywania [29, 36]. Do czynników sieciujących zalicza się tempera‑
turę, substancje chemiczne, np. aldehyd glutarowy, czy też naturalnie występującą, biozgodną genipi‑
nę oraz substancje o charakterze jonowym (trifosfo‑
ran, tetrafosforan, siarczan (VI) sodu, chlorek wapnia, laurylosiarczan czy molibdenian) [1, 2, 10]. Metoda ta polega na wkraplaniu roztworu polimeru (np. alginia‑
nu) z rozpuszczoną lub zawieszoną w nim substancją leczniczą do naczynia z czynnikiem sieciującym (np.
jonami Ca2+). Przeprowadzanie procesu w środowi‑
sku wodnym, podobnie jak w metodzie ekstruzyjnej, niesie ze sobą pewne niedogodności. Może bowiem dojść do powstania mikrosfer o dużych rozmiarach, nieregularnych, kroplopodobnych kształtach, a je‑
śli substancja lecznicza jest hydrofilowa – do dużych strat wynikających z ucieczki substancji z matrycy tworzących się mikrosfer [29]. Bardziej powszechna w użyciu jest metoda emulsyjno‑sieciująca, w któ‑
rej zewnętrzna faza olejowa ogranicza dyfuzję leku, a rozmiar mikrosfer można dodatkowo kontrolować szybkością obrotów mieszadła [2, 7, 29].
Produkt leczniczy Postać Substancja czynna/
dawka [mg]
Polimer Zastosowanie
Lucrin Depot® (Abbott Lab.) Liofilizat mikrosfer + rozpuszczalnik do sporządzania zawiesiny
s.c. lub i.m.
Octan leuproreliny/
3,75 11,25
PLA Rak gruczołu krokowego
Endometrioza Mięśniaki macicy Rak piersi Decapeptyl Depot®
(Ferrinng GmBH)
Mikrokapsułki* + rozpuszczalnik (ampułkostrzykawka) do sporządzania zawiesiny
s.c. lub i.m.
Tryptorelina/
3,75
PLGA (PLA: PGA
1: 1)
Rak gruczołu krokowego Endometrioza Mięśniaki macicy
Diphereline SR® (Ibsen Pharma Brotech)
Liofilizat (fiolka) + rozpuszczalnik (ampułkostrzykawka) do sporządzania zawiesiny i.m.
Tryptorelina/
3,75 11,25
PLGA Rak gruczołu krokowego
Endometrioza Mięśniaki macicy Rispolept Consta®
(Janssen Cilag Ltd)
Fiolka z mikrosferami + rozpuszczalnik do sporządzania zawiesiny i.m.
Risperidon/
25,0 37,5 50,0
PLGA Schizofrenia i inne zaburzenia
psychotyczne
Sandostatin LAR® (Novartis Pharma)
Mikrogranulki*(fiolka) + rozpuszczalnik do sporządzania zawiesiny i.m.
Octan oktreotydu/
10,0 20,0 30,0
PLGA – glukoza Akromegalia
* Producenci w ulotkach informacyjnych używają terminu „mikrokapsułki” lub „mikrogranulki” jako wyrażeń synonimowych określających mikrosfery [37]; co prawda, obie te formy należą do mikrocząstek, jednak w odróżnieniu od mikrosfer, w mikrokapsułkach substancja lecznicza nie jest inkorporowana w matrycy, a otoczkowana odpowiednimi polimerami, najczęściej pochodnymi celulozy [2].
Tabela 2. Zarejestrowane w Polsce produkty lecznicze wytwarzane na bazie mikrosfer
Suszenie rozpyłowe
Suszenie rozpyłowe to jednoetapowy, zamknię‑
ty proces, który z uwagi na krótki czas ekspozycji na działanie temperatury, jest wykorzystywany do otrzy‑
mywania mikrosfer z materiałów termowrażliwych.
