Analiza czynników warunkujących organogenezę agrestu (Ribes grossularia L.) w kulturach in vitro i in vivo oraz ocena genetyczna i fenotypowa otrzymanego materiału
Zadanie 79.
Kierownik projektu:
dr inż. Danuta Kucharska danuta.kucharska@inhort.pl Wykonawcy:
Pracownicy naukowi
dr Danuta Wójcik, dr Aleksandra Trzewik, mgr Małgorzata Kunka, prof. dr hab. Teresa Orlikowska, dr hab. Stanisław Pluta
Pracownicy techniczni:
Angelika Niewiadomska-Wnuk, Lucyna Ogórek, Barbara Wiosna, Stanisław Bodek
Instytut Ogrodnictwa, Skierniewice
Zakład Biologii Stosowanej
Cele projektu
1. Określenie czynników warunkujących inicjację i stabilizację kultur in vitro oraz czystość mikrobiologiczną 15 genotypów agrestu.
2. Analiza wpływu poszczególnych składników pożywki na proces namnażania, ukorzeniania i aklimatyzacji in vitro 15 genotypów agrestu.
3. Zbadanie potencjału regeneracji przybyszowej z fragmentów liści, pędów i korzeni 5 genotypów agrestu.
4. Poznanie reakcji pędów w kulturach in vitro na okresowe przechowywanie w niskich temperaturach oraz wpływ tego czynnika na indukcję procesów rozwojowych 10 genotypów agrestu.
5. Ocena fenotypowa i genetyczna roślin 15 genotypów agrestu, rozmnożonych in vitro oraz przez sadzonki zielne w warunkach doświadczenia polowego.
6. Określenie wpływu mikrorozmnażania agrestu na zachowanie jednorodności genetycznej i powstawanie zmienności somaklonalnej 10 genotypów agrestu techniką AFLP.
7. Analiza polimorfizmu DNA 15 genotypów agrestu przy użyciu techniki AFLP i ISSR-PCR.
Wszystkie cele zostały osiągnięte.
Materiały i metody
• Materiałem badawczym było 15 genotypów agrestu: 8 odmian ustalonych oraz 7 klonów hodowlanych. Pąki wierzchołkowe i pąki boczne pobierano w miesiącach luty-marzec oraz maj-czerwiec i wykładano na pożywkę inicjalną. Czystość mikrobiologiczną sprawdzano na pożywkach bakteryjnych: PDA, KB i NA.
• Optymalizując proces mikrorozmnażania agrestu sprawdzano wpływ poszczególnych składników pożywki: soli MS, WPM oraz QL;
stężenia cytokin BAP, kinetyny i meta-topoliny (m-T); gibereliny GA3; współdziałania cytokinin z auksynami IAA, IBA i NAA na efektywność namnażania oraz wpływ auksyn na ukorzenianie pędów in vitro. Sprawdzano wpływ agarów Plant, Bacto oraz Gerlite, a także dodatku wapnia, magnezu i żelaza.
• Badając potencjał regeneracji przybyszowej in vitro wykorzystywano fragmenty pędów, korzeni i liści 5 genotypów agrestu.
Eksplantaty inkubowano na pożywkach indukcyjnych z tidiazuronem (TDZ), następnie przekładano na pożywki regeneracyjne z BAP, m-T i TDZ. W celu zwiększenia zdolności organogenetycznych, kultury mateczne kondycjonowano przez 30 dni na pożywce z TDZ, kontrolę stanowiły pędy na pożywce z m-T.
• Miesięczne kultury 10 genotypów agrestu, na pożywce do namnażania, przechowywano przez 2, 4 i 6 miesięcy w temperaturach 2oC i 4oC. Po tym okresie sprawdzano jakość oraz współczynnik namnażania pędów.
• Rośliny 15 genotypów agrestu, rozmnożone w kulturach in vitro oraz przez sadzonki zielne, oceniano w doświadczeniu polowym, założonym jesienią 2017 r. Prowadzono obserwacje wzrostu i owocowania krzewów oraz porażenie przez amerykańskiego mączniaka agrestu i antraknozę liści.
