Aktywność granulocytów u dzieci
z nawracającymi zakażeniami dróg oddechowych
The activity of granulocytes in children with recurrent infections of respiratory tract
Barbara Jakubczak1, Urszula Demkow1, 2, Maria Wąsik1
1 Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej i Immunologii Klinicznej Wieku Rozwojowego AM w Warszawie, kierownik: prof. M. Wąsik
2 Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej Instytut Gruźlicy i Chorób Płuc, kierownik: mgr. A. Borowska
Summary: Acute upper respiratory tract infection (URTI) is a common disease in young children. URTI contrib- utes to approximately 20% of mortality in children younger than 5 years of age. Infections of the upper respiratory tract are the most common cause of viral morbidity in children. They represent the most frequent problem in gen- eral pediatric practice and are responsible for more than one third of school absences. On the other hand respira- tory tract infections through MALT system play a positive role in maturation and development of immune system.
Many different immunologic disturbances can occur during the development of respiratory infections. Disorders of granulocyte functions are the principal cause of inflammation in the upper respiratory tract. Chemiluminescence of granulocytes is a renowned method for the estimation their overall activity as measured by the production of reactive oxygen species. The goal of the study was to evaluate chemiluminescent activity of granulocytes from 41 children with recurrent infections of the respiratory tract compared to 30 healthy children. Chemiluminescent re- sponse to all the examined stimuli in children with recurrent infections was significantly lower compared to control.
. In the examined group of 41 children depressed response to at least 1 stimulus was detected in 32 (78%) cases.
The use of both fMLP and opsonised zymosan allowed to detect defect of granulocyte function in 93,75% cases.
This defect may be related to delayed maturation of the immune system in certain children or may be induced by intensive therapy with antibiotics.
Pneumonol. Alergol. Pol. 2005, 73, 160:166 Key words: respiratory tract infections in children, immune system, granulocytes, chemiluminescence
Wstęp
Nawracające zakażenia dróg oddechowych (NZDO) stanowią powszechny problem w praktyce klinicznej (1, 2). Stanowią one najczęstszą przy- czynę konsultacji pediatrycznych i powodują około 1/3 absencji szkolnych (1, 2, 3). Z drugiej jednak strony zakażenia dróg oddechowych poprzez sys- tem MALT (Mucosa Associated Lymphoid Tissue) odgrywają ważną rolę w rozwoju i dojrzewaniu układu odpornościowego u dzieci (3).
Odporność organizmu na zakażenia bakteryjne, wirusowe i grzybicze jest uwarunkowana prawi- dłowym współdziałaniem odporności nieswoistej wrodzonej i swoistej nabytej (4, 5). U noworodków i małych dzieci przeważa odporność nieswoista (4, 5, 6). W miarę dojrzewania układu immunologicz- nego mechanizmy odporności nieswoistej zostają wzmocnione przez swoistą, nabytą odpowiedź im- munologiczną. Mechanizmy odporności nieswo- istej pozostają w stałej gotowości obronnej choć u małych dzieci nie są jeszcze w pełni skuteczne, co może być powodem nawracających zakażeń [7].
Głównymi komórkami odporności nieswoistej są fagocyty (granulocyty, monocyty i makrofagi).
Stanowią one pierwszą linię obrony przed zakaże- niami. Granulocyty obojętnochłonne są najszyb- ciej reagującą i dominującą liczbowo populacją komórek żernych krwi obwodowej. Zdolne są one do fagocytowania drobnoustrojów, wewnątrzko- mórkowego ich zabijania i degradacji. Warunkiem sprawności granulocytów jest prawidłowy przebieg ich przemian metabolicznych [8, 9, 10, 11]. Proce- sowi wewnątrzkomórkowego zabijania towarzyszy aktywacja szeregu enzymów, która prowadzi do wytwarzania reaktywnych form tlenu i uwalniania wolnych rodników tlenowych (10, 11), co nosi na- zwę wybuchu tlenowego „respiratory burst”.
Znanych jest kilka metod oceny „wybuchu tle- nowego” występującego w fagocytujących granu- locytach (12, 13, 14, 15, 16). Ponieważ procesowi
„wybuchu tlenowego” towarzyszy emisja światła – chemiluminescencja, więc liczbę powstałych fo- tonów można mierzyć przy użyciu luminometru lub fotopowielacza licznika scyntylacyjnego określając wskaźniki chemiluminescencji (CI) (18, 19, 20).
W granulocytach chemiluminescencję można indukować różnymi drogami: przez receptor che- motaktyczny (fMLP), receptor dla fragmentu Fc przeciwciała i dopełniacza (opsonizowany zymo-
san – OZ) oraz drogą pozareceptorową (PMA) [12].