Suszenie rozpyłowe należy, po metodach emulsyj‑
nych, do najszerzej stosowanych metod otrzymywa‑
nia mikrosfer. Substancja czynna i polimer zostają rozpuszczone w wodnym lub bezwodnym rozpusz‑
czalniku (np. PLA w chlorku metylenu). Lek może być zawieszony w roztworze polimeru lub układ może mieć charakter emulsji. Płynny materiał jest rozpyla‑
ny za pomocą dyszy na subtelne kropelki, a następnie suszony w strumieniu gorącego czynnika suszącego [4]. Jakość otrzymanych tą metodą mikrosfer można poprawić, dodając do mieszaniny plastyfikator, np.
kwas cytrynowy, który ułatwiając formowanie po‑
limerowego filmu, umożliwia powstanie gładkich, kulistych mikrosfer [34]. Suszenie rozpyłowe nie wy‑
maga stosowania wysokich temperatur (proces prze‑
biega zazwyczaj w temperaturze poniżej 50°C) [30].
Metoda ta pozwala uzyskać cząstki wielkości kil‑
ku mikrometrów, przy czym na ich rozmiar wpły‑
wa szybkość suszenia, stosunek ilości polimeru do substancji czynnej, średnica dyszy oraz temperatu‑
ra w komorze suszarki. Metodę suszenia rozpyłowe‑
go można łatwo przenieść ze skali laboratoryjnej na
skalę przemysłową, a dzięki wykorzystaniu systemu zamkniętego możliwe jest otrzymywanie mikrosfer sterylnych [2, 4, 34].
Mimo ogromnego zainteresowania mikrosferami oraz znacznych postępów w opracowywaniu nowo‑
czesnych technologii ich otrzymywania, do tej pory na świecie do obrotu dopuszczono tylko kilka produktów leczniczych w tej postaci. Na polskim rynku farmaceu‑
tycznym obecnie znajduje się pięć takich preparatów (tabela 2) [37–39].
Dostępne preparaty z mikrosferami są przeznaczo‑
ne do podania pozajelitowego (domięśniowego lub podskórnego) i wykorzystywane przede wszystkim w leczeniu hormonalnym akromegalii, nowotworów i endometriozy. We wszystkich tych preparatach ma‑
trycę mikrosfer stanowią polimery α‑hydroksykwasów – PLA, PGA i PLGA, ponieważ do tej pory tylko one uzyskały zgodę komisji FDA na wykorzystanie w pre‑
paratach pozajelitowych u ludzi [39].
preparaty w postaci mikrosfer
Lucrin Depot® to preparat liofilizowanych, otrzy‑
manych metodą emulsyjną mikrosfer z polimeru kwa‑
su mlekowego. Zawiera octan leuproreliny – analog hormonu uwalniającego gonadotropinę i jest wy‑
korzystywany w leczeniu raka gruczołu krokowego,
Produkt leczniczy Substancja czynna/
dawka [mg]
Polimer Zastosowanie Droga podania/czas działania
Lupron Depot® (TAP Pharmaceuticals)
Octan leuproreliny/
3,75; 7,5;
11,25; 15,0;
22,5; 30,0
PLA Rak prostaty
Endometrioza Mięśniaki macicy
i.m./
3 miesiące
Enanton Depot Enanton SR® (Takeda)
Octan leuproreliny/
3,75; 11,25
PLGA Rak prostaty
Endometrioza Rak piersi
s.c. lub i.m./
1–3 miesiące
Suprefact Depot® (Sanofi Aventis)
Buserelina/
6,6; 9,45
PLGA Rak prostaty
Endometrioza
s.c./
2–3 miesiące Suprecur MP®
(Aventis)
Buserelina/
1,8
PLGA Endometrioza s.c./ 1 miesiąc
Nutropin Depot® (Genentech Inc)
Rekombinowany hormon wzrostu/
13,5; 18,0;
22,5
PLGA Terapia hormonalna u dzieci z zaburzeniami wzrostu
s.c./ 1 miesiąc
Somatuline LA® (Ipsen‑Beaufour)
Lanreotyd/ 30,0 PLGA Akromegalia i.m./ 14 dni
Risperdal Consta® (Janssen Pharmaceutica)
Risperidon/
25,0;
37,5; 50,0
PLGA Schizofrenia i inne zaburzenia psychotyczne
i.m./ 14 dni
Trelstar® Depot (Pfizer)
Tryptorelina/
3,75
Matryca – PLGA Otoczka CMC Na
Rak prostaty i.m./ 1 miesiąc
Arestin® (OraPharma)
Minocyklina/
1,0
PLGA Przewlekłe zapalenie przyzębia co 2 tygodnie do kieszonki zębowej
Vivitrol® (Alkemres)
Naltrekson/
380,0
PLGA Leczenie alkoholizmu i.m./ 1 miesiąc
Optison® (GE Healthcare)
Perflutren/
0,19 mg/ml
Albumina ludzka Echokardiografia i.v.