• Genomowe DNA izolowano przy użyciu zestawów komercyjnych DNeasy® Plant Mini Kit, NucleoSpin® 96 Plant kit oraz Plant/Fungi DNA Isolation Kit pobierając ok. 100 mg tkanki roślinnej (sadzonki in vitro, wegetatywne oraz rośliny mateczne).
Preparaty analizowano spektrofotometrycznie, obliczono stężenie DNA oraz współczynnik 260/280 nm. Otrzymane praparaty DNA wykorzystano w analizie AFLP i ISSR-PCR. Po reakcjach amplifikacji oceniano całkowitą liczbę produktów, obecność i liczbę produktów polimorficznych oraz określono poziom polimorfizmu. Dla analiz AFLP opracowano macierz podobieństwa genetycznego (SI), obliczaną pomiędzy parami wszystkich genotypów i opracowano drzewo filogenetyczne za pomocą analizy skupień metodą UPGMA z zastosowaniem programu XLSTAT .
Wyniki - mikrorozmnażanie
• Największą efektywność inicjowania kultur odnotowano w terminie wiosennym z pąków wierzchołkowych roślin, utrzymywanych w karkasie. W każdym z genotypów zaobserwowano obecność bakterii endogennych. Największy stopień ich wykrywalności zaobserwowano na pożywce bakteryjnej KB.
• Spośród trzech testowanych pożywek: MS, WPM oraz QL, najkorzystniejsza okazała się pożywka MS, na której pędy były najgrubsze, miały największe i najbardziej zielone liście. Pędy na pożywce z BAP dobrze mnożyły się, ale następowało zahamowanie wydłużania i tworzyły się rozety. Dodatek kinetyny powodował wydłużanie pędów, ale zwiększał odsetek pędów nekrotycznych.
• Wpływ agaru był większy niż obecność i stężenie gibereliny. Gerlite wpływał na zwiększenie współczynnika namnażania, udział pędów >1cm, ale zwiększał również szklistość pędów. Zaznaczył się wpływ gibereliny na udział pędów wyższych, jednak dla niektórych genotypów obniżał się współczynnik namnażania. Dodatek jonów wapnia oraz magnezu poprawiał parametry wzrostu i namnażania agrestu. Dodatek jonów żelaza zmniejszał współczynnik namnażania i jakość pędów (Fot 1).
• Zaobserwowano bardzo znaczący wpływ m-T na wzrost współczynnika namnażania oraz zahamowanie zamierania pędów towarzyszące mnożeniu w obecności cytokininy BAP. Wpływ auksyny w morfogenezie agrestu zależał od genotypu. Dla większości IAA we współdziałaniu z BAP i m-T był bardziej korzystny niż IBA, zwiększał współczynnik namnażania i liczbę pędów wyższych (Fot. 2).
Fot. 1. Wpływ dodatków mineralnych na kultury in vitro agrestu.
Fot. 2. Wpływ BAP i meta-topoliny na mikrorozmnażanie agrestu odm. ‚Resika’.
Fot. 3. Wpływ stężenia i rodzaju auksyny na ukorzenianie in vitro agrestu.
• W procesie rizogenezy nie odnotowano większych różnic w działaniu pomiędzy badanymi auksynami (Fot. 3). U większości genotypów jakość ukorzenionych pędów była nieznacznie lepsza na pożywce z IAA niż IBA. Procent i jakość ukorzenionych pędów bardziej zależał od ich wysokości niż badanej auksyny. Wpływ auksyny NAA na mikrorozmnażanie i ukorzenianie in vitro dla wszystkich genotypów był niekorzystny.
Wyniki - regeneracja przybyszowa in vitro i chłodzenie kultur
• W fazie indukcji regeneracji przybyszowej lepszą efektywność stwierdzono dla pożywki zawierającej 0,5 mg/l TDZ, eksplantaty były dłużej zielone a kalus mniejszy. Odnotowano niską przydatność regeneracyjną fragmentów pędów i korzeni. Zaczątki pędów przybyszowych obserwowano na eksplantatach liściowych z nasadami, na pożywce z BAP (Fot. 4 i 5). Bez względu na zastosowane czynniki, trzy genotypy wykazywały małą zdolność do regeneracji, natomiast dwa pozostałe wytworzyły więcej pędów przybyszowych.