Ocenę zdolności komórek do chemiluminescencji przeprowadza się dwuetapowo. W pierwszym etapie bada się chemiluminescencję spontaniczną, w drugim, po dodaniu czynnika pobudzające- go (chemiluminescencja stymulowana). W celu wzmocnienia reakcji stosuje dwa związki o dużej wydajności kwantowej: luminol i lucygenina.
Związki te łatwo przechodzą w procesie utleniania w stan wzbudzenia, co pozwala na wzmocnienie efektów świecenia ok. 100 razy [12].
W praktyce klinicznej badanie chemilumi- nescencji znalazło zastosowanie w diagnostyce przewlekłej choroby ziarniniakowej, a także w nawracających zakażeniach, zapaleniu stawów, oparzeniach, urazach, posocznicach noworodków, zaburzeniach metabolicznych i innych. Coraz częściej stosuje się ocenę chemiluminescencji we wrodzonych i nabytych defektach czynnościowych granulocytów [18]. Ocena chemiluminescencji jest badaniem zalecanym przez Światową Organizację Zdrowia WHO [21] do oceny stanu odporności nieswoistej. Uważa się, że jest to metoda pośred- nia oceny właściwości bakteriobójczych komórek żernych. Objawy zaburzeń czynności granulocytów mogą być związane ze zmniejszeniem ich liczby lub upośledzeniem ich zdolności do fagocytozy i zabijania wewnątrzkomórkowego [22]. Zakłócenie tylko jednej funkcji tych komórek może prowadzić do ciężkich nawracających zakażeń, w tym zakażeń układu oddechowego [23].
Cel pracy
1. Ocena aktywności metobolicznej granulo- cytów obojętnochłonnych mierzona testem che- miluminescencji u dzieci chorujących na NZDO w porównaniu do dzieci zdrowych.
2. Określenie przydatności zastosowania jedno- czasowej stymulacji fMLP, OZ i PMA do oceny zaburzeń czynności granulocytów mierzonej che- miluminescencją,
Materiał i metody
Grupa badana obejmowała 41 dzieci (21 dziewczy- nek i 20 chłopców), w wieku od 1 roku do 15 lat (średnia wieku 7,0±4,19) chorujących na NZDO.
Za kryterium nawracających zakażeń uznano 8 lub więcej epizodów zakażeń dróg oddechowych w ciągu roku. U tych chorych nie stwierdzano chorób alergicznych, hematologicznych i innych o podłożu immunologicznym oraz wyklucza- no dzieci z rozpoznanymi wadami wrodzonymi
i innymi przewlekłymi chorobami. Badania im- munologiczne wykonywano w okresie zdrowia, tj. bez klinicznych cech zakażenia i co najmniej 3 tygodnie po ostatniej infekcji, antybiotykoterapii, szczepieniu oraz co najmniej 3 miesiące po przeby- ciu choroby zakaźnej
Grupa kontrolna obejmowała 30 dzieci zdro- wych (11 dziewczynek i 19 chłopców), w wieku od 1 roku do 15 lat (średnia wieku 6,9±4). Do grupy kontrolnej zakwalifikowano dzieci, które w ciągu ostatniego miesiąca nie przebyły żadnej choroby zakaźnej, nie przyjmowały leków (w szczególności antyoksydantów, immunomodulatorów, antybioty- ków) oraz miały prawidłowy obraz morfologiczny krwi obwodowej.
Badania prowadzone były zgodnie z protokołem zatwier- dzonym przez Komisję Bioetyczną AM w Warszawie. Ro- dzice pacjentów wyrazili pisemną zgodę na udział dziecka w badaniach po wcześniejszym zapoznaniu się z protokołem badawczym.
Krew do badań pobierano z żyły łokciowej z jednorazo- wego wkłucia metod. U dzieci pobierano ok. 1,5 ml krwi. Do badania czynności granulocytów metodą chemiluminescencji oraz do izolacji granulocytów jako antykoagulantu stosowano heparynę (10 j./ml). Badanie wykonywano do dwóch godzin od pobrania materiału. Morfologię krwi obwodowej pobierano na wersenian potasu i wykonywano badanie w analizatorze hema- tologicznym Micro Diff II, firmy Coulter.
Ocena chemiluminescencji.
Badanie pomiaru światła emitowanego przez komórki krwi obwodowej wykonano w liczniku scyntylacyjnym Wallac 1409 firmy Wallac, Finland (z opcją do chemiluminescencji). Wy- korzystywane w badaniu odczynniki przygotowywano według procedur opisanych wcześniej przez innych autorów [12, 13].
Odczynniki
• Luminol (5-amino,2,3-dihydro1,4-ftalazynodion) firmy Sigma ( stężenie 10-5 mola).
Do 5 ml PBS dodawano 50 µl roztworu macierzystego luminolu (stężenie 10-3 mola)
• nfMLP (n-formylo-metionylo-leucylo-fenyloalanina) fir- my Sigma(stężenie 10-5 mola).