T e c h n o l o g i a p o s Ta c i l e k u
raka piersi i endometriozy. Lucrin Depot® podaje się jednorazowo, domięśniowo lub podskórnie, co 28 dni, po uprzednim przygotowaniu zawiesiny za pomocą dołączonego rozpuszczalnika zawierającego sól so‑
dową karboksymetylocelulozy, mannitol, polisorbat oraz wodę do wstrzykiwań [38].
Decapeptyl Depot® oraz Diphereline SR® to pre‑
paraty hormonu peptydowego – tryptoreliny, wy‑
korzystywanej w terapii nowotworów prostaty, endometriozy czy mięśniaków macicy. Liofilizat mi‑
krosfer wykonanych z kopolimeru kwasu mlekowego i glikolowego metodą emulsyjną powinien być prze‑
chowywany w temperaturze 2–8°C, a odpowiednio przygotowana ex tempore zawiesina jest podawana pacjentom w głębokim wstrzyknięciu domięśniowym co 28 dni [38, 39].
Preparat Sandostatin LAR® zawierający analog somatostatyny – octan oktreotydu, stosowany jest w leczeniu akromegalii. Ma postać proszku z mikros‑
ferami wykonanymi z PLGA w połączeniu z glukozą oraz rozpuszczalnika (zawierającego sól sodową kar‑
boksymetylocelulozy, mannitol i wodę do iniekcji) do sporządzania zawiesiny przeznaczonej do wstrzyk‑
nięć domięśniowych [38].
Rispolept Consta® jest preparatem stosowanym w leczeniu schizofrenii, w którym substancja czyn‑
na – risperidon została zamknięta w matrycy z PLGA.
Preparat, otrzymywany metodą emulsyjną, jest poda‑
wany pacjentom domięśniowo co dwa tygodnie [38].
Dostępne na świecie inne produkty lecznicze w postaci mikrosfer przedstawia tabela 3 [38–41].
Obecnie prowadzi się liczne badania kliniczne nad skutecznością i bezpieczeństwem stosowania substan‑
cji leczniczych w postaci mikrosfer. Badania te dotyczą m.in. wykorzystania mikrosfer w hormonalnej terapii zastępczej (iniekcje domięśniowe estradiolu z progeste‑
ronem), leczeniu retinopatii cukrzycowej (preparat Re‑
taac® z triamcinolonem wprowadzanym bezpośrednio do ciała szklistego) [42], raka piersi (preparat Paclimer® [23]), czy nieoperacyjnego nowotworu wątroby (mikros‑
fery znakowane izotopem itru 90Y do radioembolizacji naczyń zaopatrujących guz). Mikrosfery badane są tak‑
że pod kątem ewentualnego zastosowania w diagno‑
styce – echokardiografii i ultrasonografii kontrastowej (albuminowe mikrosfery z perflutrenem) [42].
W ostatnich latach nastąpił ogromny postęp w technologii otrzymywania mikrosfer oraz możli‑
wości kontrolowania procesu uwalniania substan‑
cji czynnych z matrycy polimerowej [1, 2]. Dążenie do wykorzystania w lecznictwie niestabilnych substan‑
cji czynnych (białka, materiał genetyczny [18, 25]) oraz próby zminimalizowania działań niepożądanych przez dostarczenie leku do specyficznych tkanek pozwalają przypuszczać, że prace nad rozwojem tej postaci leku będą kontynuowane.