Więcej pędów przybyszowych wytworzyło się po 14-dniowej indukcji regeneracji niż po 7-dniowej. Kondycjonowanie kultur matecznych, na pożywce z TDZ nie wpłynęło na częstotliwość pojawiania się pędów przybyszowych w porównaniu do kontroli na pożywce z m-T.
• Po trzech okresach chłodzenia kultur w temperaturach 2
oC i 4
oC, wszystkie genotypy podjęły namnażanie. Odsetek pędów nekrotycznych po 2 i 4 miesiącach chłodzenia był znikomy, a po 6 większy, jednak w stopniu umożliwiającym odtworzenie kultur. Kultury ośmiu genotypów przechowywane 6 miesięcy w 2
oC były lepszej jakości niż w 4
oC (Fot. 6). Dla większości genotypów w II pasażu po chłodzeniu nastąpiło zwiększenie namnażania oraz udział pędów wyższych w porównaniu do kontroli.
Fot. 4 i 5. Przykłady organogenezy przybyszowej agrestu. Fot. 6. Porównanie stanu kultur in vitro agrestu odm. ‚Resika’ po 6 miesiącach chłodzenia w temperaturach 2oC i 4oC.
Wyniki – doświadczenie polowe
• W celu uzyskania roślin do doświadczenia polowego, pędy 15 genotypów agrestu ukorzeniano in vitro w systemie dwuetapowym a następnie aklimatyzowano w szklarni. W zależności od odmiany ukorzeniło się od 20% do 90% a zaaklimatyzowało od 50% do 100% pędów. Do rozmnażania tradycyjnego pobierano wierzchołki tegorocznych pędów. Efektywność ukorzeniania sadzonek zielnych w szklarni wynosiła od 20% do 100%.
Rośliny z in vitro odznaczały się silniejszym wzrostem w porównaniu do roślin z sadzonek zielnych (Fot. 7, i 8).
• Po trzech sezonach wegetacyjnych w doświadczeniu polowym, parametry wzrostu i owocowania, były większe dla krzewów rozmnażanych in vitro. Średnia wysokość krzewów z in vitro wynosiła 54,1 cm a rozmnożonych tradycyjnie 45,1 cm, szerokość wynosiła odpowiednio 67,0 cm do 53,5 cm a liczba pędów 32,4 do 20,6.
Największa dynamika dotyczyła liczby pędów. W roku 2019 przyrost liczby pędów dla krzewów z in vitro wynosił 1,4 a dla rozmnażanych tradycyjnie 1,8, w roku 2020 odpowiednio 18,7 i 13,8. W sezonie 2020, plon owoców z 3 poletek, był wyższy z roślin in vitro dla 13 genotypów, a dla 2 genotypów z roślin rozmnażanych tradycyjnie.
Najlepiej plonującą odmianą, niezależnie od sposobu rozmnażania był ‘Hinonmaki Rot’ (Fot. 9. 10 i 11).
• Największe porażenie przez amerykańskiego mączniaka agrestu stwierdzono u odmiany ‘Biały Triumf’, a największe porażenie przez antraknozę liści obserwowano u odmiany ‘Biały Triumf,’ ‘Hinonmaki Rot’, ’Pax’ oraz klonów 86, 108 i 117, niezależnie od sposobu rozmnażania.
Fot. 8. Porównanie wzrostu roślin z in vitro (po lewej) i z sadzonek zielnych (po prawej) otrzymanych w tym
samym czasie. Fot. 11. Porównanie plonowania odm.
‘Invicta’, u góry owoce z krzewów z in vitro, u dołu z krzewów z sadzonek zielnych.
Fot. 9 i 10. Wzrost roślin odm.
‘Hinonmaki Rot’ in vitro (po lewej), z sadzonek zielnych (po prawej) Fot. 7. Sadzonki odm.
‘Captivator’ z in vitro (po lewej) z sadzonki zielnej (po prawej)
Wyniki – analizy AFLP oraz ISSR-PCR
• Liczba produktów generowanych przez pary starterów AFLP wynosiła średnio 47,96. Zmienność genetyczna w roślinach in vitro wahała się od 0,35 % dla odmiany ‘Hinnonmaki Rot’ do 18,49% dla klonu 108. Łącznie w wyniku analizy AFLP 15 genotypów agrestu z 12 kombinacjami starterów uzyskano 625 markerów AFLP, z czego 238 było polimorficznych. Największy procent polimorficznych produktów uzyskano w wyniku reakcji z zastosowaniem starterów Pst-GA/Mse-TC – 51,3%, najmniej polimorficznych produktów – 6,7% uzyskano w reakcji ze starterami Pst-TA/ Mse-GA.