• Opsonizowany zymosan (stężenie 20 mg/ml)
• PMA (ester forbolu) firmy Sigma (stężenie 1µg/ml)
• Płyn Hanksa z dodatkiem 0,5% hydrolizatu laktoalbumi- ny i NaHCO3
(Wytwórnia Surowic i Szczepionek w Lublinie) – do rozcieńczania krwi.
Wykonanie badania.
Krew pobraną na heparynę rozcieńczano 5x płynem Hanksa (50 µl krwi i 200 µl płynu Hanksa). Do probówki dodawano 200 µl luminolu (w stężeniu 10-5 mola), a następnie dodawano 50 µl rozcieńczonej krwi. Probówkę wstawiano do liczni- ka scyntylacyjnego i uruchomiano przyciskiem startowym pomiar chemiluminescencji spontanicznej (pomiar tzw. tła).
Oznaczano 15 sek.impulsy emitowanego światła. Po uzyskaniu 3 do 5 wyników pomiarowych wyłączano aparat. Następnie do tej samej probówki dodawano 20 µl fMLP (w stężeniu 10-3 mola). Ponownie uruchamiano licznik przyciskiem startowym i mierzono chemiluminescencję stymulowaną. Czas pomiaru chemiluminescencji stymulowanej nie przekraczał 60 min.
(wyłączano aparat w przypadku spadku aktywności). Do dru-
giej probówki dodawano 200 µl luminolu, 50 µl rozcieńczonej krwi i 20 µl opsonizowanego zymosanu (w stężeniu 20 mg/ml) i ponownie mierzono chemiluminescencję stymulowaną. Do trzeciej probówki dodawano 200 µl luminolu, 50 µl rozcień- czonej krwi i 20 µl PMA (w stężeniu 1µg/ml) i ponownie mierzono chemiluminescencję stymulowaną. Odczytane im- pulsy światła emitowane przez granulocyty w objętości 10 µl krwi przeliczano uwzględniając liczbę granulocytów w 1 µl.
Obliczano wartość chemiluminescencji przypadającą na jed- ną komórkę (imp./kom.) w czasie maksymalnej odpowiedzi.
Dla ilościowej oceny stymulacji granulocytów wprowadzono pojęcie indeksu chemiluminescencji (Cl), którego wartość jest proporcjonalna do ilorazu chemiluminescencji stymulowanej do spontanicznej.
We wszystkich grupach oceniano indeks chemiluminescen- cji oraz czas potrzebny do uzyskania maksymalnej odpowiedzi na każdy stymulator. Uwzględniając leukocytozę oraz odsetek granulocytów obojętnochłonnych obliczano liczbę impulsów światła emitowanego przez na jedną komórkę w czasie 1 min.
Analiza statystyczna wyników.
Do analizy statystycznej wykorzystano program staty- styczny STATISTICA 5.1; 97/00 w polskiej wersji. Do oceny istotności statystycznej różnic między badanymi paramerami stosowano testy nieparameryczne dla prób niezależnych (test U Manna-Whitneya) oraz test Wicoxona. Za poziom istotno- ści przyjmowano p<0,05. Z uzyskanych wyników obliczano wartości średnie, odchylenia standardowe oraz medianę.
Wyniki grupy zdrowych dzieci nie miały rozkładu normalnego, dlatego zastosowano metodę percentylową do obliczenia war- tości odniesienia. Obliczano wartość 5 i 95 percentyla. Zakres wyników prawidłowych przyjmowano wyniki mieszczące się między 5 i 95 percentylem.
Wyniki
Wiek oraz wyniki leukocytozy w grupie kontrolnej i grupie badanej były porównywalne. Podobnie, odsetki limfocytów i granulocytów we krwi obwo- dowej nie różniły się istotnie statystycznie między grupą kontrolną i badaną (Tab. I.)
Granulocyty dzieci chorujących na NZDO od- powiadały na stosowane stymulatory znacznie sła- biej niż granulocyty dzieci zdrowych. Prawidłową odpowiedź na wszystkie stymulatory, stwierdzono tylko w 9 na 41 badanych dzieci. Obniżona od- powiedź granulocytów na stosowane stymulatory wystąpiła u 32 badanych dzieci z nawracającymi zakażeniami.
Różnice średnich impulsów światła emitowane- go w czasie 1min przez 1 komórkę w odpowiedzi na wszystkie trzy stosowane stymulatory były istotne statystycznie niższe w grupie dzieci chorujących na NZDO w porównaniu do grupy dzieci zdrowych.
Porównano również czas uzyskania maksymalnej odpowiedzi (szczytowej produkcji wolnych rodni- ków) po zastosowaniu fMLP, OZ i PMA, który nie różnił się istotnie statystycznie w obu porównywa- nych grupach dzieci (Tab.II).