Otrzymano: 2009.02.10 · Zaakceptowano: 2009.03.09
piśmiennictwo
1. Varde N.K., Pack D.: Microspheres for controlled release drug delive‑
ry. Expert Opin Biol Ther, 2004, 4, 1‑17.
2. Burgess D.J., Hickey A.J.: Microsphere technology and applications.
W: Swarbrick J. Encyclopedia of pharmaceutical technology. Infor‑
ma Healthcare, 2007, 3, 2328‑2337.
3. Freiberg S., Zhu X.X.: Polymer microspheres for controlled drug re‑
lease. Int. J. Pharm, 2004, 282, 1‑18.
4. Słomkowski S.: Biodegradable nano‑ and microparticles as carriers of bioactive compounds. Acta Pol. Pharm, 2006, 63, 351‑358.
5. Pillai O., Panchagnula R.: Polymers in drug delivery. Curr. Opin. Chem.
Biol, 2001, 5, 447‑451.
6. Manca M.L., Mourtas S., Dracopoulos V. i wsp.: PGLA, chitosan or chi‑
tosan‑coated PGLA microparticles for alveolar delivery? A compara‑
tive study of particle stability during nebulization. Colloids Surf. B.
Interfaces, 2007, 62, 220‑231.
7. Sam M.T., Gayathri D.S., Sandhya K.V.: Formulation and evaluation of ketorolac tromethamine‑loaded albumin microspheres for potential intramuscular administration. AAPS Pharm Sci. Tech, 2007, 8, 1‑9.
8. Chan O.C.M., So K.F., Chan B.P.: Fabrication of nano fibrous‑collagen microspheres for protein delivery and effects of photochemical cros‑
slinking on release kinetics. J. Control. Release, 2008, 129, 135‑143.
9. Lin W.J., Kang W.W.: Comparison of chitosan and gelatin coated mi‑
croparticles: prepared by hot‑melt method. J. Microencapsul, 2003, 20, 169‑177.
10. Sinha V.R., Singla A.K., Wadhawan S. i wsp.: Chitosan microspheres as a potential carrier for drugs. Int. J. Pharm. 2004, 274, 1‑33.
11. Liu F., Liu L., Li X. i wsp.: Preparation of chitosan‑hyaluronate double‑
walled microspheres by emulsification ‑ coacervation method. J. Ma‑
ter. Sci.: Mater. Med, 2007, 18, 2215‑2224.
12. Leonard M., De Boisseson M.R., Hubert P. i wsp.: Hydrophobically modified alginate hydrogels as protein carriers with specific con‑
trolled release properties. J. Control. Release, 2004, 27, 395‑405.
13. Sam M.T., Gayathri D.S., Prasanth V.V. i wsp.: NSAIDs as microsphe‑
res. Inernet. J. Pharmcol. 2008, 6, 1‑18.
14. Wu Y., Hu Y., Cai J. i wsp.: Coagulation property of hyaluronic acid – collagen/chitosan complex film. J. Mater. Sci.: Mater. Med., 2008, 19, 3621‑3628.
15. Mainardes R.M., Silva L.P.: Drug delivery systems: past, present, and future. Curr. Drug Targets, 2004, 5, 449‑455.
16. Wang L.Y., Gu Y.H., Zhou Q.Z. i wsp.: Preparation and characteriza‑
tion of uniform‑sized chitosan microspheres containing insulin by membrane emulsification and two‑step solidification process. Col‑
loids. Surf. B. Biointerfaces, 2006, 50, 126‑135.
17. Silva C.M., Ribeiro A.J., Figueiredo M. i wsp.: Microencapsulation of hemoglobin in chitosan‑coated alginate microspheres prepared by emulsification/internal gelation. AAPS J, 2006, 13, 903‑913.