• Wartości podobieństwa wahały się od 0,870 ( ‘Hinnonmaki Rot’ vs AGR 117) do 0,978 (AGR 86 vs AGR 2/33).
Na dendrogramie wyodrębniono 2 główne grupy skupień obejmujące 6 i 5 genotypów oraz 1 mniejszą, skupiającą odmiany ‘Hinsel’ i ‘Hinnonmaki Rot’. Genotypy AGR 117 i ‘Captivator’ nie tworzą skupień (Rys.1.).
AGR 117 'Captivator' 'Hinnonmaki Rot'
'Hinsel' 'Resika' AGR 2/2 AGR 108 'Kamieniar' AGR 86 AGR 2/33 AGR 101 AGR 102 'Invicta' 'Biały Triumf' 'Pax'
0,890277 0,910277
0,930277 0,950277
0,970277 0,990277
Indeks podobieństwa Dice'a
• W wyniku analizy ISSR-PCR z pięcioma starterami uzyskano łącznie 2294 produktów amplifikacji, z czego 64 (2,8%) było polimorficznych.
Wielkości otrzymanych produktów amplifikacji były w granicach 250 – 2900 pz, w zależności od użytego startera i odmiany. Zastosowane startery różniły się w ilości generowanych produktów PCR.
Przykładowo, liczba produktów amplifikacji w odmianie Invicta wahała się od 42 dla startera 834 do 168 dla startera 849.
Rys 1. Dendrogram 15 genotypów agrestu metodą UPGMA w oparciu o markery AFLP.
Wnioski
1. W obecności meta-topoliny uzyskano najwyższy współczynnik namnażania oraz udział pędów wyższych, nastąpiło także całkowite ograniczanie nekrozy pędów, występujące w obecności BAP.
2. Ukorzenianie in vitro i aklimatyzacja mikrosadzonek agrestu jest efektywna i wynosi ponad 90%.
3. Kultury agrestu przechowywane 6 miesięcy w temperaturze 2
oC były lepszej jakości niż przechowywane w 4
oC.
4. Parametry wzrostu i owocowania krzewów agrestu, w doświadczeniu polowym, po trzech sezonach wegetacyjnych były większe dla krzewów rozmnażanych in vitro.
5. Potwierdzono skuteczność techniki AFLP w detekcji zmienności somaklonalnej agrestu, generowanej w kulturach in vitro oraz w badaniach zróżnicowania genetycznego pomiędzy genotypami agrestu.
6. Potwierdzono skuteczność techniki ISSR w uzyskaniu markerów identyfikacji genotypów oraz w detekcji polimorfizmu DNA agrestu.
7. Współczynniki podobieństwa genetycznego uzyskane na podstawie analizy
markerów AFLP wskazują na małe zróżnicowanie genetyczne analizowanych
genotypów agrestu.
Osiągnięcia projektu
1. Opracowano kompleksową procedurę mikrorozmnażania 15 genotypów agrestu.
2. Wykazano, iż przełomowym czynnikiem w rozmnażaniu agrestu in vitro było zastosowanie meta-topoliny.
3. Potwierdzono możliwość długotrwałego przechowywania kultur agrestu w temperaturze 2
oC oraz pozytywny wpływ tego czynnika na namnażanie pędów.
4. W doświadczeniu polowym prowadzono pionierskie obserwacje roślin in vitro oraz z sadzonek zielnych 15 genotypów agrestu.
5. Potwierdzono skuteczność technik AFLP oraz ISSR w detekcji zmienności somaklonalnej i polimorfizmu DNA oraz w uzyskaniu markerów identyfikacji genotypów agrestu.