Spośród 41 dzieci badanych w 14 przypadkach zaobserwowano obniżoną odpowiedź na wszystkie stymulatory. U 6 chorych stwierdzono obniżo- ną odpowiedź na dwa stymulatory: fMLP i OZ, u jednego wystąpiło obniżenie odpowiedzi jedno- cześnie na fMLP i PMA a u 2 pacjentów stwier- dzono defekt odpowiedzi jednocześnie na zymosan i PMA (Tab. III). Obniżoną odpowiedź na jeden stymulator stwierdzono u 9 chorych, z tego u 4 pa- cjentów była to obniżona odpowiedź na fMLP i u 3 obniżoną odpowiedź na zymosan oraz u 2 obniżoną odpowiedź na PMA (Tab.III).
U chorych, u których obserwowano niską odpo- wiedź lub brak odpowiedzi, szczególnie po stymu- lacji fMLP, wykonywano oznaczenie aktywności mieloperoksydazy granulocytów. Badanie to wy- konano u 25 chorych na NZDO. Tylko u jednego pacjenta stwierdzono brak aktywności tego enzy- mu, w pozostałych przypadkach aktywność była porównywalna do grupy kontrolnej.
Tabela I. Wyniki badań i zakresy chemiluminescencji granulocytów krwi w zależności od zastosowanych stymulatorów uzyska- ne w grupie zdrowych dzieci.
Table I. The results of chemiluminescence assay in different ranges depending on stimulator used in the group of healthy chil- dren.
Wynik
Result Cl
Spont.
FMLP OZ PMA
CI Czas/time
(min) CI. Czas/time
(min) CI Czas/time (min)
Średnia / Mean 0,13 48,9 11,3 81,4 20,6 71,26 31,1
SD 0,23 50,4 6,6 55,6 7,9 72,5 11,2
Mediana / Median 0,08 34,4 10,0 81,1 20,5 56,2 30,0
Percentyl 0,05 0,04 7,6 4,9 10,8 10,4 2,4 13,7
Percentyl 0,95 0,39 136,3 29,0 189,6 31,5 229,9 52,2
CI – index chemiluminescencji; OZ – opsonizowany zymosan
Z grupy dzieci chorujących na NZDO, u których stwierdzono indeks chemiluminescencji granu- locytów poniżej dolnej granicy wyników obser- wowanych w grupie kontrolnej, wydzielono trzy podgrupy z obniżoną na wszystkie trzy stymulatory, na dwa z trzech stymulatorów i na jeden z trzech symulatorów (Ryc.1).
Analizie poddano wyniki uzyskane w grupie 32 dzieci, u których zastosowanie trzech stymu- latorów umożliwiło wykrycie defektu odpowiedzi granulocytów przynajmniej na jeden stymulator.
W przypadku zastosowania tylko fMLP rozpo- znanie defektu byłoby niemożliwe u 21,88%
dzieci z nawracającymi się zakażeniami. Stosując tylko opsonizowany zymosan rozpoznanie defek- tu byłoby niemożliwe u 21,87% a w przypadku stosowania tylko PMA nie rozpoznanie defektu dotyczyłoby aż 40,6% dzieci z nawracającymi się zakażeniami. Zastosowanie fMLP i OZ wykrywało w tej grupie defekt granulocytów u 93,75% dzieci.
Brak rozpoznania dotyczyłby tylko 6,25% bada- nych. Zastosowanie fMLP i PMA wskazywało na defekt występujący tylko u 87,6% dzieci badanych a brak rozpoznania dotyczyłby 12,38% badanych.
Przyjmując, że 32 dzieci z grupy 41 badanych z na-
wracającymi zakażeniami ma zaburzoną czynność granulocytów w zakresie odpowiedzi na czynniki stymulujące do emisji światła zastosowanie przy- najmniej dwóch stymulatorów zwiększało znacznie czułość tego testu.
Tabela II. Porównanie chemiluminescencji w grupie dzieci zdrowych i dzieci chorujących na nawracające zakażenia.
Table II. The comparison of chemiluminescence index in the group of children with recurrent infection and in healthy children.
Symulator
Badane grupy / Examined groups
Indeks chemiluminescencji/CI Czas maksymalnej odpowiedzi / Time Zdrowe/
Healthy n=30
NZDO/
Recurrent infections
n=41
p Zdrowe/
Healthy n=30
Recurrent NZDO infections
n=41
p
Spontaniczna 0,13±0,2 0,11±0,1 ns
FMLP 48,9±50,4 17,6±20,2 0,000022 11,3±6,6 15,9±10,6 0,20
OZ 81,4=±55,6 29,7±33,7 0,000019 20,6±7,9 18,8±9,7 0,36
PMA 71,3±72,5 18,2±26,8 0,000065 31,1±11,2 31,4±9,6 0,82
Tabela III. Częstość występowania obniżonego indeksu chemiluminescencji w odpowiedzi na różne stymulację.
Table III. Frequency of decreased results of chemiluminescence stimulated by different factors.