18. Malik D.K., Baboota S., Ahuja A. i wsp.: Recent advances in protein and peptide drug delivery systems. Curr. Drug Deliv, 2007, 4, 141‑151.
19. Coccoli V., Luciani A., Orsi S. i wsp.: Engineering of poly(ε‑
caprolactone) microcarriers to modulate protein encapsulation ca‑
pability and release kinetic. J. Mater. Med, 2008, 19, 1703‑1711.
20. Torres M.P., Determan A., Anderson G.L. i wsp.: Amphiphilic polyan‑
hydrides for protein stabilization and release. Biomaterials, 2007, 28, 108‑116.
21. Berkland C., Kipper M.J., Narasimhan B. i wsp.: Microsphere size, precipitation kinetics and drug distribution control drug release from biodegradable polyanhydride microspheres. J. Control. Rele‑
ase, 2004, 94, 129‑141.
22. Nair L.S., Laurencin C.T.: Polymers as biomaterial for tissue engine‑
ering and controlled drug delivery. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol, 2006, 102, 47‑90.
23. Zhao Z., Wang J., Mao H.Q. i wsp.: Polyphosphoesters in drug and gene delivery. Adv. Drug Deliv. Rev., 2003, 55, 483‑499.
24. Caponetti G., Hrkach J.S., Kriwet B. i wsp.: Microparticles of novel branched copolymers of lactic acid and amino acids: preparation and characterization. J. Pharm. Sci, 1999, 81, 136‑141.
25. Dong W., Bodmeier R.: Encapsulation of lipophilic drugs within en‑
teric microparticles by a novel coacervation method. Int. J. Pharm., 2006, 1, 128‑138.
26. Giannola L.I., De Caro V., Giandalia G. i wsp.: Ocular gelling micro‑
spheres: In vitro precorneal retention time and drug permeation through reconstituted corneal epithelium. J. Ocul. Pharmacol. Ther., 2008, 24, 186‑196.
27. Liu Z., Lu W., Qian L. i wsp. In vitro and in vivo studies on mucoadhesi‑
ve microspheres of amoxicillin. J. Control. Release, 2005, 20, 135‑144.
gelation technique. Acta Pol. Pharm., 2008, 65, 249‑259.
29. Vasir J.K., Tambwekar K., Garg S.: Bioadhesive microspheres as a con‑
trolled drug delivery system. Int. J. Pharm., 2003, 255, 13‑32.
30. Sznitowska M.: Technologia mikrocząsteczek i nanocząsteczek jako nośników leku. Farm. Pol, 2001, 57, 962‑969.
31. Quan J.S., Jiang H.L., Kim E.M. i wsp.: pH‑sensitive and mucoadhesi‑
ve thiolated Eudragit‑coated chitosan microspheres. Int. J. Pharm., 2008, 359, 205‑210.
32. Cortesi R., Ajanji S.C., Sivieri E. i wsp.: Eudragit microparticles as a possible tool for ophthalmic administration of acyclovir. J. Micro‑
encapsul., 2007, 24, 445‑456.
33. Rosca I.D., Watari F., Uo M.: Microparticle formation and its mecha‑
nism in single and double emulsion solvent evaporation. J. Control.
Release, 2004, 99, 271‑280.
35. Chattopadhyay P., Huff R., Shekunov B.Y.: Drug encapsulation using supercritical fluid extraction of emulsions. J. Pharm. Sci, 2006, 95, 667‑678.
36. Reis C.P., Neufeld R.J., Vilela S. i wsp.: Review and current status of emulsion/dispersion technology using an internal gelation process for the design of alginate particles. J. Microencapsul., 2006, 23, 245‑257.
37. Urzędowy wykaz produktów leczniczych dopuszczonych do obrotu na terytorium Rzeczypospolitej Polskiej. Stan na 31.01.2009. Polskie Towarzystwo Farmaceutyczne, Warszawa, 2008.
38. www.emc.medicines.org.uk 39. www.medilexicon.com.
40. www.drugs.com.
41. www.fda.gov.
42. http: //clinicaltrials.gov.