6. Wyniki projektu mogą być wdrożone przez laboratoria komercyjne a także stały się podstawą do przygotowania kolejnego projektu z Badań Podstawowych,
„Zastosowanie poliploidyzacji mitotycznej in vitro w indukowaniu zmienności
genetycznej oraz możliwości poprawy wybranych cech użytkowych agrestu (Ribes
grossularia L.) i czereśni (Prunus avium L.)” - zadanie 46
Wykaz publikacji wyników
Doniesienia konferencyjne (postery)
1. Kucharska D., Orlikowska T. (2015). The initial results of experiments of in vitro propagation of gooseberry (Ribes grossularia L.). XIV Ogóln. Konfer. Kultur In Vitro i Biotech, Poznań 14-17.09 BioTechnologia 96(1):116 57
2. Kucharska D., Orlikowska T. (2016). Factors influencing micropropagation of gooseberry (Ribes grossularia L). III International Symposium on Horticulture in Europe, “Growing Health and Life”, Greece, October 17-21, Book of abstracts 151.
3. Kucharska D., Orlikowska T. (2016). The role of meta-topolin in micropropagation gooseberry (Ribes Grossularia L). 57 Zjazd PTB Lublin Mat. Konferencyjne 186.
4. Kucharska D., Kunka M., Pluta S. (2017). In vitro culture of gooseberry Ribes grossularia L. Fourth International Horticulture Research Conference 16-20.07 East Malling, UK Book of abstracts 88.
5. Kucharska D., Kunka M., Pluta S. (2017). Wpływ chłodzenia kultur pędowych na mikrorozmnażanie agrestu (Ribes grossularia L.) Ogólnopolska Ogrodnicza Konferencja Naukowa, Kraków wrzesień 20-21. Mat. Konferencyjne 104.
6. Niewiadomska-Wnuk A., Kucharska D. (2018). Evaluation of the possibility of adventitious regeneration of gooseberry (Ribes grossularia L) in vitro. Mat. XV Ogóln. Konfer. Kultur In Vitro i Biotech. Roślin. BioTechnologia Vol. 99(3) str. 294.
7. Kucharska D., Kunka M. (2019). Wpływ chłodzenia na jakość i namnażanie in vitro agrestu. Zjazd PTB, Kraków, 1–7 lipca.
8. Wójcik D., Kucharska D. (2019). Wpływ mikrorozmnażania agrestu na zachowanie jednorodności genetycznej w obrębie gatunku. Zjazd PTB, Kraków, 1–7 lipca.
9. Wójcik D., Kucharska D. (2019). Evaluation of genetic diversity within gooseberry cultivars (Ribes grossularia subgenus Grossularia) with the use of AFLP technique. Eurobiotech, 7th Central European Congress of Life Sciences, Kraków 23-25.09
Publikacje
1. Kucharska D., Niewiadomska-Wnuk A., Kiszczak W. (2017). Czynniki wpływające na inicjację i stabilizację agrestu (Ribes grossularia L.) w kulturach in vitro. Zeszyty Naukowe IO 25: 5–17. 6 pkt
2. Kucharska D., Trzewik A., Wójcik D., Pluta S., Seliga Ł., Ogórek L., Wiosna B., Bodek S. (2019). Analiza czynników warunkujących organogenezę agrestu (Ribes grossularia L.) w kulturach in vitro i in vivo oraz ocena genetyczna i fenotypowa otrzymanego materiału.
Komunikat Biuletyn IHAR, 286: 407-410
3. Kucharska D., Orlikowska T., Maciorowski R., Kunka M., Niewiadomska-Wnuk A. (2020). Storage of proliferating gooseberry cultures under slow growth conditions. W druku Horticultural Science 70 pkt.
4. Kucharska D., Orlikowska T., Maciorowski R., Kunka M., Wójcik D., Pluta S. (2020). Application of meta-topolin for improving micropropagation of gooseberry (Ribes grossularia). Scientia Horticulture 272: 109529. 140 pkt
5. Kucharska D., Trzewik A., Wójcik D. (2020). Evaluation of genetic stability of in vitro-derived goosberry plants (Ribes grossularia L.) with the use of AFLP and ISSR techniques. W druku AGRONOMY 100 pkt.
6. Kucharska D., Trzewik A., Wójcik D., Pluta S. Niewiadomska-Wnuk A. (2020). Ocena wzrostu i stabilności genetycznej agrestu (Ribes grossularia L.) rozmnażanego in vitro oraz ex vitro. Biuletyn IHAR 20 pkt