Pojedyńcze stymu- latory i ich zestawy obniżające CI / Single
stimulators and their set decreasing CI
Dzieci zdrowe/Healthy children
n=30 NZDO/Recurrent infections
n=41
Liczba/N % Liczba/N %
FMLP+OZ+PMA 0 0 14 34,1
FMLP+OZ 0 0 6 14,6
FMLP+PMA 0 0 1 2,4
OZ+PMA 0 0 2 4,9
FMLP 1 3,3 4 9,8
OZ 1 3,3 3 7,3
PMA 1 3,3 2 4,9
Ryc.1 Częstość występowania niskiej odpowiedzi granulo- cytów w grupie dzieci chorujących na NZDO.
The frequency od low response in the group of children with recurrent infections.
Dyskusja
W niniejszej pracy wykazano, że granulocyty dzieci chorujących na NZDO odpowiadały istotnie staty- stycznie słabiej na wszystkie stosowane stymula- tory w porównaniu z granulocytami dzieci zdro- wych. Może to wynikać z wyczerpania zasobów energetycznych komórki, czyli reaktywnych form tlenu lub złuszczania się błonowych receptorów dla fMLP i Fc immunoglobulin, o czym świadczą obni- żone wartości Cl po stymulacji fMLP i zymosanem.
Depresyjnie na aktywność metaboliczną granulo- cytów może także działać antybiotykoterapia wy- wierająca hamujący wpływ na metabolizm tlenowy granulocytów [12]. Z danych w piśmiennictwie wynika, że częstość występowania defektu czynno- ści granulocytów dotyczy od 12 do 100 % chorych na NZDO [24, 25]. Wyniki przedstawione w tej pracy są porównywalne z większością doniesień in- nych autorów [26, 27, 28, 29]. Zjawisko obniżonej chemiluminescencji, zarówno u dzieci jak i osób dorosłych chorujących na NZDO, opisano w wielu pracach [30, 31, 32, 33]. Badania Sikory i wsp. wy- kazały obniżoną chemiluminescencję granulocytów u dzieci chorych na NZDO [32]. Podobnie u dzieci chorych na nawracające lub przedłużające się zapa- lenia płuc obserwowano niskie wartości chemilumi- nescencji granulocytów [34, 35]. W chorobach za- palnych o nawracającym przebiegu obserwowano niskie wartości chemiluminescencji po stymulacji fMLP i OZ, natomiast prawidłowe po stymulacji PMA. Odpowiedź na stymulację PMA może być związana z miejscem jego działania, czyli z za- chowaną lub zmienioną zdolnością do fosforyzacji czynnika cytozolowego oksydazy NADPH [36].
Zaobserwowano, że granulocyty mogą wystę- pować w kilku stanach czynnościowych: spo- czynkowym, reaktywowanym, aktywowanym i wyczerpanym. Granulocyty osób zdrowych wy- kazują stosunkowo niską spoczynkową aktywność ocenioną chemiluminescencją i aktywnie odpo- wiadają na stymulację [37]. Natomiast u osób cho- rujących na NZDO komórki te mogą znajdować się w stanie preaktywowanym, aktywowanym lub wyczerpanym co powoduje, że mimo pobudzania ich różnymi stymulatorami nie odpowiadają zna- czącym wzrostem wytwarzania wolnych rodni- ków tlenowych [37]. W prezentowanej pracy nie stwierdzono jednak statystycznie istotnych różnic wartości chemiluminescencji spontanicznej w gru- pach badanych dzieci zdrowych oraz dzieci choru- jących na NZDO, co upoważnia do wnioskowania, że obniżona zdolność do wybuchu oddechowego nie była efektem preaktywacji granulocytów. Nie
można jednak wykluczyć stanu ich wyczerpania.
Stan ten byłby bardzo silny i długotrwały biorąc pod uwagę, że prezentowane badania były prze- prowadzone po upływie 3 tygodni od ostatniego epizodu choroby i po zakończonym leczeniu. Wy- niki badań innych autorów oceniające wpływ fazy choroby i jej leczenia na zjawisko chemilumine- scencji są sprzeczne. Braun i wsp. wykazali wzrost chemiluminescencji u chorych na ciężkie zapale- nie płuc w porównaniu do chorych z obrzękiem płuc spowodowanym niewydolnością krążenia [38]. Adachi i wsp opisali pobudzenie chemilumi- nescencji zarówno w granulocytach izolowanych, jak i pełnej krwi u chorych we wczesnym okresie zapalenia płuc w porównaniu z osobami zdrowy- mi [39]. W trakcie leczenia obserwowano u tych chorych normalizację parametrów chemilumine- scencji i stopniowy powrót do wartości obser- wowanych u osób zdrowych. Podobnie Teramoto i wsp. [40] obserwowali podwyższoną aktywność chemiluminescencyjną granulocytów chorych na astmę i z przewlekłe zapalenie płuc w porównaniu z wartościami u osób zdrowych. Lewandowicz- Uszyńska stwierdziła w grupie dzieci chorych na astmę lub astmę powikłaną (NZDO) znacznie wyższą stymulowaną fMLP i PMA chemilumi- nescencję granulocytów w porównaniu z grupą kontrolną (35, 36). Przy czym, w grupie dzieci chorych na astmę powikłaną NZDO wykazano niższą stymulowaną aktywność metaboliczną gra- nulocytów w porównaniu z grupą dzieci chorych tylko na astmę [75]. Lewandowska i wsp. również obserwowali upośledzenie chemiluminescencji u chorujących na nawracające zapalenia płuc w po- równaniu z dziećmi, które chorowały na zapalenie płuc sporadycznie. Dzieci, u których obserwowa- no słabą chemiluminescencję na początku choroby wracały do zdrowia wolniej. Zabuska-Jabłońska i wsp.[41], Zgliczyński [18] obserwowali także niskie wartości chemiluminescencji w granulocy- tach osób dorosłych chorujących na nawracające zapalenia płuc. Wydaje się, że zasadnicze różnice mogą być spowodowane różnym odstępem czasu pomiędzy badaniem a okresem aktywnej choroby i jej leczeniem. Chorzy zakwalifikowani do ni- niejszej pracy byli badani w okresie zdrowia co potwierdzono badaniem lekarskim i prawidłowym wynikiem leukocytozy. Krew pobierano przynajm- niej 3 tygodnie po zakończeniu leczenia.
Wykrycie różnych dróg przekazywania sygna- łów z błony komórkowej do wnętrza komórki w zależności od zastosowanego stymulatora stwa- rza możliwość kompleksowej oceny czynności granulocytów. Poprzez jednoczasowe zastosowanie
stymulatorów angażujących różne szlaki enzyma- tyczne w komórce prowadzące do tego samego końcowego efektu jakim jest „wybuch tlenowy”
i zabicie sfagocytowanych bakterii można wniosko- wać o sprawności określonego szlaku enzymatycz- nego i obecności lub braku określonego izoenzymu.
Ponieważ enzymy te występują nie tylko w granu- locytach, ale również ich obecność stwierdzano w limfocytach, można się spodziewać, że zaburzonej czynność granulocytów mogą towarzyszyć pewne zmiany w czynności limfocytów [42, 43].
Jednym z celów podjętych w tej pracy badań było określenie korzyści z jednoczasowego zastoso- wania trzech stymulatorów do oceny zaburzeń zdol- ności granulocytów krwi obwodowej do produkcji reaktywnych form tlenu ocenianej za pomocą testu chemiluminescencji. W niniejszej pracy przeprowa- dzono również analizę częstości występowania de- fektu odpowiedzi na fMLP, OZ i PMA. Z indywidu- alnych wyników zdrowych dzieci wyliczono dolny i górny zakres spotykanych w tych grupach wyni- ków z ogólnie przyjętym prawdopodobieństwem na poziomie 95% (tab.1). W grupie dzieci zdrowych tylko wyniki 3 dzieci nie mieściły się w tym zakre- sie, sugerując obniżoną odpowiedź na jeden z trzech stosowanych stymulatorów (tab.3). W grupie dzieci chorujących na NZDO obniżoną odpowiedź lub jej brak stwierdzono u 32 dzieci z grupy 41 (78%). De- fekt odpowiedzi obserwowano na wszystkie trzy, na dwa z trzech oraz tylko na jeden z trzech stymula- torów odpowiednio u 14 z 41 (34%), 9 z 41(22%) i 9 z 41 (22%) dzieci. Analizując wyniki w tej grupie 32 dzieci, w której wystąpiła istotnie obniżona od- powiedź lub jej brak stwierdzono, że błędny wynik sugerujący prawidłową czynność granulocytów w przypadku badania z zastosowaniem tylko fMLP, OZ lub PMA dotyczyłby odpowiednio 21,88%, 21,87% i aż 40,6% dzieci chorych na NZDO. Zasto-
sowanie fMLP i OZ wykrywało w tej grupie defekt granulocytów u 93,75% dzieci. Brak rozpoznania dotyczyłby tylko 6,25% badanych. Zastosowanie fMLP i PMA wskazywało na defekt występujący tylko u 87,6% dzieci badanych a brak rozpoznania dotyczyłby 12,38 % badanych. Przyjmując, że 32 dzieci z grupy 41 badanych z nawracającymi zaka- żeniami miało obniżoną odpowiedź granulocytów w zakresie odpowiedzi na czynniki stymulujące syntezę rodników i emisję światła, zastosowanie trzech stymulatorów zwiększyło w sposób istotny czułość tego testu. Przedstawione wyniki sugerują dużą przydatność tak wykonywanego badania. U 9 dzieci z nawracającymi zakażeniami, u których nie wykryto zmian w zdolności do wybuchu tlenowego stymulowanych granulocytów poszukiwać należa- łoby zmian w czynności komórek odpowiedzial- nych za immunologiczną odpowiedź swoistą.
Ponieważ nie stwierdzono istotnych różnic w czasie, w którym odpowiedź stymulowanych granulocytów, zarówno dzieci z tendencją do na- wracających w porównaniu do odpowiednich grup kontrolnych, uzyskiwała wartość maksymalną to analizę tego parametru można pomijać przy wyko- nywaniu diagnostycznych badań rutynowych.
Wnioski
1. W grupie dzieci chorujących na nawracające zakażenia chemiluminescencja granulocytów akty- wowanych jest obniżona.
2. Czułość testu chemiluminescencji, stosowa- nego do oceny aktywności granulocytów obojętno- chłonnych krwi obwodowej, zwiększa się gdy jest on wykonywany z zestawem stymulatorów aktywu- jących zarówno różne błonowe drogi przekazywa- nia sygnału, jak i różne wewnątrzkomórkowe szlaki enzymatyczne prowadzące do wybuchu tlenowego.
Piśmiennictwo
1. Guidelines for research on acute respiratory infections:
memorandum from a WHO meeting. Bull World Health Organ 1982; 60:521-533
2. A program for the control of acute respiratory tract infec- tions in children: memorandum of a reunion of the WHO. Bull World Health Organ 1984; 62:229-242
3. Howel D, Webster S, Hayes J i wsp. The impact of recur- rent throat infection on children and their families. Fam Pract 2002; 19: 242–246
4. Gupta BD, Parakh M, Arora A Management of commu- nity acquired respiratory infections. Indian J Pediatr 2001; 68 Suppl 2: S39–S49
5. Crowe Jr JE, Williams JV Immunology of viral respi- ratory tract infection in infancy. Paediatr Respir Rev 2003; 4:
112–119
6. Daele J, Zicot AF. Humoral immunodeficiency in recurrent upper respiratory tract infections. Some basic, clinical and thera- peutic features. Acta Otorhinolaryngol Belg 2000; 54: 373–390
7. Kramer V.: Evaluation of certain immunological parame- ters in infants and small children with recurrent respiratory tract infection, Int.Rev. Allergol. Clin. Immunol., 1998, 4, 150-154
8. Paśnik J.: Preaktywacja( priming) neutrofila przez TNF-α-wpływ na wybrane funkcje neutrofila, Post. Hig. Med.
Dośw.1998; 52, 2, 139-155.
9. Wysocka J.: Metody oceny funkcji granulocytów, Diagn.
Lab., 1998, 34, 483-495.
10. Zeman K., Majewska E.: Receptory granulocytów obo- jętnochłonnych (neutrofili) krwi obwodowej. I.Charakterystyka struktury i biologicznej funkcji receptorów, Postępy Biologii Kom., 1991, 18, 1-18
11. Zeman K. I wsp.: Contemporary diagnostics of chronic granulomatous disease, Cent. Eur. J. Immunol., 2000; 25, 113
12. Jurczak W.J., Skotnicki A. B., Zgliczyński M. i wsp.:
Chemiluminescencja granulocytów, Przegl. Lek., 1993; 50, 53-58
13. Zimmermann B., Dalhoff K., Braun J.: Impaired neutro- phil exocytosis in patients with severe pneumonia, Intens. Care Med., 1999; 25: 44-51
14. Zeman K., Kantorski J.: Receptory granulocytów obo- jętnochłonnych (neutrofili) krwi obwodowej. II.Charakterysty- ka struktury i biologicznej funkcji receptorów, Postępy Biologii Kom., 1991, 18, 19-30
15. Cockeran R., Theron A.J., Steel H.C., i wsp..: Proin- flammatory interactions of pneumolysin with human neutro- phils, J. Infect. Dis., 2001, 183, 604-611.
16. Elbim C., Gougerat Pocidalo M.A.: Priming study of human phagocytes oxidative burst by using flow cytometry, Hematol. Cell Ther., 1996, 38, 527-535
17. Van Dyke K., Castranowa V.: Cellular chemilumine- scence, CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida, 1987, 95-97
18. Zgliczyński J.M., Kwasnowska E., Stelmaszyńska T i wsp.: Functional states of neutrophils as suggested by whole blood chemiluminescence, Acta Bioch. Pol., 1988, 35, 331- 34219. Koie T., Suzuki K., Shimoyama T. i wsp. Effect of inter- feron-alfa on production of reactive oxygen species by human neutrophils, Lumnesence,2001, 16, 39-43
20. Komatsu H., Tsukimori K., Hata K. i wsp.: The charak- terization of super oxide production of human neonatal neutro- phil, Early Human Development, 2001, 65, 11-19
21. Raport of WHO Scientific Group: Primary immunodefi- ciency diseases, Clin. Exp. Immunol.,109, Suppl., 1, 26-28
22. Sasson Y., Zeltser D., Rogowski O. i wsp: Neutrophilia of infection/inflammation: are we really dealing wih “inflama- ted” leukocytes?, J. Med. Sci, 1998, 29,217-229
23. Ottonello L., Dapino P., Pastorino G. Et all.: Neutrophil dysfunction and increased susceptibility to infection, Europ. J.
Clin. Inv., 1995, 25, 687-692.
24. Bernatowska E.: Zakażenia dróg oddechowych u dzieci:
diagnostyka, leczenie. Problemy laryngologiczne w codziennej praktyce, Servier, 1998, 2, 2-8.
25. Jung A., Kalicki B., Rutka J. i wsp.: Czynniki wpływa- jące na nawrotowość zakażeń układu oddechowego u dzieci, w: Postępy w pneumonologii i alergologii dziecięcej, red. R.
Kurzawa, A. Jung, J. Żuber, Warszawa, 1996.
26. Kowalska M., Kowalska H., Zawadzka-Głos L. i wsp.:
Dysfunction of peripheral blood granulocyte oxidative meta- bolism in children with recurrent upper respiratory tract infec- tions. Intern. J. Ped. Othorhin., 2003, 67, 365-371
27. Lakshman R., Finn A.: Neutrophil disorders and their management, J. Clin. Pathol., 2001, 54, 1, 7-19
28. Ley K.: Molecular mechanisms of leukocyte recruit- ment in the inflammatory process, Cardio-vasc. Res., 1996, 32, 733-742
29. Maly F. E. i in.: Functional states of neutrophils as sug- gested by whole blood chemiluminescence, J. Immunol., 1989, 142, 1260-1267
30. Mitkowska Z.: Chemiluminescencja (CL) w diagnosty- ce posocznicy noworodków, Przegl. Ped., 1995, 25, 221-225
31. Murphy S., van Epps D.E.: Neutrophil and monocyte function in pediatric patients with recurrent pneumonia, Am.
Rev. Respir. Dis., 1982, 126, 92-96
32. Sikora J.P.: Chemiluminescent assessment of aerobic metabolism of peripheral blood polymorphonuclear leukocytes in children with increased susceptibility to respiratory tract in- fections, Centr. Eur. J. Immunol., 1996, 21, 1, 33-38
33. Zeller J., Landay A.L., Lint T.F. i wsp..: Aggregated C- reactive protein binds to human polymorphonuclear leukocytes and potentiates Fc receptor-mediated chemiluminescence, J.
Lab. Clin. Med., 1986, 567-575
34. Lewandowicz-Uszyńska A.: The influence of selected stimulators on chemiluminescence of neutrophils in whole blond in children with bronchial astma, Pol. Merk. Lek., 2003, 28, 393-396
35. Lewandowicz-Uszyńska A. i wsp.: Aktywność neutro- fili oceniana testem chemiluminescencji u dzieci z zapaleniem płuc, Acta Bio-Optica, 1995, 3, 109
36. Lewkowicz P., Lauk-Pachuła B., Górańska N. i wsp..:
Próba standaryzacji pomiaru chemiluminescencji krwi pełnej jako metody oceny funkcji ludzkich granulocytów w badaniach in vitro, Diagn. Lab., 1999, 35, 497-510
37. Zhong L., Jiang H., Xie W., i wsp..: Role sof PLC-β2 and – β3 and PI3Kγ in chemoattractant- mediated signal trans- duction, Science, 2000, 287, 1046-1049
38. Braun J., Pein M., Djonlagic H. i wsp.: Production of reactive oxygen species by central venous and arterial neutro- phils in severe pneumonia and cardiac lung edema, Intens. Care Med., 1997, 23, 170-176
39. Adachi S., Suzuki K., Yamoto T.: Studiem of neutrophil function in the elderly: especially analysis of bedridden patients and patients with bacterial infection, Kansenhogaku Zasshi, 1993, 67, 1083-1093
40. Teramoto S., Shu C.Y., Ouchi Y., i wsp..: Increased spontaneous production and generation of superoxide anion by blood neutrophils in patients with asthma, J. Asthma, 1996, 33, 149-155.
41. Zabuska-Jabłońska K., Broniek A.: Disturbances of polymorphonuclear neutrophil leukocyte chemiluminescence in patients with chronic of recurrent respiratory tract infections, Pneumonol. Alergol. Pol., 1997, 65, 649-656
42. Ward S.G. i wsp..: PI 3-kinase: a pivotal pathway in T- cell activation?, Immunol. Today, 1996, 17, 187-197
43. Wymann M. P., Sozzani S., Altruda F., i wsp..: Lipids on the move: phosphoinositide 3-kinases in leukocyte function, Immunology Today, 2000, 21, 260-264
Wpłynęła: 25.06.2005 r.
Adres: Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej i Immunologii Klinicznej Wieku Rozwojowego AM, ul. Marszałkowska, Warszawa
